CN111072669B - 一种苯基咪唑并吡嗪酮类化合物及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种苯基咪唑并吡嗪酮类化合物及制备方法与应用，化学结构如式(Ⅰ)的所示：
Figure DDA0002300892670000011
其中，R1选自苯氧基、苯硫基、5‑甲基呋喃基、4‑甲氧基苯基、4‑氟苯基、4‑氯苯基、4‑溴苯基、3‑氟‑4‑氨基苯基、3‑呋喃基、4‑甲基呋喃基、萘‑2‑基、4‑甲基苯基、3,5‑二甲基苯基、4‑羟甲基苯基、4‑羟基苯基、4‑巯基苯基。本公开通过对Furimazine底物的C8位进行修饰改造，能够使其成像波长产生红移并且增强其发光强度，尤其增强了动物水平的生物发光成像。

Description

一种苯基咪唑并吡嗪酮类化合物及制备方法与应用
技术领域
本公开涉及一种苯基咪唑并吡嗪酮类化合物及制备方法与应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
生物发光成像(Bioluminescent imaging,BLI)是一种灵敏、可靠、非侵入性的监控手段，可用于监测肿瘤的生长和转移、目标基因的表达、蛋白-蛋白之间的相互作用、药物高通量筛选和体内ATP水平等。生物发光成像具有以下几点优势：一是信噪比(SNR)高，由于生物发光体系的背景信号可以忽略不计因此生物发光更加灵敏；二是萤光素底物分子毒性很小，适合各种生物活性评价；三是生物发光不需要外界光源，因此避免了自身的光漂白和光致毒风险；四是生物发光较适合于深层组织成像。综上所述，生物发光成像是一门新兴的成像技术，已经广泛应用到化学生物学、医学、分子生物学和药学等学科，并在多个领域有着不可替代的技术优势。NanoLuc(Nluc)萤光素酶作为分子量最小(19kDa)的萤光素酶包含171氨基酸。在Oplophorus萤光素酶(Oluc)基础上经过基因工程改造得到了性能卓越的生物发光报告基因—NanoLuc。NanoLuc萤光素酶相较于萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶具有分子量小、稳定性高、发光强度强等优势。NanoLuc催化萤光素酶底物Furimazine可产生高强度、辉光性的发光。NanoLuc/Furimazine生物发光体系简单，不需要ATP、Mg2+等辅助因子，生物发光强度是其他生物发光体系的150倍以上，且发光持续时间大大延长。该生物发光体系已经被用于微生物学、生物化学、医学、免疫学等多个学科和领域，用来研究蛋白：蛋白和蛋白：配体相互作用、蛋白稳定性、报告基因分析和信号传导还可以作为遗传编码的生物传感器以及生物发光成像。
虽然NanoLuc/Furimazine生物发光体系有着无与伦比的发光优势，但是，经过本公开发明人研究发现，其存在以下缺陷：发射波长短只有460nm，低于其他的生物发光体系因此不能很好的用于体内发光成像；稳定性差，在中性或碱性介质中容易被氧化产生化学发光，提升了背景信号；底物单一等。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种苯基咪唑并吡嗪酮类化合物及制备方法与应用，本公开通过对Furimazine底物的C8位进行修饰改造，能够使其成像波长产生红移并且增强其发光强度，尤其增强了动物水平的生物发光成像。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
一方面，本公开提供了一种苯基咪唑并吡嗪酮类化合物，其化学结构如式(Ⅰ)的所示：
Figure BDA0002300892660000021
其中，R1选自苯氧基、苯硫基、5-甲基呋喃基、4-甲氧基苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟-4-氨基苯基、3-呋喃基、4-甲基呋喃基、萘-2-基、4-甲基苯基、3,5-二甲基苯基、4-羟甲基苯基、4-羟基苯基、4-巯基苯基。
进一步的，苯基咪唑并吡嗪酮类化合物包括以下化合物：
A1：2-(呋喃-2-基甲基)-8-苯氧基-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A2：2-(呋喃-2-基甲基)-8-苯硫基-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A3：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(5-甲基呋喃基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A4：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-甲氧基苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A5：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-氟苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A6：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-氯苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A7：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-溴苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A8：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