CN113480545B - 一种咪唑并吡嗪酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种咪唑并吡嗪酮类化合物及其制备方法和应用。所述咪唑并吡嗪酮类化合物的结构具有式I所示结构，其中，R1为苯基、R2为苄基，并且所述化合物中具有至少一个D取代基，所述D取代基位于R1和/或R2上。所述化合物具有优异的发光性能，可以作为NanoLuc发光体系的底物，并应用在萤光素酶的检测以及药物的检测中。
Figure DDA0003166253310000011

Description

一种咪唑并吡嗪酮类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种咪唑并吡嗪酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
氘是氢的稳定同位素，氘代是将化合物分子结构中特定位置的氢原子替换为氘原子的一种方法，此类化合物改构的主要目的是在保持原化合物的活性的情况下，可以改变其代谢速度，延缓代谢速率等。目前，氘核成为化学，生物学和医学领域必不可少的工具。
生物发光(Bioluminescene)是一种常见的在活的生物体上进行发光的现象，存在于包括细菌，昆虫，真菌和大量海洋生物在内的多种生命中。通常是由萤光素酶与其底物萤光素的相互作用引起的，萤光素酶通过分子氧催化萤光素氧化，以激发态转化为氧化萤光素分子，氧化萤光素发出可见光，返回基态。
NanoLuc-Furimazine生物发光体系是目前研究较为广泛的生物发光系统，NanoLuc是针对Oplophorus萤光素酶的Oluc-19进行蛋白结构改造，得到一种新型的萤光素酶。NanoLuc包含171个氨基酸，分子量是19kDa,是迄今为止报道的最亮的生物发光。以Furimazine和O2作为底物，产生了长的半衰期发光型生物发光。且新型NLuc系统的活性比FLuc和RLuc高150倍以上。另外，发光输出保持稳定并且持续时间比以前的萤光素酶更长。
NanoLuc-Furimazine生物发光系统是一种用途非常广泛的技术，在医药领域有着很多应用。例如，蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用；生物发光成像；NanoBRET；生物发光探针等。但是生物发光体系存在一些问题，例如生物发光强度低，持续时间短，生物发光的发射波长较短，对组织伤害较大等问题。因此如何改善这些缺点是学者亟需解决的问题。萤光素酶和萤光素底物是生物发光体系的重要组成成分，所以，可以从萤光素酶和萤光素底物两个方面进行生物发光体系的改造。而萤光素作为小分子底物，增加改造的简单性和可行性，因此对萤光素酶底物的改造可以推动生物发光在成像领域的应用，更甚推动在生物发光在生命领域的应用。
发明内容
为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种咪唑并吡嗪酮类化合物及其制备方法和应用。在本发明中，发明人创造性的将氘核应用至生物发光底物的改造，以Furimazine为基础，对其C-6和C-8位进行氘代设计，结果发现在一些实施方式中，由于氘核在特定位置和特定数量的引入，使得生物发光强度和生物发光衰减速度得到明显的改善。因而这类化合物很好的解决了NanoLuc-Furimazine生物发光系统生物发光强度低、持续时间短、衰减速度快等问题，并且，发明人还发现这类化合物还具有更小的米氏常数，以及与NanoLuc更好的亲和力。
具体地，本发明的技术方案如下所示：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种咪唑并吡嗪酮类化合物，具有式I所示结构，R1为苯基、R2为苄基，所述化合物中具有至少一个D取代基，所述D取代基位于R1和/或R2上；
Figure BDA0003166253290000021
现有技术中，学者往往将氘核与氚核用于光谱学、质谱分析、药物以及机理和药物动力学研究。在本发明中，发明人创造性的将氘核应用至生物发光底物的改造，在Furimazine的基础上，对Furimazine的C-6和C-8位进行氘代设计，结果发现在本发明的一些实施方式中，氘核的引入，明显改善了生物发光强度并减缓了生物发光衰减速度。
在本发明的实施方式中，“氘代”表示至少一个可用氢(H)被氘(即2H，表示为D)取代。被x％氘代的化合物或基团具有x％的可用H被D取代，x％因此也被称为氘代度。在本发明中，发明人发现，在式I化合物的C-6(R1)和C-8(R2)位进行氘代能够很好的实现生物发光性能的改善。举例而言，C-6位置即R1基团、C-8位置即R2基团上的可氘代位置分别如下所示：
R1中的可氘代位置有
Figure BDA0003166253290000031
R2中的可氘代位置有
Figure BDA0003166253290000032
未氘代前这些位置均为H，氘代即上述示意出的基团由H变为D。R1或R2中所示位置分别被全部氘代的话，在R1的氘代度为100％，R2的氘代度为100％，则R1或R2则变为
Figure BDA0003166253290000033
Figure BDA0003166253290000034
若以上位置均无氘代，则R1的氘代度为0，R2的氘代度为0。
在本发明的一些实施方式中，R1的氘代度为0或100％；R2的氘代度为0-100％。
在这些实施方式中，发明人发现当R1的氘代度为0时，R2至少是10％氘代的；以及，进一步地，在一些实施方式中，R2的氘代度小于50％时，氘代位置选自R3和R4中的至少一个，更优选为R3和R4不同时进行氘代时会有更为更好的活性。
或者，在一些实施方式中，R1的氘代度为100％时，R2的氘代度为0或至少是不低于10％氘代的。在这些实施方式中，化合物往往具有更好的活性。进一步地，在一些实施方式中，R2的氘代度小于50％时，氘代位置选自R3和R4。更进一步地，在本发明的一些实施方式中，R2的氘代度不小于80％，更优选为100％时，会有更好的活性。
在本发明的一些实施方式中，以下情况下往往具有更为有利的活性结果：R1的氘代度为0或100％；R2的氘代度为小于50％或者为100％，其中，R2的氘代度小于50％时，氘代位置选自R3和R4。
进一步地，R1选自苄基，1-氘-1-苯基甲基，1,1-二氘-1-苯基甲基，1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)甲基；R2为苯基或2,3,4,5,6-五氘代苯基。
作为示例，本发明提供了一些具体地示例化合物，其选自：
F2：2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1-氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
F3：2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
F4：2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮；
F5：2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
F6：2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1-氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
F7：2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
F8：2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮。
上述化合物中，化合物F2、F5、F6、F7、F8具有优异的改善效果，而化合物F3和F4的改善程度有限，同时，本发明还在研究中发现，其他位点的氘代还会产生不为期盼的结果。这说明氘代对于化合物的性能的影响表现出位置选择性，并非任意氘代均能实现本发明的理想效果。
在本发明的第二方面，本发明还提供了一种制备上述第一方面中所述的咪唑并吡嗪酮类化合物的方法，所述方法包括：
R1X与活化锌粉反应生成锌试剂，锌试剂与2-氨基-3,5-二卤代吡嗪反应得到中间体6；
以对甲基苯磺酰氯为原料，与叠氮化钠反应，得到中间体13即对甲基苯磺酰叠氮化物；中间体13与二甲氧基膦酰基乙酸叔丁酯反应，得到中间体14即2-重氮-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸叔丁酯；
中间体6与中间体14反应得到中间体7；中间体7与糠醛反应得到中间体8；中间体8与苯硼酸或R2取代的苯硼酸R2-B(OH)2反应得到中间体9；中间体9脱去叔丁基得到中间体10；中间体10发生环化反应生成中间体11；中间体11经还原反应得到R1和/或R2上具有氘代的式I化合物；
其中，R1为苯基、R2为苄基，其中，R1和/或R2上具有至少一个D取代基，X为卤素，优选为Br；
中间体6-11的结构如下所示：
Figure BDA0003166253290000051
其中，R1为苯基、R2为苄基，其中，R1和/或R2上具有至少一个D取代基，X为卤素，优选为Br。
在本发明的一些实施方式中，R1选自苄基，1-氘-1-苯基甲基，1,1-二氘-1-苯基甲基，1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)甲基，X为卤素，优选为Br；R2为苯基或2,3,4,5,6-五氘代苯基。
