CN114436995A - 吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种吗啉‑茚酮‑查尔酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用，其中吗啉‑茚酮‑查尔酮衍生物的化学结构式如下：
Figure 247830DEST_PATH_IMAGE002
；制备方法为：将5‑羟基‑1‑茚酮、4‑(4‑吗啉)苯甲醛和氢氧化钠溶解于有机溶剂中回流搅拌反应，盐酸酸化至pH＝6，处理后得中间体5‑羟基‑2‑（4‑吗啉苄基亚基）‑2，3‑二氢‑1H‑茚酮；将其与乙酸酐、三乙胺溶解于有机溶剂中；在室温下搅拌反应得吗啉‑茚酮‑查尔酮衍生物荧光探针。本发明的吗啉‑茚酮‑查尔酮衍生物荧光探针在95%水相（含5%二甲基亚砜，v/v）条件下能够选择性的与羧酸酯酶（CEs）作用，绿色荧光显著增强，特别是作为CEs荧光探针在细胞溶酶体荧光成像中的应用。

Description

吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于有机合成领域，具体涉及吗啉-茚酮-查尔酮衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
羧酸酯酶(CEs)是丝氨酸水解酶中的一种，广泛分布于自然界中，尤其在哺乳动物肝脏中常见。它是催化酯类化合物水解生成醇和羧酸的一类酶，同时还能催化酰胺类、氨基甲酸酯类以及硫酯类化合物的水解代谢。因而在一些外源性药物的代谢活化与清除、内源性脂质的代谢水解过程中起到十分重要的作用。而且，CEs的异常调节或缺乏与人类疾病密切相关，例如肥胖，动脉粥样硬化，肝脂肪变性，沃尔曼病，高脂血症，胰岛素敏感性低下甚至是肝细胞癌。溶酶体被称为真核细胞的消化器官，并参与各种细胞代谢调节过程，如酶降解和细胞凋亡。值得注意的是，溶酶体内部的酸性pH范围为4.5-5.5，对于消化酶降解各种细胞成分是非常理想的。早期研究表明，CEs集中在肝脏的溶酶体部分。因此，开发一种快速灵敏的方法来精确监测生物体内的CEs水平对于各种生物化学研究以及治疗药物的评估非常重要。
因其操作简单、灵敏度高、特异性强、检测时间短、无损性和实时监测的可能性，荧光探针方法已被广泛认为是一种有吸引力的生物成像工具。但目前已有的CEs荧光探针大多数都存在水溶性差、响应时间长、灵敏度低和斯托克斯位移小的问题，不利于CEs的实际检测。并且，目前只有少数CEs探针提供溶酶体靶向功能。因此，在亚细胞器溶酶体领域研究CEs探针的成像是极具挑战性。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明考虑到查尓酮衍生物和茚酮衍生物优异的光化学和光物理特性，设计一种含茚酮结构的查尓酮衍生物，并引进吗啉基团增加水溶性，合成了一种高灵敏度、高选择性的CEs荧光探针。该探针能应用于95％水体系中CEs的测定，具有溶酶体靶向功能，并能应用于溶酶体内CEs活度的检测。
本发明的主要目的在于提供一种可用于95％水体系针对CEs的灵敏度高、选择性好的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针；另一目的是提供该荧光探针的制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针，所述吗啉-茚酮-查尔酮衍生物具有如下结构式：
Figure BDA0003520475660000021
本发明还提供了一种吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法，具体制备方法如下：
S1：将5-羟基-1-茚酮、4-(4-吗啉)苯甲醛和氢氧化钠溶解于有机溶剂A中；
S2：将S1所得混合物在50℃下回流搅拌反应5h；
S3：将S2所得溶液冷却至室温，并用盐酸酸化至pH＝6，减压旋蒸，所得固体残渣用乙醇重结晶，得到的产物减压抽滤、干燥得中间体5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮；
S4：将S3所得固体中间体5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮与乙酸酐、三乙胺溶解于有机溶剂B中；
S5：将S4所得混合物在室温下搅拌反应5h；
S6：将S5所得溶液减压旋蒸，所得油状物用乙醇重结晶，得到的产物减压抽滤、干燥，得到所述吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针。
更进一步地，所述步骤S1中的有机溶剂A为无水乙醇；所述步骤S4中的有机溶剂B为二氯甲烷。
更进一步地，所述步骤S1中加入的5-羟基-1-茚酮、4-(4-吗啉)苯甲醛和氢氧化钠的摩尔比为1:1:3。
更进一步地，所述步骤S2中的回流搅拌反应的时间为5h；所述步骤S5中的搅拌反应的时间为5h。
更进一步地，所述步骤S4中，中间体5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮、乙酸酐和三乙胺的摩尔比为1:1.2:3。
本发明吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针典型的制备方法如下：
