CN112961177B - 一种检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸nadh的近红外荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测NADH的近红外荧光探针及其应用，所述荧光探针以BODIPY为荧光母体，喹啉鎓作为NADH的还原位点，探针与NADH反应之后，由于存在较强的分子内电荷转移(ICT)，最大吸收波长红移至725nm，在760nm处发射较强的荧光信号，不易受到生物基质和杂质的干扰。本发明提供的荧光探针具有较高的检测灵敏度，且BODIPY母核具有较低的细胞毒性和较好的生物相容性，可广泛的用于细胞和生物组织中NADH的检测。

Description

一种检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH的近红外荧光探 针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及近红外荧光探针及制备方法和应用，特别涉及具备检测NADH的近红外荧光探针的制备方法及其应用。

背景技术

在许多生物催化过程中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其磷酸酯(NADPH)分别作为还原型辅酶Ⅰ和还原型辅酶Ⅱ有着广泛的应用。受糖酵解、三羧酸循环和线粒体呼吸的影响，NAD(P)H在能量代谢中起着至关重要的作用，是线粒体中能量产生链中的控制标志物。监视NAD(P)H的氧化还原状态是表征活体内线粒体功能的最佳参数。

NADH(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶Ⅰ。N指烟酰胺，A指腺嘌呤，D是二核苷酸。NADH在维持细胞生长、分化和能量代谢以及细胞保护方面起着重要作用。NADH产生于糖酵解和细胞呼吸作用中的柠檬酸循环，并作为生物氢的载体和电子供体，在线粒体内膜上通过氧化磷酸化过程，转移能量供给ATP合成，所以NADH又被称为线粒体素。NADH分子是线粒体中能量产生链中的控制标志物。

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。有研究表明AD患者神经元细胞线粒体内NADH含量明显低于非AD患者。因此，检测NADH的近红外荧光探针用来进一步研究AD的发病进程具有广阔的应用前景。

近红外荧光探针作为NADH检测的主要手段之一，在细胞及活体内NADH检测中发挥着重要作用。常见的传统检测NADH方法有紫外分光光度法、电化学分析法、毛细管电泳法、色谱法、酶循环法等。与这些传统NADH检测方法(只能体外检测、信号弱、背景高等)相比，近红外荧光探针检测方法的灵敏度高，对活细胞无毒性，稳定性好，反应快，使用方便，更具有优势。因而构建、研发可识别检测NADH的近红外荧光探针是目前NADH检测的研究热点。

发明内容

为克服上述现有技术中的缺点，本发明目的是提供一种具备检测NADH的近红外荧光探针及其制备方法和应用。

本发明通过以下技术方案实现发明目的：

本发明的第一个目的是提供一种实时检测NADH的近红外荧光探针，该探针的结构式如式(Ⅰ)所示：

进一步的，式(Ⅰ)所示近红外荧光探针以硼二吡咯甲烷(BODIPY，CAS:947328-71-4)为荧光母体，喹啉鎓作为NADH的还原位点。

探针与NADH反应之后，由于存在较强的分子内电荷转移(ICT)，最大吸收波长移至715nm，并在760nm处发射较强的荧光信号。

为达到上述目的，本发明采用如下反应步骤：

本发明的第二个目的是提供一种制备前述检测NADH的近红外荧光探针的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

a：取式(Ⅱ)所示化合物1和3-喹啉甲醛置于装有迪安-斯达克分水器的圆底烧瓶中，并用乙腈和哌啶的混合溶液溶解，在对甲基苯磺酸(p-TsOH)的催化下，80℃回流30分钟，得到固体产物；

