CN114716407A - 一种检测泛酰巯基乙胺酶活性的化学发光探针、制备方法及其生物应用 - Google Patents
一种检测泛酰巯基乙胺酶活性的化学发光探针、制备方法及其生物应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测泛酰巯基乙胺酶活性的化学发光探针、制备方法及其生物应用，属于生物探针技术领域。本发明的化学发光探针包括可以被泛酰巯基乙胺酶特异性水解的泛酸衍生物、丙烯酸甲酯取代的金刚烷基‑1,2‑二氧杂环丁烷类化学发光团及其可自断裂的链接基团，本申请的化学发光探针化合物5具备极高的灵敏度和检测限，具有广阔的生物应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物探针领域，具体涉及一类泛酰巯基乙胺酶激活型化学发光探针及其制备方法和应用。
背景技术
泛酰巯基乙胺酶，又称血管非炎症因子(Vanin-1)，是一种通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)附着在细胞膜上的表面分子，参与小鼠骨髓细胞的胸腺内归巢，引起了广泛关注。通过体内和体外实验验证被鉴定为具有将D-泛-酰巯基乙胺水解成D-泛酸(维生素B5)和半胱胺的能力。泛酰巯基乙胺酶在泛酸循环起到重要作用。泛酸作为辅酶A的重要成分广泛存在于各种食物中，辅酶A是细胞营养物质转化的必要辅助因子。更重要的是，泛酰巯基乙胺酶严格调节体内半胱胺的产生。半胱胺作为一种重要的抗氧化剂，可以保护身体免受ROS攻击。半胱胺可以通过抑制合成谷胱甘肽(GSH)所需的酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的活性来减少细胞内GSH的储存。同时，它还抑制抗氧化酶的表达。并增加ROS的水平。在复杂的生物环境中，这两个看似矛盾的角色让泛酰巯基乙胺酶更加神秘。近年来，越来越多的研究小组阐明了泛酰巯基乙胺酶表达与疟疾、糖尿病药物引起的肾损伤、炎症、肿瘤和细菌感染等疾病的密切关系。鉴于其在许多病理条件下的功能多样性和异常表达，实时检测其在生物体中的活性具有十分重要的意义。
据我们所知，泛酰巯基乙胺酶主要通过放射性同位素标记和其水解产物的分光光度法进行检测分析。这两种方法均比较麻烦，并且无法原位检测泛酰巯基乙胺酶。光学成像探头由于具有高时空分辨率、高灵敏度、低侵入性等优点，在基础研究和临床应用中发挥了重要作用，适用于生命系统的实时分析。近年来，已经报道了一些发射波长在相对生物透明区域的近红外荧光探针，这些探针在实时检测泛酰巯基乙胺酶方面表现出显着优势。然而，仍然无法避免强光衰减和生物组织自发荧光。因此，迫切需要开发具有高分辨率的荧光探针和易于操作的新方法。
发明内容
为了克服泛酰巯基乙胺酶检测过程中荧光探针和生物发光探针的诸多缺点和不便，本发明提供了一类泛酰巯基乙胺酶激活型化学发光探针及其制备方法和应用，所述化学发光探针包括可以被泛酰巯基乙胺酶特异性水解的泛酸衍生物、丙烯酸甲酯取代的金刚烷基-1,2-二氧杂环丁烷类化学发光团及其可自断裂的链接基团，本申请的化学发光探针具备极高的灵敏度和检测限，具有广阔的生物应用前景。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一类泛酰巯基乙胺酶激活型化学发光探针，包括可被泛酰巯基乙胺酶特异性水解的氨基酸底物泛酸、金刚烷基-1，2-二氧杂环丁烷类的化学发光团及其可自断裂的链接基团L，结构通式如下：
其中：L选自L1、L2和L3，L1、L2和L3的结构如下所示：
本发明另一方面提供上述的泛酰巯基乙胺酶激活型化学发光探针的制备方法，化合物1和化合物2-1或化合物2-2反应得到化合物3，经过单线态氧氧化得到化合物4，化合物4通过脱保护得到化学发光探针化合物5，合成路线如下：
基于上述技术方案，进一步地，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)中间体化合物3的合成
