CN110372829A - 基于偶氮还原响应的聚合物凝胶荧光探针的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及偶氮苯还原响应性的四苯基乙烯聚合物的制备及在水凝胶荧光探针中的应用,该四苯基乙烯聚合物在含四苯基乙烯和偶氮苯基团的双头丙烯酸酯交联剂(TPE‑2AzoMA)的作用下,将聚乙二醇类单体与丙烯酸类单体在引发剂的作用下自由基聚合后得到。将得到的交联无规共聚物在水中溶胀处理,可得到聚合物水凝胶。采取浸泡溶胀法进行凝胶载药,得到包裹药物的水凝胶。加入Na2S2O4或偶氮还原酶后,伴随着凝胶的降解,溶液产生荧光并随着时间逐渐增强,包裹的药物也逐渐被释放。通过荧光光谱仪测试上述过程中溶液的荧光强度变化可以监测药物释放过程。偶氮还原酶主要存在人体的结肠中,因此,此聚合物水凝胶是一种潜在的结肠定位药物控释载体。
Description
技术领域
本发明涉及聚合物制备技术和生物材料领域,尤其涉及一种基于偶氮还原响应的聚合物凝胶荧光探针的制备及应用。
背景技术
为了使材料具有更加通用的动态变化性能,在过去几十年中,智能响应型材料应运而生并呈现不断增长的趋势。响应型材料是一类在外界环境微小刺激因素作用下,自身的某些物理或化学性质会发生相应的可逆或不可逆变化的材料。常见的刺激因素有光、温度、pH、离子强度、氧化还原、酶、电场和磁场等,基于这些多样的响应性而设计的智能材料已广泛地应用于各个领域,尤其一些生物响应性材料已经被广泛地应用于药物可控释放,成像造影剂,基因和生物活性分子的载体等领域。
智能或刺激响应性水凝胶,它们对外界环境条件的变化能产生较大的物理或化学变化响应,如温度、磁场、机械应力等物理环境变化或pH、离子强度等化学环境变化。在聚合物体系中,这种类型的水凝胶在色谱、生物相关应用,如药物递送等生物技术方面的应用。最近,人们还发展了使用水膨胀、交联的生物医学聚合物作为药物、多肽和蛋白质的载体,作为位点特异性递送的靶向剂,或作为制备蛋白质或酶偶联物的组分。这些聚合物水凝胶网络结构和组成的热力学性质在它们的扩散行为、分子网格大小的变化(特别是在环境反应性水凝胶中)以及与之相关的生物活性物质的分子稳定性方面起着关键作用。
水凝胶的另一个优点是,它们可以为药物、多肽,特别是蛋白质提供理想的保护,使其免受释放位点附近潜在恶劣环境的影响,而这一点目前才被认识到。因此,这种载体在未来可能被用于蛋白质或肽的口服递送。此外,水凝胶作为生物可识别的生物材料具有很好的应用前景。因此,它们可以作为生物活性物质的可选载体,作为生物粘附体系或具有理想生物特性的偶联物。
人体结肠中存在的大量微生物群和独特的酶(纤维素酶、偶氮还原酶和硝基还原酶等)被越来越多地用于释放结肠中的药物。偶氮苯化合物除了具有在光和热的作用下会发生可逆的光致异构化行为,还具有特殊的还原响应性。偶氮苯的N=N双键在特定的还原剂(如连二亚硫酸钠、偶氮还原酶等)作用下会被还原打断,可实现水凝胶的降解。基于偶氮苯的水凝胶应用于结肠靶向药物释放载体的研究已有报道。
荧光探针作为一种高效灵敏的生物光学探测器,在生物成像和生物传感应用领域显示了重要地位。而基于酶响应的荧光探针的出现又为酶的识别、细胞分类、跟踪新陈代谢历程及细胞调控/繁殖、药物传送与生物成像提供了一种有力的研究手段并具有广泛的应用前景。基于AIE类DDSs被广泛应用于检测药物分布,药物活化和原位治疗[参见:Yuan,Y.Y.;Liu,B.,Visualization of drug delivery processes usingAIEgens.Chem.Sci.2017,8,2537-2546.],现有技术公开报道的多以胶束载药为主,可视化的水凝胶载药系统的研究相对较少,尤其在结肠给药系统领域尚未见报道。因此,需要研发并制备一种既有特定偶氮苯还原响应性又具有荧光探针性能的水凝胶,实现水凝胶的药物的结肠靶向释放,同时荧光伴随药物的释放不断提高。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种基于偶氮还原响应的聚合物凝胶荧光探针的制备及应用,本发明提供了一种基于偶氮苯的交联剂,并进一步合成偶氮苯还原响应性聚合物,该聚合物在在偶氮苯还原剂作用下可发出荧光,利用上述性质可将其作为水凝胶荧光探针和药物载体。