所述化合物1与3-喹啉甲醛物质的量的比为1:2；所述混合溶液中，乙腈和哌啶的体积比为50:1，所述化合物1在混合溶液中的浓度为5～6mg/mL。

将所得固体产物溶解在二氯甲烷中，用水洗涤，优选的，洗涤次数为3次；所得有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸发溶剂，所得残渣经硅胶柱层析纯化，再由二元溶剂重结晶得到式(Ⅲ)所示化合物2(蓝色固体)，所述二元溶剂为二氯甲烷/正己烷，优选的，所述二氯甲烷与正己烷的体积比为1：8；所述化合物1和化合物2结构式如下：

b：将化合物2和碘甲烷加入到三氯甲烷中，得到混合物，所述化合物2在三氯甲烷中的浓度为20mg/mL，所述碘甲烷与三氯甲烷体积比为1:100；

室温下，将混合物在氮气保护下搅拌24小时，减压蒸发溶剂，所得残渣加入二氯甲烷得到新的沉淀(化合物3，紫色固体)，即为式(Ⅰ)所示检测NADH的近红外荧光探针。

本发明的第三个目的是提供前述的近红外荧光探针在检测NADH中的应用，具体的，为式(Ⅰ)所示的检测NADH的近红外荧光探针作为荧光化学传感器用于细胞和生物组织中NADH的检测的应用。

所述近红外荧光探针与NADH反应之前，在652nm处有荧光发射；在与NADH反应之后，会在700～760nm处产生新的荧光，为OFF-ON型荧光反应。优选的，在760nm处产生新的荧光。

进一步的，所述近红外荧光探针与NADH反应之前，荧光光谱仪检测中，所述荧光探针的激发波长为595nm，发射波长为652nm；与NADH反应之后，产物的激发波长为715nm，发射波长为760nm。

进一步的，所述荧光探针的线性范围为0.1μM～15μM的NADH，检测限为0.20μM的NADH。

进一步的，所述应用包括以下步骤：

S1、取所述近红外荧光探针，溶于乙腈，充分混匀，使其完全溶解，配制探针储备液，放于4℃冰箱备用；所述探针储备液中，近红外荧光探针的浓度为2×10^-3M。

S2、制备待测样品；所述待测样品为NADH溶液；

待测样品制备方法为：取NADH，溶于PBS缓冲液，配制NADH溶液；

S3、将S1得到的探针储备液和S2得到的待测样品，以及吐温溶液混合，再用PBS缓冲液定容，所述PBS缓冲液pH＝5～8，使得探针浓度为10μM，NADH浓度为100μM，吐温溶液的体积比为0.05％，进行反应，所述反应温度为37℃，反应时间为60～90分钟，优选的，反应PBS缓冲液pH＝7.4，反应时间为60分钟；

S4、采用荧光分光光度计进行荧光测试，当反应体系在激发波长为715nm，发射波长为760nm，表示待测样品中包含NADH。

或者，所述应用包括以下步骤：

S1、取所述近红外荧光探针，溶于乙腈，充分混匀，使其完全溶解，配制探针储备液，放于4℃冰箱备用；所述探针储备液中，近红外荧光探针的浓度为2×10^-3M。

S2、制备待测样品，所述待测样品为待测细胞；

待测样品制备方法为：将待测细胞接种到35mm共聚焦培养皿中，并在37℃，5％CO₂培养箱中正常培养培养24小时，所述待测细胞接种密度为5×10³～3×10⁴个/mL，进一步优选的，所述待测细胞接种密度为1×10⁴个/mL；

S3、将S1得到的探针储备液和S2得到的待测样品，以及吐温溶液混合，再用无血清培养基定容，使得探针浓度为10μM，吐温溶液的体积比为0.05％，进行反应，所述反应温度为37℃，反应时间为为15～60分钟优选的，反应时间为15分钟；

S4、用PBS缓冲液冲洗S3所得样品，优选的，用PBS缓冲液冲洗S3所得样品冲洗3次，加入不含酚红的培养基，采用激光共聚焦显微镜进行细胞共聚焦成像，在715nm激发探针，收集发射波长范围为700～760nm，正常细胞中呈现红色荧光，受损细胞NADH含量减少细胞红色荧光变弱，根据像素强度变化，判断待测样品中NADH含量。

进一步的，所述NADH为存在于细胞和生物组织中的NADH。

本发明的第四个目的是提供式(Ⅰ)所示的近红外荧光探针在作为阿尔茨海默病诊断试剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供式(Ⅰ)所示的近红外荧光探针在制备阿尔茨海默病诊断试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明所述的近红外荧光探针光谱变化明显、灵敏度高、特异性强、细胞毒性低、成像效果好，适用于细胞和生物组织中NADH的检测。

