CN111116594B - 一种C-6位改造NanoLuc类型类似物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种C‑6位改造NanoLuc类型类似物及制备方法与应用，具有式Ⅰ的所示结构：
Figure DDA0002301007780000011
R1选自4‑氟苯基、4‑氯苯基、4‑溴苯基、3‑氟‑4‑氨基苯基、噻吩基、呋喃基、5‑甲基呋喃基、萘‑2‑基、苯并呋喃基、4‑甲基苯基、3,5‑二甲基苯基、4‑羟甲基苯基、4‑甲氧基苯基、4‑巯基苯基。该类化合物可作为生物发光的底物用于研究蛋白：蛋白和蛋白：配体相互作用，监测蛋白稳定性和生物发光共振能量转移等领域，利用生物发光作为探针检测NanoLuc萤光素酶作用下在体外、细胞水平和体内水平分布成像的应用，在NanoLuc萤光素酶存在下作为报告信号检测药物在酶水平、细胞水平、动物水平的药理作用和毒性作用。

Description

一种C-6位改造NanoLuc类型类似物及其制备方法与应用
技术领域
本公开属于药物技术领域，涉及一种C-6位改造NanoLuc类型类似物及制备方法与应用。
背景技术
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。
生物发光(bioluminescence)是自然界中一种很常见的现象，也是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100％。生物发光至少需要三个因素：萤光素酶、相应的萤光素底物以及氧气。不同的生物发光体系需要的萤光素酶和萤光素底物也有所不同，但是其发光机理大致相同：萤光素底物在氧气条件下被萤光素酶催化氧化，生成处于激发态的电子中间体，由激发态返回基态时多余的电子以光能的形式释放出来，使化学能转化为光能。NanoLuc(Nluc)萤光素酶是一个经过基因工程改造的小分子酶，是性能卓越的生物发光报告基因。NanoLuc使用一种新型的萤光素酶底物(Furimazine)，可以产生高强度、辉光性的发光。NanoLuc作为一种新型的萤光素酶具有稳定性高、分子量小、发光强度强等优点。NanoLuc/Furimazine生物发光体系相较于其他生物发光体系，发光强度是其他生物发光体系的150倍以上、发光持续时间大大提升，使得NanoLuc在生物发光领域得到了广泛的应用。生物发光成像(Bioluminescent imaging,BLI)是基于生物发光原理，利用灵敏的光学监测仪器监控萤光素酶标记的细胞或基因在活体生物内活动和行为过程的一种新兴的成像技术。生物发光成像技术具有操作简单、高灵敏度、信噪比高、能够实现实时动态观测等优点，使得这项技术成为一种重要的成像手段，并且成功的应用到了生命科学、药学、医学等学科和领域。在诸如肿瘤的生长、转移示踪、目的基因的表达和检测、高通道药物筛选、细胞内物质的水平测试和研究细菌病毒感染宿主过程等有着显著的优势。
然而，经过本公开发明人研究发现，NanoLuc/Furimazine生物发光体系存在发射波长短、底物稳定性差、底物单一等缺点。体内成像作为生物发光成像最突出的应用，适用于体内成像的最佳波长为650～800nm，而NanoLuc催化Furimazine发射的最大波长为460nm，容易被组织吸收和散射不能很好的穿透组织和皮肤因而不能够良好的用于体内成像。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种C-6位改造NanoLuc类型类似物及制备方法与应用，本公开对Furimazine底物的C6位进行修饰改造，得到波长红移或持续时间延长或体内发光强度增强的NanoLuc类型类似物。此类化合物可以代替Furimazine作为 NanoLuc/Furimazine生物发光体系的底物。
为了实现上述目的，本公开的技术方案为：
一方面，一种C-6位改造NanoLuc类型类似物，具有式(Ⅰ)的所示结构：
Figure BDA0002301007770000021
其中，R1选自4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟-4-氨基苯基、噻吩基、呋喃基、5- 甲基呋喃基、萘-2-基、苯并呋喃基、4-甲基苯基、3,5-二甲基苯基、4-羟甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-巯基苯基。
另一方面，一种C-6位改造NanoLuc类型类似物的制备方法，包括以2-氨基-3,5-二溴吡嗪、4-甲基苯磺酰氯、二乙基膦酰基乙酸叔丁酯作为原料按照如下反应路线获得式(Ⅰ)的所示化合物：
Figure BDA0002301007770000022
其中，R1选自4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟-4-氨基苯基、噻吩基、呋喃基、5- 甲基呋喃基、萘-2-基、苯并呋喃基、4-甲基苯基、3,5-二甲基苯基、4-羟甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-巯基苯基。
第三方面，一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在作为生物发光底物中的应用。
本公开提供的C-6位改造NanoLuc类型类似物可以在NanoLuc萤光素酶的作用下作为报告信号检测药物在酶水平、细胞水平、体内水平的药理作用和毒性作用，因而第四方面，本公开提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在制备检测药物在酶水平、细胞水平、体内水平的药理作用和/或毒性作用的传感器中的应用。
本公开提供的C-6位改造NanoLuc类型类似物可以作为NanoLuc生物发光体系的底物，用于研究蛋白：蛋白和蛋白：配体相互作用，监测蛋白稳定性和生物发光共振能量转移(BRET)，因而第五方面，本公开提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在检测蛋白稳定性和/或生物发光共振能量转移中的应用。
本公开提供的C-6位改造NanoLuc类型类似物能用于酶水平、细胞水平、动物水平的生物发光成像监测肿瘤的生长、目的基因的表达，还可运用于高通道药物筛选，因而第六方面，本公开提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在筛选高通道药物中的应用。
本公开提供的C-6位改造NanoLuc类型类似物具有良好的化学发光的性质，也可应用于化学发光领域，因而第七方面，本公开提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在化学发光领域中的应用。
本公开的有益效果为：
1.本公开提供的C-6位改造NanoLuc类型类似物均可以作为NanoLuc萤光素酶的底物，扩大了NanoLuc类型类似物的范围，扩宽NanoLuc生物发光体系的应用范围。
2.本公开提供的C-6位改造NanoLuc类型类似物与原始底物Furimazine相比，在相同环境下具有波长红移或发光强度更强或稳定性提高等特点。
3.本公开提供的部分C-6位改造NanoLuc类型类似物在体内发光成像方面可以比肩甚至超过Furimazine，在一定条件下弥补了NanoLuc生物发光体系不适用于体内生物发光成像的缺陷。
4.本公开提供的部分C-6位改造NanoLuc类型类似物相较于Furimazine，发光时间有所延长，可用于研究体内药物代谢的监测且有作为前药的潜力。
5.本公开提供的部分C-6位改造NanoLuc类型类似物与Furinazine相比，化合物溶液对 NanoLuc萤光素酶具有较低的检测限，在作为探针应用时具有较高的灵敏度。
6.本公开提供的C-6位改造NanoLuc类型类似物的合成方法简单，花费时间少，经济适用，对NanoLuc类型类似物的设计合成有很大的促进作用。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本公开提出了一种C-6位改造NanoLuc类型类似物及制备方法与应用。
本公开的一种典型实施方式，提供了一种C-6位改造NanoLuc类型类似物，具有式(Ⅰ) 的所示结构：
Figure BDA0002301007770000041