进一步地，在上述制备方法中，所述反应路线如下所示：
Figure BDA0003166253290000052
本领域技术人员在知晓上述技术路线之后，可以采用实验手段选取合适的溶剂并选择适宜的反应条件，作为示例，发明人提供了一些较为详细的反应参数，应当理解，本领域技术人员基于本发明的公开是定然能够获取更为有益的制备方式的，此处所述的更为有益可以包括获取更好的产率、更好的纯度等本领域技术人员的合理追求。
具体地，在该反应路线中，制备锌试剂所用溶剂为体积比为超干四氢呋喃：超干N,N-二甲基甲酰胺＝5：1的溶剂组合；反应g中，溶解2-氨基-3,5-二溴吡嗪的溶剂为超干N,N-二甲基甲酰胺；制备锌试剂的温度为85℃，反应时间为3～5h，锌试剂与2-氨基-3,5-二溴吡嗪反应的温度为室温，反应时间为12～24h；R1X、活化锌粉、碘单质、1,2-二溴乙烷、2-氨基-3,5-二溴吡嗪与双三基磷二氯化钯之比为1：1.5：0.08：0.09：0.7：0.03。
在反应h中，所述溶剂为甲苯，反应温度为110℃，反应时间为12～24h；中间体6、2-(二甲氧基膦酰基)-2-重氮乙酸叔丁酯与二聚醋酸铑之比为1：2：(0.06-0.1)。
在反应i中，所述溶剂为甲醇；温度为室温；反应时间为1～4h；中间体7-2或中间体7-3或中间体7-4、糠醛、四甲基胍之比为1：1.3：1.5。
在反应j中，所述溶剂为1,4-二氧六环；温度为85℃；反应时间为2～4h；中间体8、苯硼酸或2,3,4,5,6-五氘苯基硼酸、四三苯基膦、碳酸钾之比为1：(1.2-1.5)：(0.06-0.1)：(2-3)。
在反应k中，所述溶剂为二氯甲烷；反应温度为室温；反应时间为2～4.5h；三氟乙酸含量10％。
在反应l中，所述溶剂为四氢呋喃；反应温度为0℃；反应时间为5～10min；中间体10、乙酸酐、三乙胺之比为1：10：10。
在反应m中，所述溶剂为二氯甲烷、甲醇，二氯甲烷与甲醇之比为2：1；反应温度为0℃；反应时间为0.5～2h；中间体11-2或11-3或11-4或11-5或11-6或11-7或11-8、硼氢化钠之比为1：(3-5)。
以及，在本发明的一些实施方式中，本发明提供了R1X的制备方式，以以下情况作为示意说明：R1X中R1分别为1-氘-1-苯基甲基，1,1-二氘-1-苯基甲基或1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)甲基，X为卤素Br时，其通过以下反应制备得到：
Figure BDA0003166253290000061
在该反应中，所述溶剂为四氯化碳；反应温度为80-110℃，反应时间为2～4h；氘代甲苯、N-溴代琥珀酰亚胺之比为1：(0.8-1.2)；
Figure BDA0003166253290000062
在反应b中，所述溶剂可以为四氢呋喃，超干四氢呋喃，新鲜的重蒸四氢呋喃，进一步优化为超干四氢呋喃；温度为0℃，反应时间为0.5～2h；苯甲醛与氘代氢化锂铝之比为1：(0.6-1)；在反应c中，所述温度为室温，反应时间12～36h，中间体2与三甲基溴硅烷之比为1：1.1。
Figure BDA0003166253290000063
在反应d中，所述溶剂为四氢呋喃，超干四氢呋喃，新鲜的重蒸四氢呋喃，进一步优化为超干四氢呋喃；温度为0℃至室温，反应时间为1～2h；苯甲酸乙酯与氘代氢化锂铝之比为1：(1.2-2)；在反应c中，所述温度为室温，反应时间12～36h,，中间体4与三甲基溴硅烷之比为1：1.1。
以及，在本发明的实施方式中，本发明提供了中间体14的制备方法，其包括进行以下反应：
Figure BDA0003166253290000071
在反应e中，所述溶剂可以为丙酮和水，丙酮与水的比例为1：1；反应温度为0℃，反应时间为2～4h；对甲基苯磺酰氯与叠氮化钠之比为1：1；在反应f中，所述溶剂为四氢呋喃；反应温度为0℃至室温；反应时间为2～4h；对甲基苯磺酰叠氮、二甲氧基膦酰基乙酸叔丁酯与氢化钠之比为1.2：1.0：1.2。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种生物发光底物，其为上述第一方面中所述的咪唑并吡嗪酮类化合物或包含上述第一方面中所述的咪唑并吡嗪酮类化合物。
在本发明的第四方面，本发明提供给了一种探针，其为上述第一方面中所述的咪唑并吡嗪酮类化合物，或包含上述第一方面中所述的咪唑并吡嗪酮类化合物。
在本发明的第五方面，本发明提供了上述第一方面所述的咪唑并吡嗪酮类化合物在制备生物发光底物中的应用；和/或，在检测萤光素酶中的应用(比如作为NanoLuc底物检测萤光素酶的存在，监测萤光素酶在体外和体内的分布成像)；和/或，在药物检测中的应用(比如，化合物作为NanoLuc底物在萤光酶的存在下作为报告信号检测药物在酶水平、细胞水平、动物水平的药理作用和毒性作用等)。
根据本发明的应用，本发明的化合物可用于疾病的诊断和治疗，也可在非疾病诊断和治疗目的下应用于广泛的科学研究之中，具有广泛的意义。
相较于现有技术，本发明的优势在于：
本发明化合物扩大了NanoLuc的底物种类，并且本发明的化合物衰减速率较Furimazine慢，增加了生物发光的半衰期，为以后进行生物发光底物的改造提供了一种新的思路。具体地，经实验证明，本发明提供的以Furimazine为基础的一系列化合物在酶水平、细胞水平上具有良好的生物活性作用，在酶水平和细胞水平表现出化合物浓度依赖性，并且化合物F2，F5，F6，F7，F8在生物发光衰减速率显著方面优于Furimazine，即它们的衰减速率较Furimazine慢，将它们应用于活体动物成像，F2，F5，F6，F7，F8的生物发光强度优于Furimazine，在生物发光成像的后期，F5，F6，F7，F8的生物发光时间的持续时间优于Furimazine。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1：(A)Furimazine的氘代化合物(5μM)与NanoLuc作用后，生物发光随时间的变化曲线图；(B)在5μM条件下，Furimazine的氘代化合物的生物发光强度与Furimazine的相对生物强度之比随时间的变化曲线图。
图2：(A)Furimazine的氘代化合物(2μM)与NanoLuc作用后，生物发光随时间的变化曲线图；(B)在2μM条件下，Furimazine的氘代化合物与Furimazine的相对生物强度随时间的变化曲线图。
图3：(A)Furimazine的氘代化合物(2μM)与NanoLuc作用后，生物发光随时间的变化曲线图。(B)在2μM条件下，Furimazine的氘代化合物与Furimazine的相对生物强度随时间的变化曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明的下述实施例按照以下反应路线进行：
Figure BDA0003166253290000091
根据上述反应路线制备得到的基于Furimazine的氘代化合物的结构如下所示：
Figure BDA0003166253290000092
上述反应路线中涉及的试剂和条件：a，过氧化苯甲酸叔丁酯，N-溴代琥珀酰亚胺，四氯化碳，2h，90℃；b，氘代氢化锂铝，四氢呋喃，30min，0℃；c，三甲基溴硅烷，24h，rt；d，氘代氢化锂铝，0℃→25℃，1h，重水，0℃，30min；e，叠氮化钠，丙酮，H2O，0℃，2h；f，氢化钠，0℃→25℃，2h，g，活化锌粉，碘单质，1,2-二溴乙烷，Pd(PPh3)2Cl2，四氢呋喃，N,N-二甲基甲酰胺，80℃；h，二聚醋酸铑，甲苯，110℃，12h；i，四甲基胍，甲醇，rt，2h；j，碳酸钾，四三苯基膦钯，1,4-二氧六环，85℃，2h；k，三氟乙酸，rt，4h；l，三乙胺，醋酸酐，4-二甲氨基吡啶，四氢呋喃，0℃；m，硼氢化钠，二氯甲烷，甲醇，0℃；
实施例1：2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1-氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(F2)的制备
1-氘-1-苯基甲醇(2)(phenylmethan-d-ol)的制备：
氘代氢化锂铝(160mg,3.82mmol)加入到25mL的双颈瓶中，在氮气保护的情况下，加入5mL的超干四氢呋喃，冰浴，在0℃的条件下，使用注射器滴加溶于超干四氢呋喃的苯甲醛(540mg,5.10mmol)，在0℃条件下，反应30min，TLC监测反应，依次加入160μL水，160μL15％氢氧化钠，480μL水，继续搅拌反应5min，使用硅藻土过滤，乙醚洗涤硅藻土，收集滤液，使用饱和食盐水洗涤，得有机相化合物，无水硫酸钠干燥，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以一定比例的石油醚和乙酸乙酯为洗脱液，进行梯度洗脱，得中间体化合物2，无色透明油状化合物433mg,产率为78％，Rf约为0.4,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.32(d,J＝4.0Hz,4H),7.23(dd,J＝8.3,4.1Hz,1H),5.14(d,J＝5.6Hz,1H),4.47(d,J＝3.8Hz,1H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 110.07,found for110.15.
