CN101235187A - 一种磁性荧光纳米复合材料、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性荧光纳米复合材料，其制备方法及应用。它是以磁性纳米颗粒与水溶性荧光共轭高分子通过静电组装方法获得单层或多层磁性荧光纳米复合材料。该方法简单易行，磁性荧光纳米复合材料荧光量子效率高，能够进行生物细胞的荧光成像；响应外界环境的能力强，可以检测低至微摩尔每升的化学或生物分子；同时该纳米复合物可以在磁场下迁移。本发明中的磁性荧光纳米复合材料可适用于环境监测、基因识别与突变观测、细胞成像、医疗诊断等。
Description
技术领域
本发明公开了一种磁性荧光纳米复合材料及其制备方法、应用，具体涉及磁性纳米颗粒、水溶性共轭高分子、表面静电自组装、荧光传感，应用于化学、生物分子检测以及生物成像。
背景技术
磁性颗粒可应用于生物、制药和诊断等领域。例如标记有生物亲和分子的磁性颗粒可以在磁场中快速、方便和有效地分离，并能进一步与生物素、抗体、蛋白等结合。在靶向载药体系中，负载药物的磁性颗粒通过外磁场的导向实现给药、传输过程，保证药物安全、有效地达到并针对特定的组织释放。另外超顺磁性纳米颗粒可用于体内磁共振成像。纳米尺寸的磁性颗粒具有沉降速率低，比表面积大、可适用于特异性或非特异性结合位点多的特点。
荧光技术可用于活体动物体内光学成像，它采用荧光探针基团如有机荧光染料、半导体量子点等进行标记，利用灵敏的光学检测仪器，可以直接检测活体生物体内的细胞活动和基因行为。荧光技术具有无损检测，操作简便、结果直观、测量快速、灵敏度高及费用低廉等优点，已广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等领域。
设计可用于化学、生物或医学传感的磁性荧光多功能复合纳米材料具有极大的价值。目前这类复合材料的制备技术有三种。其中主要是将磁性颗粒与荧光材料这两种物质包裹在二氧化硅或高分子微球内部形成核壳结构(如中国专利公开号CN1580775，名称为“一种纳米荧光磁粒及其制备方法”，公开日2005.02.16；公开号CN1523076，名称为“一种具有核壳结构的磁性荧光双功能微球及其制备方法”，公开日2004.08.25；公开号CN1539913，名称为“荧光磁性多功能纳米材料及其制备方法”，公开日2004.10.27；公开号CN101055782，名称为“一种新型生物兼容磁性荧光纳米颗粒的制备方法”，公开日2007.10.17；公开号CN1475805，名称为“磁性荧光微球及其制备方法和采用该磁性荧光微球进行生物分子检测的方法”，公开日2004.02.18)，这些方法的缺点是使用的外层包裹材料容易阻挡微球内部荧光材料对光的吸收和荧光发射，而且这些外壳材料为了便于结合生物分子，必须同时携带各种表面修饰的官能基团。第二种方法是将磁性颗粒与半导体荧光纳米晶(量子点)通过静电作用形成磁性荧光复合物(如中国专利公开号CN1524925，名称为“荧光磁性纳米复合物及其制备方法和应用”，公开日2004.09.01；公开号CN1831079，名称为“荧光磁性多功能纳米材料的制备方法”，公开日2006.09.13)，其主要缺点是需要使用有毒的金属镉离子，并且需要进一步在复合物表面修饰生物亲合基团。第三种技术是磁性颗粒表面化学沉积或接枝荧光物质(Gu J.Am.Chem.Soc.126，5664，2004和Kim J.Am.Chem.Soc.127，544，2005)，需要的步骤较多，表面荧光基团含量很低，复合物的荧光性质不能随意调节。