本发明的第一个目的是提供一种基于偶氮苯的交联剂,其结构式如式(I)所示:
本发明的第二个目的是提供一种上述基于偶氮苯的交联剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)将式(1)的化合物TPE-2OH与式(2)的化合物TEG-OTs在碱金属盐的作用下,在有机溶剂中于50-80℃(优选为50℃)下反应,反应完全后得到式(3)的化合物TPE-2TEGOH;
(2)将式(3)的化合物TPE-2TEGOH与对甲苯磺酰氯(TsCl)在有机胺和催化剂的作用下,在有机溶剂中于0-25℃下反应,反应完全后得到式(4)的化合物TPE-2TEGOTs;
(3)将式(4)的化合物TPE-2TEGOTs与式(5)的化合物Azo-OH在碱金属盐的作用下,在有机溶剂中于50-80℃(优选为50℃)下反应,反应完全后得到式(6)的化合物TPE-2TEGAzo;
(4)将式(6)的化合物TPE-2TEGAzo与甲基丙烯酰氯在有机胺的作用下,在有机溶剂中于0-25℃下反应,反应完全后得到式(I)的化合物TPE-2AzoMA;其中,式(1)-(6)的结构式如下:
进一步地,在步骤(1)和步骤(3)中,碱金属盐为碳酸铯和/或碳酸钾。优选地,碱金属盐为碳酸铯。
进一步地,在步骤(2)和步骤(4)中,有机胺为三乙胺。
进一步地,在步骤(1)中,TPE-2OH和TEG-OTs的摩尔比为1:2-2.5;反应时间为8-12h;有机溶剂优选为DMF。优选地,TPE-2OH和TEG-OTs的摩尔比为1:2.5;反应时间为12h。
进一步地,在步骤(1)中,TPE-2OH采用4-羟基苯甲酮在锌粉和四氯化钛(TiCl4)的作用下,在-20℃下反应24h;优选的,锌粉、4-羟基二苯甲酮、四氯化钛的摩尔比为4:1:2.4。反应结束后,反应液经10wt%碳酸钾溶液猝灭,将得到的固体用乙酸乙酯萃取,然后将有机层用无水硫酸钠干燥,柱层析提纯得到化合物TPE-2OH,柱层析时洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯。
进一步地,在步骤(1)中,TEG-OTs的制备方法包括以下步骤:将三缩四乙二醇(TEG-2OH)和对苯甲磺酰氯在三乙胺的作用下,在0-25℃下反应6h。优选地,TEG-2OH、对苯甲磺酰氯和三乙胺的摩尔比为5:1:1.5。反应结束后,反应液经过水洗三次,然后将有机层用无水硫酸钠干燥,柱层析提纯得到TEG-OTs化合物;柱层析时洗脱剂为乙酸乙酯。
进一步地,在步骤(2)中,TPE-2TEGOH与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:2-2.5;反应时间为6-8h;有机溶剂优选为二氯甲烷。优选地,TPE-2TEGOH与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:2.5;反应时间为6h。
进一步地,在步骤(2)中,催化剂优选为DMAP。
进一步地,在步骤(2)中,有机胺与对甲基苯磺酰氯摩尔比为1.5-2:1(优选为1.5:1)。
进一步地,在步骤(3)中,TPE-2TEGOTs与Azo-OH的摩尔比为1:2-2.5(优选为1:2.2);反应时间为8-12h(优选为12h);有机溶剂优选为DMF。
进一步地,在步骤(3)中,Azo-OH的制备方法包括以下步骤:
将对氨基苯甲醇重氮盐与苯酚在浓盐酸、亚硝酸钠和碳酸钾的存在下,在冰水浴中进行偶联反应,反应pH为4~5。
进一步地,在步骤(4)中,TPE-2TEGAzo与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2-3(优选为1:3);反应时间为6-10h(优选为6h);有机溶剂优选为四氢呋喃。
进一步地,在步骤(4)中,有机胺与对甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2-5(优选为1.3:1)。
进一步地,在步骤(1)中,反应结束后,反应液滴入大量水中,用乙酸乙酯萃取、有机相用饱和氯化铵溶液洗涤4-5次、水洗三次,然后将有机层用无水硫酸钠干燥,浓缩产物后柱层析提纯得到化合物TPE-2TEGOH。
进一步地,在步骤(2)中,反应结束后,反应液经过抽滤,滤液旋蒸浓缩,然后柱层析提纯得到TPE-2TEGOTs化合物。