1-氘-1-苯基-1-溴甲烷(3)((bromomethyl-d)benzene)的制备：
1-氘-1-苯基甲醇(1.2g,10.99mmol)和三甲基溴硅烷(1.85g,12.99mmol)加入到10mL的单颈瓶中，在室温的条件下，反应24h，TLC监测反应，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以石油醚为洗脱剂，得中间体化合物3，无色透明油状化合物1.5g,产率为79％，Rf约为0.8,展开剂为石油醚。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.45(d,J＝7.5Hz,2H),7.34(dt,J＝14.2,7.5Hz,3H),4.69(s,1H).
2-氨基-3-(1-氘-1-苯基)甲基-5-溴吡嗪(6-2)(5-bromo-3-(phenylmethyl-d)pyrazin-2-amine)的制备：
活化的锌粉(570mg,8.72mmol)加入到50mL的双颈瓶中，在氮气保护下、室温条件下，加入碘单质(88mg,0.35mmol)溶液(碘单质溶于超干四氢呋喃和超干N,N-二甲基甲酰胺，超干四氢呋喃：N,N-二甲基甲酰胺＝5：1)，搅拌至碘单质的颜色褪去。使用注射器将1-氘-1-苯基-1-溴-甲烷(1g,5.81mmol)和1,2-二溴乙烷(65mg,0.35mmol)加入到上述的溶液中，85℃条件下回流反应。经3h反应后，反应液(呈灰色的均一的溶液)静止冷却至室温。将2-氨基-3,5-二溴吡嗪(980mg,3.87mmol)和双三苯基膦二氯化钯(81mg,0.11mmol)溶于超干N,N-二甲基甲酰胺溶液中，将其滴加到上述溶液中。室温条件下，反应24h。反应终止，将反应液经硅藻土过滤，在滤液中加入200mL的饱和氯化铵溶液和2×200mL的乙酸乙酯溶液萃取，收集有机层溶液加入无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，旋干，加入100-200目硅胶拌样，以200-300目硅胶装柱，以乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，进行梯度洗脱，得中间体化合物6-2，淡黄色油状化合物634mg,产率为58％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1。1HNMR(400MHz,DMSO)δ7.95(s,1H),7.33–7.21(m,5H),6.54(s,2H),3.96(s,1H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 265.02,267.02,found for 265.08,267.08.
对甲基苯磺酰叠氮(4-methylbenzenesulfonyl azide)的制备：
将15mL的丙酮和15mL的水加入到100mL的圆底烧瓶中，加入对甲基苯磺酰氯，搅拌至溶解，冰浴，在0℃的条件下，分批次加入叠氮化钠，在0℃条件下，反应2h,TLC监测反应，Rf约为0.5,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝20：1，反应完全，加入100mL的水，使用2×100mL的乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，旋干，直接投入下一步。
2-重氮-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(tert-butyl 2-diazo-2-(dimethoxyphosphoryl)acetate)的制备：
将对甲基苯磺酰叠氮(2g,10.14mmol)和二甲氧基膦酰基乙酸叔丁酯(1.89g,8.45mmol)加入至50mL的圆底烧瓶中，加入30mL四氢呋喃将其溶解，冰浴，在0℃的条件下，分批次加入氢化钠(243mg,10.14mmol)，在0℃的条件下，搅拌30min，移至室温，继续搅拌2h，TLC监测反应，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1，反应完全，加入15mL水，终止反应，加入100mL的水，使用2×100mL的乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，旋干，得奶酪状化合物，直接投入下一步。
2-((5-溴-3-(1-氘-1-苯基)甲基吡嗪-2-基)氨基)-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(7-2)(tert-butyl 2-((5-bromo-3-(phenylmethyl-d)pyrazin-2-yl)amino)-2-(dimethoxyphosphoryl)acetate)的制备：
2-氨基-3-(1-氘-1-苯基甲基)-5-溴吡嗪(434mg,1.64mmol)、2-重氮-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(819mg,3.27mmol)和二聚醋酸铑(43mg,0.10mmol)加入至100mL的双颈瓶中，加入30mL甲苯使其溶解，在氮气保护下，在110℃的条件下反应12h，TLC监测反应，使用硅藻土过滤，收集滤液，以100-200目硅胶拌样，以200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，得中间体化合物7-2，灰色固体483mg,产率为61％，熔点为110-111℃，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.12(s,1H),7.29(q,J＝7.4Hz,4H),7.23(d,J＝7.1Hz,1H),6.82(s,1H),5.09(dd,J＝23.5,8.4Hz,1H),4.17(d,J＝53.8Hz,1H),3.68(d,J＝11.0Hz,3H),3.59(d,J＝10.9Hz,3H),1.39(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 487.09,489.08,found for 486.71,488.71.
2-((3-((1-氘-1-苯基)甲基)-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(8-2)(tert-butyl 2-((5-bromo-3-(phenylmethyl-d)pyrazin-2-yl)amino)-3-(furan-2-yl)acrylate)的制备：
2-((5-溴-3-(1-氘-1-苯基甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(480mg,0.99mmol)溶于少量甲醇中，缓慢滴加糠醛(123mg,1.28mmol)，将糠醛滴加完毕后，再缓慢滴加四甲基胍(170mg,1.48mmol)，在室温的条件下，搅拌反应2h，TLC监测反应，反应完毕，过滤，收集滤饼，滤饼即是化合物8-2，土黄色固体414mg,产率为92％，熔点为147-148℃，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.39(s,1H),8.10(s,1H),7.64(s,1H),7.40–7.21(m,5H),6.98(s,1H),6.51(d,J＝15.8Hz,2H),4.21(s,1H),1.31(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 457.10,459.10,found for456.81,458.81.
2-((3-((1-氘-1-苯基)甲基)-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(9-2)(tert-butyl 3-(furan-2-yl)-2-((5-phenyl-3-(phenylmethyl-d)pyrazin-2-yl)amino)acrylate)的制备：
2-((3-(1-氘-1-苯基甲基)-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(300mg,0.66mmol)、苯硼酸(103mg,0.85mmol)、四三苯基膦钯(76mg,0.07mmol)、无水碳酸钾(272mg,1.97mmol)溶于1,4-二氧六环和水中(1,4-二氧六环：水＝5：1)，在氮气保护下，在85℃条件下，反应2h，TLC监测反应，使用硅藻土过滤，收集滤液，加入50mL水，使用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物9-2，黄色油状化合物278mg,产率为93％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.55(s,1H),8.26(s,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,2H),7.61(s,1H),7.50–7.38(m,4H),7.34(t,J＝7.1Hz,3H),7.26(t,J＝7.1Hz,1H),6.92(s,1H),6.50(d,J＝8.7Hz,2H),4.32(s,1H),1.31(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 455.22,found for 455.06.
