CN109369719B - 一种用于碱性磷酸酶检测的分子探针及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于碱性磷酸酶检测的分子探针及制备方法与应用。所示分子探针为分子探针LET‑CyP，所示分子探针LET‑CyP的结构式如下所示：

本发明通过制备新型花菁染料IR‑823进而制得半花菁染料LET‑CyOH，半花菁染料LET‑CyOH进一步反应制得分子探针LET‑CyP，该探针可同时应用于生物体内碱性磷酸酶的荧光和光声成像。本发明所述的分子探针LET‑CyP能够同时实现活体内荧光和光声成像的碱性磷脂酶探针，具有灵敏度高、特异性强和深度组织穿透的优点，在生物样品检测、化学染料及有机光敏剂等领域具有广阔的应用前景。

Description

一种用于碱性磷酸酶检测的分子探针及制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物体内源性碱性磷酸酶检测领域，尤其涉及一种双模态成像分子探针及其制备方法与应用。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是广泛分布于动物体肝脏、骨骼、肠、肾等组织的一种酶，这种酶能够将对应底物去磷酸化，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。ALP的表达异常与诸多疾病相关，如乳腺癌，前列腺癌，糖尿病，骨病和肝脏功能障碍等等，但由于缺乏能够在体内实时监测ALP的分子探针，所以目前关于ALP具体的生理和病理机制还尚未明确。因此开发用于检测生物体内ALP的分子探针具有重要的研究意义。荧光成像(FLI)是一种比较成熟且广泛应用于生物活体领域的成像技术，具有灵敏度高和选择性好的优点，但对于深层组织成像有限。光声成像(PAI)是一种基于光声效应的新型成像模式，通过造影剂吸收脉冲激光能量并转换成热能，进而以超声波形式发射，超声探头通过捕捉该超声信号进行成像。PAI结合了光学成像和超声成像的优点，成像深度可达到50～60mm，具有丰富的对比度、高分辨率和深度组织穿透，在生物医学应用中具有巨大的应用前景。目前已报道的ALP分子探针都为基于单模态荧光成像，所以开发一种同时具有荧光-光声双模态成像的ALP分子探针对于活体检测ALP具有重要的研究和应用价值。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种双模态成像分子探针及其制备方法与应用，旨在提供一种同时具有荧光-光声双模态成像的ALP分子探针用于活体检测ALP。

本发明的技术方案如下：

一种双模态成像分子探针，其中，所示分子探针为分子探针LET-CyP，所示分子探针LET-CyP的结构式如下所示：

一种如上所述的双模态成像分子探针的制备方法，其中，包括步骤：

(1)花菁染料IR-823的制备：

将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和溴化苄于第一溶剂中混溶，在第一预定温度下反应第一预定时间后，将得到的反应液经洗涤后抽滤，得到的固体为1-R基-2,3,3-三甲基-3H-苯并[e]吲哚溴化铵盐；

0℃下将三氯氧磷与4-叔丁基环己酮加入到第二溶剂中，在第二预定温度下搅拌反应第二预定时间后，将反应液倾入冰水中，反应产物迅速在冰水中结晶，依次经抽滤和干燥后，得到2-氯-3-羟基亚甲基-环已烯-1-烯甲醛；

将所述1-R基-2,3,3-三甲基-3H-苯并[e]吲哚溴化铵盐和2-氯-3-羟基亚甲基-环已烯-1-烯甲醛溶解于第三溶剂中，加入无水吡啶或无水三乙胺，惰性气体保护条件下于第三预定温度搅拌反应第三预定时间，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到花菁染料IR-823；

(2)半花菁染料LET-CyOH的制备：

将花菁染料IR-823与间二苯酚混溶于第四溶剂中，加入无水吡啶或无水三乙胺，惰性气体保护条件下于第四预定温度搅拌反应第四预定时间，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到半花菁染料LET-CyOH；

(3)分子探针LET-CyP的制备：

将半花菁染料LET-CyOH与三氯氧磷混溶于第五溶剂中，常温搅拌反应第五预定时间，将反应液倾入大量冰水中搅拌10～12h，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到分子探针LET-CyP；

