CN109187473A - 基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用于外泌体的检测 - Google Patents

基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用于外泌体的检测 Download PDF

Info

Publication number
CN109187473A
CN109187473A CN201811077538.7A CN201811077538A CN109187473A CN 109187473 A CN109187473 A CN 109187473A CN 201811077538 A CN201811077538 A CN 201811077538A CN 109187473 A CN109187473 A CN 109187473A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ucnps
epcam
added
tamra
excretion body
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201811077538.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109187473B (zh
Inventor
兰建明
陈敬华
李春艳
吴芳
罗登旺
方垚
盛依伦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujian Medical University
Original Assignee
Fujian Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujian Medical University filed Critical Fujian Medical University
Priority to CN201811077538.7A priority Critical patent/CN109187473B/zh
Publication of CN109187473A publication Critical patent/CN109187473A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109187473B publication Critical patent/CN109187473B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching

Abstract

本发明公开一种基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用于外泌体的检测，涉及稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针的传感器，通过携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链，能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA间的距离拉近到小于10 nm，从而发生荧光共振能量转移，产生荧光信号；该传感器的优点：稀土掺杂的上转换发光纳米材料由于其独特的反斯托克斯发光性能，具有光化学稳定性，无自体荧光；避免使用蛋白等昂贵的试剂、简化了实验流程；该方法基于荧光能量共振转移原理检测具有高灵敏度。可用于乳腺癌细胞来源外泌体的高灵敏检测。