(3-氟-4-氨基苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A9：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(呋喃基-3)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A10：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-甲基呋喃基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A11：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(萘-2-基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A12：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-甲基苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A13：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(3,5-二甲基苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A14：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-羟甲基苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A15：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-羟基苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮
A16：2-(呋喃-2-基甲基)-8-(4-巯基苯基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮。
另一方面，本公开提供了一种苯基咪唑并吡嗪酮类化合物的制备方法，将2-氨基-5-溴吡嗪和苯硼酸在碳酸钠作用下进行反应获得中间体1，中间体1与N-溴琥珀酰亚胺反应获得中间体2，4-甲基苯磺酰氯与叠氮钠获得中间体3，中间体3与二乙基膦酰基乙酸叔丁酯在氢化钠的作用下反应制备中间体4，中间体2与中间体4在二聚醋酸铑的催化下反应获得中间体5，中间体5与2-呋喃甲醛、四甲基胍混合反应获得中间体6，中间体6与硼酸类化合物反应获得中间体7，中间体7和三氟乙酸反应获得中间体8，中间体8与三乙胺、醋酸酐和4-二甲氨基吡啶混合反应获得中间体9，中间体9与硼氢化钠反应获得式(Ⅰ)的所示化合物；
Figure BDA0002300892660000031
中间体1的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000032
中间体2的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000033
中间体3的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000034
中间体4的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000035
中间体5的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000036
中间体6的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000037
硼酸类化合物化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000038
中间体7的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000041
中间体8的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000042
中间体9的化学结构式为：
Figure BDA0002300892660000043
R1选自苯氧基、苯硫基、5-甲基呋喃基、4-甲氧基苯基、4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟-4-氨基苯基、呋喃基、4-甲基呋喃基、萘-2-基、4-甲基苯基、3,5-二甲基苯基、4-羟甲基苯基、4-羟基苯基、4-巯基苯基。
进一步的，2-氨基-5-溴吡嗪与苯硼酸的摩尔比为1:1～2。
进一步的，惰性气氛下，将2-氨基-5-溴吡嗪与苯硼酸溶解，加入碳酸钠和双-(三苯基磷)二氯化钯，加热至不低于100℃进行反应。更进一步的，反应温度为100～110℃。本公开所述惰性气氛可以为氮气氛围，也可以为氩气氛围，还可以为氖气氛围等。
进一步的，中间体1与N-溴琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1～2。
进一步的，向中间体1的溶液中分批加入N-溴琥珀酰亚胺。
进一步的，中间体1与N-溴琥珀酰亚胺反应的温度为室温，反应时间为1.5～2.5h。本公开所述室温是指室内环境的温度，一般为15～30℃。
进一步的，4-甲基苯磺酰氯与叠氮钠的摩尔比为1:0.9～1.1。
进一步的，将4-甲基苯磺酰氯和叠氮钠溶于丙酮和水的混合溶液里，于冰浴条件下反应1.5～2.5h。
进一步的，中间体3、二乙基膦酰基乙酸叔丁酯、氢化钠的摩尔比为1～2:1:1～2。
