CN108752594A - 基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物及其制备方法与应用，首先制备出连接偶氮苯TPE小分子（TBS‑TPE‑Azo），由于偶氮苯基团对荧光的淬灭作用，使TPE的AIE荧光处于休眠状态。通过CuAAC点击反应，将小分子中的TPE‑Azo基团连接到PEG和PCL的中间，得到AIE休眠的两亲性嵌段聚合物PCL‑TPE‑Azo‑PEG。本发明首次公开了基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物荧光探针。两亲性聚合物能够自组装形成胶束，含偶氮苯两亲性聚合物胶束在偶氮还原酶的作用下可发生解离导致药物释放，同时又能实现荧光从无到有的荧光响应。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚合物材料，尤其涉及一种在偶氮还原剂或偶氮还原酶作用下既能实现药物释放又同时能实现荧光探针作用的两亲性嵌段聚合物。
背景技术
为了使材料具有更加通用的动态变化性能，在过去几十年中，智能响应型材料应运而生。响应型材料是一类在外界环境微小刺激因素作用下，自身的某些物理或化学性质会发生相应的可逆或不可逆变化的材料。常见的刺激因素有光、温度、pH、离子强度、氧化还原、酶、电场和磁场等，基于这些多样的响应性而设计的智能材料已广泛地应用于各个领域，尤其一些生物响应性材料已经被广泛地应用于药物可控释放, 成像造影剂，基因和生物活性分子的载体等领域。
酶在生命体中发挥着重要的作用。在病变细胞和组织内，许多酶的含量比正常情况下要高的多并且有非常高的活性。根据这一特征，可以利用特定位点的酶响应来实现药物的传输与可控释放。近年来，有关酶响应和控制的药物传输及释放研究引起了广大科研工作者的关注。典型的用于药物输送响应的酶有蛋白酶、磷脂酶、氧化还原酶等。当前流行的策略是在生理条件下，载体（如聚合物组装体）在酶或者酶促产物的作用下解离或发生结构的重排或断裂达到释放药物的目的。药物负载可以通过将药物共价连接到聚合物上实现药物包裹，更为常用的方法是将药物物理封装在纳米组装体内。
众所周知，人类结肠内有多种微生物和细菌，其中大多数是厌氧菌（人体内含量：1010-1012/每克消化道内容物）。这些菌群能够分泌出大量的酶液，如β-糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、硝基还原酶、硝酸还原酶和偶氮还原酶。基于偶氮还原酶主要存在于结肠中并发挥着重要的作用，引起了研究者的关注，一系列具有结肠靶向治疗的药物，如5-氨基水杨酸（5-ASA）相继被开发出来，并已应用于临床。
荧光探针作为一种高效灵敏的生物光学探测器，在生物成像和生物传感应用领域显示了重要地位。而基于酶响应的荧光探针的出现又为酶的识别、细胞分类、跟踪新陈代谢历程及细胞调控/繁殖、药物传送与生物成像提供了一种有力的研究手段并具有广泛的应用前景。现有技术报道了一种基于偶氮还原酶响应性的二聚物荧光探针（4-二甲氨基偶氮苯甲酰-2-单酰-肌醇-1,3,5-原甲酸酯），加入偶氮还原酶后，该二聚物中的偶氮键被破坏，体系发射的荧光逐渐增强；又报道了一种含有偶氮桥键的偶氮还原酶荧光探针（2,4-二单酰-6,7-二氮杂二环-6-烯），当加入含有偶氮还原酶的梭状芽孢杆菌细胞后，分子中的偶氮桥键被还原断裂，分子荧光增强。
两亲性聚合物能够自组装形成胶束。含偶氮苯两亲性聚合物胶束在偶氮还原酶的作用下可发生解离导致药物靶向运输。近年来基于偶氮还原酶响应的两亲性聚合物由于其很好的生物应用潜力引起关注。同时相对于小分子，聚合物大的分子尺寸可以有效减少探针分子的吸收，并且聚合物具有较高的负载量。因此，开发基于酶响应的大分子荧光探针具有广阔的应用前景。到目前为止，基于偶氮苯还原酶响应的药物控释聚合物荧光探针鲜有报道。
发明内容
本发明公开了一种在偶氮还原酶作用下既能实现药物释放又同时能实现荧光探针作用的两亲性嵌段聚合物及其制备方法与应用。
本发明采用如下技术方案：
一种基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物，所述基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物（PCL-TPE-Azo-PEG）的结构通式如下：
其中，50≤m≤200，10≤n≤50。
到目前为止，基于偶氮苯还原酶响应的两亲性聚合物荧光探针鲜有报道。本发明公开了基于偶氮苯还原酶响应的聚合物荧光探针，此聚合物为两亲性嵌段共聚物，由偶氮苯连接的四苯基乙烯（TPE）作为桥梁，连接亲水链段聚乙二醇（PEG）和疏水链段聚己内酯(PCL)。其中，TPE 是一个典型的AIE（Aggregation-Induced Emission）型荧光分子。此两亲性聚合物在PB（磷酸缓冲液）溶液中（pH=7.4）能组装成纳米粒子并包裹药物。虽然TPE被包裹在组装体核内，但由于偶氮苯基团对荧光的淬灭作用，此时TPE的AIE荧光处于休眠状态，几乎无荧光。当在胶束溶液中加入偶氮还原剂（如Na2S2O4）或偶氮还原酶，偶氮键(-N=N-)被还原断开，组装体发生解离，聚合物被分离成PEG链和PCL链，PEG链溶于溶液中，而疏水PCL链在溶液中形成新的聚集体，由于偶氮键断开后TPE基团连接在PCL链上因而被包裹在聚集体内，并且偶氮苯基团对荧光的淬灭已消除，因此，其AIE效应被激活，荧光随之逐渐增强。将药物包裹在聚合物胶束内，随着胶束解离，药物逐渐被释放，并且随着药物释放荧光逐渐增强。通过荧光强度的变化可以监测药物释放过程。偶氮还原酶主要存在人体的结肠中，因此，本发明两亲性嵌段共聚物是一种潜在的结肠定位药物控释载体。
本发明公开了一种基于偶氮还原酶响应的聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛加入到四氢呋喃中，反应得到1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯（TPE-2OH）；