Description

基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用 于外泌体的检测
技术领域
本发明涉及一种基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明之间的荧光共振能量转移原理的分析方法，属于分析化学及纳米技术领域。
本发明涉及以稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针的适配体传感器，并通过上转换荧光强弱的变化，来实现对外泌体(exosome)的高灵敏检测，属于传感器领域。
背景技术
外泌体是由多种活细胞分泌的囊泡小体，可以被绝大多数类型的细胞如：B 细胞，T细胞，树突细胞，巨噬细胞，神经元，神经胶质细胞，肿瘤细胞和干细胞等分泌产生，直径约为30～100nm。外泌体来源多样并且携带大量的蛋白质、脂质、DNA、RNA等生物信息分子，这使其成为细胞间信息传递或改变的使者。大量与外泌体有关的报道都表明，研究外泌体对生物及医学领域具有重大意义。尤其重要的是，外泌体含有丰富的内容物，是提供癌症诊断、发展、转移等信息的潜在来源。因此，外泌体的分析检测在研究中显得尤为重要。
外泌体定量常用的方法主要是利用动态光散射仪(DLS)、纳米粒子示踪技术(NTA)；外泌体的定性分析主要是依赖其表面蛋白进行的，常用的检测方法有流式细胞术(Flow Cytometry)、蛋白质印迹法(Western Blot)、酶联免疫吸附实验 (ELISA)等。这些方法虽然经典，却有着仪器昂贵、分析耗时、所需样品量大等缺点。因此，开发一种高灵敏度、便捷快速的外泌体检测方法显得尤为重要。
最近，多位学者利用核酸适配体的方法对外泌体进行了检测。核酸适配体是一条可以与配体特异性结合的DNA或RNA单链。Qing等人利用外泌体表面蛋白CD63的适配体研制出一种电化学传感器，对外泌体进行了检测，检测限(LOD) 为1×106particles/mL；Xia等人应用纳米材料碳管设计了一种可视化的适配体生物传感器用于外泌体检测，检测限低达5.2×105particles/μL；Chen应用上转换纳米材料设计了一种基于荧光共振能量转移的纸基技术用于外泌体检测，检测限可低至1.1×103particles/μL。以上技术提供了一种检测外泌体的新思路。
稀土掺杂的上转换发光纳米材料由于其独特的反斯托克斯发光性能在生物应用中具有较大优势，被广泛应用于生物领域。荧光共振能量转移(LRET)是一种无辐射过程，即处于激发态的能量供体将能量无辐射的转移给能量受体，后者通过荧光发射或其它无辐射方式将能量释放出来。产生荧光共振能量转移的前提是能量供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠且二者的空间距离在10nm之内，因此LRET技术具有灵敏度高、分辨率高、简单方便等优点。UCNPs具有良好的化学稳定性、光稳定性、无自体荧光等优点，是一种较好的进行LRET的能量供体。基于LRET原理，使用UCNPs构建荧光生物传感器用于生物检测或光动力治疗、光学成像等应用正成为研究热点。四甲基罗丹明(TAMRA)是一种可见光区荧光染料，它的荧光激发光谱与NaYF4:Yb,Er的发射光谱具有较大重叠，且其发射峰位于585nm，恰好与NaYF4:Yb,Er的发射峰分离，因此在 NaYF4:Yb,Er作为能量供体进行能量共振转移时，TAMRA是一个很好的能量受体。
受上述研究启发，我们设计了一种基于荧光共振能量转移原理检测外泌体的方法。先将EpCAM蛋白的DNA适配体分割成两条DNA链，分别将UCNPs和 TAMRA修饰在两条链的末端。当检测外泌体时，由于外泌体表面EpCAM蛋白的存在，使两条DNA链靠近，从而拉近了UCNPs与TAMRA间的距离，使UCNPs 的荧光发生猝灭，利用上转换荧光强弱的变化，来实现对外泌体的高灵敏检测。本方法有望实现一种简单、经济、高选择性、高灵敏度检测外泌体的新型生物传感技术。
发明内容
本发明的目的在于设计了一种基于荧光共振能量转移原理检测外泌体的方法，利用上转换荧光强弱的变化，来实现对外泌体的高灵敏检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器，其特征在于：包括UCNPs、TAMRA修饰的EpCAM-2和UCNPs 修饰的EpCAM-1(DNA)，所述的EpCAM-1的DNA序列为： 5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGT-3’,5’端修饰-COOH；EpCAM-2的碱基序列为：5’-CCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’,3’端修饰TAMRA；
携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链 (EpCAM-1-UCNPs，EpCAM-2-TAMRA)，能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA之间的距离拉近到小于10nm，从而发生荧光共振能量转移，当在980nm近红外光激发下， TAMRA会发出黄色荧光，利用585nm处荧光强弱的变化，能进行溶液中外泌体的定量分析。