合成连接臂为L1或L3的化合物3：将化合物1和三光气在惰性气体保护下溶于无水二氯甲烷溶液中，在0～4℃条件下搅拌反应0.1～1h，加入DIPEA后继续搅拌反应0.1～1h，然后滴加化合物2-1或化合物2-2的无水二氯甲烷溶液，室温搅拌反应3～10h，通过硅胶色谱纯化得到化合物3；
合成连接臂为L2的化合物3：在化合物2-2的无水二氯甲烷溶液中加入2，4-甲基苯磺酰氯和三乙胺，在0～4℃条件下搅拌反应3～7h，通过硅胶色谱纯化，将纯化过后的产物与化合物1、碳酸钾、碘化钠溶于无水乙腈，混合物在60～100℃的条件下反应3-8h，通过硅胶色谱纯化得到化合物3；
(2)中间体化合物4的合成
将化合物3和亚甲蓝溶于CDCl3，冰浴条件下，在用640～680nm的光照射的同时，向反应溶液中通入氧气，通过RP-HPLC监测反应，待氧化反应完全后，除去亚甲基蓝，得到化合物4；
(3)探针化合物5的合成
在0～4℃条件下，向所得的化合物4中加入体积百分数为80％乙酸水溶液，避光条件下搅拌进行脱保护反应，通过TLC监测反应，反应结束后，纯化得到化合物5。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述化合物1的浓度为1～50mg/mL，化合物1和三光气的投料质量比为3:1～1:1；DIPEA的加入量为反应体系总体积的0.1～10％；化合物1与化合物2-1或化合物2-2的投料质量比为3:1～1:3。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述惰性气体为氩气、氦气、氮气中一种或二种以上的组合。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中所述化合物3的浓度为1～20mg/mL，化合物3和亚甲蓝的投料质量比为100:1～2:1。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中使用乙酸乙酯快速过柱的方式除去亚甲基蓝。
基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中所述纯化的具体过程为：向反应溶液中添加碱性水溶液调pH至中性，加入CH2Cl2，并用饱和食盐水萃取2～5次，收集有机相并用无水Na2SO4干燥，通过硅胶色谱纯化得到化合物5。
基于上述技术方案，进一步地，所述碱性水溶液为饱和Na2CO3水溶液。
本发明还提供上述的泛酰巯基乙胺酶激活型化学发光探针在泛酰巯基乙胺酶检测中的应用。
基于上述技术方案，进一步地，所述应用为用于活细胞或活体动物中泛酰巯基乙胺酶活性的检测。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
本申请的化学发光探针对泛酰巯基乙胺酶具备极高的灵敏度，对泛酰巯基乙胺酶的检测限(LOD＝3δ/k)低至0.02ng/mL，并且对深层的组织具有良好的成像能力，具有广阔的生物应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
图1为链接臂为L2的化学发光探针CL-PA的质谱表征图。
图2为实施例1合成的化学发光探针CL-N-PA的质谱表征图。
图3为实施例1合成的化学发光探针CL-N-PA的核磁共振氢谱表征图。
图4为实施例1合成的化学发光探针CL-N-PA的核磁共振碳谱表征图。
图5为实施例1合成的化学发光探针化学结构及其对泛酰巯基乙胺酶响应后的化学转变过程。
图6为实施例1合成的化学发光探针CL-N-PA(1μM)在不同泛酰巯基乙胺酶浓度(0-800ng/mL)下的化学发光动力学曲线(A)以及70分钟时化学发光强度与泛酰巯基乙胺酶浓度的线性拟合曲线(B)。
图7为实施例1合成的化学发光探针CL-N-PA在细胞水平的应用，其中，(A)为探针CL-N-PA对HepG2细胞的存活率；(B)为探针CL-N-PA对Hela细胞的存活率；(C)为抑制剂RR6对HepG2和Hela细胞的存活率；(D)为探针CL-N-PA对HepG2和Hela细胞内泛酰巯基乙胺酶的响应情况；(E)为图(D)化学发光强度数据的量化结果。
