CN112763708B - 外泌体检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种外泌体检测方法，包括：提供包被有dsDNA的载体，所述dsDNA由能够特异性结合待检测外泌体靶标的核酸适配体与其互补探针杂交得到；所述核酸适配体与所述互补探针中的其一偶联有信号基团，另一个偶联有淬灭基团，所述dsDNA中所述信号基团与所述淬灭基团互相作用而失去信号；将所述载体与离心式微流控芯片富集得到的外泌体接触，当所述靶标存在时，所述核酸适配体与靶标结合形成比dsDNA结果更稳定的核酸适配体‑靶标复合物，并使得所述信号基团暴露，通过对所述信号基团进行检测以表征含有所述靶标的外泌体。

Description

外泌体检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种外泌体检测方法。
背景技术
外泌体是由活细胞分泌大小约为30nm～200nm的细胞外囊泡。外泌体中含有多种重要物质，包括蛋白质、RNA、脂质等，携带了原始细胞上丰富的分子信息，外泌体被认为是早期肿瘤诊断的潜在标志物。因此，开发肿瘤外泌体灵敏和特异性的检测是至关重要的。
核酸适配体(aptamer)是上世纪90年代出现的一种具有识别功能的分子。它是指可以与待测物特异性结合的单链寡聚核苷酸链。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术从体外筛选得到的，可以是单链DNA也可以是RNA。单链核酸空间构象的多样性导致了核酸适配体与待测物的特异性结合。当目标物存在时，在静电作用、氢键作用或是某些碱基的互补配对作用下，单链核酸形成稳定的三维空间结构，如发卡、假结、G-四分体、凸环。核酸适配体的发现为目标物质的检测带来了方便，因此，适配体被广泛应用于生物分析，环境检测，药物研发等领域。
目前，许多方法被用于检测外泌体，如纳米颗粒跟踪仪(NTA)、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞仪、电化学等。上述方法或者需要昂贵的大型仪器，或者需要复杂的操作步骤。此外，检测外泌体的方法还包括酶联免疫分析、免疫印迹分析，虽然利用此方法能得到较高的检测灵敏度，但抗体蛋白易受pH、温度等环境因素影响而变性、且价格昂贵。
发明内容
本发明涉及一种外泌体检测方法，所述方法包括：
提供包被有dsDNA的载体，所述dsDNA由能够特异性结合待检测外泌体靶标的核酸适配体与其互补探针杂交得到；
所述核酸适配体与所述互补探针中的其一偶联有信号基团，另一个偶联有淬灭基团，所述dsDNA中所述信号基团与所述淬灭基团互相作用而失去信号；
将含有外泌体的样本施加到载体上，样本中的外泌体与其核酸适配体结合，释放出互补探针，信号恢复，根据所述信号的强度得出样本中外泌体浓度。
所述外泌体检测方法用于疾病诊断治疗或非疾病诊断治疗目的。
本发明还涉及一种成套产品，其包括如上所述外泌体检测方法中所定义的载体和离心式微流控芯片。
本发明的有益效果为：
本发明实现了微流控芯片分离得到的外泌体的直接快速的检测。该方法设计简单、简便，检测快速，对核酸适配体分子的大小和空间结构无特别要求，具有普遍应用性，因而也具有很好的应用前景。微流控芯片对样本中的外泌体进行分离富集，提高了样本中外泌体的可检测浓度，结合核酸适配体对外泌体的特异靶向性以及荧光分析方法，提高了外泌体的检测灵敏度和准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的检测原理示意图；
图2为一实施例的离心式微流控芯片的结构示意图；
图3为一实施例的离心式微流控芯片的顶板示意图；
图4为一实施例的外泌体的提取方法中离心示意图；
图5为一实施例提取到的外泌体的粒径统计图；
图6为一实施例提取到的外泌体的电镜图；
图7为一实施例的外泌体荧光检测结果图；
图8为一实施例的不同浓度的外泌体对应的荧光曲线。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明涉及一种外泌体检测方法，所述方法包括：
提供包被有dsDNA的载体，所述dsDNA由能够特异性结合待检测外泌体靶标的核酸适配体与其互补探针杂交得到；