本发明所述的用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)稀土掺杂上转换纳米材料的合成：加含量是Y 78％，Yb 20％，Er 2％的稀土硬脂酸盐0.8mmol，NaF 28mmol，油酸(OA)12mL，十八烯(ODE)8mL 于100mL三颈烧瓶，氩气氛围中回流加热至135℃～145℃，保持30min进行脱水脱气；然后迅速升温至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000 rpm离心3min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥，获得油酸包覆的UCNPs；
2)BF4 -修饰UCNPs：称取10mg步骤1)制得的油酸包覆的UCNPs，超声分散在2mL环己烷中，加入2mLNOBF4的DMF溶液，轻轻摇动10min，静置分层，将上方己烷层除去，加入体积比为1:1的甲苯和环己烷混合溶剂共2mL 纯化，离心11000r/min，5min，DMF洗一次，沉淀烘干备用；
3)EpCAM-1修饰UCNPs：取1mg/mL步骤2)制得的BF4 --UCNPs的水溶液500μL，加入至小玻璃瓶中，加入1.5nmol的EpCAM-1，加纯水使最终体积为1mL，UCNPs修饰的EpCAM-1的EpCAM-1-UCNPs最终浓度为1.5μM，4 ℃搅拌过夜，8000r/min超滤离心5min，沉淀水洗两次，重分散在500μL纯水中，4℃保存备用；
4)5ml的EP管中分别加入5μL步骤3)制得的浓度为1.5μM EpCAM-1-UCNPs、0.25μM的EpCAM-2-TAMRA最后加配比为Tris-HCl 10mM, NaCl 100mM的Tris盐酸缓冲液配置成100μL溶液，28℃振荡1h，检测其荧光强度，即得荧光传感器，用于检测其荧光强度。
所述的BF4 -修饰UCNPs的制备：
1)含量为Y 78％，Yb 20％，Er 2％的稀土硬脂酸盐的制备：将稀土硝酸盐乙醇溶液与浓度为284.48g/mol的硬脂酸(十八酸)17.0688g(60mmol)加入到250mL三颈烧瓶中；70℃加热回流至液体澄清，逐滴加入119g/L的NaOH溶液， 10mL左右，调节溶液pH至5～6之间；滴加完后升温至78℃继续回流搅拌 30min；冷却至室温后减压抽滤，水洗2次后再用乙醇洗涤2次；所得的滤饼转移至烘箱中，60℃条件下干燥12h，得白色粉末状稀土硬脂酸盐前驱体；
2)油酸包覆的UCNPs的合成：取100mL三颈烧瓶，加入步骤1)制得的稀土硬脂酸盐(Y 78wt％，Yb 20wt％，Er 2wt％)0.8mmol，NaF 28mmol，油酸 (OA)12mL，十八烯(ODE)8mL，氩气氛围中回流加热至140℃，保持30min 进行脱水脱气；然后迅速升温至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000rpm离心3min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥，得到油酸包覆的UCNPs；
3)0.01M NOBF4(四氟硼酸亚硝)的DMF溶液的制备：称取0.1168g NOBF4置于一洁净烧杯中，加入少量DMF溶解完全后，倒入100mL容量瓶，用DMF 定容至100mL，室温储存备用；
4)BF4 -修饰UCNPs：称取10mg步骤2)制得的油酸包覆的UCNPs，超声分散在2mL环己烷中，加入2mL步骤3)制得的NOBF4的DMF溶液，轻轻摇动10min，静置分层，将上方己烷层除去，加入体积比为1:1的甲苯和己烷混合溶剂共2ml纯化，离心11000r/min，5min，DMF洗一次，沉淀烘干获得BF4 -修饰UCNPs，备用。
本发明所述的一种用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器或上述的方法制得的荧光传感器用于检测外泌体，其特征在于：将不同浓度的MDA-MB-231外泌体分别加入含EpCAM-1-UCNPs和EpCAM-2-TAMRA的Tris盐酸缓冲液中， 28℃振荡1h后，测量其荧光强度；随着外泌体浓度的增加，585nm处的荧光强度逐渐增加；外泌体浓度和荧光能量共振转移产生的585nm处荧光的强度呈良好的线性关系，线性方程为G＝22.6321c-56.2021，r＝0.9989，G为585nm处的已扣除背景的荧光强度，c为外泌体的浓度，其基于3σ法的检测限为80 particles/mL。
具体地说，本发明采用以下技术方案：
本发明基于荧光共振能量转移原理检测外泌体的方法的设计及其用于外泌体的检测，其特征是将EpCAM蛋白的DNA适配体分割成两条DNA链(EpCAM-1，EpCAM-2)，分别将UCNPs和TAMRA修饰在两条链的末端。当检测外泌体时，由于外泌体表面EpCAM蛋白的存在，使两条DNA链靠近，从而拉近了UCNPs与TAMRA间的距离，使UCNPs的荧光发生猝灭，利用上转换荧光强弱的变化，来实现对外泌体的高灵敏检测。