共轭高分子是具有共轭电子结构的长链大分子，链上电子高度离域，有利于电荷传输。自1990年代以来共轭高分子在电致发光、太阳能电池等领域的应用受到大量关注。共轭高分子可被视做一串荧光基团相互串接形成的天线阵，每个单独的荧光基团都可以采集外界入射的光，因而其集体吸收光的能力远远超过荧光小分子。共轭高分子在光激发下产生电子跃迁，再经振动能级弛豫并最后回到基态而辐射出荧光，这种行为和荧光小分子的荧光现象相似。值得注意的是共轭高分子允许光激发产生的能量、电子等在链上相邻的荧光基团之间连续、高效地传递，形成所谓的分子导线效应，可以发展成高灵敏度的光学传感器。其原理是当外来的单个待检测物质与共轭高分子链上的一个或多个荧光基团作用，并打断或改变上述能量或电子传递过程，那么整个链的荧光将明显变化；与之相比，单个分析物只能使一组荧光小分子受体中单个发色团的荧光改变也就是说单个发色团-分析物质相结合的事件在共轭高分子体系中被放大了。麻省理工学院的Swager教授首先将荧光共轭高分子的“检测信号倍增效应”用于化学分析(Swager Acc.Chem.Res.31，201，1998)。如果在共轭高分子的化学结构中引入磺酸盐、季铵盐等离子基团，增加材料水溶性，则形成水溶性的荧光共轭高分子。目前水溶性共轭高分子荧光探针已经被推广到一系列传感体系，包括荧光淬灭剂、表面活性剂、糖类、多肽、蛋白、RNA、DNA等，其检测限可以达到纳(10-9)摩尔到皮(10-12)摩尔数量级，在环境监测、基因识别与突变观测、医疗诊断等方面潜力巨大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种制备方法简捷、稳定性高、荧光强度大、检测限低的多功能磁性荧光复合纳米材料，其包含可与生物分子作用的离子基团、灵敏度高、检测模式多样，并能用于化学、生物分子的荧光检测以及生物细胞的荧光成像。
本发明所述的磁性荧光纳米复合材料，包括磁性纳米颗粒和水溶性荧光共轭高分子，其中的水溶性荧光共轭高分子包裹在磁性纳米颗粒表面形成纳米复合材料。
上述水溶性荧光共轭高分子可以单层或多层包裹在磁性纳米颗粒表面。
其中磁性纳米颗粒包括：自制及购买的纳米磁性颗粒，如Fe3O4，Fe2O3，CoXFe2-XO4等，其尺寸小于100纳米。
本发明所述的水溶性荧光共轭高分子为共轭主链采集光能量，跃迁后电子空穴相遇发光，侧链带磺酸根或铵基等水溶性基团。具体说具有如下结构，但是不止限于所示结构：
PFS R1＝(CH2)nSO3M n＝3 M＝Na+ 
PFN R1＝(CH2)mN(CH3)2(C2H5)X m＝3 X＝Br- 
ThPFS R1＝(CH2)nSO3M n＝3 M＝Na+ 
上述的水溶性荧光共轭高分子主链化学结构可以调节，通过在共轭主链上引入不同的不饱和性共聚单元(如苯环、噻吩等，但不止限于这些基团)，调节高分子链上共轭基团的共平面性、共轭长度或电荷密度，就可调节水溶性共轭高分子的荧光量子效率、发光波长、激子迁移速度等光学特性。
本发明中制备磁性荧光纳米复合材料的方法为：将水溶性荧光共轭高分子与表面带相反电荷的磁性纳米颗粒共混，并自发组装于磁性纳米颗粒表面形成纳米复合物。还可以将获得的磁性荧光纳米复合材料再与带有相反电荷的水溶性荧光共轭高分子混合，通过静电力自发组装成表面组装有双层荧光高分子的多功能纳米复合物。交替加入带有正、负电荷的水溶性荧光共轭高分子，可以进一步获得表面组装有多层荧光高分子的多功能纳米复合物。
本发明中磁性荧光功能纳米复合材料的纯化方法是将磁性纳米颗粒超声分散在共轭高分子的水溶液中，然后用永磁体将复合物收集，经过纯水反复洗涤，获得磁性荧光纳米复合材料。
本发明制备的磁性荧光功能纳米复合材料表面修饰了带有不同电荷的水溶性荧光共轭高分子，可以和带有异种电荷的荧光淬灭剂、表面活性剂、糖类、多肽、蛋白、RNA、DNA等相互作用。
本发明还要求保护磁性荧光纳米复合材料在化学、生物分子荧光检测中的应用。磁性荧光纳米复合材料进行荧光检测的方法是：在磁性荧光纳米复合材料中加入待检测物，利用荧光谱仪记录荧光发射光谱强度或峰形状的变化。磁性荧光功能纳米复合材料用于荧光检测的机制为(但不仅限于)光致电荷转移，即在受激发的共轭高分子链与可以接受电子的待测物质之间发生电子的转移。