所述核酸适配体与所述互补探针中的其一偶联有信号基团，另一个偶联有淬灭基团，所述dsDNA中所述信号基团与所述淬灭基团互相作用而失去信号；
将含有外泌体的样本施加到载体上，样本中的外泌体与其核酸适配体结合，释放出互补探针，信号恢复，根据所述信号的强度得出样本中外泌体浓度。
当所述靶标存在时，所述核酸适配体与靶标结合形成比dsDNA结果更稳定的核酸适配体-靶标复合物，并使得所述信号基团暴露，通过对所述信号基团进行检测以表征含有所述靶标的外泌体，进而确定外泌体的浓度，当然，也可以进行定性判断，仅判断外泌体的有无。
其中，在一些实施方式中，所述样本中的外泌体通过离心式微流控芯片富集得到，所述离心式微流控芯片包括至少一个外泌体提取机构。
所述外泌体通过如下方法富集：将样本液加至所述离心式微流控芯片的进样单元；控制所述离心式微流控芯片的转速，使所述样本液经过所述捕获释放单元，且使所述样本液中的外泌体被捕获；
将被所述捕获释放单元捕获的外泌体释放至所述富集单元；
在一些实施方式中，所述提取机构包括进样单元、捕获释放单元以及富集单元；所述富集包括控制所述离心式微流控芯片的转速，使所述样本液经过所述捕获释放单元，所述样本液中的外泌体被捕获，将被所述捕获释放单元捕获的外泌体释放至所述富集单元；将所述富集单元富集到的外泌体添加至载体上进行检测。
在本发明中，“信号基团”泛指能被检测到的信号物质，“淬灭基团”则泛指能与所述信号基团作用使得所述信号基团无法被检测到的物质，通常需要信号基团和淬灭基团在物理位置上足够近，随着二者的远离或接近，信号物质的检测转态可以在“打开”和“关闭”状态直接进行转换。这样的物质例如能够实现荧光共振能量转移的供体-受体对。
在一些实施方式中，所述信号基团为荧光发射基团，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。
在一些实施方式中，所述荧光发射基团选自FAM、HEX、TET、NED、ROX、CY5、CY3、Texas Red、TFAM、SYBR Green I、VIC以及JOE中的任一种；
在一些实施方式中，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ、Dabcyl、Eclipse以及NFQ-MGB中的任一种。
在一些实施方式中，所述靶标选自CD63、CD9、CD81、HSP70、Tsg101、EpCam、flotillin、Syntenin、Alix、HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5以及a-1AT中的至少一种。
在一些实施方式中，所述载体为吸水性载体。
在一些实施方式中，所述载体为纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或塑料膜；进一步的，所述塑料膜为尼龙膜或聚苯乙烯。
在一些实施方式中，所述包被的方法为，将所述dsDNA滴加在所述载体上，50℃～60℃，例如52℃、54℃、56℃、58℃，干燥。
由于外泌体存在于原核生物和真核生物中，并且跨越所有的进化，所以本发明可以使用得自原核生物、真核生物、细菌、真菌、酵母、无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物、鱼、昆虫、植物或动物(包括哺乳动物，例如啮齿动物和灵长目动物)的任何组合物。例如样本液来源可以为鸡、小鼠、大鼠、兔、山羊、羔羊、绵羊、马、猪、牛(胎牛)和人类。样本液的优选的实例为鼠、牛或人类，其用于制备分别为鼠、牛或人类的细胞胞外囊泡；更优选的，所述样本液来源于人类。
在一些实施方式中，所述样本液选自细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、胸腔液、尿、精液、卵泡液、宫腔液、胆汁、羊水、阴道分泌物、唾液、痰或者从生物组织样品得到的澄清的裂解液。
所述样本液可以是新鲜的或事先冷冻的，然后解冻。
在一些实施方式中，所述样本液在基本上不破坏外泌体形态学特征或功能特征或者细胞表面抗原的条件下被分离；
上述，外泌体在所述组合物中应该保持了它们的原始抗原图谱，这样它们是“抗原性完整的”，由此被检测的外泌体才能用以分析其浓度/粒径。