其中，所述花菁染料IR-823、半花菁染料LET-CyOH和分子探针LET-CyP的结构式如下所示：

所述的双模态成像分子探针的制备方法，其中，所述第一溶剂为苯类溶剂，第一预定温度为90～110℃，第一预定时间为18～25h。

所述的双模态成像分子探针的制备方法，其中，所述第二溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺和无水四氢呋喃组成的混合溶剂，第二预定温度为60～80℃，第二预定时间为3～5h。

所述的双模态成像分子探针的制备方法，其中，所述第三溶剂为醇类溶剂，第三预定温度为40～60℃，第三预定时间为25～30h。

所述的双模态成像分子探针的制备方法，其中，所述第四溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺，第四预定温度为90～105℃，第四预定时间为30～60min。

所述的双模态成像分子探针的制备方法，其中，所述第五溶剂为无水吡啶，第五预定时间为3～5h。

一种如上所述的双模态成像分子探针的应用，其中，将所述分子探针LET-CyP用于检测碱性磷酸酶。

所述的双模态成像分子探针的应用，其中，当所述分子探针LET-CyP用于检测内源性碱性磷酸酶时，采用的动物模型为荷瘤裸鼠，肿瘤细胞为HeLa细胞。

所述的双模态成像分子探针的应用，其中，将分子探针LET-CyP分散于Tris-HCl与MeOH的混合溶剂中，配制成LET-CyP溶液，再将所述LET-CyP溶液与碱性磷酸酶进行作用。

有益效果：本发明中，分子探针LET-CyP与ALP特异性响应后，天蓝色分子探针LET-CyP被还原为湖蓝色的半花菁染料LET-CyOH，溶液颜色发生明显变化。LET-CyP与ALP反应后结构转换为荧光信号和光声信号非常显著的LET-CyOH，从而实现双模态同步成像。该分子探针LET-CyP不仅可以检测外源性ALP，也可检测内源性ALP，并且对ALP的响应具有高效性和专一性，可有效排除生物体内其他内源性蛋白质的干扰；同时分子探针LET-CyP与ALP作用条件比较温和，符合生物体生理环境。

附图说明

图1为实施例1中LET-CyP的合成路线图。

图2为实施例1中LET-CyP与ALP的响应机制图。

图3为实施例1中LET-CyP的ESI-MS质谱图。

图4为实施例1中LET-CyP的核磁共振氢谱图。

图5为实施例1中LET-CyP的核磁共振碳谱图。

图6中(1)为实施例2中LET-CyP在体外与ALP特异性反应前后的紫外-可见吸收光谱变化图；(2)为荧光发射光谱变化图；(3)为光声光谱变化图。

图7为实施例3中LET-CyP在体外对ALP的荧光检测图：(1)为随ALP浓度变化的荧光发射光谱图；(2)为荧光强度与ALP浓度的线性关系图；(3)为与不同蛋白质反应的荧光发射光谱图；(4)为与不同蛋白质反应后的荧光强度量化图。

图8为实施例4中LET-CyP在体外对ALP的光声检测图：(1)为随ALP浓度变化的光声图；(2)为光声强度与ALP浓度的线性关系图；(3)为与不同蛋白质反应的光声图；(4)为与不同蛋白质反应后的光声强度量化图。

图9中(1)为实施例5中LET-CyP与细胞孵育后的细胞荧光图；(2)为细胞光声图。

图10为实施例6中LET-CyP在动物肿瘤内对ALP的检测图：(1)为不同时间的动物肿瘤荧光图；(2)为不同时间的动物肿瘤荧光强度图；(3)为不同时间的动物肿瘤光声图；(4)为不同时间的动物肿瘤光声强度图。

具体实施方式

本发明提供一种双模态成像分子探针及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种双模态成像分子探针，其中，所示分子探针为分子探针LET-CyP，所示分子探针LET-CyP的结构式如下所示：

本实施例中，分子探针LET-CyP与ALP特异性响应后，天蓝色分子探针LET-CyP被还原为湖蓝色的半花菁染料LET-CyOH，溶液颜色发生明显变化。LET-CyP与ALP反应后结构转换为荧光信号和光声信号非常显著的LET-CyOH，从而实现双模态同步成像。该分子探针LET-CyP不仅可以检测外源性ALP，也可检测内源性ALP，并且对ALP的响应具有高效性和专一性，可有效排除生物体内其他内源性蛋白质的干扰；同时分子探针LET-CyP与ALP作用条件比较温和，符合生物体生理环境。