图8为实施例1合成的化学发光探针CL-N-PA在组织穿透能力图，其中，(A)为覆盖不同厚度鸡肉组织的化学发光和荧光图像；(B)为图(A)中化学发光成像数据的信背比(SBR)；(C)为图(A)中荧光成像数据的信背比(SBR)。
图9为实施例1合成的化学发光探针CL-N-PA在检测小鼠体内泛酰巯基乙胺酶活性图，其中，(A)为探针CL-N-PA对小鼠体内泛酰巯基乙胺酶活性的化学发光成像图，右侧为实验组，左侧为对照组；(B)为图(A)化学发光图像的量化数据；(C)为探针CL-N-PA检测炎症小鼠模型中泛酰巯基乙胺酶的化学发光成像图，小鼠右腿提前12h注射LPS诱导炎症，左腿同一时间注射等量生理盐水作为对照：(D)为图(C)化学发光图像的量化数据。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以是本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思进行等同替换或改变均属于本发明的保护范畴。
下述实施例中，如无特殊说明，所有试剂均可由常规方法制备或由商业途径购买。
实施例1
泛酰巯基乙胺酶激活的化学发光探针CL-N-PA，该探针包括可以被泛酰巯基乙胺酶特异性水解的泛酸衍生物、丙烯酸甲酯取代的金刚烷基-1,2-二氧杂环丁烷类化学发光团及含有两个协同的可自断裂的链接基团。其中，酶切底物泛酸衍生物已经广泛的应用于泛酰巯基乙胺酶荧光探针识别基团，3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(2-氯-3-羟基-4-丙烯酸甲酯)-苯基-1,2-二氧杂环丁烷发光团在水性条件下能发射出540nm的荧光并且具有良好的进入细胞能力，双自断裂的链接基团中的N,N’-二甲基乙二胺和对氨基苯甲醇有利于减小发光团空间位阻的影响，帮助泛酸部分深入到泛酰巯基乙胺酶的疏水空腔当中，当泛酸部分被泛酰巯基乙胺酶水解掉之后，探针的自断裂部分不稳定，能通过电子转移自发的发生1,6-醌甲基消除和自环化，形成裸露的酚羟基负离子，酚羟基负离子对二氧杂环丁烷部分的电子转移是过氧键断裂生成激发态的荧光物质和金刚烷酮，激发态物质以释放光子的形式去激发；
探针CL-N-PA的合成路线如下：
具体制备方法包括如下步骤：
(1)中间体化合物6的合成
将76mg化合物1(按照文献D.Shabat,ACS Central Science,2017,3,349-358合成)和三光气(30mg)在N2气氛下溶于10mL无水二氯甲烷，在0℃条件下搅拌0.5h，随后加入DIPEA(0.348mL)继续搅拌0.5h，然后滴加5mL含有化合物2-1(按照文献H.Ma,ChemicalScience,2020,11,12802-12806合成)的无水二氯甲烷溶液(18.4mg/mL)，N2气氛下，室温搅拌反应5h，通过硅胶色谱纯化得到化合物6(94mg，60％)；
(2)中间体化合物7的合成
将化合物6(45mg)和1毫克亚甲蓝溶于4mL CDCl3，冰浴条件下，用660nm的LED灯照射，同时将氧气采用鼓泡方式通入反应溶液，通过RP-HPLC监测反应，待氧化完全后使用纯乙酸乙酯快速过柱，以除去亚甲基蓝，粗产品7无需提纯即可用于下一步反应；
(3)探针CL-N-PA的合成
在0℃条件下，向粗产品7(50mg)中加入体积百分数为80％乙酸水溶液，避光条件下快速搅拌进行脱保护反应，通过TLC监测反应，反应结束后向反应物中添加饱和Na2CO3水溶液调pH至中性，倒入CH2Cl2并用饱和食盐水萃取三次，收集有机相并用无水Na2SO4干燥，通过硅胶色谱纯化得到化合物CL-N-PA(34mg,83％)。
当链接基团L选自L3时，除了步骤(1)中的化合物2-1替换为化合物2-2(按照文献H.Ma,Chemical Science,2020,11,12802-12806合成)，其他具体合成过程同上述步骤；当链接基团L选自L2时，合成步骤(1)具体为化合物2-2与2,4-甲基苯磺酰氯反应，分离纯化中间产物，将中间产物在碳酸钾和碘化钠催化的情况下与化合物1加热得到化合物3，其余合成过程同上述步骤。