进一步地,本发明上述制备方法中,反应均在惰性气氛保护下进行。惰性气氛优选为氮气气氛或氩气气氛。
上述制备方法得到了含四苯基乙烯(TPE)和偶氮苯基团的甲基丙烯酸酯类交联剂,将其命名为TPE-2AzoMA。该交联剂中TPE荧光基团与偶氮苯相连,由于两者之间具有“FRET”效应,导致该交联剂荧光猝灭,在偶氮苯还原剂的作用下偶氮键被还原打断,TPE荧光的逐渐增强。
本发明的第三个目的是提供一种偶氮苯还原响应性聚合物的制备方法,包括以下步骤:
在惰性气氛保护下,在本发明的上述式(I)所示的基于偶氮苯的交联剂的作用下,以热引发剂引发聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体聚合反应,反应在有机溶剂中进行,聚合温度为50-70℃(优选为70℃),反应5h后得到所述偶氮苯还原响应性聚合物。
进一步地,聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体的摩尔比为1-8:1;所述基于偶氮苯的交联剂占聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体总摩尔量的0.005-0.03,所述引发剂的占聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体总摩尔量的0.002。优选地,聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体的摩尔比为1:1,基于偶氮苯的交联剂占聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体总摩尔量的1:1:0.005。
进一步地,聚乙二醇类单体为甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)。聚乙二醇类单体的分子量为500-1000g/mol。优选地,聚乙二醇类单体的分子量为500g/mol。
进一步地,丙烯酸类单体为丙烯酸(AAc)或甲基丙烯酸。
进一步地,热引发剂为AIBN。
优选地,有机溶剂为DMF。
本发明的第四个目的是提供一种采用上述制备方法所制备的偶氮苯还原响应性聚合物,其结构通式如式(II)所示:
其中,R为甲基或氢,m+n=1,p=0.005-0.03,q=7-19。优选地,p=0.005,q=7-8或18-19,更优选地,q=7-8。
本发明的第五个目的公开上述偶氮苯还原响应性聚合物在制备水凝胶荧光探针中的应用。
进一步地,偶氮苯还原响应性聚合物在制备水凝胶时,以THF为溶剂,通过脂肪索氏提取法对偶氮苯还原响应性聚合物凝胶提纯,以除去残留的反应物及溶剂DMF,然后将提纯后的聚合物放置室温下12h后干燥除去THF,即可得到干凝胶;将干凝胶放在水或PBS中进行溶胀制备水凝胶。
上述水凝胶荧光探针具有以下优点:(1)TPE具有高的荧光量子产率,甚至在水中的荧光量子产率可以达到1.0;(2)荧光信号对溶剂的极性和pH不敏感;(3)具有相对较好的光热稳定性;(4)水凝胶溶胀率大,交联剂为0.5%单体的摩尔含量时,溶胀比高达20多倍。(5)水凝胶降解后的产物,具有良好的生物相容性。
本发明的第六个目的公开上述偶氮苯还原响应性聚合物在制备抗癌药物或结肠定位药物控释载体中的应用。
进一步的,制备抗癌药物或结肠定位药物控释载体时,采取浸泡溶胀法,将偶氮苯还原响应性聚合物在含有抗癌药物或结肠定位药物的磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡,待溶胀平衡后取出、干燥,得到载药水凝胶。
进一步的,抗癌药物或结肠定位药物控释载体均具有偶氮苯还原响应性。
进一步的,响应温度为37℃。
进一步的,缓冲液pH=7.4。药物为蛋白类药物,优选为牛血清白蛋白(BSA)。
本发明的偶氮苯还原响应性聚合物由于具有亲水性基团,因此可作为水凝胶。同时,聚合物中TPE荧光基团与偶氮苯相连,由于两者之间具有“FRET”效应,导致该聚合物或基于该聚合物的水凝胶处于荧光猝灭状态,在偶氮苯还原剂的作用下偶氮键(-N=N-)被还原打断,聚合物或水凝胶发生降解,交联剂中TPE也由于-N=N-的断开而脱离凝胶,在溶液中形成聚集体,进而诱导荧光发射,实现了荧光从无到有的转变。因此,该聚合物水凝胶具有偶氮苯还原响应的灵敏性和高选择性。