2、本发明所述的近红外荧光探针分子制备流程简单、产率高，适合规模化生产。

附图说明

图1是实施例1制备的荧光探针YJ-760对不同浓度NADH响应的吸收光谱变化示意图。

图2a和图2b是实施例1制备的荧光探针YJ-760对不同浓度NADH在652nm和760nm处的荧光光谱变化示意图，图2c是实施例1制备的荧光探针YJ-760与NADH之间的线性关系示意图。

图3是实施例1制备的荧光探针YJ-760的选择性实验结果示意图。

图4是实施例1制备的荧光探针YJ-760的pH条件优化示意图。

图5是实施例1制备的荧光探针YJ-760的温度条件优化示意图。

图6是实施例1制备的荧光探针YJ-760在加入NADH以后荧光强度随时间变化的示意图。

图7是实施例1制备的荧光探针YJ-760用于监测细胞内NADH浓度变化的动态监测。

图8是荧光探针YJ-760“关闭-开启”原理图

具体实施方式

本发明中，“M”表示mol/L。

本发明中，“μM”表示μmol/L。

本发明中，YJ-760表示本发明式(Ⅰ)所示的近红外荧光探针。

实施例1：

取式(Ⅱ)所示化合物1 300mg和292mg的3-喹啉甲醛置于装有迪安-斯达克分水器的圆底烧瓶中，并用50mL乙腈和1mL哌啶的混合溶液溶解，所述化合物1在混合溶液中的浓度为5.88mg/mL，在对甲基苯磺酸(p-TsOH)的催化下，80℃回流30分钟，得到固体产物。

所得固体溶解在二氯甲烷中，并用水洗涤3次。将洗涤所得有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸发溶剂，所得残渣经硅胶柱层析纯化(采用二元溶剂体积百分比80％乙酸乙酯/正己烷为洗脱液)，再由二元溶剂二氯甲烷/正己烷重结晶得到式(Ⅲ)所示化合物2(蓝色固体)。¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ＝9.13(d，J＝4Hz，2H)，8.50(s，2H)，8.18(m，2H)，7.99(t，J＝4Hz，4H)，7.77(t，J＝8Hz，2H)，7.63(t，J＝8Hz，2H)，7.54(m，3H)，7.44(s，1H)，7.40(s，1H)，7.36(m，2H)，6.75(s，2H)，2.05(s，6H)。HRMS:Ca1cd for[M+H]⁺，m/z＝602.2453；Found m/z＝603.2520。化合物1和化合物2结构式如下：

将化合物2(100mg，0.17mmol)和碘甲烷(0.05mL，0.85mmol)加入到5mL的三氯甲烷中，得到混合物。

室温下，将混合物在氮气保护下搅拌24小时。减压蒸发溶剂，所得残渣加加入10mL二氯甲烷得到新的沉淀(式(Ⅰ)所示化合物3，紫色固体)，即得到检测NADH的近红外荧光探针。化合物合成产率为88％。¹H NMR(400MHz，DMSO)：δ＝9.88(d，J＝28Hz，1H)，8.50(s，2H)，9.42(s，1H)，9.18(s，1H)，8.58(m，3H)，8.11(m，2H)，7.92(m，3H)，7.89(m，5H)，7.65(m，3H)，7.52(t，J＝4Hz，2H)，7.17(t，J＝20Hz，2H)，4.72(d，J＝4Hz，3H)，1.50(t，J＝4Hz，6H)。HRMS:Ca1cd for[M+H]+，m/z＝617.2688；Found m/z＝617.2697。化合物3(YJ-760)结构式如式(Ⅰ)所示：

应用例1：

S1、准确称取0.0062g实施例1制备的探针化合物3(YJ-760)，溶于5mL乙腈(色谱纯)中，充分混匀，使其完全溶解，放于4℃冰箱备用，得到探针储备液，浓度为2×10^-3M。

S2、本应用例待测样品为NADH溶液。取NADH，溶于PBS缓冲液，配制0-200μM范围内不同浓度的NADH溶液(0、1、2、5、10、15、25、50、75、100、120、150、200μM)；