外泌体的富集方式可通过密度梯度离心、超速离心、超滤、聚乙二醇沉淀中的任一种方法进行。
如图1所示，在一个具体示例中，在本发明所提供的离心式微流控芯片200种，捕获释放单元包括装载液池25、孵育池26、载体过滤池27和洗脱液池28，装载液池25用于加装含有能够与提取目标物结合的载体的装载液。孵育池26分别与样品池10和装载液池25连接。洗脱液池28用于加装能够使提取目标物与载体分离的洗脱液。载体过滤池27分别与孵育池26和洗脱液池28连接，且载体过滤池27中设有用于截留载体的载体滤膜271。装载液池25、孵育池26、载体过滤池27自旋转中心近心端至远心端依次分布。
该离心式微流控芯片200在使用时，可将样本液加至进样单元，装载液池25加装有装载液，洗脱液池28加装有洗脱液。然后通过控制离心式微流控芯片200的转速，使样本液和装载液到达孵育池26进行孵育，装载液中的载体与样本液中的提取目标物如外泌体结合。然后通过顺时针或逆时针旋转离心使样本液和装载液从孵育池26释放至载体过滤池27，并经过载体滤膜271使载体及其结合的提取目标物被载体滤膜271截留。接着通过与前一步相反的方向旋转离心以将洗脱液释放至载体过滤池27，并经过载体滤膜271使提取目标物在洗脱液的作用下与载体分离，然后收集洗脱液即可得到提取目标物。本发明通过离心式微流控芯片200仅需一次加样，通过控制芯片旋转，即可达到快速提取外泌体的目的，并可方便地将提取得到的外泌体进行后期运用。采用离心式微流控芯片200的提取过程操作简便，提取速度快效率高，试剂用量低，提取得到的外泌体量大，解决了传统提取方式操作繁杂，需要多次加样换样，耗费时间长等不足，可以节省试剂的消耗，缩短提取时间，降低提取成本。
可以理解，离心式微流控芯片200的中部为旋转安装部，离心式微流控芯片200的旋转中心即离心操作时的转动中心。可以理解，载体上可以通过偶联目标物捕获物质来捕获提取目标物，从而使提取目标物与载体被载体滤膜271截留，洗脱液则可以使样本液中的提取目标物与载体解离，从而被冲洗至目标物池60。
可选地，离心式微流控芯片200大致呈圆形，包括两个绕圆心均匀分布的提取机构，可以同时提取2个样本，适用于全血、血浆、唾液等各种液体样本。当然，在其他实施方式中，离心式微流控芯片200还可以是其他形状，例如矩形、多边形等等。离心式微流控芯片200上的提取机构的数量还可以为一个、两个、四个、五个、七个等等。
在一个具体示例中，进样单元包括加样孔11和样品池10，加样孔11与样品池10连接以用于向样品池10输入样本液，样品池10用于存储样本液。
在一个具体示例中，富集单元包括分别与载体过滤池27连接的目标物池60和废液池70和检测孔80，目标物池60用于收集来自载体过滤池27的提取目标物，废液池70用于收集来自载体过滤池27的废液，检测孔80用于储存外泌体并提供检测外泌体的场所。优选地，目标物池60、废液池70和检测孔80沿旋转方向分别设于载体过滤池27的两侧，即一个位于载体过滤池27出口的顺时针方向一侧，另一个位于载体过滤池27出口的逆时针方向一侧。
在一个具体示例中，捕获释放单元还包括分离池21，样品池10通过分离池21与孵育池26连接，样品池10分离池21和孵育池26自旋转中心近心端到远心端依次分布。如此，以全血等为样本液时，可以先将样本液释放至分离池21，通过离心使全血在分离池21中分离出血浆(靠近旋转中心一侧)，而血细胞等沉淀则位于远离旋转中心一侧，有利于防止血细胞等进入孵育池26，提高提取效率及灵敏度。
在一个具体示例中，分离池21包括第一腔室、连接部和第二腔室，第一腔室通过连接部与第二腔室连接，且连接部的内径小于第一腔室和第二腔室的内径，第一腔室、连接部和第二腔室从近心端到远心端依次分布。如此，分离池21由上下两个腔室组成，中间则呈缩颈状，有利于第一腔室(即靠近旋转中心的上腔室)的定量控制，减少了血浆的损耗量，并能有效保证第二腔室(即远离旋转中心的第二腔室)的血细胞不会流至下游，简而言之就是若不做此缩颈状设计，离心后上部分血浆(近旋转中心)与下部分血细胞(远离旋转中心)的界面会很大，若要从中定量取50μL血浆，则分离池21的出口位置要尽可能靠近旋转中心以远离血浆与血细胞界面，防止取到血细胞，那么下面就会有很多剩余血浆。另外因为界面大，界面不稳，使得取出的量可能会增多。优选地，下游的腔室与分离池21的连接部连接，以更好地使分离的血浆进入后续提取分离过程。可选地，样品池10的容量为140μL～200μL，第一腔室的容量为50μL。