其中，R1选自4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟-4-氨基苯基、噻吩基、呋喃基、5- 甲基呋喃基、萘-2-基、苯并呋喃基、4-甲基苯基、3,5-二甲基苯基、4-羟甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-巯基苯基。
该实施方式的一种或多种实施例中，包含以下化合物：
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-氟苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A1)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-氯苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A2)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-溴苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A3)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(3-氟-4-氨基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A4)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(噻吩基-2)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A5)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(呋喃基-3)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A6)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(5-甲基呋喃基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A7)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(萘-2-基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A8)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(苯并呋喃基-2)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A9)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-甲基苯基)-8-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A10)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(3,5-二甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A11)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A12)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-甲氧基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A13)
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-巯基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A14)。
本公开的另一种实施方式，提供了一种C-6位改造NanoLuc类型类似物的制备方法，包括以2-氨基-3,5-二溴吡嗪、4-甲基苯磺酰氯、二乙基膦酰基乙酸叔丁酯作为原料按照如下反应路线获得式(Ⅰ)的所示化合物：
Figure BDA0002301007770000051
其中，R1选自4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、3-氟-4-氨基苯基、噻吩基、呋喃基、5- 甲基呋喃基、萘-2-基、苯并呋喃基、4-甲基苯基、3,5-二甲基苯基、4-羟甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-巯基苯基。
该实施方式的一种或多种实施例中，苄基溴与锌、碘反应形成有机锌试剂，2-氨基-3,5- 二溴吡嗪与有机锌试剂进行根岸(Negishi)偶联反应获得中间体1-1，4-甲基苯磺酰氯与叠氮钠进行叠氮化反应获得中间体2-1，二乙基膦酰基乙酸叔丁酯与中间体2-1进行重氮基转移反应生成中间体3-1，中间体1-1与中间体3-1在二聚醋酸铑的催化下反应生成中间体4-1，中间体4-1与2-呋喃甲醛在四甲基胍的作用下反应生成中间体5-1，中间体5-1与硼酸类化合物进行铃木偶联反应获得中间体6-1，中间体6-1脱去叔丁基获得中间体7-1，中间体7-1进行环化反应获得中间体8-1，中间体8-1进行还原反应获得式Ⅰ的所示化合物。
本公开所述的根岸(Negishi)偶联反应是一种反应，指有机锌试剂与卤代烃在镍或钯的配合物的催化下发生偶联生成一根新的碳-碳键的反应。
本公开所述的叠氮化反应是指产生叠氮有机物的反应。
本公开所述的重氮基转移反应是指重氮基从有机化合物分子的一个部位转移到另一部位或从一个分子转移到另一分子的反应。
本公开所述的铃木偶联反应是一种有机偶联反应，在零价钯配合物催化下，芳基或烯基硼酸或硼酸酯与氯、溴、碘代芳烃或烯烃发生交叉偶联。
该系列实施例中，锌粉、碘、苄基溴和2-氨基-3,5二溴吡嗪的摩尔比例为1～2:1～2:1～2:1。
该系列实施例中，形成有机锌试剂的反应温度为80～90℃，反应时间为2.5～3.5h。
该系列实施例中，根岸偶联反应中，催化剂为三苯基膦二氯化钯。
该系列实施例中，根岸偶联反应中，反应温度为室温，反应时间为15～25h。本公开所述室温是指室内环境的温度，一般为15～30℃。
该系列实施例中，4-甲基苯磺酰氯与叠氮钠的摩尔比为1:0.9～1.1。
该系列实施例中，叠氮化反应的过程为：将4-甲基苯磺酰氯和叠氮钠溶于丙酮和水的混合溶液里(丙酮：水＝1：1),于冰浴条件下反应1.5～2.5小时。
该系列实施例中，重氮基转移反应的过程为：将二乙基膦酰基乙酸叔丁酯、中间体2-1、氢化钠溶于溶剂中，冰浴下反应设定时间，然后在室温下继续反应。
该系列实施例中，二乙基膦酰基乙酸叔丁酯、中间体2-1、氢化钠的摩尔比为1:1～2:1～2。
该系列实施例中，中间体1-1与中间体3-1的摩尔比为1:1～2。
该系列实施例中，在惰性气氛下，中间体1-1、中间体3-1、二聚醋酸铑溶于溶剂中，100～110℃反应22～26小时。所述惰性气氛，例如氮气气氛、氩气气氛、氦气气氛等。
该系列实施例中，间体4-1、2-呋喃甲醛、四甲基胍摩尔比为1:1～2:2～3。
该系列实施例中，生成中间体5-1的反应条件为室温下反应1.5～2.5h。
硼酸类化合物的结构式为：
Figure BDA0002301007770000061
R1选自4-氟苯基、4-氯苯基、 4-溴苯基、3-氟-4-氨基苯基、噻吩基、呋喃基、5-甲基呋喃基、萘-2-基、苯并呋喃基、4-甲基苯基、3,5-二甲基苯基、4-羟甲基苯基、4-甲氧基苯基、4-巯基苯基。
该系列实施例中，中间体5-1与硼酸类化合物的摩尔比为1:1～2。
该系列实施例中，铃木偶联反应的过程为：将中间体5-1、四三苯基膦钯、硼酸类化合物溶于1,4-二氧六环中，然后加入碳酸钠溶液，82～88℃反应3～4小时。
该系列实施例中，中间体6-1与三氟乙酸反应脱去叔丁基获得中间体7-1。反应温度为室温，反应时间为4～6h。
该系列实施例中，中间体6-1与三氟乙酸的摩尔比为1:9.5～10.5。
该系列实施例中，环化反应的过程为：中间体7-1、三乙胺、醋酸酐和4-二甲氨基吡啶混合反应。