本发明所述的上基于荧光共振能量转移原理检测外泌体的方法，包括以下步骤：1)稀土掺杂上转换纳米材料的合成：取100mL三颈烧瓶，加入稀土硬脂酸盐(Y 78％，Yb20％，Er 2％)0.8mmol，NaF 28mmol，油酸(OA)12mL，十八烯(ODE)8mL，氩气氛围中回流加热至135℃～145℃，保持30min进行脱水脱气；然后迅速升温至312℃至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000rpm离心3min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥。
2)0.01M NOBF4的DMF溶液的制备：称取0.1168g NOBF4置于一洁净烧杯中，加入少量DMF溶解完全后，倒入100mL容量瓶，用DMF定容至100mL，室温储存备用。
3)BF4 -修饰UCNPs：称取10mg油酸包覆的UCNPs，超声分散在2mL环己烷中，加入2mLNOBF4的DMF溶液。轻轻摇动10min，静置分层，将上方己烷层除去。加入甲苯和己烷(1:1，v/v)共2mL纯化，离心11000r/min，5min。 DMF洗一次，沉淀烘干备用。
4)EpCAM-1修饰UCNPs：取BF4 --UCNPs的水溶液(1mg/ml)500μl，加入至小玻璃瓶中，加入1.5nmol的EpCAM-1，加纯水使最终体积为1ml，UCNPs 修饰的EpCAM-1的最终浓度为1.5μM，4℃搅拌过夜。8000r/min超滤离心5min，沉淀水洗两次，重分散在500μL纯水中，4℃保存备用。
5)外泌体提取：乳腺癌MDA-MB-231细胞株以含有5％胎牛血清、1％青霉素和10μg/mL链霉素的RPMI-1640为培养基在37℃，含有5％二氧化碳的培养箱中培养。换液时均使用PBS溶液清洗细胞分泌物。
选择生长状态良好，密度较大的细胞，使用不含胎牛血清的培养基进行孵育，待48h后进行离心，离心温度均为4℃，程序为300g离心10min去除死细胞， 2000g离心20min去除细胞碎片，11000g离心45min去除蛋白质，100000g 离心70min后弃去培养液收集外泌体沉淀，使用PBS重悬外泌体沉淀后需要再次100000g离心70min，最后用少量PBS重悬，-20℃保存备用。
6)以稀土掺杂上转换纳米材料为荧光探针作为传感器基于荧光共振能量转移的外泌体的检测：5mL的EP管中分别加入5μL浓度为1.5μM EpCAM-1-UCNPs、0.25μM的EpCAM-2-TAMRA最后加Tris盐酸缓冲液 (Tris-HCl 10mM,NaCl 100mM)成100μL溶液，28℃振荡1h，检测其荧光强度，即得荧光传感器。
本发明通过对探针基因的设计，将分别携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链(EpCAM-1，EpCAM-2)混于同一溶液中，当外泌体分子存在时，探针基因能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA间的距离拉近(小于10nm)，从而发生荧光共振能量转移，当在980nm近红外光激发下，TAMRA会在585nm 处发出黄色荧光。因此，利用585nm处荧光强弱的变化，可以对溶液中的外泌体进行定量分析。该方法的检测限为80particles/mL。
本发明的优点：
(1)稀土掺杂的上转换发光纳米材料由于其独特的反斯托克斯发光性能，具有光化学稳定性，无自体荧光；
(2)避免使用蛋白、抗体等昂贵的试剂检测成本、简化了实验流程；
(3)该方法基于UCNPs和TAMRA之间的荧光能量共振转移来检测外泌体，具有高灵敏度。
附图说明
图1为UCNPs的透射电镜图。
图2为UCNPs的X射线衍射图。
图3为DNA修饰的UCNPs紫外表征对比图。
图4为外泌体透射电镜表征图。
图5从A到G为不同浓度的外泌体(0，1×103，1×104，1×105，1×106，1× 107，1×108particles/mL)FRET荧光强度的变化图。
图6为外泌体检测的拟合线性关系图。
图7为基于UCNPs与TAMRA的荧光共振能量转移(LRET)的原理图。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实例1：基于荧光共振能量转移的荧光生物传感器的制备方法为：
1)稀土硝酸盐的制备：分别称取稀土氧化物(RE2O3)，包括氧化铒(Er2O3) 0.0766g(0.2mmol)、氧化镱(Yb2O3)0.7882g(2mmol)、氧化钇(Y2O3)1.7614g (7.8mmol)；注：M(Er2O3)＝382.52g/mol M(Yb2O3)＝394.08g/mol M (Y2O3)＝225.82g/mol混合置于250mL三颈烧瓶中，加足量稀硝酸(浓硝酸：水体积比＝1：1)，共100mL，封口膜密封，水浴磁力搅拌加热90-100℃，澄清后，打开封口膜，并继续加热至多余的硝酸完全挥发，得到稀土硝酸盐固体；自然冷却后加入100mL乙醇，搅拌溶解后得到Er、Yb、Y共掺杂的稀土硝酸盐乙醇溶液。
反应方程式为：
其中RE代表Er、Yb、Y按元素百分摩尔比2％:20％:78％掺杂的混合物。
2)前驱体稀土硬脂酸盐的制备：将步骤1)得的稀土硝酸盐乙醇溶液与硬脂酸(十八酸)17.0688g(60mmol)加入到250mL三颈烧瓶中；注：M硬脂酸＝284.48 g/mol，70℃加热回流至液体澄清，逐滴加入119g/L的NaOH溶液，10mL左右，调节溶液pH至5～6之间；滴加完后升温至78℃继续回流搅拌30min；冷却至室温后减压抽滤，水洗2次后再用乙醇洗涤2次；所得的滤饼转移至烘箱中，60 ℃条件下干燥12h，可得白色粉末状稀土硬脂酸盐前驱体。
