CN114437055B - 用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针PTNPy是由3‑(4‑甲基‑噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵与[3‑(4‑甲基‑噻吩氧基)丙基]‑双吡啶‑2‑亚甲基胺经三氯化铁氧化聚合而成。PTNPy在水溶液中发射强烈的荧光，与铜离子结合后形成复合物，由于铜离子的顺磁性，PTNPy溶液的荧光被淬灭。当加入高半胱氨酸后，Hcy能与Cu2+生成更加稳定的络合物Hcy‑Cu2+，从而将PTNPy从PTNPy/Cu2+复合物中释放出来，其荧光恢复。该PTNPy荧光探针合成方法简单，水溶性好，响应速度快，选择性高，可用于水溶液中Cu2+和Hcy的连续定量检测，也可用于活细胞中Cu2+和Hcy的荧光成像及活细胞中Hcy含量波动监测。

Description

用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于荧光传感检测技术领域，具体来说涉及一种用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
铜(II)离子作为蛋白质和酶的组成部分是生物体代谢过程中必需的微量元素。正常情况下，人体内约含100～120mg的铜，微量铜有助于提供生理过程所需的能量，并有助于在血液中形成血红素。但是铜离子摄入不足或者过量的铜离子在人体内积累，都会导致严重的人类疾病，如威尔逊病、门克斯综合征、阿尔茨海默病、胃肠道疾病和肝肾损伤等。此外，铜离子也广泛存在于环境中，如果长期积累且不能有效清除会引发毒性，被认为是可造成环境污染的重金属离子之一。因此，快速、灵敏地检测铜离子对生命科学和环境科学都具有重要的意义。
生物硫醇在细胞信号转换与传递、细胞凋亡调控、蛋白质合成、免疫系统调节、维持生物体内生理平衡和氧化还原平衡等方面发挥着重要作用。人血浆中最常见的生物硫醇是半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)。研究发现：生物硫醇水平异常与某些疾病有关，如高半胱氨酸可直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，增强血小板功能，促进血栓形成。更为重要的是，临床医学观察到在心血管疾病患者的血浆中铜和Hcy水平同时升高。因此，发展一种快速、灵敏的荧光探针用于连续检测Cu2+和Hcy是非常必要的。
近年来，一些能够连续检测Cu2+和Hcy的荧光探针被相继报道，但这些探针通常存在灵敏度低、响应时间长、非水体系检测或者受其它物质如Cys、GSH或H2S等干扰等问题。发展新的荧光探针以实现快速、高灵敏度、高选择性Cu2+和Hcy的连续检测仍然是一个挑战。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于快速、高灵敏度、高选择性的连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针(PTNPy)。
本发明的另一目的是提供上述荧光探针的制备方法。
本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。
一种用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针，其化学结构式为：
其中，m、n为1～9的整数且m/n＝0.11～9。
上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
1)将3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵、[3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基]-双吡啶-2-亚甲基胺和三氯化铁溶解于氯仿中，于40～60℃反应24～48h，冷却至室温，其中，按物质的量份数计，所述3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵、[3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基]-双吡啶-2-亚甲基胺和三氯化铁的比为(0.1～0.9):(0.1～0.9):(0.6～5.4)；