该系列实施例中，环化反应的具体过程为：向中间体7-1的溶液中滴加三乙胺和醋酸酐，然后加入4-二甲氨基吡啶，在冰浴下进行反应。
该系列实施例中，中间体7-1、三乙胺、醋酸酐和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为 1:9.5～10.5:9.5～10.5:0.09:0.11。
该系列实施例中，还原反应的还原剂为硼氢化钠。
该系列实施例中，中间体8-1与硼氢化钠的摩尔比为1:2.5～3.5。
该系列实施例中，还原反应的过程为：在冰浴条件下：向中间体8-1的溶液中添加甲醇和硼氢化钠，进行反应。反应时间为20～40min。
本公开的第三种实施方式，提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在作为生物发光底物中的应用。
本公开的第四种实施方式，提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在制备检测药物在酶水平、细胞水平、体内水平的药理作用和/或毒性作用的传感器中的应用。
本公开的第五种实施方式，提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在检测蛋白稳定性和/或生物发光共振能量转移中的应用。
本公开的第六种实施方式，提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在筛选高通道药物中的应用。
本公开的第七种实施方式，提供了一种上述C-6位改造NanoLuc类型类似物在化学发光领域中的应用。
本公开所述的应用均以非疾病的诊断与治疗为目的。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
以下实施例的反应路线如下：
Figure BDA0002301007770000071
反应试剂与条件：(a)锌粉，单质碘，(Ph3P)2PdCl2，DMF，80℃→rt；(b)叠氮钠，丙酮：水＝1：1，冰浴2h；(c)氢化钠，THF，冰浴→室温；(d)二聚醋酸铑，甲苯回流，24h；(e)糠醛，TMG，甲醇，室温2h；(f)Pd(PPh3)4，K2CO3,1,4-二氧六环回流，4h；(g)三氟乙酸，室温搅拌4h；(h)三乙胺，醋酸酐，DMAP，冰浴2h；(i)硼氢化钠，冰浴2h。
实施例1：2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-氟苯基)-8-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A1)的制备。
中间体2-氨基-5-溴-3-苯基甲基吡嗪(中间体1-1)的制备：
在氮气保护条件下，将活化锌粉(5g，77mmol)和单质碘(500mg)混合，加入DMF, 室温搅拌10分钟至碘的颜色消失。然后加入苄基溴(3.6ml，25.6mmol)，在85℃油浴回流 3h。3h后移至室温，加入2-氨基-3,5-二溴吡嗪(5g，20mmol)和双三苯基磷二氯化钯(700mg，1mmol)。室温反应12h。反应液用硅藻土过滤，加入乙酸乙酯和饱和氯化铵溶液反复萃取三次，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，即得中间体1-1为黄色固体4.86g，产率91.8％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)：δ7.65(s,1H),7.30–7.25(m,5H),6.56(s,1H),3.98(s,2H)。ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 264.1,266.1,found 264.2，266.3。
中间体4-甲基苯磺酰基叠氮化物(中间体2-1)的制备：
将4-甲基苯磺酰氯(1g，5.25mmol)与叠氮钠(0.34g，5.25mmol)混合，加入丙酮：水＝(1：1)，在冰浴条件下反应2h。蒸干丙酮，向反应液中加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相用饱和氯化钠洗涤，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，无需进行进一步纯化，得到中间体2-1为黄色油状物0.903g，产率87.3％。
中间体2-二氮杂-2-(二乙基膦酰基)乙酸叔丁酯(中间体3-1)的制备：
将4-甲基苯磺酰基叠氮化物(0.65g，3.31mmol)和氢化钠(79mg，3.31mmol)混合，加入重蒸的THF，在冰浴条件下搅拌5min后，加入二乙基膦酰基乙酸叔丁酯(1g,3.97)，继续搅拌30min，之后转移至室温，继续反应2h。加入5ml蒸馏水终止反应，再加入乙酸乙酯萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋干，无需进一步纯化，得到中间体3-1为白色油状物0.603g，产率87.4％。
中间体2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙基膦酰基)乙酸叔丁酯(中间体4-1)的制备：
在氮气保护条件下，2-氨基-5溴-3-苯基甲基吡嗪(1g，3.79mmol)和2-二氮杂-2-(二乙基膦酰基)乙酸叔丁酯(2.11g,7.57mmol)溶于甲苯中，搅拌5min后，加入二聚醋酸铑(165mg， 0.38mmol)，110℃下加热回流反应24h。冷却至室温，加入乙酸乙酯和饱和NaCl溶液萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，200～300目硅胶纯化，得中间体4-1为棕色固体1.15g，产率为69.9％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝7.99(s,1H),7.27–7.17(m,5H),5.26–5.17(m, 1H),5.00(d,J＝7.9Hz,1H),4.92(d,J＝7.9Hz,1H),4.08–3.81(m,6H),1.39(s,9H),1.23(td, J＝6.5Hz,0.4Hz,3H),1.15(td,J＝7.3Hz,0.4Hz,3H)。ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 514.1， foud 514.2。
中间体2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(中间体5-1)的制备：
2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙基膦酰基)乙酸叔丁酯(0.63g，1.22mmol)溶于甲醇中，加入糠醛(0.13g，1.35mmol)和TMG(0.43g，3.67mmol)，在室温条件下反应4h。加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，200～300目硅胶纯化，得中间体5-1为墨绿色固体0.35g，产率为62.6％。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ＝8.10(s, 1H),7.39–7.26(m,5H),6.94(s,1H),6.88(s,1H),6.67(s,1H),6.25(dd,J＝3.6,2.0Hz,1H),6.13 (d,J＝3.3Hz,1H),4.24(s,2H),1.42(s,9H)。ESI-MS：m/z[M+H]+calcdfor 456.3，foud 456.5。
中间体2-((3-苄基-5-(4-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(中间体6-1) 的制备：
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入4-氟苯硼酸(122.5mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300 目硅胶纯化，得中间体6-1为黄色固体184mg，产率89.3％。