3)稀土掺杂上转换纳米材料(油酸包覆的UCNPs)的合成：取100mL三颈烧瓶，加入步骤2)制得的稀土硬脂酸盐(Y 78wt％，Yb 20wt％，Er 2wt％) 0.8mmol，NaF 28mmol，油酸(OA)12mL，十八烯(ODE)8mL，氩气氛围中回流加热至140℃，保持30min进行脱水脱气；然后迅速升温至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000rpm离心3min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥，得到油酸包覆的UCNPs。UCNPs的TEM及XRD表征图如图1和图2所示。
4)0.01M NOBF4(四氟硼酸亚硝)的DMF溶液的制备：称取0.1168g NOBF4置于一洁净烧杯中，加入少量DMF溶解完全后，倒入100mL容量瓶，用DMF 定容至100mL，室温储存备用。
5)BF4 -修饰UCNPs：称取10mg步骤3)制得的油酸包覆的UCNPs，超声分散在2mL环己烷中，加入2mL步骤4)制得的NOBF4的DMF溶液。轻轻摇动10min，静置分层，将上方己烷层除去。加入甲苯和己烷(1:1，v/v)共2ml 纯化，离心11000r/min，5min。DMF洗一次，沉淀烘干备用。
6)EpCAM蛋白的DNA适配体系列：EpCAM-1的碱基序列为： 5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGT-3’以及EpCAM-2的碱基序列为： 5’-CCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’，购买厂家：Sangon Biotech Co., Ltd.(Shanghai,China)；外泌体蛋白：由MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)提取，购买厂家：China Center forType Culture Collection in Shanghai。下述的TAMRA 为四甲基罗丹明。
7)MDA-MB-231外泌体提取：乳腺癌MDA-MB-231细胞株以含有5wt％胎牛血清、1wt％青霉素和10μg/mL链霉素的RPMI-1640(购买厂家：Hyclone) 为培养基在37℃，含有5wt％二氧化碳的培养箱中培养。换液时均使用PBS溶液清洗细胞分泌物。
上述的乳腺癌MDA-MB-231细胞株的筛选：选择生长状态良好，密度较大的细胞，使用不含胎牛血清的培养基进行孵育，待48h后进行离心，离心温度均为4℃，程序为300g离心10min去除死细胞，2000g离心20min去除细胞碎片，11000g离心45min去除蛋白质，100000g离心70min后弃去培养液收集外泌体沉淀，使用PBS重悬外泌体沉淀后需要再次100000g离心70min，最后用少量PBS重悬，-20℃保存备用。
8)UCNPs修饰EpCAM-1：取步骤5)制得的BF4 -修饰UCNPs配置成浓度为1mg/mL的BF4 --UCNPs的水溶液500μL，加入至小玻璃瓶中，加入1.5nmol 的EpCAM-1，加纯水使最终体积为1mL，UCNPs修饰的EpCAM-1的最终浓度为1.5μM，4℃搅拌过夜。8000r/min超滤离心5min，沉淀水洗两次，重分散在500μL纯水中，4℃保存备用。UCNPs修饰的EpCAM-1紫外表征图如图3所示。
9)基于荧光共振能量转移的生物传感器的制备：5mL的EP管中分别加入5 μL浓度为1.5μM步骤7)制备的EpCAM-1-UCNPs、0.25μM的 EpCAM-2-TAMRA(购买厂家：SangonBiotech Co.,Ltd.(Shanghai,China))最后加Tris盐酸缓冲液(Tris-HCl 10mM,NaCl100mM)成100μL溶液，28℃振荡1h，检测其荧光强度，即得荧光传感器。
实例2：
本发明的实例1制得的荧光传感器用于检测外泌体，图4为外泌体透射电镜表征图，具体的检测方法为：将含有EpCAM-1-UCNPs与EpCAM-2-TAMRA于溶液中混匀，将不同浓度的MDA-MB-231外泌体(0，1×103，1×104，1×105， 1×106，1×107，1×108个/mL)分别加入含EpCAM-1-UCNPs和 EpCAM-2-TAMRA的Tris盐酸缓冲液中，28℃振荡1h后，测量其荧光强度。如图5所示，随着外泌体浓度(图中A到G为不同浓度的外泌体(0，1×103，1 ×104，1×105，1×106，1×107，1×108particles/mL)的增加，585nm处的荧光强度逐渐增加。图6是外泌体检测的拟合线性关系图，由图可知外泌体浓度和荧光能量共振转移产生的585nm处荧光的强度呈良好的线性关系，线性方程为 G＝22.6321c-56.2021(r＝0.9989)，G为585nm处的荧光强度(已扣除背景)，c 为外泌体的浓度，其基于3σ法的检测限为80particles/mL。图7为基于UCNPs 与TAMRA的荧光共振能量转移(LRET)的原理图。
以上所述仅为本发明的较佳的实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。