在一个具体示例中，自旋转中心近心端到远心端，捕获释放单元还包括用于加装样本稀释液的稀释液池22和稀释混合池23，稀释液池22与稀释混合池23连接，分离池21通过稀释混合池23与孵育池26连接。如此，可将稀释液和样本液释放至稀释混合池23进行混匀，通过稀释液池22中的稀释液对样本液进行稀释，以便于后续更好地与装载液混合孵育。
在一个具体示例中，捕获释放单元还包括杂质过滤池24，稀释混合池23通过杂质过滤池24与孵育池26连接，杂质过滤池24中设有用于截留杂质的杂质滤膜241。如此，可将稀释后的样本液释放至杂质过滤池24并通过杂质滤膜241进行过滤除去混杂的血细胞等杂质，以便于更好地与装载液混合孵育。
可选地，载体滤膜271的孔径为0.22μm，杂质滤膜241的孔径为4～6μm。可以理解，载体粒径大于载体滤膜271的孔径。
在一个具体示例中，捕获释放单元还包括缓冲池29，洗脱液池28通过缓冲池29与载体过滤池27连接，洗脱液池28、缓冲池29和载体过滤池27自旋转中心近心端至远心端依次分布。如此，通过在洗脱液池28和载体过滤池27之间再设置缓冲池29，可以增强流体过程控制能力。
在一个具体示例中，捕获释放单元还包括余样池30，余样池30与分离池21靠近旋转中心的一端连接。如此，在将样本液加入样品池10后进行离心时，多余的样本液会进入旁边的余样池30，避免样本液过多。
在一个具体示例中，捕获释放单元还包括流向选择池31，目标物池60、废液池70和检测孔80分别通过流向选择池31与载体过滤池27的出口连接，液体由载体过滤池2流向流向选择池31，再由流向选择池31流向目标物池60或废液池70和检测孔80。如此，液体经过载体过滤池27后先到达流向选择池31，然后根据离心的旋转方向可以更好地流向目标物池60或废液池70或和检测孔80。
在一个具体示例中，载体过滤池27具有膜前入口部和膜后出口部，膜前入口部和膜后出口部之间的底壁开设有放膜槽，载体滤膜271嵌设于放膜槽，从而有利于有效地稳固滤膜。可选地，杂质过滤池24也具有膜前入口部和膜后出口部，膜前入口部和膜后出口部之间的底壁开设有放膜槽，杂质滤膜241嵌设于放膜槽。可选地，载体滤膜271和杂质滤膜241均贴于硬质基板上，并连同硬质基板一起嵌设于放膜槽中，从而可以克服滤膜薄，容易变形的问题，该操作简便，有效地将滤膜稳固地置于流路中。可选地，膜前入口部和膜后出口部的深度(芯片厚度方向)为0.1mm～7.8mm，放膜槽的深度为0.2mm～7.8mm，放膜槽的宽度为0.2mm～5mm。
在一个具体示例中，分离池21与稀释混合池23之间通过第一通道101连接，稀释液池22与稀释混合池23之间通过第二通道102连接，装载液池25与孵育池26之间通过第三通道103连接，洗脱液池28与缓冲池29之间通过第四通道104连接，缓冲池29与载体过滤池27之间通过第五通道105连接，孵育池26与载体过滤池27之间通过第六通道106连接。如此，在高速离心时，离心力较大，离心力大于毛细力，通道未能填充满样品液体，虹吸现象不能触发，当降低离心力在合适范围内时，毛细力大于离心力，触发虹吸现象，从而可通过离心来控制液体的流动。
在一个具体示例中，第一通道101、第二通道102、第三通道103、第四通道104、第五通道105和第六通道106均交替地朝向旋转中心和离心式微流控芯片200的边缘弯折，从而形成一个或多个倒U型结构，且第二通道102、第三通道103、第四通道104和第五通道105在每段朝向旋转中心延伸的部分均设有毛细阀。可以理解，各通道向离心式微流控芯片200的边缘弯折处的位置相对于其上游的腔室更靠近旋转中心。可选地，各通道的深度(芯片厚度方向)可为0.2mm，毛细阀的形状为圆形、方形或各种多边形，直径均为1.5mm，深度(芯片厚度方向)可为0.5mm。