中间体2-((3-苄基-5-(4-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(中间体7-1)的制备：
2-((3-苄基-5-(4-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(180mg，0.386mmol) 溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，无需进一步纯化，得黄色固体160.4mg。
中间体6-(4-氟苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(4-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(160mg， 0.386mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(393mg，3.86mmol)，三乙胺(390mg，3.86mmol)，DMAP(4.7mg，0.0386mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得中间体7-1为砖红色固体76.2mg，产率为49.7％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-氟苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A1)的制备：
冰浴条件下，6-(4-氟苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮 (76mg，0.19mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(20.5mg，0.54mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得化合物A1为黄色固体32.2mg，产率为42％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(s,1H),8.07(s,2H),7.54(s,1H),7.45(d,J＝ 7.5Hz,2H),7.30(q,J＝8.7,7.6Hz,4H),7.21(d,J＝7.4Hz,1H),6.37(s,1H),6.11(s,1H),4.38 (s,2H),4.12(s,2H)。ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 400.1456,foud 400.1455。
实施例2：2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-氯苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A2)的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(4-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备：
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入4-氯苯硼酸(136.7mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300 目硅胶纯化，得黄色固体186.2mg，产率87.3％。
中间体2-((3-苄基-5-(4-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(4-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(180mg，0.37mmol) 溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体165.6mg。
中间体6-(4-氯苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(4-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(165.6mg， 0.384mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(393mg，3.84mmol)，三乙胺(390mg，3.84mmol)， DMAP(4.7mg，0.0384mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体65.7mg，产率为41.4％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-氯苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A2)的制备：
冰浴条件下，6-(4-氯苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮 (65.7mg，0.159mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(18.2mg，0.48mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体28.6mg，产率为43.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.48(s,1H),8.05(s,2H),7.53(t,J＝4.4Hz,3H),7.44(d,J＝ 7.5Hz,2H),7.28(t,J＝7.4Hz,2H),7.19(t,J＝7.3Hz,1H),6.36(s,1H),6.17(s,1H),4.38(s,2H),4.12(s,2H)。ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 415.1088,foud 415.1086。
实施例3：2-(呋喃-2-甲基)-6-(噻吩基-2)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A5)的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(噻吩基-2)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入2-噻吩硼酸(112.1mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300 目硅胶纯化，得黄色固体153.8mg，产率72.1％。
中间体2-((3-苄基-5-(噻吩基-2)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(噻吩基-2)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(150mg，0.308mmol) 溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.2ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体128.2mg。
中间体6-(噻吩基-2)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(噻吩基-2)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(120mg， 0.297mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(303mg，2.97mmol)，三乙胺(300mg，2.97mmol)， DMAP(3.6mg，0.0297mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体52.1mg，产率为45.5％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(噻吩基-2)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A5)的制备：