Claims (4)

1.一种用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器，其特征在于：包括UCNPs、TAMRA 修饰的EpCAM-2和UCNPs修饰的EpCAM-1（DNA），所述的EpCAM-1的DNA序列为：5’-CACTACAGAGGTTGCGTCTGT-3’, 5’端修饰-COOH；EpCAM-2的碱基序列为： 5’-CCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3’, 3’ 端修饰TAMRA；
携带UCNPs和TAMRA的两条不同的EpCAM蛋白适配体DNA链（EpCAM-1-UCNPs，EpCAM-2-TAMRA），能识别到外泌体表面的EpCAM蛋白并结合到该蛋白上，形成发夹结构，导致UCNPs与TAMRA之间的距离拉近到小于10 nm，从而发生荧光共振能量转移，当在980 nm近红外光激发下，TAMRA会发出黄色荧光，利用585 nm处荧光强弱的变化，能进行溶液中外泌体的定量分析。
2.一种制备如权利要求1所述的用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）稀土掺杂上转换纳米材料的合成：加含量是Y 78%，Yb 20%，Er 2%的稀土硬脂酸盐0.8 mmol，NaF 28 mmol，油酸（OA）12 mL，十八烯（ODE）8 mL于100 mL三颈烧瓶，氩气氛围中回流加热至135℃~145℃，保持30 min进行脱水脱气；然后迅速升温至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000 rpm离心3 min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥，获得油酸包覆的UCNPs；
2）BF4 -修饰UCNPs：称取10 mg步骤1）制得的油酸包覆的UCNPs，超声分散在2 mL环己烷中，加入2 mL NOBF4的DMF溶液，轻轻摇动10 min，静置分层，将上方己烷层除去，加入体积比为1:1的甲苯和环己烷混合溶剂共2 mL纯化，离心11000 r/min，5 min，DMF洗一次，沉淀烘干备用；
3）EpCAM-1修饰UCNPs：取1 mg/mL 步骤2）制得的BF4 --UCNPs的水溶液500 μL，加入至小玻璃瓶中，加入1.5 nmol的EpCAM-1，加纯水使最终体积为1 mL， UCNPs修饰的EpCAM-1的EpCAM-1-UCNPs最终浓度为1.5 μM，4℃搅拌过夜，8000 r/min超滤离心5 min，沉淀水洗两次，重分散在500 μL纯水中，4℃保存备用；
4 ）5ml的EP管中分别加入5 μL步骤3）制得的浓度为1.5 μM EpCAM-1-UCNPs、0.25 μM的EpCAM-2-TAMRA最后加配比为Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM的Tris盐酸缓冲液配置成100 μL溶液，28℃振荡1 h，检测其荧光强度，即得荧光传感器，用于检测其荧光强度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的BF4 -修饰UCNPs的制备方法，包括如下步骤：
1）含量为Y 78%，Yb 20%，Er 2%的稀土硬脂酸盐的制备：将稀土硝酸盐乙醇溶液与浓度为284.48 g/mol的硬脂酸(十八酸)17.0688 g加入到250 mL三颈烧瓶中；70℃加热回流至液体澄清，逐滴加入119 g/L的NaOH溶液，10 mL左右，调节溶液pH至5～6之间；滴加完后升温至78℃ 继续回流搅拌30 min；冷却至室温后减压抽滤，水洗2次后再用乙醇洗涤2次；所得的滤饼转移至烘箱中，60℃ 条件下干燥 12 h，得白色粉末状稀土硬脂酸盐前驱体；
2）油酸包覆的UCNPs的合成：取100 mL三颈烧瓶，加入步骤1）制得的稀土硬脂酸盐（Y78wt%，Yb 20wt%，Er 2wt%）0.8 mmol，NaF 28 mmol，油酸（OA）12 mL，十八烯（ODE）8 mL，氩气氛围中回流加热至140℃，保持30 min进行脱水脱气；然后迅速升温至314℃，保持反应45min后冷却至室温，所得产物11000 rpm离心3 min后弃去上清液，沉淀用乙醇、环己烷、纯水离心洗涤至无NaF成分，70℃真空干燥，得到油酸包覆的UCNPs；
3）0.01 M NOBF4的DMF溶液的制备：称取0.1168 g NOBF4置于一洁净烧杯中，加入少量DMF溶解完全后，倒入100 mL容量瓶，用DMF定容至100 mL，室温储存备用；
4）BF4 -修饰UCNPs：称取10 mg步骤2）制得的油酸包覆的UCNPs，超声分散在2 mL环己烷中，加入2 mL 步骤3）制得的NOBF4的DMF溶液，轻轻摇动10 min，静置分层，将上方己烷层除去，加入体积比为1:1的甲苯和己烷混合溶剂共2 ml纯化，离心11000 r/min，5 min，DMF洗一次，沉淀烘干获得BF4 -修饰UCNPs，备用。
4.权利要求1所述的一种用于外泌体浓度检测的荧光生物传感器或权利要求2或3所述的方法制得的荧光传感器用于检测外泌体，其特征在于：将不同浓度的MDA-MB-231外泌体分别加入含EpCAM-1-UCNPs和EpCAM-2-TAMRA的Tris盐酸缓冲液中，28℃振荡1 h后，测量其荧光强度；随着外泌体浓度的增加，585 nm处的荧光强度逐渐增加；外泌体浓度和荧光能量共振转移产生的585 nm处荧光的强度呈良好的线性关系，线性方程为G=22.6321c-56.2021，r=0.9989，G为585 nm处的已扣除背景的荧光强度，c为外泌体的浓度，其基于3σ法的检测限为80 particles/mL。
CN201811077538.7A 2018-09-15 2018-09-15 基于上转换荧光的能量共振转移技术用于外泌体的检测 Active CN109187473B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811077538.7A CN109187473B (zh) 2018-09-15 2018-09-15 基于上转换荧光的能量共振转移技术用于外泌体的检测