本发明中磁性荧光纳米复合材料检测灵敏度高的机制包插共轭高分子带有大量的电荷，可以富集带异种电荷的待测分子，从而显著提高局部分析物的浓度；共轭高分子摩尔消光系数大，高效收集入射光能；同时也存在信号倍增效应等因素。
本发明还要求保护磁性荧光纳米复合材料在生物细胞的荧光成像中的应用。生物荧光成像的方法是将磁性荧光纳米复合材料与细胞培养液配成含纳米复合物溶液，将该溶液作为培养液用于细胞培养，于细胞培养箱中培养，取出用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜将细胞成像于光电传感器。
本发明的有益效果是(1)磁性荧光纳米复合材料制备容易，分离手段简单，只需要通过简单的溶液共混，再用永久磁铁分离并清洗；(2)磁性荧光纳米复合材料的发光颜色、表面电荷类型均可以调节，适用于不同的成像或检测场合；(3)磁性荧光纳米复合材料中的发光物质位于纳米颗粒表面，不存在对入射或出射光的阻挡吸收；(4)磁性荧光纳米复合材料表面修饰的共轭高分子荧光量子效率高、荧光强度大，通常在极低浓度(10-6到10-8摩尔/升)下也能够用普通荧光仪检测到信号，因而即使表面修饰一层荧光共轭高分子也能够满足生物体内或体外荧光检测或荧光成像的需求；(5)磁性荧光纳米复合材料响应外界环境的能力强，灵敏度高，检测极限可以低至微摩尔/升；(6)磁性荧光纳米复合材料表面携带能与待测物质相互作用的离子性基团、且比表面积大，表面拥有多触点，易于和蛋白质、DNA等结合；(7)磁性荧光纳米复合材料的粒径包裹前后变化不大，磁性荧光纳米复合材料颗粒之间存在表面电荷的互相排斥，长时间静置也不易沉降；(8)磁性荧光纳米复合材料所使用的磁性纳米颗粒与共轭高分子均具有水溶性、同时没有生物毒性，满足生物检测的需要，同时又绿色环保；(9)通过静电作用，磁性荧光纳米复合材料能够负载生物活性物质或药物，从而同时实现荧光传感、磁场控制和释放、磁成像等多种功能。
本发明中的磁性荧光纳米复合材料可适用于环境监测、基因识别与突变观测、细胞成像、医疗诊断等方面。
附图说明
图1.a图为磁性荧光纳米颗粒(MPs-PFN-ThPFS)水溶液在紫外灯照射下的照片，容器为石英比色皿，溶液整体呈现荧光。b图为相同溶液在永久磁铁作用下的照片，磁铁位于比色皿右侧，仅在右侧器壁上呈现荧光，溶液整体不发光。
图2.磁性荧光纳米颗粒(MPs-PFN-ThPFS)水溶液在永久磁铁作用下荧光强度随时间的变化。
图3.红外光谱：a)磁性纳米颗粒MPs；b)磁性荧光纳米颗粒MPs-PFN；c)磁性荧光纳米颗粒MPs-PFN-ThPFS；d)共轭高分子PFN；e)共轭高分子ThPFS。
图4.磁性荧光纳米颗粒(MPs-(PFN-ThPFS)3-PFN)的透射电子显微镜照片。
图5.磁性荧光纳米颗粒(MPs-PFN)水溶液中加入电子淬灭剂K4Fe(CN)6前后荧光强度变化。
图6.磁性荧光纳米颗粒(MPs-PFN-PFS)水溶液中加入细胞色素c前后荧光强度变化。
图7.磁性荧光纳米颗粒(MPs-PFN-ThPFS-PFN)用于细胞成像。a图为自然光下含有磁性荧光纳米颗粒细胞的显微照片，b图为紫外光下与a相同视野下的细胞荧光显微照片。
具体实施方式
实施例1：荧光高分子9，9-双(3’-(磺酸钠)丙基)芴和苯撑共聚物(简称PFS)的合成
步骤a)2，7-二溴-9，9-双(3’-(磺酸钾)丙基)芴的合成：三颈瓶中加入1.61克2，7-二溴芴、1.26克叔丁醇钾、40毫升四氢呋喃(THF)，在氮气保护下滴加1.27克γ-丙磺酸内酯(溶于7毫升THF中)，电磁搅拌。室温反应3小时后将反应液倒入200毫升丙酮中，沉淀用乙醇洗涤。固体抽干后用水/丙酮重结晶，乙醇洗涤，真空烘干得产品。