分子探针LET-CyP对ALP的识别具有特异性，可有效排除酯酶、过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶、凝血酶、半乳糖苷酶、牛血清蛋白、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶、抗生物素蛋白、溶菌酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶和酸性磷酸酶等生物蛋白质的干扰。

分子探针LET-CyP分散于混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1，体积比计)中，与ALP作用时体系环境pH为7.4，反应温度为37℃。该条件较为温和，符合生物体生理生化环境。

本发明实施例还提供一种如上所述的双模态成像分子探针的制备方法，其中，包括步骤：

(1)花菁染料IR-823的制备：

将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和溴化苄于第一溶剂中混溶，在第一预定温度下反应第一预定时间后，将得到的反应液经洗涤(如用乙醚反复洗涤)后抽滤，得到的固体为1-R基-2,3,3-三甲基-3H-苯并[e]吲哚溴化铵盐；优选的，所述第一溶剂为苯类溶剂，第一预定温度为90～110℃(如105℃)，第一预定时间为18～25h(如20h)。

0℃下将三氯氧磷与4-叔丁基环己酮加入到第二溶剂中，在第二预定温度下搅拌反应第二预定时间后，将反应液倾入冰水中，反应产物迅速在冰水中结晶，依次经抽滤和干燥后，得到2-氯-3-羟基亚甲基-环已烯-1-烯甲醛；优选的，所述第二溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和无水四氢呋喃(THF)组成的混合溶剂，第二预定温度为60～80℃(如80℃)，第二预定时间为3～5h(如3h)。

将所述1-R基-2,3,3-三甲基-3H-苯并[e]吲哚溴化铵盐和2-氯-3-羟基亚甲基-环已烯-1-烯甲醛溶解于第三溶剂中，加入无水吡啶或无水三乙胺(作为有机碱性溶剂)，惰性气体(如氮气)保护条件下于第三预定温度搅拌反应第三预定时间，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到花菁染料IR-823；优选的，所述第三溶剂为醇类溶剂，第三预定温度为40～60℃(如40℃)，第三预定时间为25～30h(如25h)。

(2)半花菁染料LET-CyOH的制备：

将花菁染料IR-823与间二苯酚混溶于第四溶剂中，加入无水吡啶或无水三乙胺(作为有机碱性溶剂)，惰性气体(如氮气)保护条件下于第四预定温度搅拌反应第四预定时间，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到半花菁染料LET-CyOH；优选的，所述第四溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，第四预定温度为90～105℃(如105℃)，第四预定时间为30～60min(如40min)。

(3)分子探针LET-CyP的制备：

将半花菁染料LET-CyOH与三氯氧磷混溶于第五溶剂中，常温搅拌反应第五预定时间，将反应液倾入大量冰水中搅拌10～12h，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到分子探针LET-CyP；优选的，所述第五溶剂为无水吡啶，第五预定时间为3～5h(如4h)。

其中，花菁染料IR-823、半花菁染料LET-CyOH和分子探针LET-CyP的结构式如下所示：

本发明实施例首先合成新型花菁染料IR-823，在花菁染料IR-823的基础上进一步合成半花菁染料LET-CyOH。基于荧光信号和光声信号显著的半花菁染料LET-CyOH合成荧光信号和光声信号不显著的分子探针LET-CyP。其中，所述花菁染料IR-823的紫外-可见吸收峰位于823nm处，是一种理想的近红外母体结构。所述LET-CyOH具有显著的荧光信号和光声信号，而LET-CyP的荧光信号和光声信号非常微弱。

天蓝色分子探针LET-CyP与ALP特异性响应后，被还原为湖蓝色的半花菁染料LET-CyOH，溶液颜色发生明显变化，并实现荧光信号和光声信号的同步开启与放大，实现双模态同步成像。该分子探针LET-CyP不仅可以检测外源性ALP，也可检测内源性ALP，并且对ALP的响应具有高效性和专一性，可有效排除生物体内其他内源性蛋白质的干扰；同时分子探针LET-CyP与ALP作用条件比较温和，符合生物体生理环境。另外，本发明实施例所提供的分子探针LET-CyP的合成方法简单，操作方便，不需要复杂昂贵的设备，易于实现工业化生产。