在如图2所示的实施例中，第一通道101、第二通道102、第三通道103、第五通道105和第六通道106朝向旋转中心弯折的次数均为1次，即分别形成1个倒U型结构，第四通道104朝向旋转中心弯折的次数为2次，即形成两个倒U型结构。第四通道104采用两级弯折，配合一个缓冲池29实现流体时域的过程控制，即延迟流体流入到载体过滤池27的时间。本实施例选择两级弯折配合一个缓冲池29的理由是：(1)若采用三级弯折，整体设计会简洁，但不足是弯折结构主要依靠通道的毛细力与离心力的配合实现功能化，但当流路越长，比如三级弯折结构时很难保证毛细力每次都发挥作用，通道表面性质(亲水性)略微改变则起不到阀的作用；(2)若采用一级弯折配合两个缓冲池，会使芯片设计结构变得复杂，两个缓冲池需要更多空间布局。因此，在保证毛细阀有效性的前提下，只选择两级弯折设计，并配合一个缓冲池实现流体时域控制，从而完成分布加样过程。
优选地，第一通道101的弯折部分位于分离池21的顺时针一侧，第二通道102的弯折部分位于稀释液池22的顺时针一侧。如此，可以更好地使稀释液池22与分离池21同步，即逆时针旋转从分离池21中取出血浆，此时稀释液池22中的溶液也同步流出。
在一个具体示例中，离心式微流控芯片200的中心开设有旋转孔201，用于套设在离心仪器的离心旋转轴上，从而便于对离心式微流控芯片200进行离心。可选地，装载液池25、洗脱液池28、稀释液池22均设有相应的加样孔，以便于添加相应的溶液。可选地，离心式微流控芯片200的加工方式包括CNC、激光雕刻、软光刻技术、3D打印及注塑形成模具等方式，但不限于此。
在一个具体示例中，离心式微流控芯片200包括底板和顶板，在底板上开设相应的样品池10、装载液池25、孵育池26、载体过滤池27、洗脱液池28、目标物池60、废液池70、检测孔80、分离池21、稀释液池22、稀释混合池23、杂质过滤池24、余样池30和缓冲池29等，深度(芯片厚度方向)可为2mm，相互连接的两个腔室之间通过微流道连接。另外，如图3所示，在顶板上开设有与放膜槽对应的固定槽202，从而在顶板和底板贴合时将滤膜更好地密封固定。
本发明一实施方式的外泌体的提取方法，使用上述离心式微流控芯片200，包括以下步骤：
将样本液加至进样单元；控制离心式微流控芯片的转速，使样本液经过捕获释放单元，且使样本液中的外泌体被捕获；
将被捕获释放单元捕获的外泌体释放至富集单元。
在一个具体示例中，控制离心式微流控芯片200的转速的步骤包括：
(1)控制离心式微流控芯片200在第一速度下离心，使样本液从样品池10流入分离池21；
(2)按与步骤(1)相反的方向控制离心式微流控芯片200在第二速度下离心，停止旋转后顺时针启动离心直至达到第三速度后停止，再逆时针启动离心直至达到第三速度后停止离心并静置，使分离池21中的液体和稀释液池22中的液体流入稀释混合池23混合并流入杂质过滤池24，经过杂质滤膜241到达孵育池26，且装载液池25中的液体流入孵育池26与过滤后的液体混合；
(3)按与步骤(1)相同的方向控制离心式微流控芯片200在第四速度下离心，使孵育池26中的液体流入载体过滤池27，并经过载体滤膜271到达废液池70和检测孔80，载体被截留，同时洗脱液池28中的液体流入缓冲池29；
(4)按与步骤(1)相反的方向控制离心式微流控芯片200在第四速度下离心，使缓冲池29中的液体流入载体过滤池27，并经过载体滤膜271到达目标物池60。
在一个具体示例中，第一速度高于第二速度，第二速度高于第三速度，第四速度高于第三速度。优选地，第一速度为4000～7000转/min，第二速度为3000～5000转/min，第三速度为1500～4000转/min，第四速度为7000～9000转/min。优选地，步骤(1)的离心时间为10s～3min，步骤(2)的离心时间为5s～2min、步骤(3)的离心时间为10s～1min，步骤(4)的离心时间为10s～1min。
具体地，一个从全血中提取外泌体的方法的实施例如下：
首先，样本池10中预装全血，稀释液池22中预装PBS溶液(由于第二通道102上毛细阀的存在，PBS溶液仅在毛细力的作用下填充了毛细阀和稀释液池22之间的流路)，装载液池25中预装装载液(由于第三通道上毛细阀的存在，装载液仅在毛细力的作用下填充了毛细阀和装载液池25之间的流路)，洗脱液池28中预装洗脱液(由于第四通道上毛细阀的存在，洗脱液仅在毛细力的作用下填充了下游第一个毛细阀与洗脱液池28之间的流路)。
然后，如图4中0～t1段所示，控制离心式微流控芯片200顺时针5000转/min旋转1min后停止，全血溶液从样品池10流入分离池21中，多余全血流入余样池30，并在分离池21中分离得到血浆，血浆位于分离池21靠近旋转中心的第一腔室中，远离旋转中心的第二腔室中由血细胞、白细胞等填充。同时，在高速旋转中，第二通道102、第三通道103和第四通道104上的一个毛细阀突破，离心式芯片停止旋转时在毛细力的作用下，第二通道102、第三通道103及第四通道104两个毛细阀中间流路均被填充。
然后，如图4中t2～t4段所示，启动离心机，控制芯片逆时针4000转/min旋转1min后停止旋转，并开始正向启动达到3000转/min后减速停止，又开始反向加速到3000转/min后减速停止。在高速旋转过程中，分离池21中的血浆在虹吸力的作用下流入稀释混合池23，与稀释液池22中流出的PBS稀释剂溶液在稀释混合池23中混合并流入杂质过滤池24，过膜后进入到孵育池26中停留，装载液池25中装载液也流入到孵育池26中与稀释后的血浆溶液混合，在混合过程中血浆和装载液完成孵育。
然后，如图4中t5～t6所示，混合完成后停止芯片转动，静置一会，此时第六通道106在毛细力的作用下被混合液填充，第四通道104被洗脱液完全填充。启动芯片顺时针8000转/min旋转30s后停止，孵育池26中的混合液流过载体滤膜271，并在流向选择池31中选择进入到废液池70和检测孔80中。同时，在高速旋转下，洗脱液池28中的洗脱液流进缓冲池29中，并突破第五通道105上的毛细阀，停止一段时间后，缓冲池29中的洗脱液填充满第五通道105。
然后，如图4中t7～t8所示，启动芯片逆时针8000转/min旋转30s后停止，缓冲池29中的洗脱液流过载体滤膜271，并在流向选择池31中选择进入到目标物池60中。
经过实验测试，经100μL洗脱液进行洗脱，目标物池60中最后得到约95μL的样本收集液。对样本溶液进行NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)追踪外泌体，如图5所示，在粒径110nm左右，外泌体浓度为每毫升3E+6个。对样本溶液进行电子显微镜检测(SEM)，如图6所示为外泌体电镜图。
采用上述离心式微流控芯片200，通过控制芯片旋转实现了外泌体的快速提取，仅需一次加样，即可达到提取外泌体的目的，并可方便地将提取得到的外泌体进行后期运用。采用离心式微流控芯片200的提取过程操作简便，提取速度快效率高，试剂用量低，提取得到的外泌体量大，解决了传统提取方式操作繁杂，需要多次加样换样，耗费时间长等不足，可以节省试剂的消耗，缩短提取时间，降低提取成本。
本发明还涉及一种成套产品，其包括如上所述外泌体检测方法中所定义的载体和离心式微流控芯片。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
本实施例提供了一种外泌体检测方法。
1.取1μL 100μM CD63-BHQ-1适配体(北京擎科)与1μL 100μM CD63-FAM互补探针混匀，加入98μL PBS缓冲液，于37℃旋转混匀2h。CD63-BHQ-1适配体与CD63-FAM互补探针结合，BHQ-1猝灭FAM荧光，得到无荧光的CD63适配体溶液(P1)。
CD63适配体(5’-3’)：BHQ-1-CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA；
CD63互补探针(5’-3’)：FAM-AGGTGGGGTG。
2.将滤纸(来自)裁成直径5mm的圆形纸片，将上述得到的无荧光的CD63适配体溶液取1μL滴于裁好的试纸条上，避光60℃干燥。得到载双链适配体的试纸条(P2)。其中对比例滴加PBS。
3.将载双链适配体的试纸条放入微流控芯片检测孔中。
4.微流控芯片通过分步离心(微流控芯片及其操作方法如上所示)，从全血分离得到的外泌体进入检测孔，检测孔体积40μL，孵育时间30min。
5.检测孔中试纸条上的CD63适配体与外泌体膜蛋白CD63结合，游离其带有荧光分子的CD63互补探针，释放荧光，使用多功能酶标仪进行荧光检测。激发波长495nm，发射波长521nm。
荧光检测结果如图7所示。
使用本发明针对不同浓度的外泌体检测的荧光曲线如图8所示，检测限为103个/mL外泌体。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (11)

1.外泌体检测方法，其特征在于，包括：
提供包被有dsDNA的载体，所述dsDNA由能够特异性结合待检测外泌体靶标的核酸适配体与其互补探针杂交得到；
所述核酸适配体与所述互补探针中的其一偶联有信号基团，另一个偶联有淬灭基团，所述dsDNA中所述信号基团与所述淬灭基团互相作用而失去信号；
将含有外泌体的样本施加到载体上，样本中的外泌体与其核酸适配体结合，释放出互补探针，信号恢复，根据所述信号的强度得出样本中外泌体浓度；
所述样本中的外泌体通过离心式微流控芯片富集得到，所述离心式微流控芯片包括至少一个外泌体提取机构；
所述提取机构包括进样单元、捕获释放单元以及富集单元；
所述离心式微流控芯片包括旋转中心，所述捕获释放单元与所述进样单元连接且位于所述进样单元的下游，所述富集单元与所述捕获释放单元连接且位于所述捕获释放单元的下游；
所述捕获释放单元包括装载液池、孵育池、载体过滤池和洗脱液池，所述装载液池用于加装含有能够与提取目标物结合的载体的装载液；所述孵育池分别与所述进样单元和所述装载液池连接；所述洗脱液池用于加装能够使提取目标物与所述载体分离的洗脱液；所述载体过滤池分别与所述孵育池和所述洗脱液池连接，且所述载体过滤池中设有用于截留所述载体的载体滤膜；所述装载液池、孵育池、载体过滤池自旋转中心近心端至远心端依次分布；
所述捕获释放单元还包括分离池，所述进样单元通过所述分离池与所述孵育池连接，所述进样单元、分离池和所述孵育池自旋转中心近心端到远心端依次分布；
自旋转中心近心端到远心端，所述捕获释放单元还包括用于加装样本稀释液的稀释液池和稀释混合池，所述稀释液池与所述稀释混合池连接，所述分离池通过所述稀释混合池与所述孵育池连接；
所述捕获释放单元还包括杂质过滤池，所述稀释混合池通过所述杂质过滤池与所述孵育池连接，所述杂质过滤池中设有用于截留杂质的杂质滤膜；
所述捕获释放单元还包括缓冲池，所述洗脱液池通过所述缓冲池与所述载体过滤池连接，所述洗脱液池、缓冲池和载体过滤池自旋转中心近心端至远心端依次分布；
所述富集单元包括分别与所述载体过滤池连接的目标物池和废液池和检测孔，所述目标物池用于收集来自所述载体过滤池的提取目标物，所述废液池用于收集来自所述载体过滤池的废液，检测孔用于储存外泌体并提供检测外泌体的场所；
所述进样单元包括加样孔和样品池，所述加样孔与所述样品池连接以用于向样品池输入所述样本液，所述样品池用于存储样本液；
所述富集包括控制所述离心式微流控芯片的转速，使所述样本液经过所述捕获释放单元，所述样本液中的外泌体被捕获，将被所述捕获释放单元捕获的外泌体释放至所述富集单元；将所述富集单元富集到的外泌体添加至载体上进行检测；
控制所述离心式微流控芯片的转速的步骤包括：
（1）控制所述离心式微流控芯片在第一速度下离心，使样本液从所述样品池流入所述分离池；
（2）按与所述步骤（1）相反的方向控制所述离心式微流控芯片在第二速度下离心，停止旋转后顺时针启动离心直至达到第三速度后停止，再逆时针启动离心直至达到所述第三速度后停止离心并静置，使所述分离池中的液体和所述稀释液池中的液体流入所述稀释混合池混合并流入所述杂质过滤池，经过所述杂质滤膜到达所述孵育池，且所述装载液池中的液体流入所述孵育池与过滤后的液体混合；
（3）按与所述步骤（1）相同的方向控制所述离心式微流控芯片在第四速度下离心，使所述孵育池中的液体流入所述载体过滤池，并经过所述载体滤膜到达废液池和检测孔，所述载体被截留，同时所述洗脱液池中的液体流入所述缓冲池；
（4）按与所述步骤（1）相反的方向控制所述离心式微流控芯片在所述第四速度下离心，使所述缓冲池中的液体流入所述载体过滤池，并经过所述载体滤膜到达所述目标物池。
2.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述信号基团为荧光发射基团，所述淬灭基团为荧光淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述靶标选自CD63、CD9、CD81、HSP70、Tsg101、EpCam、flotillin、Syntenin、Alix、HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5以及a-1AT中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述载体为纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜或塑料膜；所述塑料膜为尼龙膜或聚苯乙烯。
5.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述包被的方法为：将所述dsDNA滴加在所述载体上，50°C~60°C干燥。
6.根据权利要求1所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述样本液选自细胞培养物上清液、全血、血清、血浆、腹水、脑脊液、骨髓穿刺液、支气管肺泡洗液、胸腔液、尿、精液、卵泡液、宫腔液、胆汁、羊水、阴道分泌物、唾液、痰或者从生物组织样品得到的澄清的裂解液。
7.根据权利要求1~6任一项所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述分离池包括第一腔室、连接部和第二腔室，所述第一腔室通过所述连接部与所述第二腔室连接，且所述连接部的内径小于所述第一腔室和所述第二腔室的内径。
8.根据权利要求1~6任一项所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述分离池与所述稀释混合池之间通过第一通道连接，所述稀释液池与所述稀释混合池之间通过第二通道连接，所述装载液池与所述孵育池之间通过第三通道连接，所述洗脱液池与所述缓冲池之间通过第四通道连接，所述缓冲池与所述载体过滤池之间通过第五通道连接，所述孵育池与所述载体过滤池之间通过第六通道连接；所述第一通道、所述第二通道、所述第三通道、所述第四通道、第五通道和所述第六通道均交替地朝向所述旋转中心和所述离心式微流控芯片的边缘弯折，且所述第二通道、所述第三通道、所述第四通道和所述第五通道在每段朝向所述旋转中心延伸的部分均设有毛细阀。
9.根据权利要求1~6任一项所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述载体过滤池具有膜前入口部和膜后出口部，所述膜前入口部和所述膜后出口部之间的底壁开设有放膜槽，所述载体滤膜嵌设于所述放膜槽。
10.根据权利要求1~6任一项所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述第一速度高于所述第二速度，所述第二速度高于所述第三速度，所述第四速度高于所述第三速度。
11.根据权利要求10所述的外泌体检测方法，其特征在于，所述第一速度为4000~7000转/min，所述第二速度为3000~5000转/min，所述第三速度为1500~4000转/min，所述第四速度为7000~9000转/min；所述步骤（1）的离心时间为10s~3min，所述步骤（2）的离心时间为5s~2min、所述步骤（3）的离心时间为10s~1min，所述步骤（4）的离心时间为10s~1min。
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EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20210507

Assignee: Zhaorui Medicine (Shenzhen) Limited Co.

Assignor: Bioisland Laboratory

Contract record no.: X2024980000882

Denomination of invention: Detection methods for extracellular vesicles

Granted publication date: 20220211

License type: Exclusive License

Record date: 20240117