同时,通过凝胶的浸泡溶胀法,制备载药凝胶。由于加入偶氮苯还原剂后水凝胶反生降解,药物逐渐释放,且在此过程中,产生的荧光随着还原时间延长而逐渐增强,因此可以通过用荧光光谱测试在偶氮苯还原剂作用下荧光强度的变化监测药物释放过程。偶氮还原酶主要存在人体的结肠中,因此上述偶氮苯还原响应性聚合物是一种潜在的结肠定位荧光探针。
上述偶氮苯还原剂为连二亚硫酸钠(Na2S2O4)或偶氮还原酶。
借由上述方案,本发明至少具有以下优点:
目前为止,具有偶氮苯还原响应性的聚合物水凝胶荧光探针还未见报道。本发明首先制备了一种四苯基乙烯两端连接的偶氮苯衍生物的丙烯酸酯类交联剂,然后在该交联剂作用下,选择亲水性良好的单体,最终制备出具有偶氮苯还原响应的聚合物。本发明所制备的偶氮苯还原响应性聚合物具有良好的吸水性和生物相容性,可用作水凝胶荧光探针,其在偶氮苯还原剂(连二亚硫酸钠或偶氮还原酶)作用下能实现荧光从无到有的荧光响应。并且该偶氮苯还原响应性聚合物还具有药物载体功能,在偶氮苯还原剂的作用下,伴随着聚合物的降解,溶液产生荧光并随着时间逐渐增强,包裹的药物也逐渐被释放,通过测试Na2S2O4或偶氮还原酶作用下溶液中荧光强度的变化可以监测药物释放过程。
本发明的偶氮苯还原响应性聚合物具有良好的生物相容性和吸水性,并且发光效率高、分析灵敏度强,在生物样品分析中有明显的优越性;解决了现有技术中没有基于偶氮苯还原响应的药物控释聚合物水凝胶荧光探针的问题。
本发明设计并构建一类结构新颖并且具有生物应用性能的基于偶氮还原响应性的聚合物凝胶荧光探针体系及药物释放体系,实现可降解水凝胶通过可视化的方式进行药物跟踪与释放,拓展偶氮苯类聚合物水凝胶在生物传感、载药等领域中的应用,为结肠定位药物控释载体的制备和潜在应用提供必要的理论依据,填补该研究领域的空白。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1是本发明中的TPE-2OH的核磁共振氢谱(1H NMR)图;
图2是本发明中的TEG-OTs的核磁共振氢谱(1H NMR)图;
图3是本发明中的TPE-2TEGOH的核磁共振氢谱(1H NMR)图;
图4是本发明中的TPE-2TEGOTs的核磁共振氢谱(1H NMR)图;
图5是本发明中Azo-OH的核磁共振氢谱(1H NMR)图;
图6是本发明中的TPE-2TEGAzo的核磁共振氢谱(1H NMR)图;
图7是本发明中的TPE-2AzoMA的核磁共振氢谱(1H NMR)图;
图8是本发明中水凝胶中交联剂(TPE-2AzoMA)含量对水凝胶溶胀比的关系图(PEGMA:AAc=1:1);
图9是本发明中水凝胶中两单体PEGMA与AAc比例与水凝胶溶胀比关系图(交联剂摩尔含量0.5%);
图10是本发明中水凝胶P(PEGMA-co-AAc)的红外谱图;
图11是本发明中水凝胶P(PEGMA-co-AAc)在Na2S2O4(0.5mg/mL)下随时间变化的荧光图谱;
图12是本发明中牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲溶液(pH=7.4)标准曲线;
图13是本发明中包载了BSA的P(PEGMA-co-AAc)水凝胶在有/无Na2S2O4条件下对药物的释放曲线;
图14是本发明中包载了BSA的P(PEGMA-co-AAc)水凝胶在Na2S2O4还原下的荧光图谱(激发波长:360nm);
图15为包载了BSA的P(PEGMA-co-AAc)水凝胶还原1h和24h后在365nm紫外光照下的照片。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
本发明所合成的小分子结构通过核磁表征;所合成的聚合物水凝胶结构通过红外光谱表征;还原过程中聚合物水凝胶的荧光变化通过荧光光谱跟踪测试;还原过程中聚合物水凝胶的药物释放通过紫外-可见光谱表征。
具体实施例中性能测试方法如下:
1.核磁氢谱(1H NMR)是通过Bruker 300MHz核磁仪,四甲基硅烷(TMS)为内标,将测试样品以CDCl3(或氘代DMSO)为溶剂溶解后进行测试;
2.傅里叶红外变换光谱(FT-TR)测试是用Bruker TENSOR-27FT-IR测试,KBr压片法测试;