2-((3-(1-氘-1-苯基)甲基)-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(10-2)(3-(furan-2-yl)-2-((5-phenyl-3-(phenylmethyl-d)pyrazin-2-yl)amino)acrylic acid)的制备：
2-((3-(1-氘-1-苯基甲基)-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(280mg,0.62mmol)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加2mL三氟乙酸，溶于变红，在室温的条件下反应2h后，补加三氟乙酸0.5mL,继续搅拌1h，TLC监测反应，反应完全，旋干反应液(使用旋转蒸发仪旋干时，储液球里面加入一定量的碳酸氢钠),得中间体化合物10-2，油泵抽干0.5h，深红色固体245mg，产率为99％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(加入一滴冰乙酸)，直接投入下一步。
2-(呋喃-2-基亚甲基)-6-苯基-8-((1-氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(11-2)(2-(furan-2-ylmethylene)-6-phenyl-8-(phenylmethyl-d)imidazo[1,2-a]pyrazin-3(2H)-one)的制备：
在冰浴的条件下，将2-((3-(1-氘-1-苯基甲基)-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(245mg,0.61mmol)溶于四氢呋喃中，缓慢滴加乙酸酐(628mg,6.15mmol)，滴加完毕，再缓慢滴加三乙胺(622mg,6.15mmol)，滴加完毕，在分批次加入4-二甲氨基吡啶(8mg,0.06mmol)，反应液呈酒红色，3min后，TLC监测反应，反应完毕，停止反应，向反应液中加入饱和食盐水，再加入等体积的二氯甲烷，进行萃取，直至水相中无颜色，合并有机相，使用无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以二氯甲烷：甲醇＝20：1的比例进行等度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物11-2，深红色固体117mg，产率为50％，Rf约为0.8,展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1，迅速投入下一步。
2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1-氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(F2)(2-(furan-2-ylmethyl)-6-phenyl-8-(phenylmethyl-d)imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one)的制备：
在冰浴条件下，将2-(呋喃-2-基亚甲基)-6-苯基-8-((1-氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(117mg,0.31mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL甲醇，向反应液中分批次加入硼氢化钠(35mg,0.92mmol)，反应液呈淡黄色，TLC监测反应，反应完全，使用1mol/L盐酸淬灭，加入饱和食盐水，加入等量二氯甲烷，萃取，收集有机相化合物，使用旋转蒸发仪除去大部分溶液，将剩余的反应液置于-20℃冰箱中，有固体化合物析出，过滤，收集滤饼，滤饼即为化合物F2(12-2)，白色固体63mg,产率为53％，Rf约为0.3,展开剂为二氯甲烷：甲醇＝30：1，熔点为185-186℃。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.63(s,1H),7.96(dd,J＝7.8,1.6Hz,2H),7.55–7.49(m,3H),7.45(dd,J＝4.2,2.9Hz,3H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.26(t,J＝7.3Hz,1H),6.45–6.34(m,1H),6.22(d,J＝2.6Hz,1H),4.62(d,J＝7.7Hz,1H),4.35(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ151.21,147.49,142.59,139.79,137.11,134.49,129.79,129.73,129.36,128.92,127.28,126.93,111.15,110.94,107.52,37.23,24.12.ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 383.1613,found for 383.1615.
实施例2：2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮的制备
1,1-二氘-1-苯基甲醇(4)(phenylmethan-d2-ol)的制备：
氘代氢化锂铝(201mg,4.79mmol)加入至25mL双颈瓶中，在氮气保护下，加入5mL超干四氢呋喃，冰浴，在0℃的条件下，使用注射器滴加溶于超干四氢呋喃的苯甲酸乙酯(600mg,4.00mmol)，在室温的条件下，反应1h，TLC监测反应，冷却反应液至0℃，加入0.5mL重水，在0℃的条件下，继续搅拌30min，使用硅藻土过滤，乙醚洗涤，使用无水硫酸钠干燥，旋干，以100-200目硅胶拌样，以200-300目硅胶装柱，使用一定比例的乙酸乙酯和石油醚进行梯度洗脱，得中间体化合物4，无色透明油状化合物380mg,产率为87％，Rf约为0.4,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.33(d,J＝3.9Hz,4H),7.24(dd,J＝8.2,4.0Hz,1H),5.10(s,1H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 111.08,found for 111.50.
1,1-二氘-1-苯基-1-溴甲烷(5)((bromomethyl-d2)benzene)的制备：
1,1-二氘-1-苯基甲醇(1.2g,10.89mmol)和三甲基溴硅烷(1.83g,11.98mmol)加入到10mL的单颈瓶中，在室温的条件下，反应24h，TLC监测反应，反应完全，停止反应，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以石油醚为洗脱剂，得中间体5，无色透明油状化合物1.2g,产率为63％，Rf约为0.8,展开剂为石油醚。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.45(d,J＝7.5Hz,2H),7.34(dt,J＝14.0,7.6Hz,3H).
2-氨基-3-(1,1-二氘-1-苯基)甲基-5-溴吡嗪(6-3)(5-bromo-3-(phenylmethyl-d2)pyrazin-2-amine)的制备：
活化的锌粉(1.13g,17.37mmol)加入到50mL的双颈瓶中，在氮气保护下、室温条件下，加入碘单质(132mg,0.52mmol)溶液(碘单质溶于超干四氢呋喃和超干N,N-二甲基甲酰胺，超干四氢呋喃：N,N-二甲基甲酰胺＝5：1)，搅拌至碘单质的颜色褪去。使用注射器将1,1-二氘-1-苯基-1-溴甲烷(1.5g,8.67mmol)和1,2-二溴乙烷(97mg,0.52mmol)加入到上述的溶液中，85℃条件下回流反应。经3h反应后，反应液(呈灰色的均一的溶液)静止冷却至室温。将2-氨基-3,5-二溴吡嗪(1.46mg,5.78mmol)和双三苯基膦二氯化钯(81mg,0.11mmol)溶于超干N,N-二甲基甲酰胺溶液中，将其滴加到上述溶液中。室温条件下，反应24h。反应终止，将反应液经硅藻土过滤，在滤液中加入200mL的饱和氯化铵溶液和2×200mL的乙酸乙酯溶液萃取，收集有机层溶液加入无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，旋干，加入100-200目硅胶拌样，以200-300目硅胶装柱，以乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，进行梯度洗脱，得中间体化合物6-3，淡黄色油状化合物1.07g,产率为71％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.95(s,1H),7.26(td,J＝16.9,7.1Hz,5H),6.55(s,2H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 266.03,268.02,found for 266.31,268.31.
2-((5-溴-3-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(7-3)(tert-butyl 2-((5-bromo-3-(phenylmethyl-d2)pyrazin-2-yl)amino)-2-(dimethoxyphosphoryl)acetate)的制备：
2-氨基-3-(1,1-二氘-1-苯基甲基)-5-溴吡嗪(300mg,1.13mmol)、2-重氮-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(564mg,2.25mmol)和二聚醋酸铑(49mg,0.11mmol)加入至100mL的双颈瓶中，加入30mL甲苯使其溶解，在氮气保护下，在110℃的条件下反应12h，TLC监测反应，反应完全，终止反应，使用硅藻土过滤，收集滤液，以100-200目硅胶拌样，以200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，可制备中间体化合物7-3，灰色固体370mg,产率为67％，熔点为102-104℃，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.12(s,1H),7.37–7.20(m,5H),6.84(d,J＝3.8Hz,1H),5.09(dd,J＝23.6,8.2Hz,1H),3.68(d,J＝11.0Hz,3H),3.59(d,J＝10.9Hz,3H),1.39(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 489.09,490.09,found for 489.23,490.23.
2-((3-(1,1-二氘-1-苯基)甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(8-3)(tert-butyl 2-((5-bromo-3-(phenylmethyl-d2)pyrazin-2-yl)amino)-3-(furan-2-yl)acrylate)的制备：
2-((5-溴-3-(1,1-二氘-1-苯基甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(200mg,0.41mmol)溶于少量甲醇中，缓慢滴加糠醛(51mg,0.53mmol)，将糠醛滴加完毕后，再缓慢滴加四甲基胍(70mg,0.61mmol)，在室温的条件下，搅拌反应2h，TLC监测反应，反应完毕，过滤，收集滤饼，滤饼即是化合物8-3，土黄色固体163mg,产率为87％，熔点为148-149℃，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.38(s,1H),8.09(s,1H),7.63(s,1H),7.38–7.24(m,5H),6.98(s,1H),6.51(d,J＝16.9Hz,2H),1.31(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 458.10,460.10,found for 457.92,459.92.