在所述步骤1)中，所述室温为20～25℃。
在所述步骤1)中，所述3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵的物质的量份数和所述氯仿的体积份数的比为(0.1～0.9):20，所述物质的量份数的单位为mmol，所述体积份数的单位为mL。
2)将步骤1)所得溶液浓缩至原体积的1/30～1/10，再滴加至甲醇中，抽滤，将滤饼用甲醇索式提取，以除去残留的三氯化铁，剩余固体溶解于水中，转移到截留分子量为3500-5000的透析袋中，透析2-3天，冷冻干燥后得到粉末为所述荧光探针。
在所述步骤2)中，所述甲醇的体积份数与所述3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵的物质的量份数的比为(20～180):(0.1～0.9)，所述物质的量份数的单位为mmol，所述体积份数的单位为mL。
上述荧光探针检测待测溶液中铜离子浓度的方法，包括以下步骤：
将A摩尔所述荧光探针完全溶解在B升待测溶液中，测定其荧光强度，得到Fa，将所述Fa代入第一标准曲线的方程，得到待测溶液中铜离子的浓度，其中，所述荧光强度为用390～410nm波长的光激发所获得发射光谱位于530～560nm处的强度，第一标准曲线为相同条件下铜离子浓度和荧光强度之间的关系曲线。
在上述技术方案中，A/B＝5×10-5～10×10-5M。
上述荧光探针在检测待测溶液中高半胱氨酸浓度中的应用，检测方法为：
将C摩尔的荧光探针溶解于水中，加入二价铜盐使其荧光恰好完全淬灭，得到J升探针溶液，将所述J升探针溶液加入到K升含高半胱氨酸的待测溶液中，测定荧光强度，得到Fb，将所述Fb代入第二标准曲线的线性方程，得到待测溶液中高半胱氨酸浓度，其中，所述荧光强度为用390～410nm波长的光激发所获得发射光谱位于530～560nm处的强度，所述第二标准曲线为相同条件下高半胱氨酸浓度和荧光强度之间的关系曲线。
在上述技术方案中，C/(K+J)＝5×10-5～10×10-5M。
上述荧光探针在检测细胞内高半胱氨酸浓度中的应用。
在上述技术方案中，检测方法包括：
将H摩尔的荧光探针溶解于水中，加入二价铜盐使其荧光恰好完全淬灭，得到I升探针溶液，将所述I升探针溶液加入G升含有N个细胞的液体中，进行荧光成像，得到平均光密度为Fc，将所述Fc代入第三标准曲线，得到高半胱氨酸浓度为细胞内高半胱氨酸浓度，其中，所述第三标准曲线为：将细胞接种至培养基中培养，待细胞贴壁后，加入荧光探针与细胞共孵育，再加入CuCl2水溶液与细胞共孵育，使其荧光恰好完全淬灭，用PBS清洗细胞，向细胞中加入培养基和不同体积的Hcy水溶液，得到不同Hcy浓度的第三标准溶液，第三标准溶液中荧光探针的浓度为H/(G+I)mol/L，第三标准溶液中细胞的密度为N/(G+I)个/升，培养第三标准溶液，以405nm激发波长进行荧光成像，收集波段于505～605nm的平均光密度，以第三标准溶液中Hcy浓度为横坐标，以平均光密度为纵坐标，设置坐标系，将全部第三标准溶液中的平均光密度以及高半胱氨酸浓度代入做坐标系，得到第三标准曲线。
在上述技术方案中，H/(G+I)＝1×10-5～5×10-5M。
在上述技术方案中，I/G小于等于1/200～1/100。
本发明的优点和有益效果：
1.荧光探针的制备方法简单；
2.荧光探针水溶性好，响应速度快(响应时间＜10分钟，最短可以达到1min)，可用于水溶液样品中Cu2+和Hcy的连续定量检测；
3.荧光探针毒性低，生物相容性好，可用于活细胞中Cu2+和Hcy的连续荧光成像及活细胞中Hcy含量波动监测。
附图说明
图1为荧光探针检测二价铜离子和高半胱氨酸的原理示意图；
图2为实施例2中13个第一标准溶液的发射光谱；
图3为实施例2中第一标准曲线；
图4为实施例3中16个第二标准溶液的发射光谱；
图5为实施例3中第二标准曲线；
图6为实施例4中荧光探针在细胞中的荧光成像；
图7为实施例5中第三标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
下述实施例中药品购买源如下：
3-(3-溴)丙氧基-4-甲基噻吩购买于长成化成科技发展有限公司；
无水三氯化铁、双吡啶-2-亚甲基胺、无水氯化铜、高半胱氨酸购买于天津希恩思生化科技有限公司；
30wt％的三甲胺水溶液、无水硫酸镁、碳酸钾、四氢呋喃、甲醇均购买于天津恒山化工科技有限公司；