3.紫外-可见吸收光谱在UV-2600紫外可见光谱仪(Shimadzu,(Nakagyo-ku,Kyoto,Japan))25℃下进行测定;
4.荧光发射光谱采用Hitachi F-4600型荧光光度计测试得到。
实施例一
基于偶氮苯还原响应性的交联剂的制备方法,包括以下步骤:
1.TPE-2OH的合成:
向500mL干燥三颈瓶中,加入锌粉(45.63g,0.70mol)和4-羟基二苯甲酮(34.75g,0.175mol),加入约300mL干燥THF溶解,置于冰浴中通氩气搅拌。向混合液中缓慢滴加四氯化钛(46.20mL,0.42mol),滴加结束后冰浴中继续反应0.5h后恢复室温再反应0.5h。后转入油浴锅逐步升温至回流。24h后,停止反应,恢复室温,抽滤,旋蒸浓缩,倒入10wt%碳酸钾溶液中搅拌,产生大量固体,抽滤得黄色滤液。滤液干燥浓缩,使用柱层析提纯(淋洗剂:石油醚/乙酸乙酯(V:V)=2:1)得淡黄色固体TPE-2OH,产率约82.5%;附图1是本发明TPE-2OH的核磁共振氢谱(1H NMR)图。
2.TEG-OTs的合成:
称取三缩四乙二醇(43.0g,240.0mmol)和三乙胺(10.0mL,72.0mmol)于250mL圆底烧瓶中,并加入DMAP(0.58g,4.80mmol)以及30mL干燥的二氯甲烷。混合液置于冰浴冷却至0℃,逐滴加入对甲基苯磺酰氯(9.2g,48.0mmol)(溶于30mL干燥的二氯甲烷)。滴加完后逐渐升温至室磁力搅拌6h。反应结束,水洗三次后有机层用无水硫酸钠干燥。旋蒸浓缩,柱层析分离提纯,洗脱剂为乙酸乙酯。产物为无色油状液体。产率75.3%;附图2是本发明TEG-OTs的核磁共振氢谱(1H NMR)图。
3.TPE-2TEGOH的合成:
称取TPE-2OH(1g,2.74mmol),碳酸铯(2.68g,8.23mmol),TEG-OTs(2.39g,6.86mmol)及20mL的无水DMF于100mL的圆底烧瓶中,置于50℃的恒温油浴锅中,氩气氛围下搅拌过夜。反应结束后,将反应液滴入大量水中,用乙酸乙酯进行萃取。得到的有机相用饱和氯化铵溶液洗涤4-5次,水洗3次,然后用无水硫酸钠干燥有机相,浓缩,旋蒸,柱层析提纯。产率:81.2%;附图3是本发明TPE-2TEGOH的核磁共振氢谱(1H NMR)图。
4.TPE-2TEGOTs的合成:
称取TPE-2TEGOH(1.5g,2.09mmol),三乙胺(1.06g,10.46mmol)及催化剂DMAP(25.56mg,0.2mmol)于100mL的圆底烧瓶中,加入20mL的无水二氯甲烷使其溶解后置于冰浴冷却待用。将对甲苯磺酰氯(997.3mg,5.23mmol)溶解在少量无水二氯甲烷中并缓慢滴加至上述溶液,滴加过程始终保持0℃左右。滴加完毕,继续搅拌5min后恢复室温反应。薄板层析跟踪反应进度,反应约6h后结束,除不溶性铵盐,浓缩滤液,柱层析提纯,旋蒸浓缩,真空干燥;产品为淡黄色粘稠状,产率:79.1%;附图4是本发明TPE-2TEGOTs的核磁共振氢谱(1HNMR)图。
5.Azo-OH的合成:
称取对氨基苯甲醇(2.0g,16.2mmol)于30mL的冰水中,加入34mL的浓盐酸进行搅拌。其间,称取亚硝酸钠(1.17g,17mmol)溶解在8mL的水中,冷却至0℃后,逐滴加入上述溶液。滴加完毕,在0℃条件下继续搅拌约1h。将苯酚(1.6g,17mmol)和碳酸钾(3.14g,22.7mmol)溶解在25mL的水中,冷却至0℃后,逐滴加入上述混合溶液,保持0℃,薄板层析跟踪反应。搅拌约1.5h后反应停止,用乙酸将反应体系的pH调节至4-5,直至析出红褐色沉淀。抽滤沉淀,用大量水和少量甲醇冲洗,60℃烘箱烘干,无需进一步提纯。产率:91.8%;附图5是本发明Azo-OH的核磁共振氢谱(1H NMR)图。
6.TPE-2TEGAzo的合成:
称取TPE-2TEGOTs(1.50g,1.46mmol),Azo-OH(0.73g,3.22mmol)及碳酸铯(1.19g,3.66mmol)于50mL的圆底烧瓶中,加入20mL的无水DMF后置于50℃的恒温油浴锅中搅拌使原料溶解,氩气氛围下反应过夜。反应结束后,将反应液滴入大量水中,用乙酸乙酯进行萃取。得到的有机相用饱和氯化铵溶液洗涤4-5次,水洗3次,然后用无水硫酸钠干燥有机相,浓缩,旋蒸,柱层析提纯。产率:78.3%;附图6是本发明TPE-2TEGAzo的核磁共振氢谱(1H NMR)图。