冰浴条件下，6-(噻吩基-2)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮 (52.1mg，0.135mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(15.4mg，0.406mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体23.1mg，产率为44.2％。1HNMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.96(s,1H),7.57–7.42(m,2H),7.43–7.33(m,3H),7.28 (t,J＝7.5Hz,2H),7.21(t,J＝7.3Hz,1H),7.10(t,J＝4.3Hz,1H),6.31(s,1H),6.09(s,1H),4.40(s,2H),4.16(s,2H)。ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 388.1041,foud 388.1041。
实施例4：2-(呋喃-2-甲基)-6-(呋喃基-3)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A6)的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(呋喃基-3)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入3-呋喃硼酸(98mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体183.9mg，产率94.7％。
中间体2-((3-苄基-5-(呋喃基-3)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(呋喃基-3)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(180mg，0.406mmol) 溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体157.2mg。
中间体6-(呋喃基-3)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(呋喃基-3)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(157.2mg， 0.402mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(440.6mg，4.02mmol)，三乙胺(437mg，4.02mmol)， DMAP(5.3mg，0.0402mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体54.3mg，产率为34.1％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(呋喃基-3)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A6)的制备：
冰浴条件下，6-(呋喃基-3)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮 (54.3mg，0.147mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(16.7mg，0.44mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体31.1mg，产率为57％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.31–8.14(m,1H),7.77(d,J＝15.1Hz,1H),7.67–6.98(m, 8H),6.36(s,1H),6.11(d,J＝28.6Hz,1H),4.29(d,J＝42.0Hz,2H),4.08(d,J＝19.2Hz,2H)。 ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 372.1270,foud 372.1268。
实施例5：2-(呋喃-2-甲基)-6-(5-甲基呋喃基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A7)的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(5-甲基呋喃基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入5-甲基呋喃-2-硼酸(110.4mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体176.8mg，产率88.3％。
中间体2-((3-苄基-5-(5-甲基呋喃基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(5-甲基呋喃基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(175mg， 0.383mmol)溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体151.2mg。
中间体6-(5-甲基呋喃基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(5-甲基呋喃基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸 (151.2mg，0.377mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(384.5mg，3.77mmol)，三乙胺(381mg， 3.77mmol)，DMAP(4.6mg，0.0377mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体63.8mg，产率为44.2％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(5-甲基呋喃基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A7)的制备：
冰浴条件下，6-(5-甲基呋喃基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)- 酮(63.8mg，0.166mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(18.9mg，0.50mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体33.9mg，产率为53％。1HNMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.85(s,1H),7.43–7.32(m,3H),7.28(t,J＝7.5Hz,2H), 7.21(t,J＝7.3Hz,1H),6.82(d,J＝3.3Hz,1H),6.31(t,J＝2.4Hz,1H),6.16(t,J＝3.2,0.0Hz,1H),6.09(d,J＝3.2Hz,1H),4.41(s,2H),4.16(s,2H),2.40(d,J＝0.0Hz,3H)。ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 386.1426,foud 386.1425。
实施例6：2-(呋喃-2-甲基)-6-(萘-2-基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A8)的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(萘-2-基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备：