氯仿购买于天津渤化化学试剂有限公司；
无水乙腈购买于百灵威科技有限公司。
下述实施例中所涉及仪器的型号如下：
紫外-可见光谱仪UV 2550；
荧光光谱仪F4600 FL；
核磁共振仪Varian Unity plus 400MHz NMR；
电子天平ML204/02；
激光共聚焦显微镜FV-1000。
实施例1
一种用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针，其化学结构式为：
其中，m＝3，n＝5。
上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
1)将0.5mmol 3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵(M1)和0.5mmol[3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基]-双吡啶-2-亚甲基胺(M2)溶解于15mL氯仿中，得到第一溶液，将3mmol无水三氯化铁溶解于5mL氯仿中，得到第二溶液，将第二溶液滴加至第一溶液中，于50℃反应48h后冷却至室温20～25℃；
2)将步骤1)所得溶液浓缩至原体积的1/10，再将其滴加至100mL甲醇中，静置后抽滤，将滤饼用甲醇索式提取，以除去残留的三氯化铁，将剩余固体溶解于20mL水中，转移到截留分子量为3500的透析袋中，透析3天(每天24小时)，冷冻干燥后得到粉末为荧光探针(49.7mg)。产率30.1％。聚合物的氢谱数据为：1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ:8.41(2H,s),7.62(2H,s),7.40(2H,s),7.16(2H,s),4.43(1H,d),3.80(8H,m),3.14(6H,s),2.63(2H,d),2.08(8H,m)，通过对以上数据的分析，归属氢的个数以及所属官能团，计算得出m:n＝3:5。
上述3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵(M1)的合成方法，包括以下步骤：
取3-(3-溴)丙氧基-4-甲基噻吩(2.35g，10mmol)溶于20mL THF中，完全溶解后，将其加至盛有50mL质量分数为30％的三甲胺水溶液的圆底烧瓶中，室温搅拌反应24h。旋干溶剂(THF和水)，向反应瓶中加入50mL THF搅拌30min，有大量固体析出。过滤，并用THF对滤饼进行冲洗，最终得到灰白色固体，即3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵2.7g，产率93.1％。1H NMR(400MHz,D2O)δ:7.02(1H,d),6.48(1H,d),4.13(2H,m),3.53(2H,m),3.15(9H,s),2.29(2H,m),2.07(3H,s)。
上述[3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基]-双吡啶-2-亚甲基胺(M2)的合成方法，包括以下步骤：
将3-(3-溴)丙氧基-4-甲基噻吩(1.28g，5mmol)、双吡啶-2-亚甲基胺(1.99g，10mmol)和K2CO3(1.07g，15mmol)加入到20mL无水乙腈中，80℃反应6h。冷却至室温，旋干乙腈，得到混合固体，将混合固体溶解于30mL乙酸乙酯中，用水萃取三次，有机相用无水硫酸镁干燥后过滤，旋干。粗产物经柱层析纯化(硅胶，甲醇：乙酸乙酯＝1:10(v/v))后，得到[3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基]-双吡啶-2-亚甲基胺1.29g，产率73.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.52(2H,dd),7.55(4H,td),7.14(2H,m),6.77(1H,dd),6.10(1H,d),3.96(2H,t),3.88(4H,s),2.76(2H,t),2.01(2H,m),1.88(3H,s)。