7.TPE-2AzoMA的合成:
称取TPE-2TEGAzo(1.30g,1.14mmol)和三乙胺(463mg,4.57mmol)于50mL的三颈烧瓶中,加入15mL的无水THF搅拌使其溶解,置于冰浴中冷却。将量取的甲基丙烯酰氯(358mg,3.43mmol)用5mL无水THF稀释,0℃下用恒压滴液漏斗缓慢滴加至上述混合溶液中,氩气氛围下搅拌10min。滴加完毕,恢复室温继续搅拌6h。产率:84.2%;附图7是本发明中交联剂TPE-2AzoMA的核磁共振氢谱(1H NMR)图。
实施例二
具有偶氮苯还原响应性的水凝胶荧光探针的制备方法,包括以下步骤:
在10mL的安培瓶中加入一定比例的PEGMA(500g/mol)和AAc,实施例一制备的交联剂TPE-2TEGAzoMA,引发剂AIBN以及溶剂DMF。其中,PEGMA和AAc的摩尔比为1-8:1,基于偶氮苯的交联剂占PEGMA和AAc总摩尔数的0.005-0.03,AIBN占PEGMA和AAc总摩尔数的0.002。混合均匀后,通氮气除氧后封管,置于70℃的油浴锅中反应约5h取出,倒置反应瓶无液体流下,即得到具有偶氮苯还原响应性的聚合物P(PEGMA-co-AAc),其合成路线如下:
以THF为溶剂,通过脂肪索氏提取法对聚合物P(PEGMA-co-AAc)提纯24h以除去残留的反应物及溶剂DMF。将提纯后的凝胶放置室温下12h后置于40℃的真空烘箱中进行干燥除去THF,直至其重量不再发生变化,即可得到干凝胶。将干凝胶放在水或PBS中进行溶胀制备水凝胶。
对上述得到的水凝胶的性能做如下测试:
1.在PBS中溶胀比(SR)的测试
用电子分析天平称取一定质量的干凝胶置于缓冲溶液(PBS,pH=7.4)中,记下干凝胶初始质量Wd。溶胀期间定时更换PBS溶液,使凝胶达到吸水平衡后取出,用滤纸轻轻擦拭凝胶表面水分后,立即称重,记为Ws。
溶胀比(SR)的计算公式(1)如下:
其中,Ws为凝胶溶胀后的质量;Wd为干凝胶的初始质量。
图8为本发明中不同交联剂用量对水凝胶溶胀比的关系图。其中,PEGMA:AAc的摩尔比为1:1。由图可知,随着交联剂含量的增加,水凝胶的溶胀比不断减小。原因有两点:第一,高度交联的水凝胶具有更紧密的结构,交联阻碍了聚合物链的流动性,与交联率较低的水凝胶相比,膨胀较小。其二,聚合物的化学结构也会影响水凝胶的膨胀率。与疏水凝胶相比,亲水凝胶的膨胀程度更高。凝胶网络中疏水基团在有水存在的情况下会聚集紧绷,从而使它们与水分子的接触最小化。因此,交联剂(含有四苯基乙烯和两个偶氮苯疏水基团)含量越高的水凝胶膨胀率越低,即溶胀比越小。
水凝胶中含有的PEGMA与AAc比例对其溶胀比同样具有一定的影响,如图9为交联剂含量固定为单体摩尔量0.5%的条件下,PEGMA与AAc比例对凝胶溶胀比的关系图。如图所示,PEGMA与AAc摩尔比为1:1、2:1、3:1、6:1、8:1,随着PEGMA含量比例的增加,凝胶的溶胀比越大,这是由于PEGMA的亲水性更好的原因。但两者的比例同样对凝胶的pH响应具有一定影响,故合适的比例应既要具有一定良好的溶胀比还要有较明显的pH依赖性。
2.结构表征
取一小块干凝胶,用四氢呋喃进行溶胀,保证其充分溶胀的状态下与溴化钾一起研磨,并在干燥灯下烘几分钟后,压片,通过傅里叶红外光谱仪进行红外测试。
图10是本发明中凝胶P(PEGMA-co-AAc)的红外谱图。如图所示,2882cm-1和951cm-1处分别为聚丙烯酸上羟基的伸缩振动和变形振动引起的吸收峰,1735cm-1处为聚乙二醇甲基丙烯酸酯的酯羰基的吸收峰,1115cm-1处为聚乙二醇的醚键吸收峰。表明了同时含有AAc和PEGMA-500水凝胶的成功制备。
3.在连二亚硫酸钠(Na2S2O4)作用下的还原降解
取质量约为4mg的干凝胶,置于含有3mL的0.5mg/mL的Na2S2O4-PBS缓冲溶液的比色皿中,氩气鼓泡除氧10min,加入一微量搅拌子后密封比色皿,置于37℃的恒温水浴槽中,设置搅拌速度为300rpm。设定一定时间间隔(0h、6h、8h、10h、12h、24h、48h),通过荧光分光光度计进行荧光测试(激发波长:360nm,激发/发射狭缝宽度均为10nm)。