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入2-萘硼酸 (150.6mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300 目硅胶纯化，得黄色固体192.6mg，产率87.4％。
中间体2-((3-苄基-5-(萘-2-基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(萘-2-基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(191mg，0.378mmol) 溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体168mg。
中间体6-(萘-2-基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(萘-2-基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(168mg， 0.376mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(383.5mg，3.76mmol)，三乙胺(380mg，3.76mmol)， DMAP(4.6mg，0.0376mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体75.2mg，产率为46.6％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(萘-2-基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A8)的制备：
冰浴条件下，6-(萘-2-基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮 (75.2mg，0.175mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(19.9mg，0.526mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体41.1mg，产率为54.5％。1H NMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.19(s,1H),7.92(dt,J＝22.1,7.1Hz,4H),7.76(s,1H), 7.59–7.18(m,9H),6.33(s,1H),6.13(s,1H),4.46(s,2H),4.20(s,2H)。ESI-HRMS：m/z[M+ H]+calcd for 432.1634,foud 432.1632。
实施例7：2-(呋喃-2-甲基)-6-(苯并呋喃基-2)-8-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A9)的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(苯并呋喃基-2)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备：
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入苯并呋喃 -2-硼酸(142mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300 目硅胶纯化，得黄色固体190.5mg，产率88.2％。
中间体2-((3-苄基-5-(苯并呋喃基-2)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(苯并呋喃基-2)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(190mg， 0.385mmol)溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体165.4mg。
中间体6-(苯并呋喃基-2)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(苯并呋喃基-2)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸 (168mg，0.378mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(383.6mg，3.78mmol)，三乙胺(380mg，3.78mmol)，DMAP(4.6mg，0.0378mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体72.8mg，产率为46％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(苯并呋喃基-2)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A9)的制备：
冰浴条件下，6-(苯并呋喃基-2)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)- 酮(72.8mg，0.174mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(19.7mg，0.526mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体38.9mg，产率为43.5％。1HNMR(400MHz,Methanol-d4)δ8.18(s,1H),7.58(d,J＝7.7Hz,1H),7.51(d,J＝8.3Hz, 1H),7.45–7.37(m,3H),7.35–7.26(m,4H),7.25–7.18(m,2H),6.32(t,J＝2.5Hz,1H),6.10 (d,J＝3.1Hz,1H),4.44(s,2H),4.17(s,2H)。ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 422.1426,foud422.1425。
实施例8：2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A10)的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(4-甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备：
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入4-甲基苯硼酸(119.1mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体184.2mg，产率89.9％。
中间体2-((3-苄基-5-(4-甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(4-甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(184.2mg， 0.394mmol)溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体162mg。
中间体6-(4-甲基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(4-甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(162mg， 0.394mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(402mg，3.94mmol)，三乙胺(399mg，3.94mmol)， DMAP(4.8mg，0.0394mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体69.2mg，产率为44.7％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A10)的制备：