2-((3-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(9-3)(tert-butyl 3-(furan-2-yl)-2-((5-phenyl-3-(phenylmethyl-d2)pyrazin-2-yl)amino)acrylate)的制备：
2-((3-(1,1-二氘-1-苯基甲基)-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(160mg,0.35mmol)、苯硼酸(55mg,0.45mmol)、四三苯基膦钯(40mg,0.04mmol)、无水碳酸钾(145mg,1.05mmol)溶于1,4-二氧六环和水中(1,4-二氧六环：水＝5：1)，在氮气保护下，在85℃条件下，反应2h，TLC监测反应，反应完全，停止反应，使用硅藻土过滤，收集滤液，加入50mL水，使用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋干，可制备中间体化合物9-3，黄色油状化合物148mg,产率为93％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.55(s,1H),8.25(s,1H),7.96(t,J＝12.0Hz,2H),7.61(s,1H),7.43(dd,J＝18.2,7.9Hz,4H),7.34(t,J＝6.6Hz,3H),7.26(t,J＝7.2Hz,1H),6.92(s,1H),6.50(d,J＝10.3Hz,2H),1.31(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 456.23,found for 455.01.
2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(F3)(2-(furan-2-ylmethyl)-6-phenyl-8-(phenylmethyl-d2)imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one)的制备：
2-((3-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(148mg,0.32mmol)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加1.5mL三氟乙酸，溶于变红，在室温的条件下反应2h后，补加三氟乙酸0.5mL,继续搅拌1h，TLC监测反应，反应完全，旋干反应液(使用旋转蒸发仪旋干时，储液球里面加入一定量的碳酸氢钠),得中间体化合物10-3，油泵抽干0.5h，深红色固体129mg，产率为99％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(加入一滴冰乙酸)，直接投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体化合物10-3(129mg,0.32mmol)溶于四氢呋喃中，缓慢滴加乙酸酐(330mg,3.23mmol)，滴加完毕，再缓慢滴加三乙胺(327mg,3.23mmol)，滴加完毕，加入4-二甲氨基吡啶(4mg,0.03mmol)，反应液呈酒红色，3min后，TLC监测反应，向反应液中加入饱和食盐水，再加入等体积的二氯甲烷，进行萃取，直至水相中无颜色，合并有机相，使用无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以二氯甲烷：甲醇＝20：1的比例进行等度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物11-3,深红色固体60mg，产率为50％，Rf约为0.8,展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1，迅速投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体11-3(60mg,0.16mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL甲醇，向反应液中分批次加入硼氢化钠(18mg,0.47mmol)，反应液呈淡黄色，TLC监测反应，反应完全，使用1mol/L盐酸淬灭，加入饱和食盐水，加入等量二氯甲烷，萃取，收集有机相化合物，使用旋转蒸发仪除去大部分溶液，将剩余的反应液置于-20℃冰箱中，有固体化合物析出，过滤，收集滤饼，滤饼即为化合物化合物F3，淡黄色固体30mg,产率为58％，Rf约为0.3,展开剂为二氯甲烷：甲醇＝30：1，熔点为123-125℃。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.63(s,1H),7.96(dd,J＝7.8,1.5Hz,2H),7.55–7.49(m,3H),7.45(dd,J＝4.6,2.6Hz,3H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.26(t,J＝7.3Hz,1H),6.49–6.33(m,1H),6.22(d,J＝3.1Hz,1H),4.35(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ152.00,146.52,142.32,137.63,134.85,129.59,129.44,129.32,128.87,128.12,127.14,126.77,111.06,110.11,107.16,25.10.ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 384.1676,found for 384.1681.
实施例3：2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮的制备
1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基)-1-溴甲烷(1)(1-(bromomethyl-d2)benzene-2,3,4,5,6-d5)的制备：
氘代甲苯(1g,9.98mmol,toluene-d8)和N-溴代琥珀酰亚胺(1.78g,9.98mmol)溶于50mL的四氯化碳中，然后加入过氧化苯甲酸叔丁酯(581mg,2.99mmol)。在90℃的条件下反应2h，使用TLC监测反应，反应完全，停止反应，过滤，除去反应液中的丁二酰亚胺，收集滤液，旋干，加入100-200目硅胶拌样，以200-300目硅胶装柱，以石油醚为洗脱剂，得中间体化合物1，Rf约为0.5,展开剂：石油醚，无色油状化合物1.1g，产率为62％。13C NMR(101MHz,DMSO)δ138.22,129.56,129.32,129.08,128.88,128.64,128.53,128.39,128.29,128.05,40.67,40.46,40.25,40.04,39.83,39.62,39.42,34.97,34.73,34.50,34.27,34.04.
2-氨基-3-(1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基)甲基)-5-溴-吡嗪(6-4)(2-amine-3-((phenyl-d5)methyl-d2)-5-bromo-pyrazine)的制备：
活化的锌粉(1.82g,27.85mmol)加入到50mL的双颈瓶中，在氮气保护下、室温条件下，加入碘单质(212mg,0.84mmol)溶液(碘单质溶于超干四氢呋喃和超干N,N-二甲基甲酰胺，超干四氢呋喃：N,N-二甲基甲酰胺＝5：1)，搅拌至碘单质的颜色褪去。使用注射器将1,1-二氘-1-溴-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基)甲烷(2.48g,13.93mmol)和1,2-二溴乙烷(65mg,0.35mmol)加入到上述的溶液中，85℃条件下回流反应。经3h反应后，反应液(呈灰色的均一的溶液)静止冷却至室温。将2-氨基-3,5-二溴吡嗪(2.35g,9.28mmol)和双三苯基膦二氯化钯(195mg,0.28mmol)溶于超干N,N-二甲基甲酰胺溶液中，将其滴加到上述溶液中。室温条件下，反应24h。反应终止，将反应液经硅藻土过滤，在滤液中加入200mL的饱和氯化铵溶液和2×200mL的乙酸乙酯溶液萃取，收集有机层溶液加入无水硫酸钠干燥，过滤，收集滤液，旋干，加入100-200目硅胶拌样，以200-300目硅胶装柱，以乙酸乙酯和石油醚为洗脱剂，进行梯度洗脱，得中间体化合物6-4，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1，淡黄色化合物1.3g,产率为52％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.95(s,1H),6.55(s,2H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 271.06,272.05,found for 271.07,273.07.
2-((5-溴-3-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基))甲基吡嗪-2-基)氨基)-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(7-4)(tert-butyl 2-((5-bromo-3-((phenyl-d5)methyl-d2)pyrazin-2-yl)amino)-2-(dimethoxyphosphoryl)acetate)的制备：
2-氨基-3-(1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基)甲基)-5-溴-吡嗪(600mg,2.21mmol)、2-重氮-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(1.11g,4.43mmol)和二聚醋酸铑(97mg,0.23mmol)加入双颈瓶中，加入20mL甲苯使其溶解，在氮气保护下，在110℃的条件下反应12h，TLC监测反应，反应完全，终止反应，使用硅藻土过滤，收集滤液，以100-200目硅胶拌样，以200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，可制备中间体化合物7-4,灰色固体548mg,产率为50％，熔点为104-106℃，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝1：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.12(s,1H),6.95–6.73(m,1H),5.09(dd,J＝23.7,8.6Hz,1H),3.68(d,J＝11.0Hz,3H),3.59(d,J＝10.8Hz,3H),1.39(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 493.12,495.12,found for 482.23,494.92.