（2）将TPE-2OH 与叔丁基二甲基硅基（TBS）保护的溴丙炔进行反应得到TBS-TPE-OH；
（3）将TBS-TPE-OH溶于四氢呋喃中，加入氢氧化钠调节pH为8-10，然后在冰浴条件下滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐，进行偶联反应，得到AIE休眠的小分子荧光探针TBS-TPE-Azo；
（4）将TBS-TPE-Azo与mPEG-N3在CuI催化剂作用下进行CuAAC反应得到 TBS-TPE-Azo-PEG，然后脱去保护基团TBS，得到基于偶氮还原酶响应的聚合物。
本发明还公开一种基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛加入到四氢呋喃中，反应得到1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯（TPE-2OH）；
（2）将TPE-2OH 与叔丁基二甲基硅基（TBS）保护的溴丙炔进行反应得到TBS-TPE-OH；
（3）将TBS-TPE-OH溶于四氢呋喃中，加入氢氧化钠调节pH为8-10，然后在冰浴条件下滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐，进行偶联反应，得到AIE休眠的小分子荧光探针TBS-TPE-Azo；
（4）将TBS-TPE-Azo与mPEG-N3在CuI催化剂作用下进行CuAAC反应得到 TBS-TPE-Azo-PEG，然后脱去保护基团TBS，得到端基为炔基的AIE休眠的大分子荧光探针TPE-Azo-PEG；
（5）将TPE-Azo-PEG与端基为叠氮基团的聚己内酯进行CuAAC反应，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物PCL-TPE-Azo-PEG。
上述基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物（PCL-TPE-Azo-PEG）的合成路线如下：
上述技术方案中，将聚乙二醇单甲醚（mPEG）将其端基修饰为叠氮基团，得到mPEG-N3；通过己内酯的开环聚合得到预先设定分子量的聚己内酯（PCL），将其端基修饰为叠氮基团，得到端基为叠氮基团的聚己内酯，反应式示意如下：
本发明还公开了基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛加入到四氢呋喃中，反应得到1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯（TPE-2OH）；
（2）将TPE-2OH 与叔丁基二甲基硅基（TBS）保护的溴丙炔进行反应得到TBS-TPE-OH；
（3）将TBS-TPE-OH溶于四氢呋喃中，加入氢氧化钠调节pH为8-10，然后在冰浴条件下滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐，进行偶联反应，得到AIE休眠的小分子荧光探针TBS-TPE-Azo；
（4）将TBS-TPE-Azo与mPEG-N3在CuI催化剂作用下进行CuAAC反应得到 TBS-TPE-Azo-PEG，然后脱去保护基团TBS，得到端基为炔基的亲水链段TPE-Azo-PEG；
（5）将TPE-Azo-PEG与端基为叠氮基团的聚己内酯进行CuAAC反应，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物PCL-TPE-Azo-PEG；
（6）向基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物溶液中滴加PB缓冲溶液，搅拌后透析，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束。
本发明还公开了基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛加入到四氢呋喃中，反应得到1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯（TPE-2OH）；
（2）将TPE-2OH 与叔丁基二甲基硅基（TBS）保护的溴丙炔进行反应得到TBS-TPE-OH；
（3）将TBS-TPE-OH溶于四氢呋喃中，加入氢氧化钠调节pH为8-10，然后在冰浴条件下滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐，进行偶联反应，得到AIE休眠的小分子荧光探针TBS-TPE-Azo；
（4）将TBS-TPE-Azo与mPEG-N3在CuI催化剂作用下进行CuAAC反应得到 TBS-TPE-Azo-PEG，然后脱去保护基团TBS，得到端基为炔基的亲水链段TPE-Azo-PEG；
（5）将TPE-Azo-PEG与端基为叠氮基团的聚己内酯PCL-N3进行CuAAC反应，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物PCL-TPE-Azo-PEG；
（6）向含有基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物以及药物的溶液中滴加PB缓冲溶液，搅拌后透析，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束。
本发明包括以下步骤：
（1）合成AIE休眠型的TPE-azo类小分子荧光探针；
（2）通过 “Click”反应制备一类TPE-azo基团处于亲/疏水聚合物链连接点的两亲性聚合物。
之后将其进行自组装，过程如下：将1.0- 5.0mg聚合物溶于1 mL DMF中，配成一定浓度的溶液，然后向其中缓慢滴加4 mL的PB缓冲溶液（pH=7.4, 50 mM），搅拌过夜后，通过透析法，于透析袋(MWCO 3500)中，用PB 溶液透析 24 小时，除去有机溶剂，得到聚合物的胶束PB溶液，优选亲疏水聚合物的链段比为5/3的嵌段聚合物PCL3k-TPE-Azo-PEG5k来进行的研究。