进一步的，将中间体3、二乙基膦酰基乙酸叔丁酯和氢化钠溶于无水THF中，于冰浴条件下反应20～40min，转移至室温条件下，继续反应1.5～2.5小时。
进一步的，中间体2与中间体4的摩尔比为1:1～2。
进一步的，制备中间体5的条件为：惰性气氛，温度为100～110℃，反应时间为22～26h。
进一步的，中间体5、2-呋喃甲醛、四甲基胍的摩尔比为1:1～2:2～3。
进一步的，制备中间体6的温度为室温，反应时间为1.5～2.5h。
进一步的，中间体6与硼酸类化合物的摩尔比为1:1～2。
进一步的，在惰性气氛下，将中间体6、四三苯基膦钯、硼酸类化合物溶于1,4-二氧六环中，然后加入碳酸钠溶液，85℃反应3～4小时获得中间体7。
进一步的，中间体7和三氟乙酸的摩尔比为1:9～10。
进一步的，中间体7与三氟乙酸反应的条件为室温反应4～6h。
进一步的，中间体8、三乙胺、醋酸酐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1:9～11:9～11:0.01～0.2。
进一步的，将中间体8溶于四氢呋喃中，依次添加三乙胺、醋酸酐、4-二甲氨基吡啶，冰浴条件下，反应1.5～2.5h。
进一步的，中间体9与硼氢化钠的摩尔比为1:2～4。
进一步的，在冰浴条件下，将中间体9溶于二氯甲烷中，然后添加甲醇、硼氢化钠，反应20～40min。
第三方面，本公开提供上述苯基咪唑并吡嗪酮类化合物的以下应用：
一种上述苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在作为生物发光底物中的应用；
一种上述苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在生物发光成像中的应用；该类化合物能够分别在酶水平、细胞水平、动物水平进行生物发光成像；
一种上述苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在监测蛋白稳定性和/或监测生物发光共振能量转移中的应用；
一种上述苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在监测药物药理作用和/或毒性作用中的应用：该类化合物可以在NanoLuc萤光素酶的作用下作为报告信号检测药物在酶水平、细胞水平、体内水平的药理作用和毒性作用；
一种上述苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在在化学发光领域中的应用；该类化合物具有良好的化学发光性质。
本公开的有益效果为：
1.本公开的化合物均可以作为NanoLuc萤光素酶的底物，扩大了NanoLuc类型类似物的范围，扩宽NanoLuc生物发光体系的应用范围。
2.本公开的部分化合物与Furimaizne相比，在相同环境下具有波长红移、稳定性提高等特点。
3.本公开的部分化合物相较于Furimaizne，在酶水平、细胞水平、动物水平的生物发光强度均有所增强，尤其是动物水平的发光成像是Furimazine的50倍以上。
4.本公开的部分化合物与Furinazine相比，化合物溶液对NanoLuc萤光素酶具有较低的检测限，在作为探针应用时具有较高的灵敏度。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1：NanoLuc类型衍生物与NanoLuc萤光素酶的体外酶活研究。
1、生物发光强度测定和酶促反应动力学常数计算：测定数值用GraphPad Prism计算出不同化合物的反应动力学常数和half life。以Furimazine(2μM)的测试结果为基准，折算所有化合物的相对生物发光强度值。
2、生物发光最大波长的测定：向0.5ml用Tris-HCl(50mM,pH＝7.42)溶解的不同的目标化合物和Furimazine(25μM)中分别加入0.5ml NanoLuc(0.6μg/ml)，用F-2500荧光分光光度计在lamp off的luminescence模式下，response time设置为0.4s，扫描其发射光谱，得到最大生物发射波长。
表1.NanoLuc类型衍生物与NanoLuc萤光素酶体外生物发光性质
Figure BDA0002300892660000061
结果表明，与Furimaizne相比，在酶活方面，所有的目标化合物生物发光波长均有所延长，但是在发光持续时间方面有一定程度的下降其中A1、A2、A3属于快速发光动力学；在生物发光强度方面，A1与Furimaizne相差无几,而A2则表现出更高的生物发光亮度。总之，目标化合物在发射波长、发光强度和动力学特征方面显示出了优良的特性，具有很大的潜力可以作为NanoLuc生物发光体系中底物的选择。
实施例2：NanoLuc类型衍生物与Renilla萤光素酶的体外酶活发光强度研究。
将50μL用Tris-HCl(50mM,pH＝7.42)溶解的不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、5、10、25μM)的目标化合物和Furimazine分别加入到50μL Renilla(海肾)萤光素酶(1μg/ml)于全黑的96孔板中，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统进行生物发光强度的测定。
表2.NanoLuc类型衍生物与Renilla萤光素酶体外生物发光强度
Figure BDA0002300892660000071
结果表明，所有的目标化合物均随着浓度的增高发光强度逐渐增强，但是远低于在NanoLuc萤光素酶下的发光强度(低三个数量级)，这也表明目标化合物对NanoLuc萤光素酶具有很高的选择性，可以作为探针特异性检测NanoLuc萤光素酶在体外、细胞水平和体内水平分布。
实施例3：NanoLuc类型衍生物与Gaussisa萤光素酶的体外酶活发光强度研究。