本发明实施例还提供一种如上所述的双模态成像分子探针的应用，其中，将所述分子探针LET-CyP用于检测碱性磷酸酶(ALP)。本实施例该探针可同时应用于生物体内ALP的荧光和光声成像。所述的分子探针LET-CyP是首例能够同时实现活体内荧光和光声成像的碱性磷脂酶探针，具有检测机理简单、灵敏度高、特异性强和深度组织穿透的优点，在生物样品检测、化学染料及有机光敏剂等领域具有广阔的应用前景。

在一种优选的实施方式中，当所述分子探针LET-CyP用于检测内源性ALP时，采用的动物模型为荷瘤裸鼠，肿瘤细胞为HeLa细胞。瘤内注射LET-CyP后，该探针对瘤内表达的ALP具有良好的响应性，同时实现肿瘤内荧光成像和光声成像信号的显著增强。

本实施例中，LET-CyP的荧光成像信号随着溶液中ALP浓度的增加而明显增强，且发射波长在725nm处(激发波长为685nm)。当探针浓度为10μM时，荧光强度与溶液中ALP的浓度在0～0.6U范围内具有良好的线性关系。

本实施例中，LET-CyP在710nm处的光声成像信号随着溶液中ALP浓度的增加而明显增强。当探针浓度为50μM时，光声强度与溶液中ALP的浓度在0～2.0U范围内具有良好的线性关系。

下面通过实施例对本发明进一步说明。

实施例1

如图1所示，将5g 1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和6.24g溴化苄在15mL甲苯中105℃反应20h后得到5.74g红褐色固体产物1，产率为80％。

0℃下向反应容器中滴加2mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1mL无水四氢呋喃(THF)、三氯氧磷(1.6mL，17.2mmol)和4-叔丁基环己酮(1g，10.2mmol)。80℃反应3h后，将得到的反应液倾入50mL冰水中，反应产物迅速在冰水中结晶，经抽滤和干燥得到550mg黄褐色固体产物2，产率31.3％。

将500mg固体产物1和120mg固体产物2在15mL无水乙醇中40℃反应25h，减压旋转蒸发除掉溶剂后，使用二氯甲烷/甲醇体积比为30:1作为洗脱剂，硅胶层析柱纯化得到180mg绿色固体粉末产物IR-823，产率29.0％。

将150mg IR-823和180mg间二苯酚在15mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中105℃反应40min，减压旋转蒸发除掉溶剂后，使用二氯甲烷/甲醇体积比为15:1作为洗脱剂，经硅胶层析柱纯化得到74mg蓝绿色固体粉末产物LET-CyOH，产率为22.3％。

将70mg LET-CyOH与三氯氧磷(40μL，0.4mmol)于10mL无水吡啶中常温搅拌反应4h，将反应液倾入200mL冰水中搅拌过夜，减压旋转蒸发除掉溶剂后，使用二氯甲烷/甲醇为5:1作为洗脱剂，经硅胶层析柱纯化得到53mg深蓝色黏性油状产物LET-CyP，产率为40.1％。

如图2所示，LET-CyP与ALP特异性反应后生成LET-CyOH，从而实现荧光成像信号和光声成像信号的同步开启。

如图3所示，将本实施例制备得到的LET-CyP溶于甲醇中，得到ESI-MS质谱图，测得其质荷比为590。

如图4所示，将本实施例制备得到的5mg LET-CyP溶于600μL氘代甲醇中，得到核磁共振氢谱图。

如图5所示，将本实施例制备得到的7mg LET-CyP溶于600μL氘代甲醇中，得到核磁共振碳谱图。

实施例2

如图6中(1)和(2)所示，将实施例1制备得到的LET-CyP分散在混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1)中，配成10μM的LET-CyP溶液。取两组LET-CyP溶液，第一组不做任何处理，第二组与0.6U/mL ALP于37℃孵育30min，分别测量两组LET-CyP溶液的吸光度和荧光强度。