冰浴条件下，6-(4-甲基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮 (69.2mg，0.176mmol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(20mg，0.528mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体38.1mg，产率为54.8％。1HNMR(400MHz,Methanol-d4)δ7.70(s,1H),7.53(d,J＝7.8Hz,2H),7.43–7.36(m,3H), 7.29(d,J＝7.7Hz,4H),7.23(t,J＝7.3Hz,1H),6.31(t,J＝2.5Hz,1H),6.11(d,J＝3.1Hz,1H),4.42(s,2H),4.19(s,2H),2.38(s,3H)。ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 396.1634,foud396.1634。
实施例9：2-(呋喃-2-甲基)-6-(3,5-二甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A11) 的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(3,5-二甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备：
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入3，5-二甲基苯硼酸(127mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300 目硅胶纯化，得黄色固体194.6mg，产率91.5％。
中间体2-((3-苄基-5-(3,5-二甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(3,5-二甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(194.6mg， 0.396mmol)溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体172mg。
中间体6-(3,5-二甲基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(3,5-二甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸 (172mg，0.404mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(412.1mg，4.04mmol)，三乙胺(409mg， 4.04mmol)，DMAP(4.9mg，0.0404mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体75.2mg，产率为45.7％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(3,5-二甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A11)的制备：
冰浴条件下，6-(3,5-二甲基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)- 酮(69.2mg，0.185mol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(21mg，0.555mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体29.5mg，产率为39.0％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.38(s,1H),7.65(s,1H),7.53(s,1H),7.44(d,J＝7.5Hz,2H),7.37–7.14(m,4H),7.04(d,J＝26.3Hz,1H),6.37(s,1H),6.11(s,1H),4.33(s,2H),4.10(s,2H),2.34(s,6H)。ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 410.1790,foud 410.1791。
实施例10：2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A12) 的制备。
中间体2-((3-苄基-5-(4-羟甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯的制备：
在氮气保护条件下，2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg， 0.438mmol)，Pd(PPh3)4(50.6mg，0.0438mmol)溶于1,4-二氧六环中，然后加入4-羟甲基苯硼酸(133.1mg，0.876mmol)的1,4-二氧六环溶液，加入Na2CO3(2M，0.2ml)，85℃加热回流4h。反应终止后，加入蒸馏水和乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300 目硅胶纯化，得黄色固体193.1mg，产率91.3％。
中间体2-((3-苄基-5-(4-羟甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸的制备：
2-((3-苄基-5-(4-羟甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(193.1mg， 0.40mmol)溶于二氯甲烷中，滴加三氟乙酸2.5ml，室温条件下反应4h。反应完全后，直接旋干反应液，真空泵抽真空30min，直接用于下一步无需进一步纯化，得黄色固体163.5mg。
中间体6-(4-羟甲基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)-酮的制备：
在冰浴条件下，2-((3-苄基-5-(4-羟甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸 (163.5mg，0.399mmol)溶于THF中，加入醋酸酐(407mg，3.99mmol)，三乙胺(406mg，3.99mmol)，DMAP(4.8mg，0.0399mmol)，继续冰浴反应2h。2h后，加入二氯甲烷和蒸馏水萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得砖红色固体68.9mg，产率为42.2％。
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A12)的制备：
冰浴条件下，6-(4-羟甲基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(2H)- 酮(69.2mg，0.168mol)溶于二氯甲烷中，搅拌5min后，加入甲醇，然后分批次加入硼氢化钠(19mg，0.5mmol)，反应2h。加入1MHCl猝灭反应，再加入饱和柠檬酸溶液和二氯甲烷萃取三次，干燥，过滤，200-300目硅胶纯化，得黄色固体29.5mg，产率为39.0％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.41(s,1H),7.99(s,1H),7.54(s,1H),7.44(dd,J＝14.8,7.6Hz, 4H),7.28(d,J＝8.6Hz,2H),7.21(s,1H),6.37(s,1H),6.11(s,1H),5.27(s,1H),4.55(d,J＝5.1Hz,2H),4.36(d,J＝26.2Hz,3H),4.11(s,2H).ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 411.1583,foud 411.1582。