将基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物和药物比如阿霉素共同溶解在DMF中，配成一定浓度的溶液，通过上述相同的自组装方法，制备得到聚合物载药胶束PB溶液。
将上述载药胶束PB溶液保持避光避氧环境并置于37℃水浴中，在溶液中加入还原剂（Na2S2O4）后，处于胶束核壳界面的偶氮键被逐渐打断，胶束逐渐解离，聚合物分离成PEG段（溶于溶液）和PCL段，连接TPE的PCL段在PB溶液中形成聚集体，TPE的AIE逐渐被激活。这一过程可通过使用荧光分光光度计便捷有效地检测四苯基乙烯荧光特征峰和模拟药物荧光特征峰的变化有效地监测药物释放情况。同时使用透射电子显微镜（TEM）观察组装体在还原前后形貌的变化，动态光散射（DLS）测试组装体粒径尺寸和分布的证明，紫外-可见光谱监测TPE-偶氮苯的吸收峰强度变化对药物释放过程作进一步证明。
本发明的方法，首先制备出连接偶氮苯TPE小分子（TBS-TPE-Azo），由于偶氮苯基团对荧光的淬灭作用，使TPE的AIE荧光处于休眠状态。通过CuAAC点击反应，将小分子中的TPE-Azo基团连接到PEG和PCL的中间，得到AIE休眠的两亲性嵌段聚合物PCL3k-TPE-Azo-PEG5k。将聚合物和抗癌药物通过溶液自组装形成包裹药物的纳米粒子。模拟人体环境，在还原剂（Na2S2O4）作用下，处于PEG和PCL连接处的偶氮键断开，导致组装体解离，聚合物被分离成PEG链段和PCL链段，PEG溶于溶液，PCL则形成聚集体，由于偶氮键断开后TPE基团连接在PCL链上因而被包裹在新的聚集体内，并且偶氮苯基团对荧光的淬灭已消除，休眠的AIE效应被激活。因此，加入还原剂后胶束溶液产生荧光并随着时间逐渐增强，包裹的药物也逐渐被释放。通过用荧光光谱测试在偶氮还原剂或偶氮还原酶作用下荧光强度的变化可以监测药物释放过程。偶氮还原酶主要存在人体的结肠中，因此，此两亲性嵌段聚合物是一种潜在的结肠定位药物控释载体。
本发明进一步公开了上述制备方法制备的基于偶氮还原酶响应的聚合物、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束；同时公开了上述基于偶氮还原酶响应的聚合物、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束在制备偶氮本还原酶响应的荧光探针中的应用，或在制备偶氮本还原酶响应的药物中的应用，或者上述基于偶氮还原酶响应的聚合物、基于偶氮还原酶响应的聚合物、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束在制备偶氮本还原酶响应药物的载体中的应用。
上述技术方案中，4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛的质量比为3:2:（3~4）；1,2-二对羟基苯基-1,2-二苯基乙烯、叔丁基二甲基硅基保护的溴丙炔的质量比为（3~5）:2；TBS-TPE-OH、对氨基苯丙炔醚的重氮盐的质量比为（3~4）:1；TBS-TPE-Azo、mPEG-N3的质量比为（13~16）:100；TPE-Azo-PEG、PCL-N3的质量比为5:（1～10）。
上述技术方案中，步骤（1）中，反应为回流反应20～28小时；步骤（2）中，反应为回流反应50～80分钟；步骤（3）中，偶联反应为冰盐浴反应100～150分钟；步骤（4）中，反应为60℃反应20～28小时；步骤（5）中，反应为60℃反应20～28小时。
本发明具有以下优点：
本发明首次公开了基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物荧光探针。两亲性聚合物能够自组装形成胶束，含偶氮苯两亲性聚合物胶束在偶氮还原酶的作用下可发生解离导致药物释放，同时又能实现荧光从无到有的荧光响应。
到目前为止，基于偶氮苯的酶响应聚合物的荧光探针还鲜有报道。本发明利用“Click”化学的高效，将连接了偶氮苯的TPE类AIE休眠小分子（TPE-Azo）引入到结构精致的两亲性聚合物中间，高效地制备一种基于偶氮苯还原酶刺激响应型聚合物荧光探针。
基于上述所获聚合物，进一步对聚合物的应用性能展开以下研究：通过溶液自组装制备结构稳定的聚合物胶束；利用聚合物胶束能在偶氮还原剂或还原酶作用下被破坏分解并且荧光被激活和逐渐增强的特点，进一步地将聚合物作为包裹药物的载体进行药物包裹和释放，通过荧光变化跟踪药物释放过程。
本发明旨在通过上述研究，设计并构建新颖和高效的基于酶响应的聚合物荧光探针检测体系和药物释放体系，拓展偶氮苯类聚合物在生物传感、载药和细胞标记等领域中的应用，为结肠定位药物控释载体和疾病诊断提供必要的理论依据，填补该研究领域的空白。
本发明所合成的小分子结构通过核磁、元素分析和高效液相色谱表征；所合成的聚合物结构通过核磁、凝胶色谱、红外光谱表征；所制备的聚合物胶束和包裹药物的聚合物胶束的形貌和尺寸以及还原前后变化通过透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）详细表征；还原前后聚合物胶束的AIE荧光变化通过荧光光谱跟踪测试；还原前后聚合物的结构变化通过紫外-可见光谱表征。
附图说明
图1是本发明中的1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯(TPE-2OH)的核磁共振氢谱（1H NMR）图；
图2是本发明中的TBS-TPE-OH的核磁共振氢谱（1H NMR）图；
图3是本发明中的TBS-TPE-Azo的核磁共振氢谱（1H NMR）图；
图4是本发明中TBS-TPE-Azo和TBS-TPE-OH的THF溶液和THF/水混合溶液（浓度均为5×10-5 mol L-1）当含水量达到90%时荧光发射图谱（激发波长为380nm）；
图5是本发明中TBS-TPE-Azo-PEG的核磁共振氢谱（1H NMR）图；