本发明的荧光探针(PTNPy)是由3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵与[3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基]-双吡啶-2-亚甲基胺经三氯化铁氧化聚合而成，所形成共轭聚合物侧链上带有季铵盐和双吡啶胺两种功能基团，其中季铵盐基团可增加聚合物的水溶性；双吡啶胺基团为识别位点，可与铜离子(Cu2+)结合。该荧光探针的检测原理如图1所示：荧光探针(PTNPy)的水溶液在400nm波长的光激发下发射强烈的荧光，当PTNPy与Cu2+形成PTNPy/Cu2+复合物后，PTNPy的荧光被淬灭；当向该PTNPy/Cu2+复合物的水溶液中加入高半胱氨酸(Hcy)，由于Hcy与Cu2+能够通过Cu-S键形成更加稳定的Hcy-Cu2+络合物，从而将PTNPy从PTNPy/Cu2+复合物中释放出来，体系荧光恢复；该荧光探针可用于水溶液中Cu2+和Hcy的高选择性快速的连续检测，也可用于活细胞中Hcy的标记和荧光成像。
实施例2
实施例1中荧光探针检测待测溶液中铜离子浓度的方法，包括以下步骤：
使A摩尔荧光探针完全溶解在B升待测溶液中，静置1min，测定其荧光强度，得到Fa，将Fa代入第一标准曲线的方程，得到待测溶液中铜离子的浓度，其中，荧光强度为用400nm波长的光激发所获得发射光谱位于546nm处的强度，第一标准曲线为相同条件下(相同条件：A/B的数值相同以及除去铜离子之外的体系组成相同)铜离子浓度和荧光强度之间的关系曲线，A/B＝10×10-5M，第一标准曲线如图3所示。
第一标准曲线的获得方法为：配置13个第一标准溶液，第一标准溶液为不同浓度的CuCl2水溶液和水且均溶解0.25微摩尔荧光探针，体积均为2.5毫升，13个第一标准溶液中铜离子浓度依次为0、0.6、1、1.6、2、3.6、7、9、11、13、15、17和20μM，用400nm波长的光分别激发13个第一标准溶液，获得发射光谱位于546nm处的强度，如图2所示，以发射光谱位于546nm处的强度为纵坐标，以铜离子浓度为横坐标，设置坐标系，将13个第一标准溶液的发射光谱位于546nm处的强度以及铜离子浓度代入做坐标系，得到第一标准曲线。第一标准曲线的方程为F＝3506.86+(-3629.19×[Cu2+]1.25)/(1.8+[Cu2+]1.25)，R2＝0.991，检测范围：[Cu2+]＝0～20μM([Cu2+]代表铜离子浓度，F为荧光强度)。
为了验证上述方法检测的准确程度，配制铜离子浓度为10μM的CuCl2水溶液作为上述待测溶液，经测试，将其荧光强度Fa代入第一标准曲线的方程，得到铜离子浓度为9.8μM。
其中：A＝2.5×10-7，B＝2.5×10-3。
实施例3
实施例1中荧光探针在检测待测溶液中高半胱氨酸浓度中的应用，检测方法为：
将C摩尔的荧光探针溶解于水中，加入D摩尔CuCl2使其荧光恰好完全淬灭，得到J升探针溶液，将J升探针溶液加入K升含高半胱氨酸的待测溶液中，混合均匀后静置1min，测定荧光强度，得到Fb，将Fb代入第二标准曲线的线性方程，得到待测溶液中高半胱氨酸浓度，其中，荧光强度为用400nm波长的光激发所获得发射光谱位于546nm处的强度，第二标准曲线为相同条件下(C/(K+J)的数值相同、C/D的数值相同、J/K的数值相同以及除去高半胱氨酸之外的体系组成相同)高半胱氨酸浓度和荧光强度之间的关系曲线，C/(K+J)＝10×10- 5M。
第二标准曲线的获得方法为：配置16个第二标准溶液，第二标准溶液为由J升探针溶液和K升Hcy水溶液混合而成以及由K升水和J升探针溶液混合而成，探针溶液和Hcy水溶液混合而成第二标准溶液的个数为15个，水和探针溶液混合而成第二标准溶液的个数为1个，15个第二标准溶液中Hcy水溶液中Hcy的浓度为20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280和300μM。用400nm波长的光分别激发16个第二标准溶液，获得发射光谱位于546nm处的强度，如图4所示，以发射光谱位于546nm处的强度为纵坐标，以高半胱氨酸浓度为横坐标，设置坐标系，将16个第二标准溶液的发射光谱位于546nm处的强度以及Hcy水溶液中高半胱氨酸浓度代入做坐标系，得到第二标准曲线。第二标准曲线的线性方程为F＝11.49[Hcy]+34.61，R2＝0.999，线性检测范围：[Hcy]＝0～300μM([Hcy]代表高半胱氨酸浓度，F为荧光强度)。