实施例11：NanoLuc类型类似物与NanoLuc萤光素酶的体外酶活研究。
1、生物发光强度测定和酶促反应动力学常数计算：将50μL用Tris-HCl(50mM,pH＝7.42) 溶解的不同浓度的目标化合物，Furimazine分别加入到50μL NanoLuc萤光素酶(0.6μg/ml) 于全黑的96孔板中，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统进行生物发光强度的测定。测定数值用GraphPad Prism计算出不同化合物的反应动力学常数和half life。以Furimazine(2μM) 的测试结果为基准，折算所有化合物的相对生物发光强度值。
2、生物发光最大波长的测定：向0.5ml用Tris-HCl(50mM,pH＝7.42)溶解的不同的目标化合物和Furimazine(25μM)中分别加入0.5ml NanoLuc(0.6μg/ml)，用F-2500荧光分光光度计在lamp off的luminescence模式下，response time设置为2s，扫描其发射光谱，得到最大生物发射波长。
表1.NanoLuc类型类似物与NanoLuc萤光素酶体外生物发光性质
Figure BDA0002301007770000171
Figure BDA0002301007770000181
结果表明，相较于Furimazine，所有的目标化合物在生物发射波长方面产生了红移现象，其中A8红移了55nm；除A5,A6外，所有的目标化合物半衰期都有所延长，均可产生辉光性的发光，其中A1半衰期大于1小时，有成为前药的潜力。部分目标化合物也显示出了良好的生物发光强度性能和较好的动力学特征等。部分目标化合物如A1,A7,A12的生物发光性质良好，具有成为新的NanoLuc生物发光体系底物的潜力。
实施例12：NanoLuc类型类似物与海肾萤光素酶的生物发光强度研究。
将50μL用Tris-HCl(50mM,pH＝7.42)溶解的不同浓度的目标化合物，Furimazine分别加入到50μL海肾萤光素酶(1μg/ml)于全黑的96孔板中，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统进行生物发光强度的测定，结果见表2。
表2.NanoLuc类型类似物与海肾萤光素酶的生物发光强度
Figure BDA0002301007770000182
结果表明，所有的目标化合物和Furimazine均不能很好的被海肾萤光素酶识别，发光强度远低于NanoLuc萤光素酶，表明对NanoLuc萤光素酶具有很高的选择性。
实例13：NanoLuc类型类似物在A549细胞中的细胞毒性分析。
采用CCK8的方法检测目标化合物的体外细胞毒性。
将稳定转染表达NanoLuc的A549细胞悬液(5x103/孔)加入到全透明的96孔板中，于 37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育24小时。24小时后，出去培养基，加入100μL含有一定梯度浓度的目标化合物和Furimazine(0，1，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200μM)。孵育4h后，使用酶标仪在450nm处测定各孔吸收值(OD)。最后使用GraphPad Prism软件计算化合物的IC50值，结果如表3。
表3.NanoLuc类型类似物的细胞毒性分析
化合物 IC<sub>50</sub>值
Furimazine 298.8
A1 256.1
A2 944.4
A5 150.8
A6 217.2
A7 220.9
A8 229.0
A9 682.4
A10 164.6
A11 211.5
A12 226.9
结果表明，所有化合物的IC50值均远大于细胞成像实验所用浓度的最大值(25μM)，这样的结果排除了在细胞成像过程中细胞会由于化合物的加入而死亡的可能性，可以很好的用于细胞成像实验研究。
实施例14：NanoLuc类型类似物的细胞活性研究(细胞水平)。
在黑色的96孔板中每孔加入100μL稳定转染表达NanoLuc的A549细胞悬液(4x104/孔)，于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育24小时。之后吸出培养基，加入100μL用0.9％生理盐水溶解的不同溶度的目标化合物和Furimazine(0，0.5，1，2，5，10，25μM)，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统测试，得结果如表4：
表4.NanoLuc类型类似物的细胞水平的生物发光性质
Figure BDA0002301007770000191
Figure BDA0002301007770000201
结果表明，部分目标化合物如A6，A12在细胞水平具有良好的生物发光活性。
实施例15：NanoLuc类型类似物的化学发光波长和发光强度研究。
1、化学发光发射波长的测定：200μL用无水乙醇配制成的1mM目标化合物或Furimazine的溶液中加入2ml的含0.05％的1M的NaOH溶液的DMSO溶液，用F-2500荧光分光光度计在lamp off模式下测定化学发光光谱。得到最大化学发光发射波长，结果见表5。
2、化学发光强度的测定：将50μL用无水乙醇配制成的不同浓度的目标化合物，Furimazine分别加入到50μL含0.05％的1M的NaOH溶液的DMSO溶液于全黑的96孔板中，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统进行化学发光强度的测定，在2μM处计算相对发光强度值，结果见表5。
表5：NanoLuc类型类似物的化学发光波长和发光强度
Figure BDA0002301007770000202
结果表明，相较于Furimazine，大部分目标化合物的发射波长均有所红移；部分目标化合物如A7,A11的生物发光性质良好。
实施例16：NanoLuc类型类似物的动物体内活性研究。
选取在酶水平和细胞水平发光性能表现较好的化合物A6和A12，进一步进行动物体内活性研究。将目标化合物和Furimazine配制成浓度为1mM和5mM的氯化钠溶液。取荷瘤大小为1cm左右的裸鼠进行体内发光成像实验。腹腔注射化合物100μL，用IVIS Kinetic 小动物活体成像系统进行体内发光成像。比较目标化合物和阳性对照Furimazine的最大发光强度，结果见表6。
表6.NanoLuc类型类似物的动物体内最大发光强度对比
Figure BDA0002301007770000211
结果表明，化合物A6在5mM体内发光强度是Furimazine的1.3倍；A12在1mM体内发光强度是Furimazine的1.4倍，在5mM时是Furimazine的2倍。这说明该化合物具有在体内发光成像的潜能。
本公开中化合物A1～A14及Furimazine的化学结构式如下：
Figure BDA0002301007770000221
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种C-6位改造NanoLuc类型类似物，其特征是，包含以下化合物：
2-(呋喃-2-甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮。
2.一种权利要求1所述的C-6位改造NanoLuc类型类似物在作为生物发光底物中的应用。
3.一种权利要求1所述的C-6位改造NanoLuc类型类似物在制备检测药物在酶水平、细胞水平、体内水平的药理作用和/或毒性作用的传感器中的应用。
4.一种权利要求1所述的C-6位改造NanoLuc类型类似物在检测蛋白稳定性和/或生物发光共振能量转移中的应用。
5.一种权利要求1所述的C-6位改造NanoLuc类型类似物在筛选高通道药物中的应用。
6.一种权利要求1所述的C-6位改造NanoLuc类型类似物在化学发光领域中的应用。
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