将50μL用Tris-HCl(50mM,pH＝7.42)溶解的不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、5、10、25μM)的目标化合物和Furimazine分别加入到50μLGaussisa萤光素酶(0.5μg/ml)于全黑的96孔板中，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统进行生物发光强度的测定。
表3.NanoLuc类型衍生物与Gaussisa萤光素酶体外生物发光强度
Figure BDA0002300892660000072
Figure BDA0002300892660000081
结果表明，相较于Furimazine，在Gaussisa萤光素酶作用下，A1、A2表现出更强的生物发光；但是所有化合物的发光强度远低于与NanoLuc萤光素酶，此现象表明目标化合物对NanoLuc萤光素酶具有高度选择性。
实施例4：NanoLuc类型类似物的细胞活性研究(细胞水平)。
在黑色的96孔板中每孔加入100μL稳定转染表达NanoLuc的A549细胞悬液(4x104/孔)，于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育24小时。之后吸出培养基，加入100μL用0.9％生理盐水溶解的不同溶度的目标化合物和Furimazine(0，0.5，1，2，5，10，25μM)，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统测试，得结果如下表：
表4.NanoLuc类型类似物的细胞水平的生物发光性质
Figure BDA0002300892660000082
结果表明，虽然化合物在细胞水平发光强度不如Furimaizne，但是在低浓度时(0-5μM)，A2的发光强度强于Furimaizne，且随着浓度的增加发光强度到达饱和，推测A2更容易穿过细胞膜。
实施例5：NanoLuc类型类似物的化学发光波长测定。
200μL用无水乙醇配制成的1mM目标化合物或Furimazine的溶液中加入2ml的含0.05％的1M的NaOH溶液的DMSO溶液，用F-2500荧光分光光度计在lamp off模式下测定化学发光光谱。得到最大化学发光发射波长。结果见表5。
表5：NanoLuc类型类似物的化学发光波长
Figure BDA0002300892660000083
结果表明，在化学发光波长方面，相较于Furimazine，除A1表现出轻微的蓝移外，其余的化合物均表现出明显的红移(大约50nm)。
实施例6：NanoLuc类型类似物的动物体内活性研究。
选取在酶水平和细胞水平发光性能表现较好的化合物A1和A2，进一步进行动物体内活性研究。将目标化合物和Furimazine配制成浓度为1mM和5mM的氯化钠溶液。取荷瘤大小为1cm左右的裸鼠进行体内发光成像实验。腹腔注射化合物100μL，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统进行体内发光成像。比较目标化合物和阳性对照Furimazine的最大发光强度。结果见表6。
表6.NanoLuc类型类似物的动物体内最大发光强度对比
Figure BDA0002300892660000091
结果表明，在1mM时，体内发光强度A1是Furimazine的2.3倍，A2是其7.6倍；在5mM时，A1是Furimazine的8倍，A2则是其51倍。这表明A1、A2比Furimazine更适合于体内发光成像，尤其是A2在体内成像方面展现的无与伦比的优势，使其能够完全取代Furimazine成为NanoLuc最匹配的底物。
综上所述，A2化合物在酶水平、细胞水平、体内水平均展示出了无可替代的优势，是一个可以在取代Furimazine的优秀底物。
本公开中A1～A16化合物及Furimazine的的化学结构式如下：
Figure BDA0002300892660000101
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种苯基咪唑并吡嗪酮类化合物，其特征是，化学结构如式Ⅰ的所示：
Figure FDA0002923051400000011
2.一种权利要求1所述的苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在作为生物发光底物中的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗。
3.一种权利要求1所述的苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在生物发光成像中的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗。
4.一种权利要求1所述的苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在监测蛋白稳定性和/或监测生物发光共振能量转移中的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗。
5.一种权利要求1所述的苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在监测药物药理作用和/或毒性作用中的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗。
6.一种权利要求1所述的苯基咪唑并吡嗪酮类化合物在化学发光领域中的应用，所述应用为非疾病的诊断和治疗。
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