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811077538.7A CN109187473B (zh) 2018-09-15 2018-09-15 基于上转换荧光的能量共振转移技术用于外泌体的检测

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109187473A true CN109187473A (zh) 2019-01-11
CN109187473B CN109187473B (zh) 2021-02-19

Family

ID=64911536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811077538.7A Active CN109187473B (zh) 2018-09-15 2018-09-15 基于上转换荧光的能量共振转移技术用于外泌体的检测

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109187473B (zh)

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110229165A (zh) * 2019-05-31 2019-09-13 苏州科技大学 上转换荧光探针罗丹明衍生物及其应用
CN111410950A (zh) * 2020-02-25 2020-07-14 常州诺达生化科技有限公司 一种双嵌段dna修饰上转换纳米颗粒及其制备方法和应用
CN112129939A (zh) * 2020-08-05 2020-12-25 宁波大学 基于Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子富集和PSMA传感器检测前列腺癌外泌体的方法
CN112375561A (zh) * 2020-10-27 2021-02-19 中南民族大学 上转换荧光纳米探针及其应用
CN112649605A (zh) * 2020-12-14 2021-04-13 哈尔滨理工大学 一种基于NaBiF4上转换纳米粒子的ECL生物传感器
CN112763708A (zh) * 2020-12-24 2021-05-07 生物岛实验室 外泌体检测方法
CN112782138A (zh) * 2020-12-24 2021-05-11 生物岛实验室 用于检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用
CN112945923A (zh) * 2021-02-03 2021-06-11 长沙理工大学 一种界面增敏型检测试剂及其制备方法和应用
CN113985038A (zh) * 2021-10-19 2022-01-28 福州市第二医院（福建省福州中西医结合医院、福州市职业病医院） 一种生物传感器及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160299076A1 (en) * 2015-04-08 2016-10-13 Molecular Devices, Llc Method and system for multiplexed time-resolved fluorescence detection
CN108169199A (zh) * 2018-02-09 2018-06-15 大连理工大学 一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160299076A1 (en) * 2015-04-08 2016-10-13 Molecular Devices, Llc Method and system for multiplexed time-resolved fluorescence detection
CN107709975A (zh) * 2015-04-08 2018-02-16 分子装置有限公司 荧光检测方法和系统
CN108169199A (zh) * 2018-02-09 2018-06-15 大连理工大学 一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORIACHEK K,ET AL: "Biological Functions and Current Advances in Isolation and Detection Strategies for Exosome Nanovesicles", 《NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE》 *
刘映昕: "基于上转换荧光的生物传感技术用于外泌体及谷胱甘肽的检测", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110229165B (zh) * 2019-05-31 2020-11-06 苏州科技大学 上转换荧光探针罗丹明衍生物及其应用
CN110229165A (zh) * 2019-05-31 2019-09-13 苏州科技大学 上转换荧光探针罗丹明衍生物及其应用
CN111410950A (zh) * 2020-02-25 2020-07-14 常州诺达生化科技有限公司 一种双嵌段dna修饰上转换纳米颗粒及其制备方法和应用
CN111410950B (zh) * 2020-02-25 2023-04-07 常州诺达生化科技有限公司 一种双嵌段dna修饰上转换纳米颗粒及其制备方法和应用
WO2022027976A1 (zh) * 2020-08-05 2022-02-10 宁波大学 基于Fe 3O 4@SiO 2@TiO 2纳米粒子富集和PSMA传感器检测前列腺癌外泌体的方法
CN112129939A (zh) * 2020-08-05 2020-12-25 宁波大学 基于Fe3O4@SiO2@TiO2纳米粒子富集和PSMA传感器检测前列腺癌外泌体的方法
CN112375561A (zh) * 2020-10-27 2021-02-19 中南民族大学 上转换荧光纳米探针及其应用
CN112649605A (zh) * 2020-12-14 2021-04-13 哈尔滨理工大学 一种基于NaBiF4上转换纳米粒子的ECL生物传感器
CN112649605B (zh) * 2020-12-14 2022-11-01 哈尔滨理工大学 一种基于NaBiF4上转换纳米粒子的ECL生物传感器
CN112763708B (zh) * 2020-12-24 2022-02-11 生物岛实验室 外泌体检测方法
CN112782138B (zh) * 2020-12-24 2021-10-29 生物岛实验室 用于检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用
CN112782138A (zh) * 2020-12-24 2021-05-11 生物岛实验室 用于检测细胞外囊泡的试剂盒及其应用