图11是本发明中水凝胶P(PEGMA-co-AAc)在0.5mg/mL Na2S2O4的PBS缓冲溶液中随时间变化的荧光图谱。如图所示,随着反应时间的延长,溶液中荧光强度显著增强。而且后期荧光强度的变化明显高于前期,是因为在Na2S2O4作用下,P(PEGMA-co-AAc)中的偶氮键发生断裂,凝胶降解,交联剂中的TPE衍生物脱离凝胶在PBS缓冲液中重新聚集,荧光被激活,同时,交联程度降低进而增大了凝胶的溶胀比,使Na2S2O4更容易进入网络空格接近降解位点,降解程度相应越大,因此后期荧光强度的变化明显高于前期。此外,图11表明,P(PEGMA-co-AAc)水凝胶与Na2S2O4共混24h可以将聚合物凝胶中的偶氮苯基本完全还原,凝胶完全降解,荧光得到极大的增强。以上结果表明本发明聚合物可制备偶氮苯还原响应性的聚合物水凝胶荧光探针。本发明的上述技术方案改变了以往利用水凝胶的溶胀程度及其自身重量的变化来评价凝胶降解程度的方法。
实施例三包载牛血清白蛋白(BSA)水凝胶的制备
将19.2mg实施例二制备的聚合物P(PEGMA-co-AAc)干凝胶浸泡在含有5mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液中,使其达到溶胀平衡时,取出凝胶,用少量高纯水洗涤凝胶表面,然后置于40℃的烘箱中进行干燥,直至重量不再发生变化,即可得到载药干凝胶。
分别通过荧光分光光度计便捷有效地检测荧光特征峰和紫外-可见分光光度计检测干凝胶的载药率,也可以通过BSA的紫外吸收峰的变化可有效地监测药物释放情况,方法如下:
(1)BSA标准曲线的测定:
配制浓度为1mg/mL的BSA缓冲溶液,吸取3mL于比色皿中进行紫外测试,记录其280nm处的吸光度(A)。测试完毕,吸出1.5mL溶液,同时加入1.5mL新鲜的PBS缓冲溶液,即得到0.5mg/mL的BSA缓冲溶液,以同样方法测试出浓度为0.25mg/mL,0.125mg/mL,0.0625mg/mL,0.03125mg/mL,0.0156mg/mL的BSA缓冲溶液在280nm处的吸光度。以BSA浓度为横坐标,各浓度的吸光度为纵坐标作图,制作标准曲线,如图12所示,标准曲线为y=0.6229x+0.0017,相关系数为R2=0.9998。取定量的剩余液(含清洗液)进行紫外测试得到吸光度A,通过已知的标准曲线计算出剩余的BSA含量,总量减去剩余的就是载药量。经计算,19.2mg干凝胶中可载入BSA1.52mg,即载药率为8%(w/w)。
(2)将负载了BSA的载药干凝胶与3mLNa2S2O4-PBS缓冲溶液(Na2S2O4的浓度为1mg/mL),置于37℃水浴中,保持避光,在设定的时间间隔内用荧光光谱仪测试凝胶被解离后溶液中的荧光变化及用紫外光谱仪监测模拟药物BSA的释放。由于凝胶溶胀的特点,使处于凝胶表面的偶氮键先被还原打断,交联剂含量越少,凝胶溶胀率越大,凝胶逐渐降解,交联剂中的TPE衍生物逐渐脱离凝胶在PBS缓冲液中重新聚集,导致荧光逐渐被激活。
图13是本发明中包载了BSA的水凝胶P(PEGMA-co-AAc)在1mg/mL的Na2S2O4-PBS溶液中对BSA的释放曲线(图中实验组),并按照步骤(2)的方法,将负载了BSA的载药干凝胶与不含Na2S2O4的PBS缓冲液做同样实验,以其作为对照组。由图可得,两组凝胶在前期段都表现出了一定的暴释现象,这是由于凝胶的溶胀使其包载在表面的药物得到释放造成的。在经历48h的Na2S2O4还原作用下,水凝胶的药物释放率可达到81%,而同样时间下对照组的水凝胶药物释放率为48.3%左右。同样,在凝胶降解不断释放药物的同时,溶液及凝胶的荧光强度均在逐渐增强。
图14是本发明中包载了BSA的水凝胶在Na2S2O4还原下随时间变化的荧光光谱图。如图所示,与之前未包载BSA凝胶降解的荧光图谱(图11)相比,在410nm处出现了荧光衍射峰,且四苯基乙烯衍生物的荧光发射峰发生了蓝移的现象。原因可能是溶液中含有的物质(Na2S2O4、BSA及降解后的产物)对TPE发射影响造成的。从图15也可以证明由于水凝胶的降解而引起的荧光增强的变化:a、b分别为水凝胶还原1h、24h后在365nm紫外光照下的荧光照片。起初,Na2S2O4只还原了凝胶的外部,所以只有凝胶表面发射出蓝色荧光;随着时间延长,凝胶外部逐渐被降解,Na2S2O4进入凝胶内部使更多的偶氮键被还原,破坏了FRET效应,四苯基乙烯荧光恢复,故凝胶整体具有较强荧光的发射。