2-((3-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基))甲基)-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(8-4)(tert-butyl 2-((5-bromo-3-((phenyl-d5)methyl-d2)pyrazin-2-yl)amino)-3-(furan-2-yl)acrylate)的制备：
2-((5-溴-3-(1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基)甲基)吡嗪-2-基)氨基-2-(二甲氧基膦酰基)乙酸叔丁酯(300mg,0.61mmol)溶于少量甲醇中，依次滴加糠醛(76mg,0.79mmol)、四甲基胍(105mg,0.91mmol)，在室温的条件下，搅拌反应2h，TLC监测反应，反应完毕，过滤，收集滤饼，滤饼即是中间体化合物8-4，土黄色固体251mg,产率为89％，熔点为146-147℃，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.39(s,1H),8.09(s,1H),7.64(s,1H),6.98(s,1H),6.51(d,J＝16.0Hz,2H),1.31(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 463.14,463.14,found for 463.13,463.13.
2-((3-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(9-4)(tert-butyl 3-(furan-2-yl)-2-((5-phenyl-3-((phenyl-d5)methyl-d2)pyrazin-2-yl)amino)acrylate)的制备：
2-((3-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基))甲基)-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg,0.43mmol)、苯硼酸(68mg,0.56mmol)、四三苯基膦钯(50mg,0.04mmol)、无水碳酸钾(179mg,1.29mmol)溶于1,4-二氧六环和水中(1,4-二氧六环：水＝5：1)，在氮气保护下，在85℃条件下，反应1h，TLC监测反应，反应完全，停止反应，使用硅藻土过滤，收集滤液，加入50mL水，使用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体9-4，黄色油状化合物190mg,产率为96％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.55(s,1H),8.25(s,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,2H),7.61(s,1H),7.45(t,J＝7.5Hz,2H),7.36(t,J＝7.3Hz,1H),6.92(s,1H),6.50(d,J＝8.8Hz,2H),1.31(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 461.26,found for 461.00.
2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基-8-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(F4)(2-(furan-2-ylmethyl)-6-phenyl-8-((phenyl-d5)methyl-d2)imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one)的制备：
2-((3-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基))甲基)-5-苯基吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(190mg,0.41mmol)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加2.5mL三氟乙酸，溶于变红，在室温的条件下反应2h后，补加三氟乙酸0.5mL,继续搅拌1h，TLC监测反应，反应完全，旋干反应液(使用旋转蒸发仪旋干时，储液球里面加入一定量的碳酸氢钠),得中间体化合物10-4，油泵抽干0.5h，深红色固体190mg，产率为99％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(加入一滴冰乙酸)直接投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体化合物10-4(129mg,0.32mmol)溶于四氢呋喃中，依次滴加(190mg,0.41mmol)、乙酸酐(480mg,4.70mmol)、三乙胺(475mg,4.70mmol)、加入4-二甲氨基吡啶(6mg,0.05mmol)，反应液呈酒红色，几分钟后，TLC监测反应，反应完毕，向反应液中加入饱和食盐水，再加入等体积的二氯甲烷，进行萃取，直至水相中无颜色，合并有机相，使用无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以二氯甲烷：甲醇＝20：1的比例进行等度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物11-4,深红色固体90mg，产率为50％，Rf约为0.8,展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1，迅速投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体11-4(90mg,0.23mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL甲醇，向反应液中分批次加入硼氢化钠(26mg,0.70mmol)，反应液呈淡黄色，TLC监测反应，反应完全，加入1mol/L盐酸淬灭，加入饱和食盐水，加入等量二氯甲烷，萃取，收集有机相化合物，使用旋转蒸发仪除去大部分溶液，将剩余的反应液置于-20℃冰箱中，有固体化合物析出，过滤，收集滤饼，滤饼即为化合物化合物F4(12-4)，土黄色固体46mg,产率为51％，Rf约为0.3,展开剂为二氯甲烷：甲醇＝30：1，熔点为120-124℃。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.63(s,1H),7.96(dd,J＝7.9,1.5Hz,2H),7.50(ddd,J＝16.8,8.8,2.0Hz,4H),6.37(dd,J＝3.1,1.9Hz,1H),6.22(d,J＝3.1Hz,1H),4.35(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ151.41,147.28,142.52,140.33,137.01,134.57,129.70,129.34,129.04,128.63,128.39,128.16,127.43,126.89,111.13,110.75,107.43,24.36.ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 389.1989,foundfor 389.1989.
实施例4：2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮的制备
2-((3-苄基-5-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(9-5)(tert-butyl 2-((3-benzyl-5-(phenyl-d5)pyrazin-2-yl)amino)-3-(furan-2-yl)acrylate)的制备：
2-((3-苄基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(300mg,0.66mmol)、2,3,4,5,6-五氘代苯硼酸(108mg,0.85mmol)、四三苯基膦钯(76mg,0.06mmol)、无水碳酸钾(273mg,1.97mmol)溶于1,4-二氧六环和水中(1,4-二氧六环：水＝5：1)，在氮气保护下，在85℃条件下，反应2h，TLC监测反应，反应完全，使用硅藻土过滤，收集滤液，加入50mL水，使用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物9-5，黄色油状化合物290mg,产率为96％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.56(s,1H),8.23(s,1H),7.61(d,J＝1.1Hz,1H),7.41(d,J＝7.5Hz,2H),7.35(t,J＝7.5Hz,2H),7.26(t,J＝7.2Hz,1H),6.92(s,1H),6.57–6.46(m,2H),4.35(s,2H),1.34(d,J＝16.7Hz,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 459.24,found for459.24.
2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-苄基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(F5)(8-benzyl-2-(furan-2-ylmethyl)-6-(phenyl-d5)imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one)的制备：
2-((3-苄基-5-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(290mg,0.41mmol)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加2.5mL三氟乙酸，溶于变红，在室温的条件下反应2h后，补加三氟乙酸0.5mL,继续搅拌1h，TLC监测反应，反应完全，旋干反应液(使用旋转蒸发仪旋干时，储液球里面加入一定量的碳酸氢钠),得中间体化合物10-5，油泵抽干0.5h，深红色固体250mg，产率为98％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(加入一滴冰乙酸)，直接投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体化合物10-5(250mg,0.62mmol)溶于四氢呋喃中，缓慢滴加乙酸酐(634mg,6.21mmol)，滴加完毕，再缓慢滴加三乙胺(628mg,6.21mmol)，滴加完毕，加入4-二甲氨基吡啶(8mg,0.06mmol)，反应液呈酒红色，几分钟后，TLC监测反应，反应完毕，向反应液中加入饱和食盐水，再加入等体积的二氯甲烷，进行萃取，直至水相中无颜色，合并有机相，使用无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以二氯甲烷：甲醇＝20：1的比例进行等度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物11-5,深红色固体110mg，产率为46％，Rf约为0.8,展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1，迅速投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体11-5(110mg,0.29mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL甲醇，向反应液中分批次加入硼氢化钠硼氢化钠(32mg,0.86mmol)，反应液呈淡黄色，TLC监测反应，反应完全，加入1mol/L盐酸淬灭，加入饱和食盐水，加入等量二氯甲烷，萃取，收集有机相化合物，使用旋转蒸发仪除去大部分溶液，将剩余的反应液置于-20℃冰箱中，有固体化合物析出，过滤，收集滤饼，滤饼即为化合物F5，深棕色固体78mg,产率为71％，Rf约为0.3,展开剂为二氯甲烷：甲醇＝30：1，熔点为169-172℃。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.62(s,1H),7.44(d,J＝5.4Hz,3H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.26(t,J＝7.3Hz,1H),6.37(dd,J＝3.1,1.9Hz,1H),6.22(d,J＝2.6Hz,1H),4.63(s,2H),4.35(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ151.56,147.18,142.46,140.44,137.40,134.50,129.69,128.88,127.58,127.20,126.40,111.11,110.58,107.37,37.44,24.52.ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 387.1864,foundfor 387.1863.