图6是本发明中PCL-N3, TPE-Azo-PEG和PCL-TPE-Azo-PEG的排阻色谱（SEC）流出曲线；
图7是本发明中PCL-N3, TPE-Azo-PEG和PCL-TPE-Azo-PEG的红外光谱（FT-TR）图；
图8是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG的核磁共振氢谱（1H NMR）图；
图9是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG组装体还原前后的透射电子显微镜（TEM）图像和动态光散射（DLS）粒径分布图。（a）还原前；（b）还原后；
图10是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG组装体PB溶液（浓度为0.1 mg mL-1）还原前后荧光发射图谱荧光强度变化图谱（激发波长为360nm）；
图11是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG组装体PB溶液（浓度为0.1 mg mL-1）还原前后紫外/可见吸收光谱图；
图12是本发明中包载了DOX的PCL-TPE-Azo-PEG组装体PB溶液（浓度为0.5 mg mL-1）还原前后荧光强度变化图谱（激发波长为360nm）；
图13是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG组装体在还原剂存在下药物释放结果；
图14是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG组装体PB溶液的细胞毒性测试结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方法作进一步详细描述。
本发明合成基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物荧光探针的制备方法主要如下：
（1）选用带有酚羟基TPE，通过重氮偶合反应，得到AIE型休眠的荧光小分子TBS-TPE-Azo；
（2）将上述荧光小分子TBS-TPE-Azo与PEG5k-N3通过CuAAC高效反应连接在一起，得到亲水性链段TBS-TPE-Azo-PEG；
脱去TBS保护基团得到TPE-Azo-PEG；
（3）通过己内酯的开环聚合得到PCL，将其端基修饰为叠氮基团，得到疏水链段PCL-N3；将其与上述TPE-Azo-PEG进行CuAAC反应，得到TPE-Azo在亲/疏水链段PEG/PCL中间的目标产物：基于偶氮还原酶响应的两亲性聚合物荧光探针PCL-TPE-Azo-PEG。
具体实施例中性能测试方法如下：
1、核磁氢谱（1H NMR）是通过 Bruker 300 MHz 核磁仪，四甲基硅烷（TMS）为内标，将测试样品以CDCl3为溶剂溶解后进行测试；
2、聚合物数均分子量(M n)、重均分子量(M w)和分子量分布指数(M w/M n)使用装配有示差折光检测器和紫外检测器 TOSOH HLC-8320 凝胶色谱仪(SEC)上测定，采用两根TSKgelSuper Mutipore HZ-N (3 μm beads size)柱子串联，分子量范围为 500 至 190，000 g/mol，选用色谱纯 THF 作为流动相，流速为 0.35 mL/min，40℃下进行测试，以聚苯乙烯(窄分布)为标样对聚合物分子量进行校正；
3、傅里叶红外变换光谱（FT-TR）测试是用 Bruker TENSOR- 27 FT-IR 测试，KBr 压片法测试；
4、透射电子显微镜（TEM）采用 HITACHI HT7700 TEM，工作加速电压为 120 KV。
5、紫外−可见吸收光谱在 UV-2600 紫外可见光谱仪（Shimadzu, (Nakagyo-ku,Kyoto,Japan)）25℃下进行测定；
6、荧光发射光谱采用 Hitachi F-4600型荧光光度计测试得到。
实施例一
基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物荧光探针的制备，包括以下步骤：
1、1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯(TPE-2OH)的合成
在100mL干燥三颈瓶中，加入锌粉（0.1 mol）和4-羟基二苯甲酮（0.05 mol），加入约70mL干燥四氢呋喃溶解，置于冰盐浴中通氩气搅拌。向混合液中缓慢滴加四氯化钛7 mL（0.06mol），滴加结束后室温反应半小时。后转入油浴锅逐步升温至回流。24 h后，停止反应，恢复室温后，抽滤，旋蒸浓缩，倒入10 %碳酸钾溶液中搅拌，产生大量固体，抽滤得黄色滤液。滤液干燥浓缩，使用柱层析提纯（淋洗剂：石油醚/乙酸乙酯（V:V）= 3:1）得白色固体TPE-2OH。附图1是TPE-2OH的 1H NMR图谱。
2、TBS-TPE-OH的合成：将TPE-2OH（16.8 mmol） 和碳酸钾（18.5 mmol）加入到250mL三颈烧瓶中，加入150 mL丙酮作溶剂，加热至回流。然后将TBS保护的溴丙炔（10.09mmol）溶于10 mL丙酮中，逐滴注射至混合液中滴加结束，继续反应1 h。反应结束，恢复室温后抽滤，滤液旋蒸浓缩，使用柱层析提纯（淋洗剂：石油醚/乙酸乙酯（V:V）= 20: 1）得到TBS-TPE-OH。附图2是TBS-TPE-OH的1H NMR图谱。
3、TBS-TPE-Azo的合成：
在500mL单颈圆底烧瓶中加入对乙酰氨基酚（100 mL）、TBS保护的溴丙炔（130 mmol）、碳酸钾（200 mmol）、催化量的KI及200 mL丙酮，在80℃反应18 h，反应结束后，旋蒸除去大部分溶剂，加入200 mL去离子水，析出大量白色固体，抽滤，真空干燥。之后白色固体加入烧瓶中，并加入200 mL丙酮和盐酸混合液，加热回流12 h，反应结束恢复室温，加氢氧化钠水溶液中和至中性，混合液使用乙酸乙酯萃取，有机层使用无水硫酸镁干燥过夜后，过滤，旋蒸得到棕褐色的溶液，即为化合物4-炔丙氧基苯胺.