如图6中(3)所示，将LET-CyP分散在混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1)中，配成50μM的LET-CyP溶液。取两组LET-CyP溶液，第一组不做任何处理，第二组与2.0U/mL ALP于37℃孵育60min，分别测量两组LET-CyP溶液的光声强度，并拍摄记录反应前后溶液的颜色变化情况。

实施例3

如图7中(1)和(2)所示，将LET-CyP分散在混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1)中，配成10μM的LET-CyP溶液。逐量滴加0.05U/mL ALP，每次滴加后于37℃孵育2min，分别测量与0.00，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50，0.55和0.60U/mL ALP反应后的荧光强度，并将荧光强度与ALP浓度进行线性拟合，证明二者具有良好的线性关系。

如图7中(3)和(4)所示，将LET-CyP分散在混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1)中，配成10μM的LET-CyP溶液。取十五组LET-CyP溶液，第一组不做任何处理，其余十四组分别与0.6U/mL酯酶、过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶、凝血酶、半乳糖苷酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶、抗生物素蛋白、溶菌酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶及0.6mg/mL牛血清蛋白于37℃孵育30min，分别测量十五组溶液的荧光强度，并将荧光强度进行量化，证明LET-CyP对ALP具有特异选择性。

实施例4

如图8中(1)和(2)所示，将LET-CyP分散在混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1)中，配成50μM的LET-CyP溶液。逐量滴加0.5U/mLALP，每次滴加后于37℃孵育15min，分别测量与0.0，0.5，1.0，1.5，2.0U/mL ALP反应后的光声强度，并将光声强度与ALP浓度进行线性拟合，证明二者具有良好的线性关系。

如图8中(3)和(4)所示，将LET-CyP分散在混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1)中，配成50μM的LET-CyP溶液。取十五组LET-CyP溶液，第一组不做任何处理，其余十四组分别与2.0U/mL酯酶、过氧化氢酶、乙酰胆碱酯酶、凝血酶、半乳糖苷酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶、抗生物素蛋白、溶菌酶、葡萄糖脱氢酶、磷酸二酯酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶及2.0mg/mL牛血清蛋白于37℃孵育60min，分别测量十五组溶液的光声强度，并将光声强度进行量化，证明LET-CyP对ALP具有特异选择性。

实施例5

如图9中(1)所示，将LET-CyP分散在细胞培养液DMEM(dulbecco'smodified eaglemedium)中，配成10μM的溶液；将ALP抑制剂-正矾酸钠(Na₃VO₄)分散在细胞培养液DMEM中，配成2mM的溶液。取三组HeLa细胞，第一组不做任何处理，第二组与LET-CyP溶液孵育1h，第三组先与Na₃VO₄孵育30min，再与LET-CyP孵育1h。将三组细胞制片后进行激光扫描共聚焦荧光显微镜成像。

如图9中(2)所示，将LET-CyP分散在细胞培养液DMEM中，配成50μM的溶液；将Na₃VO₄分散在细胞培养液DMEM中，配成2mM的溶液。取三组HeLa细胞，第一组不做任何处理，第二组与LET-CyP孵育1h，第三组先与Na₃VO₄孵育30min，再与LET-CyP孵育1h。对三组细胞进行离心，将离心下来的细胞进行光声成像。

实施例6

如图10中(1)和(2)所示，将LET-CyP分散在混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1)中，配成500μM的LET-CyP溶液。取两组荷瘤裸鼠，第一组瘤内注射50μL生理盐水，第二组瘤内注射50μL LET-CyP溶液，分别拍摄0，1，5，10，15，20，30，40min时裸鼠肿瘤的荧光图，并记录荧光强度。

如图10中(3)和(4)所示，将LET-CyP分散在混合溶剂(Tris-HCl/MeOH＝9:1)中，配成500μM的LET-CyP溶液。取两组荷瘤裸鼠，第一组瘤内注射50μL生理盐水，第二组瘤内注射50μL LET-CyP溶液，分别拍摄0，1，5，10，15，20，30，40min时裸鼠肿瘤的光声图，并记录光声强度。