步骤b)在三颈瓶中加入0.51克2，7-二溴-9，9-双(3’-(磺酸钾)丙基)芴、0.13克1，4-苯二硼酸、50毫克Pd[P(Ph)3]4，溶于40毫升0.3摩尔每升的Na2CO3及20毫升二甲基甲酰胺(DMF)中。在氮气保护下90摄氏度反应48小时。将溶液倒入500毫升丙酮，沉淀物溶于50毫升水中，灌入透析袋中用蒸馏水透析3天。蒸干溶剂得到产品PFS。
实施例2：荧光高分子9，9-双(3’-(磺酸钠)丙基)芴和噻吩共聚物(简称ThPFS)的合成
步骤a)2，5-双(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2基)噻吩合成：在零下78摄氏度、氮气保护下，将正丁基锂8.68毫升(2摩尔每升的环己烷溶液)滴加到溶解有2.29克2，5-二溴噻吩的50毫升四氢呋喃溶液。后加入10毫升2-异丙氧基-4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环。混合物反应1小时，室温静置过夜。该混合物倒入水中，并用乙酸乙酯提取，提取物用无水硫酸镁干燥。之后，蒸发结晶，得白色固体产品。
步骤b)称取0.51克2，7-二溴-9，9-双(3’-(磺酸钾)丙基)芴、0.27克2，5-双(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧硼戊环-2基)噻吩、50毫克Pd[P(Ph)3]4，溶于40毫升0.3摩尔每升的Na2CO3和20毫升的DMF中。在氮气保护下90摄氏度反应48小时。将溶液倒入500mL丙酮，沉淀溶在蒸馏水中，灌入透析袋中，蒸馏水透析3天。蒸干溶剂得到产品ThPFS。
实施例3：荧光高分子9，9-双(3’-(N，N，N-二甲基乙基铵)丙基)芴二溴盐和苯撑共聚物(简称PFN)的合成
步骤a)2，7-二溴-9，9-双(3’-(N，N，N-二甲基乙基铵)丙基)芴二溴盐的合成：1.8克2，7-二溴芴和50毫升四氢呋喃中加入1.26克叔丁醇钾，半小时后滴加溶解在15毫升四氢呋喃中的1.7克3-氯-N，N-二甲基丙胺。混合物在室温下搅拌12小时。蒸去溶剂，固体溶于50毫升乙酸乙酯，水洗三次，无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂。固体溶于20毫升1摩尔每升的盐酸，用乙酸乙酯洗涤三次，然后用碳酸钾溶液中和。析出的有机物用乙酸乙酯萃取，水洗三次，无水硫酸镁干燥后蒸除溶剂，获得中间产物。取该中间产物0.64克溶于30毫升四氢呋喃，加入1.4克溴乙烷，50摄氏度反应两天，离心收集产物。
步骤b)称取0.57克2，7-二溴-9，9-双(3’-(N，N，N-二甲基乙基铵)丙基)芴二溴盐、0.13克1，4-苯二硼酸、50毫克Pd[P(Ph)3]4，溶于40毫升0.2摩尔每升的Na2CO3及16毫升DMF中。在氮气保护下90摄氏度反应48小时。将溶液冷却后倒入600毫升丙酮，沉淀溶在蒸馏水中，灌入透析袋中，蒸馏水透析3天。蒸干溶剂得到产品PFN。
实施例4：磁性纳米颗粒合成：6.76克氯化铁、2克氯化亚铁溶解在30毫升0.36摩尔每升的盐酸溶液中，加入250毫升0.07摩尔每升的氨水。用永久磁铁收集磁性纳米颗粒，加入20毫升(CH3)4NOH和0.01克己二酸，搅拌24小时。
实施例5：磁性荧光纳米复合材料制备
步骤a)Fe3O4磁性纳米颗粒与PFN混合、超声分散，用永磁体将复合物收集后用蒸馏水洗涤，获得表面包裹有单层荧光共轭高分子的磁性荧光纳米复合材料，标记为MPs-PFN。
步骤b)将上一步获得的磁性荧光纳米复合材料MPs-PFN与ThPFS混合，超声分散，用永磁体将复合物收集后洗涤，获得表面包裹有双层荧光共轭高分子的磁性荧光纳米复合材料，标记为MPs-PFN-ThPFS。
步骤c)将上一步获得的磁性荧光纳米复合材料MPs-PFN-ThPFS与PFN、ThPFS交替混合，重复上述步骤a、b，获得表面包裹有多层荧光共轭高分子的磁性荧光纳米复合材料。