4-炔丙氧基苯胺溶液0.55 g置于小烧杯，加入2 mL水，并加入0.63 mL浓盐酸（37 %），加热搅拌溶解，冰盐浴降温。另取亚硝酸钠0.225 g，用5.0 mL去离子水溶解后，缓慢滴加上述溶液中，控制体系温度不超过5℃，滴加完成后继续反应1 h，得到对氨基苯丙炔醚重氮盐溶液。
称取TBS-TPE-OH（3.1 mmol）至25mL烧杯，并加入10mL THF溶解后冰盐浴降温；然后一边滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐溶液，一边滴加氢氧化钠水溶液保持pH 9。滴加结束后继续反应2 h，得到橘红色油状产物。乙酸乙酯萃取，干燥，旋蒸浓缩。柱层析（淋洗剂：石油醚/乙酸乙酯（V:V）= 25: 1- 20: 1）得TBS-TPE-Azo。
附图3是TBS-TPE-Azo的核磁共振氢谱。附图4分别是TBS-TPE-Azo和TBS-TPE-OH的THF溶液（浓度均为5 ×10-5 mol L-1）和THF/水混合溶液当水含量达到90%时的荧光发射图谱（初始THF溶液的浓度均为5 ×10-5 mol L-1），激发波长为360nm。
分别测试TBS-TPE-Azo在聚集状态和溶解状态下的荧光。通过图4可以看到，当TPE-2OH和TBS-TPE-Azo在THF溶解状态下，在475nm处均没有荧光发射；在溶液中加水，当含水量达到90%时，TPE-2OH的荧光强度大大增强，而TBS-TPE-Azo无荧光发射，证明连接在TPE上的偶氮苯淬灭了TPE的荧光。
4、TBS-TPE-Azo-PEG的合成：
PEG-OTs的合成：在50 ml的单颈圆底烧瓶中，将PEG5k (0.5 mmol)加入到含有三乙胺(20 mmol)的10 mL干燥的二氯甲烷中，冰浴下将对甲苯磺酰氯(2 mmol)用恒压滴液漏斗逐滴滴入到混合溶液中，电磁搅拌。滴加完毕后，将温度升高至55℃，继续反应12 h。反应结束后，用 NaHCO3 饱和溶液洗涤3次。接着向有机相中加入过量的无水Na2SO4干燥，充分搅拌后过滤，将滤液浓缩后逐滴加入到过量的无水乙醚中，得到对甲苯磺酰基封端的PEG5k，40℃真空干燥至恒重(2.3 g，产率：90 %)。
PEG-N3的合成：在100mL单颈圆底烧瓶中，加入20 ml干燥的N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，上述产物对甲苯磺酰基封端的PEG5k 0.2 mmol和叠氮化钠4 mmol。在85℃磁力搅拌下反应24 h。过滤除去未反应的叠氮化钠。将滤液减压蒸馏，得到淡黄色粗产物。将粗产物溶于20 mL二氯甲烷中，用蒸馏水洗3次。有机相用无水硫酸镁干燥4 h，过滤，浓缩滤液，将浓缩液缓慢滴加到冷的无水乙醚中，得到叠氮封端的PEG5k白色固体粉末PEG5k-N3，40℃真空干燥至恒重(885 mg，产率：89 %)。
先称取82 mg TBS-TPE-Azo和508 mg PEG5k-N3至20 mL聚合管中，加6 mL无水甲苯溶解，并加入38 mg五水硫酸铜和148 mg VcNa，冷冻抽氩气3次，封管，60℃反应24 h。停止反应后加少量THF稀释并加入吸铜树脂搅拌12 h，抽滤旋蒸除去大部分溶剂，滴加至过量冷的无水乙醚中，得TBS-TPE-Azo-PEG5k橘红色絮状沉淀，抽滤，干燥 (448 mg,产率: 76%,M n,SEC= 7800 Da, M w/M n =1.04)。附图5是本发明中的TBS-TPE- Azo -PEG5k的核磁共振氢谱（1H NMR）图。
5、TBS-TPE-Azo-PEG的TBS脱除
于10 mL安瓿瓶中加入100 mg TBS-TPE- Azo -PEG并用3 mL THF溶解，向其中滴加75微升TBAF/ THF，常温反应2 h，三氯甲烷稀释，并用水萃取。浓缩干燥至约2 mL，滴加至大量乙醚中沉降，冰冻，抽滤，真空干燥，得到TPE-Azo-PEG5k (96 mg, yield: 96%, M nSEC= 7400Da, M w/M n =1.02.)。
6、PCL的合成
采用乙醇为引发剂，辛酸亚锡为催化剂，ε-己内酯（ε-CL）开环聚合，合成PCL。将ε-CL(219 mmol), 辛酸亚锡(0.0365 mmol)和乙醇(2.19 mmol)置于干燥的 50 mL 聚合瓶中，充分搅匀后，抽真空10 min和充氩气约1 min交替进行，反复三次；最后一次抽真空30 min，结束后将聚合瓶置于100℃油浴中反应24 h。反应结束后，加入适量的四氢呋喃稀释粗产物，此后将其逐滴加入到过量的石油醚中进行沉淀，得到白色颗粒状产物。将产物置于40℃真空干燥箱中干燥至恒重得到PCL3k (2 g,产率: 80 %, M n,SEC= 4500Da, M w/M n =1.10)。
7、PCL-Br的合成
在25 mL单颈烧瓶中加入258 mg PCL3k和 239μL TEA，并溶于 6 mL干燥THF，冰浴降温，缓慢滴加213微升溴代异丁酰溴（并加入1.5 mL THF稀释），滴加结束后继续在冰浴中搅拌1 h，然后在室温反应12~24 h。反应液浓缩后逐滴加入到过量的石油醚中进行沉淀，得到白色颗粒状产物PCL3k-Br。
8、PCL-N3的合成
在25 mL单颈烧瓶中加入230 mg PCL3k-Br 和123 mg 叠氮化钠，并加入 7 mL干燥THF作为溶剂, 80℃搅拌反应24 h。反应停止后，直接滴加至无水甲醇中沉降得PCL-N3。
9、PCL-TPE-Azo-PEG的合成