向5-羟基-1-茚酮(2mmol，0.296g)的无水乙醇(10mL)溶液中加入4-(4-吗啉)苯甲醛(2mmol，0.382g)和氢氧化钠(3mmol，0.12g)；再将混合物在50℃下搅拌5h。反应完成后，将溶液冷却至室温，并用盐酸酸化至pH＝6，减压旋蒸，所得固体残渣用乙醇重结晶，减压抽滤、干燥得中间体5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮。再将(E)-5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮(0.14mmol，0.0458g)、乙酸酐(0.17mmol，16μL，)和三乙胺(0.42mmol，58μL)溶解在二氯甲烷中，并将所得溶液在室温下搅拌5h。最后，蒸发溶剂，乙醇重结晶，得到所述吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针。
本发明还提供了上述一种吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的一种用途，即在作为CEs荧光探针方面的应用，特别是在作为检测C6活细胞溶酶体内CEs的荧光探针中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明通过缩合反应制备吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针，原料易得，合成和后处理方法简单。在多种常见离子、酶及氨基酸等分析物中，对CEs表现出较高的荧光识别性能。探针工作环境中仅需要少量有机溶剂助溶，可以应用于生物体系，具有广泛的潜在应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的1H NMR谱图；
图2为本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的13C NMR谱图；
图3为本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的质谱谱图；
图4为本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针(1×10-5mol/L)的PBS/DMSO(95/5，v/v，10mM，pH＝7.4)溶液中分别加入2×10-4mol/L酶类分析物(CEs、乙酰胆碱酯酶、胆固醇酯酶、乳蛋白酶、透明质酸酶、脂肪酶、溶菌酶和多酚氧化酶)，氨基酸(Ala、Arg、Asp、Cys、Hcy、Leu和Ser),氧化还原活性物质(C6H12O6、GSH、HClO、H2O2和Vc)和其他离子(Al3+、Ca2+、Fe3+、Mg2+、CO3 2-、HCO3 -、OAc-和SO4 2-)的荧光光谱图(激发波长为400nm)；
图5为本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针(1×10-5mol/L)的PBS/DMSO(95/5，v/v，10mM，pH＝7.4)分别加入上述各类分析物的555nm处荧光强度比值柱状图；
图6为本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针(1×10-5mol/L)的PBS/DMSO(95/5，v/v，10mM，pH＝7.4)滴定不同浓度CEs的荧光光谱图，插图表示555nm处荧光强度比值随羧酸酯酶浓度的线性变化趋势图(激发波长为400nm)；
图7为在C6细胞中，吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针与内源性的CEs的荧光成像图；C6细胞用1×10-5mol/L荧光探针培育30min后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像；C6细胞先用100μM的CEs抑制剂BNPP处理30min后，洗涤，再与1×10- 5mol/L荧光探针培育30min后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像；
其中：a为荧光探针绿色通道荧光成像图；b为荧光探针亮场图；c为荧光探针绿色通道和亮场叠加后的图；d为荧光探针+BNPP后绿色通道荧光成像图；e为荧光探针+BNPP后亮场图；f为荧光探针+BNPP后绿色通道和亮场的叠加后的图。比例尺＝50μm。
图8为在C6细胞中，吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针与商用溶酶体定位染料LysoTracker Red共染荧光成像图；C6细胞用1×10-5mol/L荧光探针和LysoTracker Red共同培育30min后，使用Olympus FV500-IX70激光共聚焦显微镜进行荧光成像。
其中：a为红色通道荧光成像图；b为绿色通道荧光成像图；c为红色通道和绿色通道叠加后的图片；d为红色通道和绿色通道强度相关图；e为亮场图；f为红色通道、绿色通道和亮场的叠加图；g为贯穿单个C6细胞区域红色通道和绿色通道强度的分布叠加图。比例尺＝50μm。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明，但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。本发明实施例采用的试剂和原料为常规市场购买得到。