综上所述，本发明提供的双模态成像分子探针及其制备方法与应用，通过制备新型花菁染料IR-823进而制得半花菁染料LET-CyOH，半花菁染料LET-CyOH进一步反应制得分子探针LET-CyP，该探针可同时应用于生物体内碱性磷酸酶的荧光和光声成像。本发明所述的分子探针LET-CyP是首例能够同时实现活体内荧光和光声成像的碱性磷脂酶探针，具有灵敏度高、特异性强和深度组织穿透的优点，在生物样品检测、化学染料及有机光敏剂等领域具有广阔的应用前景。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种双模态成像分子探针，其特征在于，所示分子探针为分子探针LET-CyP，所示分子探针LET-CyP的结构式如下所示：

。

2.一种权利要求1所述的双模态成像分子探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：

（1）花菁染料IR-823的制备：

将1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚和溴化苄于第一溶剂中混溶，在第一预定温度下反应第一预定时间后，将得到的反应液经洗涤后抽滤，得到的固体为1-R基-2,3,3-三甲基-3H-苯并[e]吲哚溴化铵盐；

0 ℃下将三氯氧磷与4-叔丁基环己酮加入到第二溶剂中，在第二预定温度下搅拌反应第二预定时间后，将反应液倾入冰水中，反应产物迅速在冰水中结晶，依次经抽滤和干燥后，得到2-氯-3-羟基亚甲基-环已烯-1-烯甲醛；

将所述1-R基-2,3,3-三甲基-3H-苯并[e]吲哚溴化铵盐和2-氯-3-羟基亚甲基-环已烯-1-烯甲醛溶解于第三溶剂中，加入无水吡啶或无水三乙胺，惰性气体保护条件下于第三预定温度搅拌反应第三预定时间，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到花菁染料IR-823；

（2）半花菁染料LET-CyOH的制备：

将花菁染料IR-823与间二苯酚混溶于第四溶剂中，加入无水吡啶或无水三乙胺，惰性气体保护条件下于第四预定温度搅拌反应第四预定时间，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到半花菁染料LET-CyOH；

（3）分子探针LET-CyP的制备：

将半花菁染料LET-CyOH与三氯氧磷混溶于第五溶剂中，常温搅拌反应第五预定时间，将反应液倾入大量冰水中搅拌10~12 h，减压旋转蒸发除掉溶剂，经硅胶层析柱纯化得到分子探针LET-CyP；

其中，所述花菁染料IR-823、半花菁染料LET-CyOH和分子探针LET-CyP的结构式如下所示：

。

3.根据权利要求2所述的双模态成像分子探针的制备方法，其特征在于，所述第一溶剂为苯类溶剂，第一预定温度为90~110 ℃，第一预定时间为18~25 h。

4.根据权利要求2所述的双模态成像分子探针的制备方法，其特征在于，所述第二溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺和无水四氢呋喃组成的混合溶剂，第二预定温度为60~80 ℃，第二预定时间为3~5 h。

5.根据权利要求2所述的双模态成像分子探针的制备方法，其特征在于，所述第三溶剂为醇类溶剂，第三预定温度为40~60 ℃，第三预定时间为25~30 h。

6.根据权利要求2所述的双模态成像分子探针的制备方法，其特征在于，所述第四溶剂为无水N,N-二甲基甲酰胺，第四预定温度为90~105 ℃，第四预定时间为30~60 min。

7.根据权利要求2所述的双模态成像分子探针的制备方法，其特征在于，所述第五溶剂为无水吡啶，第五预定时间为3~5 h。

8.一种权利要求1所述的双模态成像分子探针的非疾病诊断目的的应用，其特征在于，将所述分子探针LET-CyP用于检测碱性磷酸酶。

9.根据权利要求8所述的双模态成像分子探针的非疾病诊断目的的应用，其特征在于，当所述分子探针LET-CyP用于检测内源性碱性磷酸酶时，采用的动物模型为荷瘤裸鼠，肿瘤细胞为HeLa细胞。

10.根据权利要求8所述的双模态成像分子探针的非疾病诊断目的的应用，其特征在于，将分子探针LET-CyP分散于Tris-HCl与MeOH的混合溶剂中，配制成LET-CyP溶液，再将所述LET-CyP溶液与碱性磷酸酶进行作用。

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