称取TPE-Azo-PEG5k和PCL3k-N3与20 mL聚合瓶中，加6 mL无水甲苯溶解，并加入CuBr和PMDETA，冷冻-抽气-充氩气重复3次，封管，于60℃搅拌反应24 h。停止反应后加少量THF稀释并加入吸铜树脂搅拌12 h，抽滤旋蒸除去大部分溶剂，滴加至过量冷的无水乙醚中，抽滤干燥得橘红色絮状沉淀。经过制备级SEC纯化得到所需要分子量的PCL3k-TPE-Azo-PEG5k(产率: 28 %, M n,SEC= 12100 Da, M w/M n =1.02)，为基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物。
其中亲疏水链段的重复单元个数（m, n）可通过PCLm-TPE-Azo-PEGn的核磁氢谱图采用下列计算公式得到：
m = (I 2.2-2.4/2)/(I 6.7-6.8/3) 公式 1
n= (I 3.4-3.8/4)/(I 6.7-6.8/3) 公式 2
I 2.2-2.4: 谱图中 2.2-2.4 ppm 对应的聚己内酯重复单元-CH2-片段的质子峰；
I 3.4-3.8: 谱图中3.4-3.8 ppm 处对应的聚乙二醇单甲醚上重复单元-OCH2CH2O-片段的质子峰；
I 6.7-6.8: 谱图中6.7-6.8 ppm 处对应的PCLm-TPE-Azo-PEGn中TPE苯环上的的质子峰。
通过 SEC 流出曲线（图6）可以看出，所得到聚合物PCL3k-TPE-Azo-PEG5k的分子量较TPE-Azo-PEG5k和PCL3k-N3明显变化，增长到12100 Da。同时从附图7看出，在PCL3k-N3的红外图中可以观察到在 2100 cm-1出现叠氮特征峰，对应于叠氮基团 N≡N 的伸缩振动。而在PCL3k-TPE-Azo-PEG5k红外光谱图中，我们可以直接的观察到该特征峰的消失，说明PCL3k-N3已反应完全。通过核磁共振氢谱分析得到的PCL3k-TPE-Azo-PEG5k分子量为8900 Da，其中亲疏水的聚合物链段比例根据上述计算方法计算为5/3，符合所用的亲疏水聚合物的分子量比例。由此我们可以得出结论：PCL3k-TPE-Azo-PEG5k成功制得。
图6是本发明中PCL-N3, TPE-Azo-PEG和PCL-TPE-Azo-PEG的排阻色谱（SEC）流出曲线；图7是本发明中PCL-N3, TPE-Azo-PEG和PCL-TPE-Azo-PEG的红外光谱（FT-TR）图；图8是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG的核磁共振氢谱（1H NMR）图。
实施例二 基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物自组装与测试
1、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物在DMF/PB溶液中的自组装和表征
向1mL基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物的DMF溶液 ( 5mg/ mL)中缓慢加入PB缓冲溶液（50 mM，pH =7.4）4 mL后搅拌过夜，滴加完毕后转移入透析袋(MWCO 3500)中，使用PB溶液透析 24 h得到PB组装体溶液。
将溶液滴在铜网上使用磷钨酸溶液染色一分钟，用透射电子显微镜（TEM）图像和动态光散射（DLS）粒径分布图表征组装体的形貌和尺寸分布。图9（a）是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG组装体的透射电子显微镜（TEM）图像和动态光散射（DLS）粒径分布图。如图9(a)所示，该两亲性嵌段聚合物在PB缓冲溶液（50 mM，pH =7.4）中可得到稳定的棒状纳米粒子，直径在20~30 nm之间，长度在200 nm左右。
2、还原前后组装体表征和荧光测试
用Na2S2O4模拟偶氮还原酶，还原聚合物PCL3k-TPE-Azo-PEG5k, 使N=N双键打断。从图9（a）和图9（b）可看出，经过还原后，组装体从原来棒状纳米粒子变成不规则的聚集体；图10是PCL3k-TPE-Azo-PEG5k组装体溶液还原前后在360nm激发波长下的荧光测试结果，从图中可以看出，加入Na2S2O4前，无荧光；而加入Na2S2O4后，荧光强度随着时间的变化逐渐增强。同时，测试组装体溶液加入Na2S2O4前后的紫外/可见吸收光谱，如图11所示。还原后在360 cm-1 和450 cm-1 左右的偶氮苯吸收峰减弱，证明N=N双键逐步被打断。与此同时，从插图可看出：还原后，原先澄清的黄色组装体溶液变为无色并有大量絮状物产生，说明连接在TPE上的N=N键断开后，聚合物被分离成亲水PEG链段和疏水PCL链段，PCL链在水溶液中形成新的聚集体，TPE被包裹在聚集体中，导致休眠的AIE活性被激发，而且随着还原时间增加荧光逐渐增强，当还原24h小时荧光强度达到最大。
图9是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG组装体在加入Na2S2O4前后的透射电子显微镜（TEM）图像和动态光散射（DLS）粒径分布图，（a）还原前；（b）还原后；图10是本发明中PCL3k-TPE-Azo-PEG5k组装体溶液还原前后在360nm激发波长下的荧光测试结果；图11是本发明中PCL3k-TPE-Azo-PEG5k组装体溶液在还原前后的紫外/可见吸收光谱图。插图是加入Na2S2O4前和加入Na2S2O4 后24h组装体溶液照片。