实施例1
本实施例吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法如下：
向5-羟基-1-茚酮(2mmol，0.296g)的无水乙醇(10mL)溶液中加入4-(4-吗啉)苯甲醛(2mmol，0.382g)和氢氧化钠(3mmol，0.12g)；再将混合物在50℃下搅拌5h。反应完成后，将溶液冷却至室温，并用盐酸酸化至pH＝6，减压旋蒸，所得固体残渣用乙醇重结晶，减压抽滤、干燥得中间体5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮。再将5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮(0.14mmol，0.0458g)、乙酸酐(0.17mmol，16μL，)和三乙胺(0.42mmol，58μL)溶解在二氯甲烷中，并将所得溶液在室温下搅拌5h。最后，蒸发溶剂，乙醇重结晶，得到所述吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针。目标产物的产率为78％。
采用核磁共振仪和高分辨质谱仪对制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物进行核磁共振分析和质谱分析，结果如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm):7.81(d,J＝7.6Hz,1H),7.67(d,J＝7.2Hz,2H),7.46(d,J＝11.5Hz,2H),7.24(d,J＝7.3Hz,1H),7.06(d,J＝7.3Hz,2H),4.08(s,2H),3.76(s,4H),3.55-3.17(m,8H),2.34(s,3H).具体核磁共振氢图谱见图1；
13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ(ppm):192.34,169.42,155.65,152.35,151.94,135.88,133.93,132.97,131.44,125.30,125.12,122.33,120.25,114.77,66.37,47.57,32.51,21.43.具体核磁共振碳图谱见图2；
质谱ESI-MS:m/z＝364.1628for[M+H]+。具体质谱谱图见图3。
实施例2
吗啉-茚酮-查尔酮衍生物对CEs的光学性质测定
将上述实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物作为荧光探针在PBS/DMSO(95/5，v/v，10mM，pH＝7.4)中配制成摩尔浓度为1×10-5mol/L的溶液，分别加入2×10-4mol/L酶类分析物(CEs、乙酰胆碱酯酶、胆固醇酯酶、乳蛋白酶、透明质酸酶、脂肪酶、溶菌酶和多酚氧化酶)，氨基酸(Ala、Arg、Asp、Cys、Hcy、Leu和Ser),氧化还原活性物质(C6H12O6、GSH、HClO、H2O2和Vc)和其他离子(Al3+、Ca2+、Fe3+、Mg2+、CO3 2-、HCO3 -、OAc-和SO4 2-)，采用紫外可见分光光度计或荧光光谱仪进行分析(激发波长为400nm)，所得荧光光谱图见图4和图5。通过图4和图5可以看出，本发明制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物作为探针只对CEs具有明显响应，荧光信号可用于CEs的快速鉴别，而其它分析物无变化。
通过图6的滴定光谱计算可以得到CEs检出限为1.3×10-4U/mL.，荧光光谱的线性检测范围分别为1.25×10-3-6×10-3U/mL，因此本发明制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物可用于CEs的荧光定量检测。
实施例3
吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针在细胞内CEs的检测实验
C6细胞用1×10-5mol/L的上述实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针在37℃下培育30min，或用1×10-4mol/L CEs抑制剂双(4-硝基苯基)磷酸酯(BNPP)孵化30min后再用1×10-5mol/L的上述实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针在37℃下培育30min，获得在C6细胞的荧光成像图。具体如图7所示，其中：a为荧光探针绿色通道荧光成像图；b为荧光探针亮场图；c为荧光探针绿色通道和亮场叠加后的图；d为荧光探针+BNPP后绿色通道荧光成像图；e为荧光探针+BNPP后亮场图；f为荧光探针+BNPP后绿色通道和亮场的叠加后的图。C6细胞中加入吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针后探针绿色通道荧光强；而先用100μM CEs抑制剂BNPP处理过C6细胞后再与吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针孵育后，绿色通道荧光明显减弱。故本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物可用于细胞内源性CEs的荧光检测。