为了验证上述方法检测的准确程度，配制高半胱氨酸浓度为200μM的水溶液作为待测溶液，经测试，将其Fb代入第二标准曲线的线性方程，得到待测溶液中高半胱氨酸浓度为197μM。
其中：C＝2.5×10-7，D＝0.5×10-7，J＝5×10-5，K＝2.5×10-3。
实施例4
实施例1中荧光探针可以作为细胞内荧光剂使用，使用方法为：向含有HeLa细胞的液体(DMEM培养基，细胞密度为105个/mL)中加入荧光探针，以使荧光探针的浓度为10μM，孵育6h，用PBS(pH＝7.4)清洗细胞，再进行荧光成像，其在明场、暗场以及叠加场的成像如图6中的(a)-(c)显示。其中，荧光成像为用405nm波长的光激发所获得发射光谱位于505～605nm内的细胞荧光强度。
向含有2μM CuCl2的细胞液体(DMEM培养基，细胞密度为105个/mL)加入荧光探针，以使荧光探针的浓度为10μM，孵育6h，用PBS清洗细胞，再进行荧光成像，其在明场、暗场以及叠加场的成像如图6中的(d)-(f)显示。其中，荧光成像为用405nm波长的光激发所获得发射光谱位于505～605nm内的细胞荧光强度；
向1mL含有40μM Hcy的细胞液体(DMEM培养基，细胞密度为105个/mL)加入2μL实施例3中的探针溶液，孵育6h，用PBS清洗细胞，再进行荧光成像，其在明场、暗场以及叠加场的成像如图6中的(g)-(i)显示。其中，荧光成像为用405nm波长的光激发所获得发射光谱位于505～605nm内的细胞荧光强度。
通过分析比较图6中不同条件下细胞内荧光强度的变化发现，只含有荧光探针的细胞荧光强度很强，加入Cu2+后细胞内的荧光完全淬灭，再加入Hcy后，细胞内的荧光完全恢复。且细胞内是一个相对复杂的生物环境，荧光探针PTNPy仍能够对细胞进行荧光成像以及定性检测细胞内Cu2+与Hcy的浓度变化，因此说明本发明的荧光探针PTNPy具有良好的抗干扰性。
实施例5
实施例1中荧光探针在检测细胞内高半胱氨酸浓度中的应用，检测方法包括：
将H摩尔的荧光探针溶解于水中，加入L摩尔二价铜盐使其荧光恰好完全淬灭，得到I升探针溶液，将I升探针溶液加入G升含有N个HeLa细胞的DMEM培养基中(I+G升＝1mL，细胞个数N＝105个)，进行荧光成像，得到平均光密度为Fc，将Fc代入第三标准曲线，得到高半胱氨酸浓度为细胞内高半胱氨酸浓度，其中，H/(G+I)＝2×10-5M。
第三标准曲线的获得方法为：将105个HeLa细胞接种至1mL的DMEM培养基中，在37℃含5％CO2(体积分数)的培养箱中培养，待细胞贴壁后，加入0.02微摩尔荧光探针，孵育6小时，再加入5×10-3M的CuCl2水溶液，使其荧光恰好完全淬灭，培养半小时，用PBS清洗HeLa细胞两次后，向HeLa细胞中加入1mL DMEM培养基和不同体积的Hcy水溶液(Hcy水溶液中Hcy的浓度是5×10-3M)，加入后HeLa细胞密度为105个/mL，得到8个Hcy浓度分别为5、10、20、30、40、50、60和70μM的第三标准溶液，培养半小时后进行荧光成像(激发波长405nm，收集波段505～605nm)。以第三标准溶液中Hcy浓度为横坐标，以平均光密度为纵坐标，设置坐标系，将8个第三标准溶液中的HeLa细胞平均光密度以及高半胱氨酸浓度代入做坐标系，得到第三标准曲线，如图7所示。第三标准曲线的线性方程为F’＝0.386[Hcy]+3.687，R2＝0.957，线性检测范围：[Hcy]＝0～70μM([Hcy]代表高半胱氨酸浓度，F’为细胞平均光密度)。
为了验证上述方法检测的准确程度，准备含有浓度为40μM高半胱氨酸的HeLa细胞液体(DMEM培养基)作为上述待测溶液，细胞的密度为105个/mL，经测试，将其平均光密度Fc代入第三标准曲线的线性方程，得到Hcy浓度为37μM。
其中：H＝2×10-8，L＝0.4×10-8，I＝4×10-6，G＝1×10-3。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于连续检测铜离子和高半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，其化学结构式为：
其中，m、n为1～9的整数且m/n＝0.11～9。