S3、在2mL EP管中，分别加入S1制备的探针储备液，吐温溶液，S2得到的0-200μM范围内不同浓度的NADH溶液(0、1、2、5、10、15、25、50、75、100、120、150、200μM)，最后用PBS缓冲液(pH＝7.4)定容至1mL，使得探针浓度为10μM，吐温溶液的体积比为0.05％，充分混匀，在37℃恒温水浴中孵育1小时后，加入1cm的石英比色皿中，用紫外可见分光光度计测试吸收光谱，用荧光分光光度计测试其荧光光谱，激发波长分别为595nm和715nm。以NADH的浓度为横坐标，以760nm处的荧光强度为纵坐标，得到荧光强度随NADH浓度变化的曲线。

结果如图1所示，图1方框中所示曲线自下而上分别为浓度为0、1、2、5、10、15、25、50、75、100、120、150、200μM的NADH溶液，随着NADH浓度的增加，溶液体系在600-650nm处的吸光度逐渐下降，而在730nm处吸光度逐渐上升。如图2a和2b所示，溶液体系在652nm处的荧光强度逐渐下降，在760nm处的荧光强度逐渐上升。图2a中，曲线自上而下分别为浓度为0、1、2、5、10、15、25、50、75、100、120、150、200μM的NADH溶液，图2b中，曲线自下而上分别为浓度为0、1、2、5、10、15、25、50、75、100、120、150、200μM的NADH溶液，如图2c所示，在加入0.1～15μM的NADH情况下，荧光强度与NADH的浓度之间有一个良好的线性关系，线性方程为y＝7095.95x+55876.83，线性相关系数为0.999，根据检测限公式(LOD＝3σ/K)可得检测限为0.20μM。

应用例2：

本应用例探针储备液、NADH溶液同应用例1。

在2mL EP管中，分别加入探针储备液，吐温溶液，NADH溶液或者不同的干扰物溶液(表1)，最后用PBS缓冲液(pH＝7.4)定容至1mL，使得探针浓度为10μM，NADH浓度为100μM，吐温的体积比为0.05％，充分混匀，在37℃恒温水浴中孵育1小时后，加入1cm的石英比色皿中，用荧光分光光度计测试其在715nm波长下激发的荧光光谱，每个样品平行配制三次，保证实验结果准确性。

表1特异性选择实验所用干扰物质

结果如图3所示，加入的金属离子、阴离子、生物硫醇类、葡萄糖和过氧化氢都不能使760nm波长处发射的荧光增强，而加入NADH后荧光强度明显增强，表明探针YJ-760对NADH有较好的选择性。

应用例3：

本应用例探针储备液、NADH溶液同应用例1。

使用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲体系调节pH，分别在pH＝3、4、5、6、7、8、9的缓冲体系中，加入探针储备液、吐温溶液和NADH溶液，最后用PBS缓冲液(pH＝7.4)定容至1mL，使得探针浓度为10μM，NADH浓度为100μM，吐温的体积比为0.05％，充分混匀，在37℃恒温水浴中孵育1小时后，加入1cm的石英比色皿中，用荧光分光光度计测试其在715nm波长下激发的荧光光谱。

结果如图4所示：在pH＝5～8的条件下，探针的荧光强度均较稳定，表明该探针可用于生理环境下的检测。

应用例4：

本应用例探针储备液、NADH溶液同应用例1。

在2mL EP管中，分别加入探针储备液，吐温溶液，NADH溶液，最后用PBS缓冲液(pH＝7.4)定容至1mL，使得探针浓度为10μM，NADH浓度为100μM，吐温的体积比为0.05％，充分混匀，分别在20℃、25℃、30℃、37℃和45℃恒温水浴中孵育1小时后，加入1cm的石英比色皿中，用荧光分光光度计测试其在715nm波长下激发的荧光光谱。

结果如图5所示，37℃时的荧光强度最大，因此我们选择37℃作为探针的孵育温度。应用例5：

本应用例探针储备液、NADH溶液同应用例1。

首先测试探针本身随反应时间变化的荧光光谱，在2mL EP管中，分别加入探针储备液，吐温溶液，最后用PBS缓冲液(pH＝7.4)定容至1mL，使得探针浓度为10μM，吐温的体积比为0.05％，充分混匀后在37℃恒温水浴中分别孵育0、10、20、30、40、50、60、70、80、90分钟后，加入1cm的石英比色皿中，用荧光分光光度计测试其在715nm波长下激发的荧光光谱。