C6细胞用1×10-5mol/L的上述实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针和商用溶酶体定位染料LysoTracker Red在37℃下共同培育30分钟，获得在C6细胞的荧光成像图，具体如图8所示，其中：a为红色通道荧光成像图；b为绿色通道荧光成像图；c为红色通道和绿色通道叠加后的图片；d为红色通道和绿色通道强度相关图；e为亮场图；f为红色通道、绿色通道和亮场的叠加图；g为贯穿单个C6细胞区域红色通道和绿色通道强度的分布叠加图。从图8g可以看出，C6细胞中探针绿色通道荧光和LysoTracker Red红色通道荧光基本吻合，重叠系数为0.80。故本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针可以靶向细胞溶酶体，说明本发明实施例1制得的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针可以用于细胞溶酶体CEs活性的荧光检测。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，其保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内，本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.一种吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针，其特征在于，所述吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针具有如下结构式：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将5-羟基-1-茚酮、4-(4-吗啉)苯甲醛和氢氧化钠溶解于有机溶剂A中；
S2：将S1所得混合物进行回流搅拌反应；
S3：将S2回流搅拌反应所得溶液冷却至室温，并用盐酸酸化至pH＝6，减压旋蒸，所得固体残渣用乙醇重结晶，得到的产物减压抽滤、干燥，得中间体5-羟基-2-（4-吗啉苄基亚基）-2，3-二氢-1H-茚酮；
S4：将S3所得中间体5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮与乙酸酐、三乙胺溶解于有机溶剂B中；
S5：将S4所得混合物在室温下搅拌反应；
S6：将S5搅拌反应后所得溶液减压旋蒸，所得油状物用乙醇重结晶，得到的产物减压抽滤、干燥，得到吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针。
3.根据权利要求2所述的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S1中的有机溶剂A为无水乙醇；所述步骤S4中的有机溶剂B为二氯甲烷。
4.根据权利要求2所述的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S1中5-羟基-1-茚酮、4-(4-吗啉)苯甲醛和氢氧化钠的摩尔比为1:1:3。
5.根据权利要求2所述的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S2中的回流搅拌反应的温度为50℃，时间为5h。
6.根据权利要求2所述的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S4中，中间体5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮、乙酸酐和三乙胺的摩尔比为1:1.2:3。
7.根据权利要求2所述的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S5中搅拌反应的时间为5h。
8.根据权利要求2所述的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针的制备方法，其特征在于步骤如下：向含有2mmol 5-羟基-1-茚酮的无水乙醇溶液中加入2mmol 4-(4-吗啉)苯甲醛和3mmol氢氧化钠；再将混合物在50℃下搅拌5h；反应完成后，将溶液冷却至室温，并用盐酸酸化至pH＝6，减压旋蒸，所得固体残渣用乙醇重结晶，减压抽滤、干燥得中间体5-羟基-2-（4-吗啉苄基亚基）-2，3-二氢-1H-茚酮；再将0.14mmol 5-羟基-2-(4-吗啉苄基亚基)-2，3-二氢-1H-茚酮、0.17mmol乙酸酐和0.42mmol三乙胺溶解在二氯甲烷中，并将所得溶液在室温下搅拌5h；最后，蒸发溶剂，乙醇重结晶，得到吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针。
9.根据权利要求1所述的吗啉-茚酮-查尔酮衍生物荧光探针作为羧酸酯酶荧光探针在细胞溶酶体荧光成像中的应用。
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