实施例5：2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1-氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮的制备
2-((3-((1-氘-1-苯基)甲基)-5-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(9-6)(tert-butyl 3-(furan-2-yl)-2-((5-(phenyl-d5)-3-(phenylmethyl-d)pyrazin-2-yl)amino)acrylate)的制备：
2-((3-((1-氘-1-苯基)甲基)-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(300mg,0.66mmol)、2,3,4,5,6-五氘代苯硼酸(108mg,0.85mmol)、四三苯基膦钯(76mg,0.06mmol)、无水碳酸钾(273mg,1.97mmol)溶于1,4-二氧六环和水中(1,4-二氧六环：水＝5：1)，在氮气保护下，在85℃条件下，反应2h，TLC监测反应，反应完全，使用硅藻土过滤，收集滤液，加入50mL水，使用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋干，可制备中间体化合物9-6，黄色油状化合物295mg,产率为98％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.55(s,1H),8.23(s,1H),7.61(d,J＝1.1Hz,1H),7.41(d,J＝7.3Hz,2H),7.35(t,J＝7.5Hz,2H),7.26(t,J＝7.1Hz,1H),6.92(s,1H),6.56–6.45(m,2H),4.32(s,1H),1.32(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 460.25,found for 460.03.
2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1-氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(F6)(2-(furan-2-ylmethyl)-6-(phenyl-d5)-8-(phenylmethyl-d)imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one)的制备：
2-((3-((1-氘-1-苯基)甲基)-5-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(260mg,0.57mmol)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加2.5mL三氟乙酸，溶于变红，在室温的条件下反应2h后，补加三氟乙酸0.5mL,继续搅拌1h，TLC监测反应，反应完全，旋干反应液(使用旋转蒸发仪旋干时，储液球里面加入一定量的碳酸氢钠),得中间体化合物10-6，油泵抽干0.5h，深红色固体225mg，产率为99％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(加入一滴冰乙酸)，直接投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体化合物10-6(225mg,0.56mmol)溶于四氢呋喃中，依次滴加乙酸酐(569mg,5.58mmol)，三乙胺(564mg,5.58mmol)，加入4-二甲氨基吡啶(7mg,0.06mmol)，反应液呈酒红色，几分钟后，TLC监测反应，反应完毕，停止反应，向反应液中加入饱和食盐水，再加入等体积的二氯甲烷，进行萃取，直至水相中无颜色，合并有机相，使用无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以二氯甲烷：甲醇＝20：1的比例进行等度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物11-5,深红色固体110mg，产率为51％，Rf约为0.8,展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1，迅速投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体11-3(110mg,0.29mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL甲醇，向反应液中分批次加入硼氢化钠(32mg,0.86mmol)，反应液呈淡黄色，TLC监测反应，反应完全，使用1mol/L盐酸淬灭，加入饱和食盐水，加入等量二氯甲烷，萃取，收集有机相化合物，使用旋转蒸发仪除去大部分溶液，将剩余的反应液置于-20℃冰箱中，有固体化合物析出，过滤，收集滤饼，滤饼即为化合物F6，黄色固体52mg,产率为71％，Rf约为0.3,展开剂为二氯甲烷：甲醇＝30：1，熔点为169-172℃。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.62(s,1H),7.45(dd,J＝4.5,2.6Hz,3H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.26(t,J＝7.3Hz,1H),6.42–6.35(m,1H),6.22(d,J＝3.1Hz,1H),4.61(s,1H),4.35(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ151.69,147.02,142.41,140.76,137.43,136.62,134.53,129.66,128.87,127.70,127.18,126.37,111.09,110.43,107.31,37.02,24.69.ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 388.1927,found for388.1925.
实施例6：2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮的制备
2-((3-((1,1-二氘代-1-苯基)甲基)-5-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(9-7)(tert-butyl 3-(furan-2-yl)-2-((5-(phenyl-d5)-3-(phenylmethyl-d2)pyrazin-2-yl)amino)acrylate)的制备：
2-((3-(1,1-二氘-1-苯基)甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(330mg,0.72mmol)、2,3,4,5,6-五氘代苯硼酸(119mg,0.94mmol)、四三苯基膦钯(82mg,0.07mmol)、无水碳酸钾(299mg,2.16mmol)溶于1,4-二氧六环和水中(1,4-二氧六环：水＝5：1)，在氮气保护下，在85℃条件下，反应2h，TLC监测反应，反应完全，使用硅藻土过滤，收集滤液，加入50mL水，使用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋干，可制备中间体化合物9-7，黄色油状化合物320mg,产率为97％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.55(s,1H),8.24(s,1H),7.61(s,1H),7.41(d,J＝7.5Hz,2H),7.34(t,J＝7.5Hz,2H),7.26(t,J＝7.2Hz,1H),6.92(s,1H),6.56–6.45(m,2H),1.31(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 461.26,found for 461.13.
2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(F7)2-(furan-2-ylmethyl)-6-(phenyl-d5)-8-(phenylmethyl-d2)imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one)的制备：
2-((3-((1,1-二氘-1-苯基)甲基)-5-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(370mg,0.80mmol)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加3mL三氟乙酸，溶于变红，在室温的条件下反应2h后，补加三氟乙酸1mL,继续搅拌1h，TLC监测反应，反应完全，旋干反应液(使用旋转蒸发仪旋干时，储液球里面加入一定量的碳酸氢钠)，得中间体化合物10-7，油泵抽干0.5h，深红色固体320mg，产率为99％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(加入一滴冰乙酸)，直接投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体化合物10-7(320mg,0.79mmol)溶于四氢呋喃中，依次滴加乙酸酐(807mg,7.91mmol)、三乙胺(800mg,7.91mmol)，加入4-二甲氨基吡啶(10mg,0.08mmol)，反应液呈酒红色，几分钟后，TLC监测反应，反应完毕，向反应液中加入饱和食盐水，再加入等体积的二氯甲烷，进行萃取，直至水相中无颜色，合并有机相，使用无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以二氯甲烷：甲醇＝20：1的比例进行等度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物11-3,深红色固体150mg，产率为49％，Rf约为0.8,展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1，迅速投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体11-7(150mg,0.39mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL甲醇，向反应液中分批次加入硼氢化钠(44mg,1.16mmol)，反应液呈淡黄色，TLC监测反应，使用1mol/L盐酸淬灭，加入饱和食盐水，加入等量二氯甲烷，萃取，收集有机相化合物，使用旋转蒸发仪除去大部分溶液，将剩余的反应液置于-20℃冰箱中，有固体化合物析出，过滤，收集滤饼，滤饼即为化合物化合物F7，淡黄色固体80mg,产率为53％，Rf约为0.3,展开剂为二氯甲烷：甲醇＝30：1，熔点为184-186℃。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.62(s,1H),7.45(d,J＝5.9Hz,3H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.26(t,J＝7.3Hz,1H),6.42–6.33(m,1H),6.22(d,J＝2.7Hz,1H),4.35(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ151.69,147.02,142.41,140.77,137.43,137.39,136.58,134.52,129.65,128.87,127.68,127.19,126.36,111.09,110.42,107.31,36.88,24.69.ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 389.1989,found for 389.1987.
实施例7：2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮的制备
2-((3-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)-5-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(9-8)(tert-butyl 3-(furan-2-yl)-2-((5-(phenyl-d5)-3-((phenyl-d5)methyl-d2)pyrazin-2-yl)amino)acrylate)的制备：
2-((3-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘苯基))甲基)-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(300mg,0.66mmol)、2,3,4,5,6-五氘代苯硼酸(106mg,0.85mmol)、四三苯基膦钯(76mg,0.07mmol)、无水碳酸钾(268mg,1.97mmol)溶于1,4-二氧六环和水中(1,4-二氧六环：水＝5：1)，在氮气保护下，在85℃条件下，反应2h，TLC监测反应，反应完全，使用硅藻土过滤，收集滤液，加入50mL水，使用2×50mL的乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，使用一定比例的石油醚和乙酸乙酯进行梯度洗脱，收集洗脱液，旋干，可制备中间体化合物9-8，黄色油状化合物292mg,产率为97％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝10：1。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.55(s,1H),8.24(s,1H),7.61(s,1H),6.92(s,1H),6.58–6.43(m,2H),1.31(s,9H).ESI-MS：m/z[M+H]+calcd for 466.29,found for 466.15.