CN112763708A (zh) * 2020-12-24 2021-05-07 生物岛实验室 外泌体检测方法
CN112945923A (zh) * 2021-02-03 2021-06-11 长沙理工大学 一种界面增敏型检测试剂及其制备方法和应用
CN113985038A (zh) * 2021-10-19 2022-01-28 福州市第二医院（福建省福州中西医结合医院、福州市职业病医院） 一种生物传感器及其制备方法和应用
CN113985038B (zh) * 2021-10-19 2023-04-21 福州市第二医院（福建省福州中西医结合医院、福州市职业病医院） 一种生物传感器及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109187473B (zh) 2021-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109187473A (zh) 基于上转换纳米材料和四甲基罗丹明的荧光能量共振转移用于外泌体的检测
Wang et al. DNase I enzyme-aided fluorescence signal amplification based on graphene oxide-DNA aptamer interactions for colorectal cancer exosome detection
CN110095608B (zh) 基于磁性分离和dna自组装的肿瘤外泌体纳米荧光传感器
Zhang et al. DNA nanomachine-based regenerated sensing platform: a novel electrochemiluminescence resonance energy transfer strategy for ultra-high sensitive detection of microRNA from cancer cells
Liu et al. Core–shell Fe3O4–Au magnetic nanoparticles based nonenzymatic ultrasensitive electrochemiluminescence immunosensor using quantum dots functionalized graphene sheet as labels
Zhang et al. Recent advances in nanomaterial-based biosensors for the detection of exosomes
Su et al. Aptamer-Based electrochemiluminescent detection of MCF-7 cancer cells based on carbon quantum dots coated mesoporous silica nanoparticles
CN104880456B (zh) 一种基于GO/MWCNTs-COOH/Au@CeO2构建的电化学发光免疫传感器的制备方法及应用
Ma et al. A label-free electrochemiluminescence immunosensor based on EuPO4 nanowire for the ultrasensitive detection of Prostate specific antigen
Fang et al. Amplified using DNase I and aptamer/graphene oxide for sensing prostate specific antigen in human serum
CN108469445B (zh) 用于无背景检测血液中癌症抗原含量的基于x射线激发的镧系荧光纳米粒子的试剂盒及制备
CN107356570B (zh) 一种固态上转换荧光探针及其制备方法与应用
CN107287297A (zh) 基于碳量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移检测氧化损伤dna的方法
Xu et al. Advances in biosensing technologies for analysis of cancer-derived exosomes
Xu et al. Immunoassay of SARS-CoV-2 nucleocapsid proteins using novel red emission-enhanced carbon dot-based silica spheres
CN105628672A (zh) 一种通过sers信号快速检测外泌体的方法
Xu et al. Fluorescent detection of emerging virus based on nanoparticles: From synthesis to application
Xie et al. A novel binary luminophore based high-efficient electrochemiluminescence biosensor for ultrasensitive detection of human epidermal growth factor receptor-2
CN108896638B (zh) 一种基于二氧化钛掺杂石墨烯负载海参状金钯核壳纳米粒子的免疫传感器的制备方法及应用
Wang et al. Electrochemiluminescent TiO 2/CdS nanocomposites for efficient immunosensing of HepG2 cells
Li et al. Rapid and specific detection nanoplatform of serum exosomes for prostate cancer diagnosis
Gao et al. Electrochemiluminescence immunosensor for cancer antigen 125 detection based on novel resonance energy transfer between graphitic carbon nitride and NIR CdTe/CdS QDs
CN114397343A (zh) 肿瘤标志物活性检测试剂盒、检测方法及其应用
Zhu et al. Turn-on fluorescent assay based on purification system via magnetic separation for highly sensitive probing of adenosine
CN113203718B (zh) 一种基于荧光共振能量转移的gpc3检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant