CN113735768B - 双光子双比率型NADH、HClO、H2S三级响应近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

双光子双比率型NADH、HClO、H2S三级响应近红外荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开双光子双比率型NADH、HClO、H2S三级响应近红外荧光探针及其制备方法和应用，所述荧光分子探针结构式如式(1)所示：
Figure DDA0003305554780000011
本发明的这种荧光分子探针具有其突出的单分子双激发模式、多重电子供‑吸切换、NADH、HClO、H2S三级响应特点，可对NADH决定的缺氧状态进行实时发现式双模成像，同时可对该状态下次氯酸所致的氧化应激和硫化氢所致的还原应激的动态变化及异质化分布进行联动成像分析，并以OFF/ON双光子激光、近红外双比率信号分级呈现。

Description

双光子双比率型NADH、HClO、H2S三级响应近红外荧光探针及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光探针检测技术领域，具体涉及一种OFF/ON双比率型 NADH、HClO、H2S三级响应的近红外荧光分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
还原型辅酶I(NADH)作为一种关键性辅酶在许多生物氧化还原过程中发挥着重要作用，NADH的抗氧化及抗衰老功效，一直备受关注，然而，NADH过量会导致体内还原性应激，致使细胞凋亡、组织缺氧。另外，次氯酸作为人体免疫系统的有力防御屏障，发挥着重要作用。同时，次氯酸过量会导致氧化应激性损伤，进而成为多种疾病的致病因。而体内硫化氢能够作为抗氧化剂，有效修复次氯酸过量导致的氧化应激性损伤。这三者将在肿瘤无度生长的过程中呈现缺氧状态下的微环境氧化/还原应激异质化。
分子荧光探针因其高灵敏、高选择性和反应迅速等优点得到迅速发展。近年来，因近红外激发和发射荧光探针对细胞和组织穿透深、组织自荧光和自吸收低以及对细胞损伤小等显著优点而获得较多关注。除此之外，本发明发现已报道的NADH探针以短波发射和吸收为主，双光子近红外荧光探针尚未报导；另外次氯酸和硫化氢探针存在联动响应速度慢、双响应灵敏度低的缺陷。
综上，本发明发现：目前缺少同时实现连续响应NADH、HClO、H2S 这三种物质，并实现OFF/ON激活的单分子双光子双比率近红外发射检测，以及实现对缺氧状态下的微环境氧化/还原应激异质化监测的技术。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种OFF/ON激活的双比率型针对NADH、 HClO、H2S实现三级响应的双光子近红外荧光探针，其突出的单分子双激发模式、多重电子供-吸切换、NADH、HClO、H2S三级响应特点，可对 NADH决定的缺氧状态进行实时发现式双模成像，同时可对该状态下次氯酸所致的氧化应激和硫化氢所致的还原应激的动态变化及异质化分布进行联动成像分析，并以OFF/ON双光子激光、近红外双比率信号分级呈现。为实现上述目的，本发明公开如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供一种OFF/ON激活的双光子双比率型 NADH、HClO、H2S三级响应近红外荧光分子探针(简称为DBIMM)，其结构式如式(1)所示：
Figure BDA0003305554760000021
在本发明的第二方面，提供一种双光子双比率型NADH、HClO、H2S 三级响应近红外荧光分子探针(DBIMM)的制备方法，包括步骤：
将原料1和三氟甲烷磺酸甲酯溶解于除氧溶剂中，反应后将反应液冷却，将得到的结晶产物洗涤、干燥，即得所述分子探针(DBIMM)；其中：所述原料1的结构式如式(2)所示：
Figure BDA0003305554760000022
进一步地，所述DBIMM的制备方法中，原料1和三氟甲烷磺酸甲酯的摩尔比范围为1：8-1：4。除氧溶剂的添加量能够充分溶解原料1和三氟甲烷磺酸甲酯即可，除此之外，在本发明中，未进行特别强调的溶剂，其添加量也以能够充分溶解相应的原料为准。
进一步地，所述DBIMM的制备方法中，将所述原料1和三氟甲烷磺酸甲酯溶解于除氧氯仿、除氧N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中的任一有机溶剂中。除氧的溶剂可减少反应物的氧化，从而提高产率并减少副产物带来的分离难度，同时克服副产物所致的荧光干扰。
进一步地，所述DBIMM的制备方法中，反应温度为20-30℃，时间为24-28小时。
进一步地，所述DBIMM的制备方法中，采用(0-5℃)的低温除氧溶剂洗涤所述结晶产物。
进一步地，所述原料1的合成包括步骤：将原料2和3-喹啉甲醛溶解于溶剂，将得到的混合液加热回流，完成后将反应液冷却结晶，将得到的结晶产物洗涤、重结晶后干燥，即得原料1；其中：所述原料2的结构式如式(3)所示：
Figure BDA0003305554760000031
进一步地，所述原料1的合成中，原料2和3-喹啉甲醛的摩尔比为1： 1-1：3。
进一步地，所述原料1的合成中，溶剂包括甲醇、乙醇等中的至少一种。
进一步地，所述原料1的合成中，加热回流温度为50-60℃，回流时间为12-15小时。采用低温甲醇(0-2℃)作为洗涤剂对所述结晶产物进行洗涤，另外采用乙醇作为重结晶溶剂。
进一步地，所述原料2的合成包括步骤：向溶有原料3的乙酸乙酯冷却液中加入溶有盐酸的乙酸乙酯，将所得混合物加热回流，完成后的反应液冷却结晶，将得到的结晶产物洗涤后纯化，即得原料2；其中：所述原料3的结构式如式(4)所示：
Figure BDA0003305554760000032
进一步地，所述原料2的合成中，原料3和盐酸的摩尔比为1：0.05-1： 0.01。所述乙酸乙酯的添加量能够提供充分的液体反应环境即可，本发明不作具体限定。
进一步地，所述原料2的合成中，加热回流的反应温度为40-50℃，时间为12-15小时。之后采用乙酸乙酯(优选为0-2℃的乙酸乙酯)作为洗涤剂对所述结晶产物进行洗涤。
进一步地，所述原料2的合成中，采用二氯甲烷和甲醇洗脱的硅胶色谱法对固体产物进行纯化，以保证纯度。
进一步地，所述原料3的合成包括步骤：将原料4和丙二腈溶解于无水溶剂中，将得到的混合液加热回流，完成后将反应液冷却结晶，将得到的结晶产物洗涤后干燥，对所得固体进行纯化，即得原料3；其中：所述原料4的结构式如式(5)所示：
Figure BDA0003305554760000041
进一步地，所述原料3的合成中，原料4和丙二腈的物质的量之比为 1：3-1：5。
进一步地，所述原料3的合成中，加热回流反应温度为50-60℃，时间优选为10-12小时。之后以乙醇(优选为0-2℃的乙醇)洗涤所述结晶产物，以保证最低消耗的同时兼顾纯度和产率。
进一步地，所述原料3的合成中，无水溶剂包括无水乙醇、无水甲醇、无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中的至少一种。
进一步地，所述原料4的合成包括步骤：将原料5和4-甲酰苯硼酸溶于无水溶剂中，在隔氧环境下，加入催化剂，完成后继续加入四(三苯基膦)钯，并对所得混合液加热回流。反应完成后先浓缩反应液，然后洗涤得到的浓缩液，再萃取浓缩液中的反应产物，将得到的萃取液干燥后浓缩，所得固体纯化后即得原料4；其中：所述原料5的结构式如式(6)所示：
Figure BDA0003305554760000042
所述式(6)中，X＝F、Cl、Br、I等元素中的任意一种。
进一步地，所述原料4的合成中，原料5、4-甲酰苯硼酸、四(三苯基膦)钯的物质的量之比为0.8：1：0.1-1：3：0.5。
进一步地，所述原料4的合成中，加热回流的温度为70-80℃，时间控制在12小时以内。优选地，本步骤中采用高浓度(>10.0mol/L)碳酸钠水溶液、碳酸钾水溶液、碳酸氢钠水溶液、碳酸氢钾水溶液等中的至少一种作为催化剂促进反应物的转化，同时限制回流时间<10h，有助于在保证产率的同时避免Boc保护的氨基自身发生副反应。
进一步地，所述原料4的合成中，采用(0-5℃)的低温饱和食盐水洗涤反应液，以除去反应液中的可溶性杂质。然后采用乙酸乙酯等萃取剂对浓缩液中的反应产物进行萃取，再采用无水硫酸钠对得到的萃取液进行干燥处理。
进一步地，所述原料4的合成中，无水溶剂包括无水甲苯和无水乙醇的混合液、无水甲苯和无水甲醇的混合液等中的任一种。需要说明的是，原料4的合成需要在无水、无氧的环境下进行，这是因为在该体系碱性环境下，需防止Boc及丙二腈脱落造成自身醛氨缩合以及醛基氧化。
进一步地，所述原料5的合成包括步骤：将对-卤素取代苯胺和二碳酸二叔丁酯溶于无水溶剂中，在隔氧环境下，将所得混合液加热回流；完成后将反应液冷却结晶，将得到的结晶产物洗涤后干燥，即得原料5。
进一步地，所述原料5的合成中，对-卤素取代苯胺和二碳酸二叔丁酯的物质的量之比为0.9：1-1：2；可选地，所述对-卤素取代苯胺包括：对氟苯胺、对氯苯胺、对溴苯胺、对碘苯胺中的任一种。
进一步地，所述原料5的合成中，无水溶剂包括无水甲苯、无水N,N- 二甲基甲酰胺(DMF)等中的任一种。需要说明的是，原料5的合成需要在无水、无氧的环境下进行，这是因为体系碱性环境下需防止Boc脱落造成自身醛氨缩合以及醛基氧化。
进一步地，所述原料5的合成中，加热回流的温度为80-90℃，回流时间优选为25-30小时。需要说明的是，遇环境温度低时可根据环境温度适当延长加热回流时间，不仅可提高反应物的利用率，而且有助于减少反应物混入生成物中，从源头上提高产物纯度。
进一步地，所述原料5的合成中，将所述结晶产物溶于乙酸乙酯溶液中后，依次采用除氧后的盐酸和无氧饱和食盐水对该乙酸乙酯溶液进行洗涤，以在除去产物中可溶性杂质的同时保护产物。然后使用无水硫酸钠进行干燥处理。
进一步地，所述原料3、原料4的合成中，均可以采用石油醚和乙酸乙酯洗脱的硅胶色谱法对固体产物进行纯化，以保证产物的纯度。
进一步地，所述原料4、原料5的合成中，隔氧环境采用向反应容器中充入惰性气体(如氩气等)或氮气等保护气体的方式实现。并且，在本发明的后续优化中，除以保护气排尽装置内空气外，另外需对重蒸后的溶剂鼓气饱和，从而同时避免水分干扰及氧化问题。
在本发明的第三方面，公开所述OFF/ON双比率型NADH、HClO、H2S 三级响应的荧光分子探针在分析化学、医疗、生物等领域中的应用。
相较于现有技术，本发明具有以下有益而独特的效果：
(1)本发明公开的荧光分子探针DBIMM中以联苯结构扩大链式共轭，在其左侧连接喹啉基团为链式共轭结构增加双光子活体供体，以甲基化作用使喹啉氮原子增加正电荷，从而既作为获取NADH电子的识别基团，又构造了强吸电子的竞争机制，使分子本身处于OFF状态。当该探针处于NADH所决定的缺氧环境下，则可被其触发，激活双光子部分OFF/ON 的荧光，同时也为后续响应作好结构上的准备。
(2)本发明的荧光分子探针DBIMM在与NADH作用荧光激活后，将可与生命体内的HClO作用，机理为中部衔接长共轭链的C＝N键被打断，同时丙二腈脱落为醛基，使探针荧光波长发生蓝移，从而构建出一级比率响应；所得产物可利用醛基与H2S再度反应，产生进一步蓝移的荧光变化，从而构建出第二级比率响应。如此实现了在NADH确定的缺氧环境下对HClO、H2S的逐级联动响应，可视化地显示出生物体内次氯酸和硫化氢的连续动态变化情况。
(3)本发明设计的这种荧光分子探针整体构造为外端可转换双吸电子基，内部隐藏可转换供电子基，通过可触发行为来多次转换电子端基及内部电子吸-供关系，以呈现多级比率信号，实现多目标物多级可区分响应。
(4)本发明制备的荧光分子探针采用光损伤较小的双光子与近红外光，由于激发光源波长较长，受光散射影响较小，使得入射光的损耗较小，对细胞和组织的损伤小，在介质中的穿透性较好，为首个实现对于缺氧状态指示并连续双比率多级检测氧化/还原应激状态异质化的强穿透双模式激发分子探针。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明第一实施例合成的荧光分子探针DBIMM的质谱。
图2为本发明第二实施中分子探针DBIMM与NADH结合产物 DBIMMH的质谱。
图3为本发明第三实施例中分子探针DBIMM和NADH的紫外吸收曲线以及荧光光谱曲线。
图4为本发明第四实施例中分子探针DBIMM以及加入NADH后的动力学曲线。
图5为本发明第五实施例中分子探针DBIMM荧光强度随NADH浓度的变化图。
图6为本发明第六实施例中干扰物质对分子探针DBIMM荧光强度的影响。
图7为本发明第七实施例中探针DBIMM对细胞毒性的影响。
图8为本发明第八实施例中探针DBIMM的HepG2细胞共聚焦成像。
图9为本发明第九实施例中探针DBIMM对正常细胞与癌细胞的共聚焦成像。
图10为本发明第十实施例中探针DBIMM在体外模拟糖酵解过程细胞成像及荧光强度对比图。
图11为本发明第十一实施例中探针DBIMM对小鼠正常肝脏组织成像。
图12为本发明第十一实施例中探针DBIMM对小鼠正常肝脏组织与肝癌小鼠肝脏组织共聚焦成像。
图13为本发明第十一实施例中验证肝癌小鼠肝脏组织NADH双光子激发荧光成像。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本发明中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
正如前文所述，目前已报道的NADH探针以短波发射和吸收为主，并且次氯酸和硫化氢探针存在联动响应速度慢、双响应灵敏度低的缺陷。为此，本发明提出一种OFF/ON双比率型NADH、HClO、H2S三级响应的荧光分子探针及其制备方法和应用。现根据说明书附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
第一实施方式
一种OFF/ON双比率型NADH、HClO、H2S三级响应的荧光分子探针 (DBIMM)的制备方法，其合成路线如路线1所示，具体地，包括如下步骤：
(1)在Ar气保护氛围中，将对溴苯胺(5g，29.0mmol)和二碳酸二叔丁酯(7g，32.0mmol)溶解在120mL的无水甲苯中，然后将所得混合物在80℃下搅拌回流27小时。反应结束后将反应液冷却至室温，真空旋出溶剂，将得到的固体溶于25mL的乙酸乙酯中，分别用盐酸(40mL)洗涤两次、饱和食盐水(100mL)洗涤依次，然后无水硫酸钠干燥。旋干溶剂后真空干燥一夜，得到白色的固体产物，记为产物1或者原料5。
(2)在Ar气保护氛围中，将产物1(2g，7.34mmol)和4-甲酰苯硼酸(1.22g，8.28mmol)溶于40mL无水甲苯和20mL无水乙醇的混合溶剂中，再加入20mL碳酸钾水溶液(12.0mol/L)，然后将四(三苯基膦)钯(0.2g)加入到反应液中。所得混合反应液在80℃下搅拌回流10小时。反应结束后将反应液冷却至室温，真空旋出溶剂，加入饱和食盐水进行洗涤后采用乙酸乙酯萃取，将所得溶液加入无水硫酸钠干燥处理。将得到的粗产物用石油醚：乙酸乙酯＝70：1-10：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，得到白色固体，记为产物2或者原料4。
(3)将产物2(1g，3.36mmol)和丙二腈(1g，15.1mmol)，溶解于20mL无水乙醇中，所得混合液在50℃下搅拌回流12小时。反应结束后将反应液冷却至2℃，将其中的固体产物过滤并使用冷却的乙醇(2℃)洗涤两次，干燥。得到的粗产物用石油醚：乙酸乙酯＝4：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，得到黄绿色固体，记为产物3或者原料3。
(4)将6N的HCl溶于90mL的乙酸乙酯，逐滴加入溶解了产物3(1 g，2.89mmol，所述盐酸与产物3摩尔比为1：0.01)并于0℃条件下搅拌 30分钟的50mL乙酸乙酯溶液中。滴加完毕后将反应体系升温至40℃，并在该条件下搅拌回流12小时。反应结束后将反应液冷却至室温，将其中的固体产物过滤并使用冷却的乙酸乙酯(0℃)洗涤两次。得到的粗产品用二氯甲烷：甲醇＝20：1-1：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，然后采用乙醇进行重结晶，得到白色固体，记为产物4或者原料2。
(5)将产物4(0.3g，1.2mmol)和3-喹啉甲醛(0.19g，1.2mmol)，溶解于50mL甲醇中，将所得混合物于50℃下搅拌15小时。反应结束后将反应液冷却至室温，将其中的固体产物过滤并使用冷却的甲醇(2℃)洗涤三次，所得粗产物采用乙醇进行重结晶，得到黄色固体，记为产物5或者原料1。
(6)将产物5(0.069g，0.18mmol)和三氟甲烷磺酸甲酯(0.1mL， 0.92mmol)溶于5mL除氧的氯仿中，所得混合物于室温下搅拌24小时，反应结束后将反应液冷却至0℃，将其中的固体产物过滤并使用冷却的氯仿 (0℃)洗涤两次，干燥。得到棕色固体0.07g，即得荧光分子探针(DBIMM，记为产物6)，其高分辨质谱如图1所示，从图中可以看出产物6为预期目标分子。
Figure BDA0003305554760000091
路线1。
第二实施方式
本实施例对第一实施例中制备的荧光分子探针(DBIMM)与NADH 的响应机理进行分析以及验证，具体包括如下步骤：
参考路线2，探针(DBIMM)与NADH结合后，荧光被打开，发射出高亮度红色荧光。如图1所示的DBIMM质谱中，存在探针m/z＝399.1300 的离子峰；当探针DBIMM与NADH结合后，如图2所示的DBIMMH质谱中，存在m/z＝399.1900的离子峰，这验证了探针(DBIMM)与NADH作用后的产物为DBIMMH，与下列路线2所示一致。
Figure BDA0003305554760000101
路线2。
第三实施方式
本实施例对第一实施例中制备分子探针(DBIMM)与NADH在反应前后的紫外吸收光谱和荧光光谱进行测试，具体包括如下步骤：
(1)将10-3M探针DBIMM加入PBS缓冲液(pH7.4，10mM)中测定其紫外吸收曲线；再向其中添加NADH(10-2M)后测定其紫外吸收曲线。如图3(a)所示。
(2)将10μM探针DBIMM加入PBS缓冲液(pH7.4，10mM)中测定其荧光光谱曲线；再向其中添加NADH(10μM)后测定其荧光光谱曲线。如图3(b)所示。
由图3(a)分析可知，探针的最大紫外吸收峰为386nm，产物的吸收峰为500nm；由图3(b)分析可知，探针无荧光；当探针DBIMM与 NADH结合之后，产物在624nm处呈现强荧光发射峰。可以看出：探针与目标物作用后，最大吸收波长红移至500nm，同时荧光发射峰在624nm 波长处具有很强的荧光，伴随124nm的Stokes位移。
第四实施方式
本实施例对第一实施例中制备分子探针(DBIMM)与NADH结合的动力学进行研究，具体包括如下步骤：
(1)在5mL离心管中，依次加入10μM的探针DBIMM储备液(10-3 M)和10mM PBS缓冲溶液(pH＝7.4)，用超纯水定容至1mL，再取其1mL 溶液于荧光皿中，随后依次按照时间为5,10,15,20,25,30分钟时，测试其荧光光谱的曲线。
(2)将10μM的探针DBIMM储备液(10-3M)、10mM PBS缓冲溶液(pH＝7.4)、20μM还原型辅酶I二钠盐的储备液(10-3M)，依次加入到离心管中，最后用蒸馏水定容至1mL。然后依次按照时间为5、10、 15、20、25、30分钟时，测试探针光谱曲线发射峰的强度数据，结果如图4所示(Ex/Em＝516/624nm)。
从图4中可以看出，在516nm的激发光波长下，探针DBIMM没有荧光，其发射信号基本保持不变；然而，当向其加入目标分析物NADH后，随着反应的进行，探针的发射信号逐渐增强。反应进行12min后，探针发射信号的强度达到最高值并维持基本不变。可以看出：探针DBIMM与 NADH结合大约需要12min左右。
第五实施方式
本实施例对第一实施例制备的探针DBIMM(μM)与一系列不同浓度 NADH响应荧光光谱进行研究，具体包括以下步骤：
将10μM探针DBIMM、10mM PBS缓冲溶液(pH＝7.4)、一系列浓度(0-20μM)和(0-2μM)的NADH加入到离心管中，使用超纯水定容至1mL，将配制好的待测液保留15min。测定所配制溶液在激发波长为516nm时，发射峰波长在624nm(Ex＝516nm,Em＝624nm)处的荧光强度随不同浓度 NADH的变化情况。为保证实验结果的准确性，每个样品平行配制测量三次。
如图5(a)所示，探针DBIMM(10μM)对目标分析物浓度范围为(0-20 μM)内都能进行很好的响应，并且探针的荧光发射强度随目标分析物浓度的增大而逐渐升高。如图5(b)和(c)所示，目标分析物浓度在0-2μM范围内时，探针的荧光发射强度与目标分析物呈良好的线性关系 (F＝19.6563+182.0723[NADH])，相关系数为0.97996。最后我们得出检测限为20nM。
第六实施方式
本实施例对第一实施例制备的分子探针DBIMM的选择性进行了研究，包括：
1、对干扰物对荧光探针DBIMM的荧光强度的影响进行研究，具体如下：将10μM探针DBIMM加入PBS缓冲液(pH7.4，10mM)中后，按下列条件添加包括：1.P5+(1mM)、2.Ca2+(1mM)、3.Cl-(1mM)、 4.K+(1mM)、5.Na+(1mM)、6.Mg2+(1mM)、7.Zn2+(1mM)、8.Fe2+ (1mM)、9.Leu(1mM)、10.Gly(1mM)、11.Lys(1mM)、12.Thr (1mM)、13.Met(1mM)、14.Ile(1mM)、15.Ser(1mM)、16.Cys (1mM)、17.L-Cys(1mM)、18.GSH(1mM)、19.Vitamin C(1mM)、20.NADH(10μM)。
测试结果如图6(a)所示(横坐标序号代表上述各干扰物)，可以看出，相对于各种反应物种的荧光相对强度图，只有目标分析物(NADH) 与探针DBIMM响应明显，加入其他干扰物时，荧光强度并未明显增强。由此说明，荧光探针DBIMM对NADH有很强的选择性。
2、对氧化性物质对荧光探针DBIMM的荧光强度的影响进行研究，具体如下：将10μM探针DBIMM加入PBS缓冲液(pH7.4，10mM)中后，干扰离子按下列剂量分别测试：
1.KO2(500μM)、2.过氧化亚硝酸盐(500μM)、3.羟基自由基(500μM)、 4.H2O2(500μM)、5.t-BuOOH(500μM)、6.NO(200μM)、7.NaClO(100μM)、 8.单线态氧(100μM)。
测试结果如图6(b)所示(横坐标序号代表上述各干扰物)，可以看出，这8种氧化性物质未对探针DBIMM的荧光强度造成干扰。
第七实施方式
本实施例对第一实施例制备分子探针DBIMM的毒性进行检测，具体包括以下步骤：
将人正常肝细胞(HL-7702)移至培养皿中，加入培养液，于37℃的培养箱中孵育过夜，待细胞完全贴壁后移除培养液，使用PBS缓冲溶液 (pH＝7.4)清洗。分别加入0、15、30、45、60、75、90、100μM的荧光探针DBIMM，然后在37℃的5％CO2的培养箱中孵育10h。最后向每个孔中加入MTT溶液，继续放入培养箱中培养大约4h，之后离心弃去上清液，向每个孔板中加入100μL二甲基亚砜溶液，使用酶标仪测试每个孔板的吸光度(490nm)。添加DBIMM的浓度于细胞存活率如图7所示。
由图7可以看出，探针DBIMM浓度为100μM进行细胞染色时，细胞存活率为65％；当探针浓度在(0-30μM)时，细胞的存活率高达95％以上。可以得出：探针DBIMM对细胞的毒性很小，在低浓度(0-60μM) 的范围内完全可以用于活细胞实验中的成像。
第八实施方式
本实施例对第一实施例制备分子探针DBIMM对内源性NADH的成像能力进行检测，具体包括以下步骤：
将人肝癌细胞(HepG2)移至培养皿中，加入培养液，于37℃的培养箱中孵育过夜，待细胞完全贴壁后移除培养液，使用PBS缓冲溶液 (pH＝7.4)清洗，加入10μM的DBIMM染色15min。将培养好的待测细胞使用共聚焦显微镜对前20min内探针DBIMM的荧光强度变化进行了检测。如图8所示。
由图8可知，探针DBIMM添加到细胞中后，探针的荧光强度逐渐增强，细胞逐渐被点亮，这说明探针DBIMM能透过细胞膜作用于细胞内部，即DBIMM具有很好细胞膜通透性。可以得出：探针DBIMM具有很好的细胞成像能力。
第九实施方式
本实施例对第一实施例制备探针DBIMM对正常细胞以及癌变细胞的区分能力进行测试，具体包括以下步骤：
将人的正常肝细胞(HL-7702)和人肝癌细胞(HepG2)分别移至培养皿中，加入培养液，然后放入37℃的培养箱中孵育过夜，待细胞完全贴壁后再移除培养液，最后使用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)清洗，加入10μM 的DBIMM染色10min，将培养好的细胞使用共聚焦显微镜进行成像，如图9所示。
如图9(A)所示细胞成像，证实了探针DBIMM具有区分肝癌细胞(a) 与正常肝细胞(b)中的NADH含量的能力；如图9(B)所示HepG2与 HL-7702荧光强度量化图，也证实了探针DBIMM具有区分正常细胞与癌变细胞的能力。
第十实施方式
本实施例对第一实施例中制备探针DBIMM在体外模拟糖酵解过程中对NADH的成像能力进行验证，具体包括以下步骤：
将人肝癌细胞(HepG2)移至培养皿中，加入培养液，于37℃的培养箱中孵育过夜，待细胞完全贴壁后移除培养液，使用PBS缓冲溶液 (pH＝7.4)清洗，加入10μM的DBIMM染色15min，标记为a组；先加入10mM葡萄糖，再加入10μM的DBIMM染色15min，标记为b组；将培养好的待测细胞使用共聚焦显微镜探针DBIMM的荧光强度变化进行检测。如图10所示。
由图10可知，b组的荧光强度更明显，结果证实了外加葡萄糖会刺激癌变细胞内NADH水平的升高。
第十一实施方式
本实施例对第一实施例中制备探针DBIMM在正常小鼠肝脏组织的成像能力，探针DBIMM对正常小鼠肝脏组织和肝癌小鼠肝脏组织的分辨能力，以及对肝癌小鼠肝脏组织中内源性NADH增加的验证进行检测，具体包括以下步骤：
1、将小鼠肝脏组织切片用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)清洗2次，吸走多余的PBS缓冲溶液，再使用10μM的探针DBIMM进行染色。使用激光共聚焦显微镜对探针DBIMM在0-30min内对小鼠肝脏组织切片进行了成像。如图11所示。
由图11可知：随着时间的推移，探针DBIMM逐渐与小鼠肝脏组织内源性NADH相结合，从而使荧光发射信号不断的增强，这证明了探针 DBIMM在小鼠细胞中具有很好的组织穿透性，因此探针DBIMM可以用于对生物组织内源性NADH进行可视化分析与成像。
2、将小鼠肝脏组织切片和肝癌小鼠肝脏组织切片用PBS缓冲溶液 (pH＝7.4)清洗2次，吸走多余的PBS缓冲溶液，再使用10μM的探针 DBIMM染色30min后进行共聚焦成像研究。如图12所示。
由图12可知：探针DBIMM对小鼠肝癌组织A(b)与小鼠正常肝组织 A(a)中的NADH的共聚焦成像结果证实了在肝癌小鼠的肝脏组织中，NADH的含量要远高于正常的小鼠肝组织。可以得出：探针DBIMM可以实现对小鼠正常肝细胞和癌变肝细胞分辨。
3、在癌组织内会有大量的糖类物质代谢分解，其过程中将生成还原型辅酶I。(a)组小鼠癌变肝脏组织中加入了10μM探针DBIMM染色 15min，使用激光共聚焦显微镜进行成像分析；(b)组小鼠癌变肝脏细胞使用10mM的葡萄糖预处理30min后，再使用10μM的探针DBIMM染色15min，最后使用双光子激光显微镜进行荧光成像分析。如图13所示，可以看出，患有肝癌的小鼠肝脏组织内NADH水平明显有所升高。
第十二实施方式
一种OFF/ON双比率型NADH、HClO、H2S三级响应的荧光分子探针 (DBIMM)的制备方法，其合成路线如路线1所示，具体地，包括如下步骤：
(1)在Ar气保护氛围中，将对氯苯胺(29.0mmol)和二碳酸二叔丁酯(58.0mmol)溶解在180mL的无水DMF中，然后将所得混合物在90℃下搅拌回流25小时。反应结束后将反应液冷却至室温，真空旋出溶剂，将得到的固体溶于25mL的乙酸乙酯中，分别用盐酸(40mL)洗涤两次、饱和食盐水(100mL)洗涤依次，然后无水硫酸钠干燥。旋干溶剂后真空干燥一夜，得到白色的固体产物，记为产物1或者原料5。
(2)在Ar气保护氛围中，将产物1(7.3mmol)和4-甲酰苯硼酸(21.9 mmol)溶于50mL无水甲苯和30mL无水甲醇的混合溶剂中，再加入35mL 碳酸氢钠水溶液(12.0mol/L)，然后将四(三苯基膦)钯(0.58g)加入到反应液中。所得混合反应液在70℃下搅拌回流12小时。反应结束后将反应液冷却至室温，真空旋出溶剂，加入5℃的低温饱和食盐水进行洗涤后采用乙酸乙酯萃取，将所得溶液加入无水硫酸钠干燥处理。将得到的粗产物用石油醚：乙酸乙酯＝70：1-10：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，得到白色固体，记为产物2或者原料4。
(3)将产物2(3.42mmol)和丙二腈(10.26mmol)，溶解于15mL 无水甲醇中，所得混合液在60℃下搅拌回流10小时。反应结束后将反应液冷却至5℃，将其中的固体产物过滤并使用冷却的乙醇(0℃)洗涤两次，干燥。得到的粗产物用石油醚：乙酸乙酯＝4：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，得到黄绿色固体，记为产物3或者原料3。
(4)将6N的HCl溶于90mL的乙酸乙酯，逐滴加入溶解了产物3(2.47 mmol，所述盐酸与产物3摩尔比为1：0.05)并于0℃条件下搅拌30分钟的 50mL乙酸乙酯溶液中。滴加完毕后将反应体系升温至50℃，并在该条件下搅拌回流15小时。反应结束后将反应液冷却至室温，将其中的固体产物过滤并使用冷却的乙酸乙酯(2℃)洗涤两次。得到的粗产品用二氯甲烷：甲醇＝20：1-1：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，然后采用乙醇进行重结晶，得到白色固体，记为产物4或者原料2。
(5)将产物4(1.2mmol)和3-喹啉甲醛(2.4mmol)，溶解于60mL 乙醇中，将所得混合物于60℃下搅拌12小时。反应结束后将反应液冷却至室温，将其中的固体产物过滤并使用冷却的甲醇(0℃)洗涤三次，所得粗产物采用乙醇进行重结晶，得到黄色固体，记为产物5或者原料1。
(6)将产物5(0.2mmol)和三氟甲烷磺酸甲酯(0.8mmol)溶于10mL 除氧的DMF中，所得混合物于室温下搅拌24小时，反应结束后将反应液冷却至5℃，将其中的固体产物过滤并使用冷却的DMF(5℃)洗涤两次，干燥。得到棕色固体，即得荧光分子探针(DBIMM，记为产物6)。
第十三实施方式
一种OFF/ON双比率型NADH、HClO、H2S三级响应的荧光分子探针 (DBIMM)的制备方法，其合成路线如路线1所示，具体地，包括如下步骤：
(1)在Ar气保护氛围中，将对碘苯胺(32.0mmol)和二碳酸二叔丁酯(32.0mmol)溶解在180mL的无水甲苯中，然后将所得混合物在85℃下搅拌回流30小时。反应结束后将反应液冷却至室温，真空旋出溶剂，将得到的固体溶于25mL的乙酸乙酯中，分别用盐酸(40mL)洗涤两次、饱和食盐水(100mL)洗涤依次，然后无水硫酸钠干燥。旋干溶剂后真空干燥一夜，得到白色的固体产物，记为产物1或者原料5。
(2)在Ar气保护氛围中，将产物1(7.2mmol)和4-甲酰苯硼酸(9mmol) 溶于40mL无水甲苯和20mL无水甲醇的混合溶剂中，再加入30mL碳酸钠水溶液(12.0mol/L)，然后将四(三苯基膦)钯(0.116g)加入到反应液中。所得混合反应液在70℃下搅拌回流9小时。反应结束后将反应液冷却至室温，真空旋出溶剂，加入0℃的低温饱和食盐水进行洗涤后采用乙酸乙酯萃取，将所得溶液加入无水硫酸钠干燥处理。将得到的粗产物用石油醚：乙酸乙酯＝70：1-10：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，得到白色固体，记为产物2或者原料4。
(3)将产物2(3.36mmol)和丙二腈(16.8mmol)，溶解于25mL无水DMF中，所得混合液在55℃下搅拌回流12小时。反应结束后将反应液冷却至2℃，将其中的固体产物过滤并使用冷却的乙醇(2℃)洗涤两次，干燥。得到的粗产物用石油醚：乙酸乙酯＝4：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，得到黄绿色固体，记为产物3或者原料3。
(4)将6N的HCl溶于90mL的乙酸乙酯，逐滴加入溶解了产物3(2.33 mmol，所述盐酸与产物3摩尔比为1：0.05)并于0℃条件下搅拌30分钟的 50mL乙酸乙酯溶液中。滴加完毕后将反应体系升温至45℃，并在该条件下搅拌回流13小时。反应结束后将反应液冷却至室温，将其中的固体产物过滤并使用冷却的乙酸乙酯(0℃)洗涤两次。得到的粗产品用二氯甲烷：甲醇＝20：1-1：1(v：v)洗脱的硅胶色谱法进行纯化，然后采用乙醇进行重结晶，得到白色固体，记为产物4或者原料2。
(5)将产物4(1.2mmol)和3-喹啉甲醛(3.6mmol)，溶解于60mL 乙醇中，将所得混合物于55℃下搅拌14小时。反应结束后将反应液冷却至室温，将其中的固体产物过滤并使用冷却的甲醇(2℃)洗涤三次，所得粗产物采用乙醇进行重结晶，得到黄色固体，记为产物5或者原料1。
(6)将产物5(0.2mmol)和三氟甲烷磺酸甲酯(1.6mmol)溶于20mL 除氧DMF中，所得混合物于室温下搅拌28小时，反应结束后将反应液冷却至5℃，将其中的固体产物过滤并使用冷却的DMF(5℃)洗涤两次，干燥。得到棕色固体，即得荧光分子探针(DBIMM，记为产物6)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (37)

1.双光子双比率型NADH、HClO、H2S三级响应近红外荧光分子探针，其结构式如式(1)所示：
Figure FDA0003539743600000011
2.根据权利要求1所述的双光子双比率型NADH、HClO、H2S三级响应近红外荧光分子探针的制备方法，包括步骤：
提供溶解有原料1和三氟甲烷磺酸甲酯的除氧溶剂；
反应后将反应液冷却，对结晶产物洗涤、干燥，即得所述荧光分子探针；
其中：所述原料1的结构式如式(2)所示：
Figure FDA0003539743600000012
3.根据权利要求2所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料1和三氟甲烷磺酸甲酯的摩尔比范围为1:8-1:4。
4.根据权利要求2所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述除氧溶剂包括除氧氯仿、除氧DMF中的任一种。
5.根据权利要求2所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述反应温度为20-30℃，时间为24-28小时。
6.根据权利要求2所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，采用0-5℃的除氧溶剂洗涤所述结晶产物。
7.根据权利要求2所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料1的合成包括步骤：
将原料2和3-喹啉甲醛溶解于溶剂，将得到的混合液加热回流；
完成后反应液冷却结晶，将结晶产物洗涤、重结晶后干燥，得原料1；
其中：所述原料2的结构式如式(3)所示：
Figure FDA0003539743600000021
8.根据权利要求7所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料1的合成中，原料2和3-喹啉甲醛的摩尔比为1:1-1:3。
9.根据权利要求7所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料1的合成中，溶剂包括甲醇、乙醇中的至少一种。
10.根据权利要求7所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料1的合成中，加热回流温度为50-60℃，回流时间为12-15小时。
11.根据权利要求7所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料1的合成中，采用0-2℃的甲醇对所述结晶产物进行洗涤，然后采用乙醇作为重结晶溶剂。
12.根据权利要求7所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料2的合成包括步骤：
向溶有原料3的乙酸乙酯冷却液中加入溶有盐酸的乙酸乙酯；
将所得混合物加热回流，完成后的反应液冷却结晶；
将得到的结晶产物洗涤后纯化，即得原料2；
其中：所述原料3的结构式如式(4)所示：
Figure FDA0003539743600000031
13.根据权利要求12所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料2的合成中，原料3和盐酸的摩尔比为1:0.05-1:0.01。
14.根据权利要求12所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料2的合成中，加热回流的反应温度为40-50℃，时间为12-15小时。
15.根据权利要求12所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料2的合成中，采用0-2℃的乙酸乙酯对所述结晶产物进行洗涤。
16.根据权利要求12所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料2的合成中，采用二氯甲烷和甲醇洗脱的硅胶色谱法对固体产物进行纯化。
17.根据权利要求12所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料3的合成包括步骤：
将原料4和丙二腈溶解于无水溶剂中，将得到的混合液加热回流；
完成后将反应液冷却结晶，将得到的结晶产物洗涤后干燥，对所得固体进行纯化，即得原料3；
其中：所述原料4的结构式如式(5)所示：
Figure FDA0003539743600000032
18.根据权利要求17所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料3的合成中，原料4和丙二腈的物质的量之比为1:3-1:5。
19.根据权利要求17所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料3的合成中，加热回流反应温度为50-60℃，时间为10-12小时。
20.根据权利要求17所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料3的合成中，采用0-2℃的乙醇洗涤所述结晶产物。
21.根据权利要求17所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料3的合成中，无水溶剂包括无水乙醇、无水甲醇、无水DMF中的至少一种。
22.根据权利要求17所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料4的合成包括步骤：
将原料5和4-甲酰苯硼酸溶于无水溶剂中，在隔氧环境下，加入催化剂，完成后继续加入四(三苯基膦)钯，并对所得混合液加热回流；
反应完成后先浓缩反应液；然后洗涤得到的浓缩液，再萃取浓缩液中的反应产物，将得到的萃取液干燥后浓缩，所得固体纯化后即得原料4；
其中：所述原料5的结构式如式(6)所示：
Figure FDA0003539743600000041
所述式(6)中，X＝F、Cl、Br、I元素中的任意一种。
23.根据权利要求22所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料4的合成中，原料5、4-甲酰苯硼酸、四(三苯基膦)钯的物质的量之比为0.8:1:0.1-1:3:0.5。
24.根据权利要求22所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料4的合成中，加热回流的温度为70-80℃，时间控制在12小时以内。
25.根据权利要求22所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料4的合成中，采用浓度>10.0mol/L的碳酸钠水溶液、碳酸钾水溶液、碳酸氢钠水溶液、碳酸氢钾水溶液中的至少一种作为催化剂，且回流时间<10h。
26.根据权利要求22所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料4的合成中，采用0-5℃饱和食盐水洗涤反应液；然后采用乙酸乙酯对浓缩液中的反应产物进行萃取，再采用无水硫酸钠对得到的萃取液进行干燥处理。
27.根据权利要求22所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料4的合成中，无水溶剂包括无水甲苯和无水乙醇的混合液、无水甲苯和无水甲醇的混合液中的任一种。
28.根据权利要求22所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料5的合成包括步骤：
将对-卤素取代苯胺和二碳酸二叔丁酯溶于无水溶剂中，在隔氧环境下，将所得混合液加热回流；完成后将反应液冷却结晶，将得到的结晶产物洗涤后干燥，即得原料5。
29.根据权利要求28所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料5的合成中，对-卤素取代苯胺和二碳酸二叔丁酯的物质的量之比为0.9:1-1:2。
30.根据权利要求28所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料5的合成中，所述对-卤素取代苯胺包括：对氟苯胺、对氯苯胺、对溴苯胺、对碘苯胺中的任一种。
31.根据权利要求28所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料5的合成中，无水溶剂包括无水甲苯、无水DMF中的任一种。
32.根据权利要求28所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料5的合成中，加热回流的温度为80-90℃，回流时间为25-30小时。
33.根据权利要求28所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料5的合成中，将所述结晶产物溶于乙酸乙酯溶液中后，依次采用除氧后的盐酸和无氧饱和食盐水对该乙酸乙酯溶液进行洗涤；然后使用无水硫酸钠进行干燥处理。
34.根据权利要求28所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料3、原料4的合成中，均采用石油醚和乙酸乙酯洗脱的硅胶色谱法对固体产物进行纯化。
35.根据权利要求28所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述原料4、原料5的合成中，隔氧环境采用向反应容器中充入惰性气体或氮气保护气体的方式实现。
36.根据权利要求35所述的荧光分子探针的制备方法，其特征在于，所述惰性气体为氩气。
37.根据权利要求1所述的双光子双比率型NADH、HClO、H2S三级响应近红外荧光分子探针或者权利要求2-36任一项所述的制备方法制备的荧光分子探针在分析化学、生物领域中的应用。
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