实施例2
探针CL-N-PA的发光能力测试：
将探针CL-N-PA溶于含有DMSO的Tris-HCl(50mM pH 7.4)缓冲液中制备探针工作液(2uM，2％DMSO)。将CL-N-PA的探针工作液(100μL)与含有不同浓度泛酰巯基乙胺酶的Tris-HCl缓冲液(100μL)等比例混合，混合后的溶液置于96孔板中，在37℃恒温条件下孵育3h，通过Spectramax I3X型多功能酶标仪收集化学发光信号。
结果如图5-6所示，本申请制备的探针本身在37℃的Tris-HCl(50mM pH 7.4)的环境中化学发光处于关闭的状态，随着泛酰巯基乙胺酶的加入，我们可以观测到明显的化学发光信号，在70分钟左右，化学发光信号达到最大值，随后开始缓慢衰减。并且化学发光强度与泛酰巯基乙胺酶的含量具有明显的线性关系，将70分钟化学发光信号强度最大处的信号与泛酰巯基乙胺酶浓度进行线性拟合，线性方程为y＝1384.5x+1866.7，R2＝0.9961。探针对泛酰巯基乙胺酶的检测限(LOD＝3δ/k)为0.02ng/mL，其可与目前所报道的最灵敏的荧光探针媲美。
实施例3
探针CL-N-PA的细胞实验
HepG2细胞系和Hela细胞系因其丰富的泛酰巯基乙胺酶表达而被选为模型。通过MTT方法对CL-N-PA和RR6对HepG2细胞和Hela细胞的毒性进行评估。在HepG2细胞和Hela细胞中分别加入不同浓度(0,10,20,30,40,50uM)的探针CL-N-PA并孵育12h，检测细胞存活率，结果如图7所示，与不同浓度(0,50,100uM)的RR6并孵育6h后细胞毒性结果相比，二者无明显区别，说明本申请的探针CL-N-PA细胞毒性在使用浓度内可忽略不计。
HepG2细胞比Hela细胞含有更多的泛酰巯基乙胺酶，在细胞成像中，HepG2细胞和Hela细胞本身没有显示出化学发光信号，与CL-N-PA孵育1h后，两种细胞均表现出明显的化学发光。然而，如果用RR6预处理细胞，细胞中的化学发光被大大抑制。根据图7的成像结果可以清楚地看出，HepG2细胞的化学发光强度明显高于Hela细胞，这些结果证实了CL-N-PA能够检测细胞中的泛酰巯基乙胺酶。
实施例4
探针CL-N-PA的组织穿透性实验
将探针(10uM)与泛酰巯基乙胺酶(800ng/mL)的混合Tris-HCl溶液(1％DMSO，50mM，pH 7.4)置于96孔板中，并在37℃的条件下孵育1h。将平均厚度为5mm的鸡肉组织覆盖在96孔板含有探针的孔的上方，通过IVIS Spectrum型小动物成像仪收集覆盖不同厚度鸡肉组织的荧光和化学发光信号。
分别在与泛酰巯基乙胺酶孵育后以化学发光和荧光模式研究了CL-N-PA的组织穿透能力，结果如图8所示，随着鸡肉组织厚度的不断增加(0到20mm)，化学发光和荧光信号都不可避免地下降，即使在孔板上覆盖了20mm的鸡肉组织，仍然可以准确地观察到化学发光信号。由于强烈的自发荧光干扰，5mm的鸡肉组织使得很难将荧光信号与背景区分开来。结果量化表明，当样品顶部覆盖20mm的鸡肉组织时，化学发光的信背比(SBR)仍大于10。相比之下，在覆盖样品上方的鸡肉组织后，荧光的SBR接近1。这些结果表明化学发光信号几乎不受自发荧光的干扰，并且对更深的组织具有良好的成像能力，这对于体内检测泛酰巯基乙胺酶活性至关重要。
实施例5
探针CL-N-PA的活体动物成像试验
在昆明小鼠腹膜内注射了RR6(30mg kg-1)或等量的生理盐水(对照)。40分钟后，将CL-N-PA(20μM×200μL)腹腔注射到上述小鼠体内，并通过IVIS光谱系统记录探针给药后的化学发光图像。在不同时间捕获的图像的总计数随时间变化的量化如图9所示。对照组在注射CL-N-PA后约20min化学发光强度逐渐增加，随后是一段平稳发光期，随后在40min时亮度逐渐降低。抑制剂组的化学发光强度明显弱于对照组。对照组在32min时的化学发光强度约为抑制剂组的3倍，表明CL-N-PA可以揭示活体动物体内泛酰巯基乙胺酶的活性。