3、包载阿霉素（DOX）的还原触发释放
避光条件下，将聚合物的DMF溶液(1.0 mL, 5 mg/mL)与DOX的DMSO溶液(50 µL, 5 mg/mL)混合均匀，然后向其中缓慢滴加4.0 mL PB溶液 (50 mM, pH 7.4)，滴加完毕后转移到透析袋(MWCO 3500)中，在PB (50mM，pH 7.4)溶液中透析24 h，期间更换5次透析溶液。整个过程在避光条件下进行。
为测定 DOX 的含量，将100μL包载DOX的胶束溶液经过冷冻干燥后加入3 mL DMSO溶解，破坏胶束释放DOX。通过荧光(Hitachi F-4600, 荧光激发波长为 480 纳米，发射波长为 590 纳米)对DOX进行定量。后测定不同浓度DOX/DMSO溶液的荧光强度得到标准曲线，纳米粒子中DOX 的含量根据 DOX在DMSO溶液中的标准曲线来确定。
载药量(DLC)和包封率(DLE)根据以下的公式得到：
载药量(wt.%) = (装载药物重量/胶束与装载药物总重量)×100%
包封率(%) = (装载药物重量/药物总投入量)×100%
其中，聚合物的胶束溶液浓度是5mg/mL，其理论载药量为5 wt.%，载药量为2 wt.%，包封率41%。
后使用荧光光度计对组装体释放DOX 过程在比色皿中进行了原位跟踪。取3 mL胶束溶液于比色皿中，通氩气除氧 10 分钟后在氩气保护下加入 0.5 mg 的Na2S2O4，密闭后于 37℃水浴中搅拌。每隔一段时间通过荧光光谱，分别在360 nm和480 nm激发波长下测试荧光变化查看其还原响应释放过程。
随着药物的还原时间的增加，DOX逐步释放，来自TPE的特征峰的荧光强度逐步增加，因此可以通过本发明达到了药物示踪作用。
图12是本发明中包载了DOX的PCL-TPE-Azo-PEG组装体PB溶液（浓度为0.5 mg mL-1）还原前后，在360nm激发波长下的荧光发射图谱；图13是本发明中包裹DOX的PCL-TPE-Azo-PEG组装体在还原剂存在下药物随时间释放量的结果。
4、细胞毒性测试
PCL-TPE-Azo-PEG胶束PB溶液的细胞毒性测试是使用Caco2人体结肠细胞来进行细胞MTT测试研究的。结果表明在不同胶束浓度下细胞均可达到90 %左右的存活率，说明这种基于PEG-PCL两亲性聚合物的胶束具有比较好的生物相容性。图14是本发明中PCL-TPE-Azo-PEG胶束PB溶液的细胞毒性测试结果。
本发明获得的基于偶氮还原酶响应的两亲性聚合物，通过溶液自组装可制备结构稳定的聚合物胶束并进一步用来作为包裹药物的载体；包裹药物的聚合物组装体在偶氮还原酶作用下被破坏分解，因而释放药物；同时随着药物释放荧光被激活并逐渐增强。因此，此聚合物不仅可以用作药物载体，同时具有荧光探针功能，可以有效地监测药物释放的过程，从而实现药物在结肠中可控和靶向释放，是一种潜在的结肠定位药物控释载体。以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物，所述基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物的结构通式如下：
其中，50≤m≤200，10≤n≤50。
2.一种基于偶氮还原酶响应的聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛加入到四氢呋喃中，反应得到1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯；
（2）将1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯与叔丁基二甲基硅基保护的溴丙炔进行反应得到TBS-TPE-OH；
（3）将TBS-TPE-OH溶于四氢呋喃中，调节pH为8～10，然后在冰浴条件下滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐溶液，进行偶联反应，得到TBS-TPE-Azo；
（4）将TBS-TPE-Azo与mPEG-N3在CuI催化剂作用下进行CuAAC反应得到 TBS-TPE-Azo-PEG，然后脱去保护基团，得到基于偶氮还原酶响应的聚合物。
3.一种基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛加入到四氢呋喃中，反应得到1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯；
（2）将1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯与叔丁基二甲基硅基保护的溴丙炔进行反应得到TBS-TPE-OH；
（3）将TBS-TPE-OH溶于四氢呋喃中，调节pH为8～10，然后在冰浴条件下滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐溶液，进行偶联反应，得到TBS-TPE-Azo；
（4）将TBS-TPE-Azo与mPEG-N3在CuI催化剂作用下进行CuAAC反应得到 TBS-TPE-Azo-PEG，然后脱去保护基团，得到TPE-Azo-PEG；
（5）将TPE-Azo-PEG与端基为叠氮基团的聚己内酯进行CuAAC反应，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物。