2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)-8-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(F8)(2-(furan-2-ylmethyl)-6-(phenyl-d5)-8-((phenyl-d5)methyl-d2)imidazo[1,2-a]pyrazin-3(7H)-one)的制备：
2-((3-((1,1-二氘-1-(2,3,4,5,6-五氘代苯基))甲基)-5-(2,3,4,5,6-五氘代苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg,0.43mmol)溶于二氯甲烷中，缓慢滴加2mL三氟乙酸，溶于变红，在室温的条件下反应2h后，补加三氟乙酸0.5mL,继续搅拌1h，TLC监测反应，反应完全，旋干反应液(使用旋转蒸发仪旋干时，储液球里面加入一定量的碳酸氢钠),得中间体化合物10-8，油泵抽干0.5h，深红色固体160mg，产率为91％，Rf约为0.3,展开剂为石油醚：乙酸乙酯＝3：1(加入一滴冰乙酸)，直接投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体化合物10-8(160mg,0.40mmol)溶于四氢呋喃中，缓慢滴加乙酸酐(403mg,3.96mmol)，滴加完毕，再缓慢滴加三乙胺(400mg,3.96mmol)，滴加完毕，加入4-二甲氨基吡啶(10mg,0.04mmol)，反应液呈酒红色，几分钟后，TLC监测反应，反应完毕，停止反应，向反应液中加入饱和食盐水，再加入等体积的二氯甲烷，进行萃取，直至水相中无颜色，合并有机相，使用无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，旋干，以100-200目硅胶拌样，200-300目硅胶装柱，以二氯甲烷：甲醇＝20：1的比例进行等度洗脱，收集洗脱液，旋干，得中间体化合物11-8,深红色固体100mg，产率为66％，Rf约为0.8,展开剂为二氯甲烷：乙酸乙酯＝10：1，迅速投入下一步。
在冰浴条件下，将中间体11-8(100mg,0.26mmol)溶于10mL二氯甲烷中，加入5mL甲醇，向反应液中分批次加入硼氢化钠硼氢化钠(29mg,0.77mmol)，反应液呈淡黄色，TLC监测反应，反应完全，使用1mol/L盐酸淬灭，加入饱和食盐水，加入等量二氯甲烷，萃取，收集有机相化合物，使用旋转蒸发仪除去大部分溶液，将剩余的反应液置于-20℃冰箱中，有固体化合物析出，过滤，收集滤饼，滤饼即为化合物F8，淡黄色固体55mg,产率为55％，Rf约为0.3,展开剂为二氯甲烷：甲醇＝30：1，熔点为145-150℃。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.62(s,1H),7.49(d,J＝30.4Hz,1H),6.41–6.35(m,1H),6.22(d,J＝3.2Hz,1H),4.35(s,2H).13CNMR(101MHz,DMSO)δ172.40,161.22,151.21,142.58,136.90,134.30,129.55,129.36,129.32,129.27,129.08,128.89,128.64,128.39,128.17,127.25,126.81,126.56,126.42,111.14,111.00,107.52,24.21,24.18,24.13,24.10,24.08,21.51.ESI-HRMS：m/z[M+H]+calcd for 394.2303,found for 394.2297.
实施例8：基于Furimazine的氘代化合物与NanoLuc的体外酶活性研究
基于Furimazine的氘代化合物的浓储(现配现用)使用Tris-HCl缓冲液(50mM)分别稀释成50,20,10,4,2,1,0.5,0μM的化合物梯度，将NanoLuc使用Tris-HCl缓冲液(50mM)稀释成0.6μg/mL，将50μL化合物分别加入全黑的96孔中，然后加入50μL的NanoLuc，每孔共100μL，混合均匀，迅速放入小动物活体成像仪，立即成像。利用Graph Pad软件的米氏方程模块，计算米氏常数(Km),酶促反应最大速率(Vmax)和生物发光半衰期。以Furimazine(25μL)的测试结果为基准，折算所有化合物的生物发光强度值。
生物发光最大波长的测定：将基于Furimazine的氘代化合物的浓储使用50mMTris-HCl缓冲液稀释成20μM，使用50mM Tris-HCl缓冲液将NanoLuc稀释成0.6μg/mL,将化合物(50μL)和NanoLuc(50μL)分别加入全黑的96孔中，每孔共100μL，使用酶标仪中的Luminescence模块，分辨率5nm，进行扫描，测试化合物的生物发光光谱。结果如图1、表1所示。
表1基于Furimazine的氘代化合物与NanoLuc作用的生物发光特性
Figure BDA0003166253290000261
结果表明，Furimazine的氘代化合物都具有很强的发光强度。但是，相对于Furimazine，Furimazine的氘代化合物的最大发光强度与Furimazine大致相同。但是，在5μM条件下，Furimazine的氘代化合物的发光强度衰减速度都比Furimazine慢，其中F2,F5,F6,F7,F8在衰减速度方面，表现的更好。值得注意的是，化合物F2、F4、F5、F6、F7和F8的米氏常数Km比Furimazine的小，这说明F2、F4、F5、F6、F7和F8与NanoLuc有更好的亲和力。
实施例9：基于Furimazine的氘代化合物在稳定表达NanoLuc的细胞株A549的活性研究
基于Furimazine的氘代化合物的浓储使用生理盐水(0.9％的氯化钠溶液)稀释为25,10,5,2,1,0.5,0.25,0μM的化合物梯度。将处于对数期的A549细胞，去除培养基，加入胰蛋白酶消化，离心，计数，调至4×106个/mL，加至96孔板中，每孔100μL。在37℃，5％CO2恒温培养箱中，培养24h。去除培养基，加入100μL各浓度梯度的化合物，曝光时间1s，立即成像，使用GraphPad Prism软件对数据进行处理。结果如图2所示。
结果表明，F2,F5,F6,F7,F8的生物发强度衰减速度明显比Furimazine的衰减速度慢。
实施例10，基于Furimazine的氘代化合物在动物水平的生物发光评价
将处于对数期的A549细胞，去除培养基，加入胰蛋白酶，消化，离心,去除上清液，加入无菌生理盐水，洗涤细胞三次，加入无菌生理盐水，吹打细胞，计数，将细胞稀释为1×107个/mL。所用的裸鼠为4周大的雌性裸鼠，使用1mL的无菌注射器将稀释好的细胞注射至裸鼠的右侧腋下，每只裸鼠100μL。在恒温的26℃，保持食物、水、生长环境为无菌且充足的情况下，饲养小鼠4周左右，用小动物活体成像仪进行皮下荷瘤生物发光成像测量。结果如图3所示。
结果表明，F2,F5,F6,F7和F8的生物发光强度优于Furimazine，其中，F2和F5的生物发光强度大约是Furimazine的2倍，F6、F7和F8的生物发光强度大概是Furimazine的1.5倍。在小动物活体成像的过程中，F2，F5，F6,F7和F8的生物发光强度一直强于Furimazine，尤其是F5的发光时间持续150min，F7和F8的生物发光强度可以持续120min。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种咪唑并吡嗪酮类化合物，其特征在于，具有式I所示结构：
Figure FDA0003602543470000011
式I选自如下化合物：
Figure FDA0003602543470000012
2.一种制备权利要求1所述的咪唑并吡嗪酮类化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
R1X与活化锌粉反应生成锌试剂，锌试剂与2-氨基-3,5-二卤代吡嗪反应得到中间体6；
以对甲基苯磺酰氯为原料，与叠氮化钠反应，得到中间体13即对甲基苯磺酰叠氮化物；中间体13与二甲氧基膦酰基乙酸叔丁酯反应，得到中间体14即2-重氮-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸叔丁酯；
中间体6与中间体14反应得到中间体7；中间体7与糠醛反应得到中间体8；中间体8与R2取代的苯硼酸R2-B(OH)2反应得到中间体9；中间体9脱去叔丁基得到中间体10；中间体10发生环化反应生成中间体11；中间体11经还原反应得到式I化合物；
中间体6-11的结构如下所示：
Figure FDA0003602543470000021
其中，R1、R2如权利要求1中所示，X为卤素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述X为Br。
4.一种发光底物，其为权利要求1所述的咪唑并吡嗪酮类化合物。
5.一种探针，其为权利要求1所述的咪唑并吡嗪酮类化合物。
6.根据权利要求1所述的咪唑并吡嗪酮类化合物在制备生物发光底物中的应用；和/或，在制备检测萤光素酶试剂中的应用；和/或，在药物检测中的应用。
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