昆明小鼠右后腿注射200μL 1mg mL-1LPS，诱发后肢炎症，左侧后腿注射等量生理盐水作为对照，12小时后，将CL-N-PA(20μM×20μL)皮下注射到小鼠的对应的双腿中。在不同时间点捕获小鼠的化学发光图像。从图9中可以看出，小鼠右后腿的荧光比左后腿的荧光强，进一步表明本申请的CL-N-PA可以揭示活体动物体内泛酰巯基乙胺酶的活性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一类泛酰巯基乙胺酶激活型化学发光探针，其特征在于，其结构通式如下：
其中：L选自L1、L2和L3，L1、L2和L3的结构如下所示：
2.权利要求1所述的泛酰巯基乙胺酶激活型化学发光探针的制备方法，其特征在于，化合物1和化合物2-1或化合物2-2反应得到化合物3，经过单线态氧氧化得到化合物4，化合物4通过脱保护得到化学发光探针化合物5，合成路线如下：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：
(1)中间体化合物3的合成
合成连接臂为L1或L3的化合物3：将化合物1和三光气在惰性气体保护下溶于无水二氯甲烷溶液中，在0～4℃条件下搅拌反应0.1～1h，加入DIPEA后继续搅拌反应0.1～1h，然后滴加化合物2-1或化合物2-2的无水二氯甲烷溶液，室温搅拌反应3～10h，通过硅胶色谱纯化得到化合物3；
合成连接臂为L2的化合物3：在化合物2-2的无水二氯甲烷溶液中加入2，4-甲基苯磺酰氯和三乙胺，在0～4℃条件下搅拌反应3～7h，通过硅胶色谱纯化，将纯化的产物与化合物1、碳酸钾、碘化钠溶于无水乙腈，混合物在60～100℃的条件下反应3-8h，通过硅胶色谱纯化得到化合物3；
(2)中间体化合物4的合成
将化合物3和亚甲蓝溶于CDCl3，冰浴条件下，在用640～680nm的光照射的同时，向反应溶液中通入氧气，通过RP-HPLC监测反应，待氧化反应完全后，除去亚甲基蓝，得到化合物4；
(3)探针化合物5的合成
在0～4℃条件下，向所得的化合物4中加入体积百分数为80％乙酸水溶液，避光条件下搅拌进行脱保护反应，通过TLC监测反应，反应结束后，纯化得到化合物5。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述化合物1的浓度为1～50mg/mL，化合物1和三光气的投料质量比为3:1～1:1；DIPEA的加入量为反应体系总体积的0.1～10％；化合物1与化合物2-1或化合物2-2的投料质量比为3:1～1:3；所述惰性气体为氩气、氦气、氮气中一种或二种以上的组合。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述化合物3的浓度为1～20mg/mL，化合物3和亚甲蓝的投料质量比为100:1～2:1。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中使用乙酸乙酯快速过柱的方式除去亚甲基蓝。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述纯化的具体过程为：向反应溶液中添加碱性水溶液调pH至中性，加入CH2Cl2，并用饱和食盐水萃取2～5次，收集有机相并用无水Na2SO4干燥，通过硅胶色谱纯化得到化合物5。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述碱性水溶液为饱和Na2CO3水溶液。
9.权利要求1所述的泛酰巯基乙胺酶激活型化学发光探针在泛酰巯基乙胺酶检测中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为用于活细胞或活体动物中泛酰巯基乙胺酶活性的检测。
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