用同样的方法，在2mL EP管中，分别加入探针储备液，吐温溶液，NADH溶液，最后用PBS缓冲液(pH＝7.4)定容至1mL，使得探针浓度为10μM，NADH浓度为50μM或100μM，吐温的体积比为0.05％，充分混匀后在37℃恒温水浴中分别孵育0、10、20、30、40、50、60、70、80、90分钟后，加入1cm的石英比色皿中，用荧光分光光度计测试其在715nm波长下激发的荧光光谱。以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标，得到探针以及探针与NADH反应的动力学曲线。

结果如图6所示，探针本身的荧光强度在90分钟内无明显变化，当加入NADH后，荧光强度在60分钟左右达到最大值，并保持不变，故选用60分钟为最优反应温度。因此，探针和NADH反应需要一定的时间，在后面的实验中，探针需要与NADH在37℃恒温水浴孵育60分钟之后再进行测试。

应用例6：

本应用例探针储备液同应用例1。

将神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞(来源：ATCC)以1×10⁴个/mL密度接种到35mm共聚焦培养皿中，并在37℃，5％CO₂培养箱中正常培养培养24小时。将细胞分为三组，分别为对照组、造模组和给药组。对照组即正常细胞，模型组即β淀粉样蛋白(Aβ)造模后红色荧光减弱，给药组即β淀粉样蛋白(Aβ)造模后再给予治疗药物多奈哌齐；将细胞在培养箱中孵育24小时，使其完全贴壁。将培养基吸出，对照组加入无血清培养基继续孵育，造模组和给药组加入等体积用无血清稀释的10μM Aβ(β淀粉样蛋白)继续孵育。48小时后，将培养基吸出，对照组和造模组加入无血清的培养基继续孵育，给药组加入10μM的多奈哌齐。24小时后，将培养基吸出。三组样品处理完成后，加入探针储备液、吐温溶液混合，再用无血清培养基定容，使得探针浓度为10μM，吐温溶液的体积比为0.05％，继续孵育。反应15分钟后，将培养基吸出，用PBS缓冲液冲洗3次，加入不含酚红的培养基进行细胞共聚焦成像。

采用激光共聚焦显微镜进行共聚焦荧光成像检测。在715nm激发YJ-760探针，收集发射波长范围为700～760nm。

结果如图7a和7b所示，与对照组相比，造模组的荧光强度有所降低而给药组的荧光有所恢复，所述荧光探针在对照组即正常细胞中呈现红色荧光，在模型组即β淀粉样蛋白(Aβ)造模后红色荧光减弱，在给药组即β淀粉样蛋白(Aβ)造模后再给予治疗药物多奈哌齐后红色荧光会有所恢复，表明该探针可用于对细胞内的NADH进行成像，同时印证了在阿尔兹海默症过程中，NADH的浓度会有所下降，而在给予治疗药物多奈哌齐之后，NADH的浓度有所上升,本发明检测NADH的近红外荧光探针能够用于研究阿尔兹海默症的发病进程。

Claims (16)

1.一种实时检测NADH的近红外荧光探针，其特征在于，该探针的结构式如式(Ⅰ)所示：

2.根据权利要求1所述的检测NADH的近红外荧光探针，其特征在于：所述近红外荧光探针以硼二吡咯甲烷为荧光母体，喹啉鎓作为NADH的还原位点。

3.一种制备权利要求1所述检测NADH的近红外荧光探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

a：取式(Ⅱ)所示化合物1和3-喹啉甲醛置于装有迪安-斯达克分水器的圆底烧瓶中，并用乙腈和哌啶的混合溶液溶解，在对甲基苯磺酸的催化下，80℃回流30分钟，得到固体产物；