相对于组装体胶束,聚合物水凝胶可以为药物、多肽,特别是蛋白质提供理想的保护,使其免受释放位点附近潜在恶劣环境的影响,本发明的基于偶氮还原响应的聚合物可用于制备蛋白质或肽的口服递送载体。因此,开发基于偶氮苯还原响应性的聚合物水凝胶荧光探针具有广阔的应用前景。到目前为止,基于偶氮苯还原响应的药物控释聚合物水凝胶荧光探针鲜有报道。本发明获得的基于偶氮苯还原响应的聚合物水凝胶,通过连二亚硫酸钠模拟的结肠环境,实现了凝胶的降解,并伴随着溶液荧光的增强,是一种具有偶氮还原响应性的荧光探针;凝胶通过浸泡溶胀法可以进行药物的包载,包载药物的聚合物水凝胶在连二亚硫酸钠作用下被还原降解,因而释放药物;同时随着药物释放荧光被激活并逐渐增强。因此,此聚合物水凝胶不仅具有荧光探针功能,同时可以用作药物载体,可以有效地追踪、监测药物释放的过程,从而实现药物在结肠中可控和靶向释放,是一种潜在的结肠定位药物控释载体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于偶氮苯的交联剂,其特征在于,其结构式如式(I)所示:
2.一种权利要求1所述的基于偶氮苯的交联剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将式(1)的化合物TPE-2OH与式(2)的化合物TEG-OTs在碱金属盐的作用下,在有机溶剂中于50-80℃下反应,反应完全后得到式(3)的化合物TPE-2TEGOH;
(2)将式(3)的化合物TPE-2TEGOH与对甲苯磺酰氯在有机胺的作用下,在有机溶剂中于0-25℃下反应,反应完全后得到式(4)的化合物TPE-2TEGOTs;
(3)将式(4)的化合物TPE-2TEGOTs与式(5)的化合物Azo-OH在碱金属盐的作用下,在有机溶剂中于50-80℃下反应,反应完全后得到式(6)的化合物TPE-2TEGAzo;
(4)将式(6)的化合物TPE-2TEGAzo与甲基丙烯酰氯在有机胺的作用下,在有机溶剂中于0-25℃下反应,反应完全后得到式(I)的化合物TPE-2AzoMA;其中,式(1)-(6)的结构式如下:
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:在步骤(1)和步骤(3)中,碱金属盐为碳酸铯和/或碳酸钾。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:在步骤(2)和步骤(4)中,有机胺为三乙胺。
5.一种偶氮苯还原响应性聚合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
在惰性气氛保护下,在权利要求1所述的基于偶氮苯的交联剂的作用下,以热引发剂引发聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体聚合反应,反应在有机溶剂中进行,聚合温度为50-70℃,反应完全后得到所述偶氮苯还原响应性聚合物。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体的摩尔比为1-8:1;所述基于偶氮苯的交联剂占聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体总摩尔量的0.005-0.03,所述引发剂的占聚乙二醇类单体和丙烯酸类单体总摩尔量的0.002。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:所述聚乙二醇类单体为甲氧基聚乙二醇甲基丙烯酸酯;所述丙烯酸类单体为丙烯酸或甲基丙烯酸。
8.一种权利要求5-7中任一项所述的制备方法所制备的偶氮苯还原响应性聚合物,其特征在于,其结构通式如式(II)所示:
其中,R为甲基或氢,m+n=1,p=0.005-0.03,q=7-19。
9.权利要求8所述的偶氮苯还原响应性聚合物在制备水凝胶荧光探针中的应用。
10.权利要求8所述的偶氮苯还原响应性聚合物在制备抗癌药物或结肠定位药物控释载体中的应用。
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