2.根据权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵、[3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基]-双吡啶-2-亚甲基胺和三氯化铁溶解于氯仿中，于40～60℃反应24～48h，冷却至室温，其中，按物质的量份数计，所述3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵、[3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基]-双吡啶-2-亚甲基胺和三氯化铁的比为(0.1～0.9):(0.1～0.9):(0.6～5.4)；
2)将步骤1)所得溶液浓缩至原体积的1/30～1/10，再滴加至甲醇中，抽滤，将滤饼用甲醇索式提取，以除去残留的三氯化铁，剩余固体溶解于水中，转移到截留分子量为3500-5000的透析袋中，透析2-3天，冷冻干燥后得到粉末为所述荧光探针。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤1)中，所述室温为20～25℃；
在所述步骤1)中，所述3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵的物质的量份数和所述氯仿的体积份数的比为(0.1～0.9):20，所述物质的量份数的单位为mmol，所述体积份数的单位为mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤2)中，所述甲醇的体积份数与所述3-(4-甲基-噻吩氧基)丙基三甲基溴化铵的物质的量份数的比为(20～180):(0.1～0.9)，所述物质的量份数的单位为mmol，所述体积份数的单位为mL。
5.如权利要求1所述荧光探针检测待测溶液中铜离子浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将A摩尔所述荧光探针完全溶解在B升待测溶液中，测定其荧光强度，得到Fa，将所述Fa代入第一标准曲线的方程，得到待测溶液中铜离子的浓度，其中，所述荧光强度为用390～410nm波长的光激发所获得发射光谱位于530～560nm处的强度，第一标准曲线为相同条件下铜离子浓度和荧光强度之间的关系曲线，其中，A/B＝5×10-5～10×10-5M。
6.如权利要求1所述荧光探针在检测待测溶液中高半胱氨酸浓度中的应用，其特征在于，检测方法为：
将C摩尔的荧光探针溶解于水中，加入二价铜盐使其荧光恰好完全淬灭，得到J升探针溶液，将所述J升探针溶液加入到K升含高半胱氨酸的待测溶液中，测定荧光强度，得到Fb，将所述Fb代入第二标准曲线的线性方程，得到待测溶液中高半胱氨酸浓度，其中，所述荧光强度为用390～410nm波长的光激发所获得发射光谱位于530～560nm处的强度，所述第二标准曲线为相同条件下高半胱氨酸浓度和荧光强度之间的关系曲线，其中，C/(K+J)＝5×10-5～10×10-5M。
7.如权利要求1所述荧光探针在检测细胞内高半胱氨酸浓度中的应用，所述应用为非疾病诊断目的。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，检测方法包括：
将H摩尔的荧光探针溶解于水中，加入二价铜盐使其荧光恰好完全淬灭，得到I升探针溶液，将所述I升探针溶液加入G升含有N个细胞的液体中，进行荧光成像，得到平均光密度为Fc，将所述Fc代入第三标准曲线，得到高半胱氨酸浓度为细胞内高半胱氨酸浓度，其中，所述第三标准曲线为：将细胞接种至培养基中培养，待细胞贴壁后，加入荧光探针与细胞共孵育，再加入CuCl2水溶液与细胞共孵育，使其荧光恰好完全淬灭，用PBS清洗细胞，向细胞中加入培养基和不同体积的Hcy水溶液，得到不同Hcy浓度的第三标准溶液，第三标准溶液中荧光探针的浓度为H/(G+I)mol/L，第三标准溶液中细胞的密度为N/(G+I)个/升，培养第三标准溶液，以405nm激发波长进行荧光成像，收集波段于505～605nm的平均光密度，以第三标准溶液中Hcy浓度为横坐标，以平均光密度为纵坐标，设置坐标系，将全部第三标准溶液中的平均光密度以及高半胱氨酸浓度代入做坐标系，得到第三标准曲线，其中，H/(G+I)＝1×10-5～5×10-5M。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，I/G小于等于1/200～1/100。
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