所述化合物1与3-喹啉甲醛物质的量的比为1:2；所述混合溶液中，乙腈和哌啶的体积比为50:1，所述化合物1在混合溶液中的浓度为5～6mg/mL；

将所得固体产物溶解在二氯甲烷中，用水洗涤；将洗涤所得有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸发溶剂，所得残渣经硅胶柱层析纯化，再由二元溶剂重结晶得到式(Ⅲ)所示化合物2，所述二元溶剂为二氯甲烷/正己烷；所述化合物1和化合物2结构式如下：

b：将化合物2和碘甲烷加入到三氯甲烷中，得到混合物，所述化合物2在三氯甲烷中的浓度为20mg/mL，所述碘甲烷与三氯甲烷体积比为1:100；

室温下，将混合物在氮气保护下搅拌24小时，减压蒸发溶剂，所得残渣加入二氯甲烷得到新的沉淀，即为式(Ⅰ)所示检测NADH的近红外荧光探针。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：a中所述洗涤次数为3次。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：a所二元溶剂二氯甲烷与正己烷的体积比为1：8。

6.权利要求1所述的近红外荧光探针在检测NADH中的应用，其特征在于：所述近红外荧光探针与NADH反应之前，在652nm处有荧光发射；在与NADH反应之后，会在700～760nm处产生新的荧光，为OFF-ON型荧光反应。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述近红外荧光探针与NADH反应之前，荧光光谱仪检测中，所述荧光探针的激发波长为595nm，发射波长为652nm；与NADH反应之后，产物的激发波长为715nm，发射波长为760nm。

8.根据权利要求6所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针的线性范围为0.1μM～15μM的NADH，检测限为0.20μM的NADH。

9.根据权利要求6所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

S1、取所述近红外荧光探针，溶于乙腈，充分混匀，使其完全溶解，配制探针储备液，放于4℃冰箱备用；

S2、制备待测样品；所述待测样品为NADH溶液；

待测样品制备方法为：取NADH，溶于PBS缓冲液，配制NADH溶液；

S3、将S1得到的探针储备液和S2得到的待测样品，以及吐温溶液混合，再用PBS缓冲液定容，所述PBS缓冲液pH＝5～8，使得探针浓度为10μM，NADH浓度为100μM，吐温溶液的体积比为0.05％，进行反应，所述反应温度为37℃，反应时间为60～90分钟；

S4、采用荧光分光光度计进行荧光测试，当反应体系在激发波长为715nm，发射波长为760nm，表示待测样品中包含NADH。

10.根据权利要求9所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：S1所述探针储备液中，近红外荧光探针的浓度为2×10^-3M。

11.根据权利要求9所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：S3所述反应PBS缓冲液pH＝7.4，反应时间为60分钟。

12.根据权利要求6所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：所述应用包括以下步骤：

S1、取所述近红外荧光探针，溶于乙腈，充分混匀，使其完全溶解，配制探针储备液，放于4℃冰箱备用；所述探针储备液中，近红外荧光探针的浓度为2×10^-3M；

S2、制备待测样品，所述待测样品为待测细胞；

待测样品制备方法为：将待测细胞接种到35mm共聚焦培养皿中，并在37℃，5％CO₂培养箱中正常培养培养24小时，所述待测细胞接种密度为5×10³～3×10⁴个/mL；

S3、将S1得到的探针储备液和S2得到的待测样品，以及吐温溶液混合，再用无血清培养基定容，使得探针浓度为10μM，吐温溶液的体积比为0.05％，进行反应，所述反应温度为37℃，反应时间为15-60分钟；

S4、用PBS缓冲液冲洗S3所得样品，加入不含酚红的培养基，采用激光共聚焦显微镜进行细胞共聚焦成像，在715nm激发探针，收集发射波长范围为700-760nm，正常细胞中呈现红色荧光，受损细胞NADH含量减少细胞红色荧光变弱，根据像素强度变化，判断待测样品中NADH含量。

13.根据权利要求12所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：S2中所述待测细胞接种密度为1×10⁴个/mL。

14.根据权利要求12所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：S3中所述反应时间为15分钟。

15.根据权利要求12所述的检测NADH的近红外荧光探针的应用，其特征在于：S4中所述冲洗为用PBS缓冲液冲洗S3所得样品冲洗3次。

16.权利要求1所述的近红外荧光探针在制备阿尔茨海默病诊断试剂盒中的应用。

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