磁性荧光纳米复合材料对外磁场的响应：将磁性荧光纳米颗粒(MPs-PFN-ThPFS)水溶液置于石英比色皿中，紫外灯照射下溶液整体呈现荧光。相同溶液在永久磁铁作用下，仅在靠近磁铁的器壁上呈现荧光，而溶液整体不发光(附图1)。将盛有磁性荧光纳米颗粒水溶液的石英比色皿置于荧光仪的光路中，在永久磁铁作用下，可以观测到磁性荧光纳米颗粒被逐步移出光路，荧光强度下降(附图2)。
磁性荧光纳米复合材料红外光谱测量：将纳米复合物溶液滴于镀有铂的硅片衬底上，采用表面反射红外仪器获得红外光谱(附图3)，可以看到纳米颗粒表面的共轭高分子吸收特征峰。
磁性荧光纳米复合材料电镜观测：将纳米复合物溶液滴于铜网上，干燥后置于透射电子显微镜下观测，其颗粒尺寸小于100纳米(附图4)。
磁性荧光纳米复合材料表面电位电位测定：将磁性纳米颗粒和表面修饰有单层—七层荧光共轭高分子的磁性荧光纳米复合材料颗粒的水溶液置于动态光散射粒径测量仪中(Brookhaven BI9000AT)，测定颗粒表面的ζ电位如下表1：
表1：
| 层数 | ζ电位 |
| 0 | -35.11 |
| 1 | 39.85 |
| 2 | -13.27 |
| 3 | 25.82 |
| 4 | -21.84 |
| 5 | 26.34 |
| 6 | -24.69 |
| 7 | 28.33 |
磁性荧光纳米复合材料用于化学检测：以检测K4Fe(CN)6的检测为例，量取3毫升磁性荧光纳米复合材料MPs-PFN溶液，采用369纳米的激发光测其荧光发射谱；接下来逐步加入浓度为10-5摩尔每升的K4Fe(CN)6测其荧光发射谱，荧光强度变化如附图5所示。
磁性荧光纳米复合材料用于生物分子检测：以细胞色素c的检测为例，量取3毫升磁性荧光纳米复合材料MPs-PFN-PFS溶液，采用369纳米的激发光测其荧光发射谱；接下来逐步加入浓度为10-6摩尔每升的细胞色素c测其荧光发射谱，荧光强度变化如附图6所示。
磁性荧光纳米复合材料用于细胞成像：量取磁性荧光纳米复合材料MPs-PFN-ThPFS-PFN溶液10微升，加入含有贴壁细胞的培养皿(皿中含2毫升培养液，培养48小时)，37摄氏度培养2小时，置于紫外荧光显微镜下数码成像(附图7)。
Claims (9)
1、一种磁性荧光纳米复合材料，其特征在于它包括磁性纳米颗粒和水溶性荧光共轭高分子，所述水溶性荧光共轭高分子包裹在磁性纳米颗粒表面。
2、根据权利要求1所述的磁性荧光纳米复合材料，其特征在于所述水溶性荧光共轭高分子单层或多层包裹在磁性纳米颗粒表面。
3、根据权利要求1或2所述的磁性荧光纳米复合材料，其特征在于所述磁性纳米颗粒材料是Fe3O4，Fe2O3或CoXFe2-XO4纳米颗粒，其尺寸小于100纳米。
4、根据权利要求1或2所述的磁性荧光纳米复合材料，其特征在于所述水溶性荧光共轭高分子结构式是：
PFS R1＝(CH2)nSO3M n＝3 M＝Na+ 
PFN R1＝(CH2)mN(CH3)2(C2H5)X m＝3 X＝Br- 
ThPFS R1＝(CH2)nSO3M n＝3 M＝Na+ 
。
5、一种权利要求1所述磁性荧光纳米复合材料的制备方法，其特征在于将水溶性荧光共轭高分子与表面带相反电荷的磁性纳米颗粒共混，水溶性荧光共轭高分子自发组装于磁性纳米颗粒表面形成纳米复合物。
6、根据权利要求5所述的磁性荧光纳米复合材料的制备方法，其特征在于将获得的磁性荧光纳米复合材料再与带有相反电荷的水溶性荧光共轭高分子混合，通过静电力自发组装成表面组装有双层荧光高分子的纳米复合物。
7、根据权利要求6所述的磁性荧光纳米复合材料的制备方法，其特征在于在纳米复合物中交替加入带有正、负电荷的水溶性荧光共轭高分子，进一步获得表面组装有多层荧光高分子的多功能纳米复合物。
8、权利要求1所述磁性荧光纳米复合材料在化学、生物分子荧光检测中的应用。
9、权利要求1所述磁性荧光纳米复合材料在生物细胞的荧光成像中的应用。
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