4.一种基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛加入到四氢呋喃中，反应得到1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯；
（2）将1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯与叔丁基二甲基硅基保护的溴丙炔进行反应得到TBS-TPE-OH；
（3）将TBS-TPE-OH溶于四氢呋喃中，调节pH为8～10，然后在冰浴条件下滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐溶液，进行偶联反应，得到TBS-TPE-Azo；
（4）将TBS-TPE-Azo与mPEG-N3在CuI催化剂作用下进行CuAAC反应得到 TBS-TPE-Azo-PEG，然后脱去保护基团，得到TPE-Azo-PEG；
（5）将TPE-Azo-PEG与端基为叠氮基团的聚己内酯进行CuAAC反应，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物；
（6）向基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物溶液中滴加PB缓冲溶液，搅拌后透析，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束。
5.一种基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束的制备方法，包括以下步骤：
（1）将4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛加入到四氢呋喃中，反应得到1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯；
（2）将1, 2-二对羟基苯基-1, 2-二苯基乙烯与叔丁基二甲基硅基保护的溴丙炔进行反应得到TBS-TPE-OH；
（3）将TBS-TPE-OH溶于四氢呋喃中，调节pH为8～10，然后在冰浴条件下滴加对氨基苯丙炔醚重氮盐溶液，进行偶联反应，得到TBS-TPE-Azo；
（4）将TBS-TPE-Azo与mPEG-N3在CuI催化剂作用下进行CuAAC反应得到 TBS-TPE-Azo-PEG，然后脱去保护基团，得到TPE-Azo-PEG；
（5）将TPE-Azo-PEG与端基为叠氮基团的聚己内酯进行CuAAC反应，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物；
（6）向含有基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物以及药物的溶液中滴加PB缓冲溶液，搅拌后透析，得到基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束。
6.根据权利要求3、4或者5所述的制备方法，其特征在于，4-羟基二苯甲酮、锌粉、四氯化钛的质量比为3:2:（3~4）；1,2-二对羟基苯基-1,2-二苯基乙烯、叔丁基二甲基硅基保护的溴丙炔的质量比为（3~5）:2；TBS-TPE-OH、对氨基苯丙炔醚的重氮盐的质量比为（3~4）:1；TBS-TPE-Azo、mPEG-N3的质量比为（13~16）:100；TPE-Azo-PEG、PCL-N3的质量比为5:（1～10）。
7.根据权利要求3、4或者5所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，反应为回流反应20～28小时；步骤（2）中，反应为回流反应50～80分钟；步骤（3）中，偶联反应为冰盐浴反应100～150分钟；步骤（4）中，反应为60℃反应20～28小时；步骤（5）中，反应为60℃反应20～28小时。
8.根据权利要求2、3、4或者5所述的制备方法，其特征在于，对氨基苯丙炔醚重氮盐溶液的制备方法为，冰盐浴下，将亚硝酸钠水溶液滴加入含有4-炔丙氧基苯胺与浓盐酸的溶液中，滴加完成后继续反应1 h，得到对氨基苯丙炔醚重氮盐溶液。
9.根据权利要求2、4或者5所述的制备方法制备的基于偶氮还原酶响应的聚合物、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束或者基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束。
10.权利要求9所述基于偶氮还原酶响应的聚合物、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物载药胶束或者权利要求1所述基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物在制备偶氮本还原酶响应的荧光探针中的应用，或在制备偶氮本还原酶响应的药物中的应用，或者权利要求9所述基于偶氮还原酶响应的聚合物、基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物胶束或者权利要求1所述基于偶氮还原酶响应的两亲性嵌段聚合物在制备偶氮本还原酶响应药物的载体中的应用。
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