CN105968114B - 一种腔肠素类似物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种腔肠素类似物及其制备方法与应用，具有结构通式(I)，式中，R1，R2，R3均为不同的取代基。该类化合物作为生物发光底物的应用，能利用生物发光检测腔肠素萤光素酶的存在和数量(包括酶水平、细胞水平和动物水平)，检测萤光素酶在体外，细胞和体内分布成像的应用；能够在萤光素酶的存在下作为报告信号检测药物在酶水平、细胞水平、动物水平的药理作用和毒性作用。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，特别涉及一类腔肠素类似物及其制备方法与应用。
背景技术
生物发光(bioluminescence)广泛存在于自然界，是指生物体内，基于生命活动的化学反应将化学能转换成光能的发光现象。生物体提取物在体外构建模型中亦会有发光的现象。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，化学能转变为光能的效率几乎为100％。不同的生物发光系统的萤光素和萤光素酶也有所不同，但是其生物发光的机理大致相同：萤光素经萤光素酶催化氧化，生成处于激发态的电子中间体，电子由激发态返回基态时释放出光子，将化学能转变为光能。
生物发光成像(Bioluminescent imaging，BLI)是通过灵敏的光学检测仪器监控萤光素酶标记的细胞或基因在活体生物内的活动和行为过程的一种新兴的成像技术。生物发光成像技术已经逐步地应用到微生物学、生物化学、环境科学、分子生物学、医学等多个学科和领域，成为了一种重要的成像手段。该技术具有操作简便快速、灵敏度高、能够实现实时动态观测以及非侵袭性等优点。生物发光技术尤其在肿瘤生长监测和转移示踪、目标基因表达的检测、蛋白-蛋白相互作用、药物高通量筛选、细胞内ATP水平探测和研究细菌病毒感染宿主过程等领域有着显著的技术优势。随着对生物发光研究的不断深入，越来越多的萤光素酶被分离提纯，其编码基因也被克隆表达，如萤火虫萤光素酶、叩头虫萤光素酶、海肾萤光素酶、腰鞭毛虫萤光素酶和细菌萤光素酶等，一部分相关的萤光素或活性物质也完成了分子结构。但是只有部分生物发光体系适用于作为成像研究的工具。[O.Shimomura,Bioluminescence:Chemical Principles and Methods,World Scientific PublishingCo.Pte.Ltd,2006.]
腔肠素(coelenterazine)及以其作为底物的萤光素酶组成的体系是一类常见的生物发光系统。研究最为透彻的是来源于海肾的萤光素酶(Renilla luciferase)系统。萤光素酶在分子氧存在的条件下，氧化底物腔肠素，产生高能量的中间物质，并且在此过程中释放CO2和发射蓝色光[C.Wu,H.Nakamura,A.Murai,O.Shimomura,Chemi-andbioluminescence of coelenterazine analogues with a conjugated group at the C-8position,Tetrahedron Letters,42(2001)2997-3000.]，海肾萤光素酶氧化腔肠素发射的最大波长为480nm。腔肠素及其萤光素酶体系成分简单，并且腔肠素的疏水性使其容易通过细胞膜。因而，腔肠素/萤光素酶体系在细胞水平和体内的生物发光成像研究中具有一定的优势。除了天然腔肠素可以作为萤光素酶的底物之外，一些具有不同光谱学性质、稳定性等特征的腔肠素衍生物已经上市，例如腔肠素h(coelenterazine h)、腔肠素400a(coelenterazine 400a)，腔肠素f(coelenterazine f)，腔肠素cp(coelenterazinecp)，腔肠素fcp(coelenterazinefcp)，腔肠素hcp(coelenterazinehcp)，腔肠素ip(coelenterazineip)等。
研究证实，腔肠素及其衍生物的3’位置是生物发光酶促反应中的关键位点，同时也是自身降解的关键位置。腔肠素自身降解导致其稳定性较差。因而如果在腔肠素及其衍生物的3’位置引入修饰集团，使得该分子的化学结构稳定性提高，而修饰集团在特定条件下可自动降解从而释放出腔肠素，这不失为一种腔肠素类底物改造的策略。而这一策略已有相关文献报道[E.Lindberg,S.Mizukami,K.Ibata,A. Miyawaki,K.Kikuchi,Development of Luminescent Coelenterazine Derivatives Activatable byβ-Galactosidase for Monitoring Dual Gene Expression,Chemistry–A EuropeanJournal,19(2013)14970-14976.]。
总之，对腔肠素结构的改造可能会使其生物发光性质受到影响。通过结构改造，人们希望得到诸如生物发光波长红移、强度增强、持续时间增长、稳定性提高等特性的新型腔肠素类似物。腔肠素及其萤光素酶体系作为一组有前景的可视化生物成像系统，对于各类探针基于酶水平、细胞水平、动物水平的成像具有重大意义。腔肠素类似物以及具有新骨架的萤光素酶底物的发现能够拓展此类生物发光体系在成像领域的应用，推动基础生命活动过程的探索和揭示。
发明内容
针对以上问题，本发明在腔肠素400a(DeepBlueC)的基础上，对其2位、6位、8位、3位的取代基进行改造，得到生物发光强度提高或持续时间延长或生物发光波长红移或稳定性提高的腔肠素类似物。此类化合物可以作为腔肠素生物发光体系中的底物。其合成方法简单，经济适用，对于生物发光在体内的应用有着较大的推进作用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种腔肠素类似物，该类似物具有通式(I)的结构：
式中，R1为氢基，羟基；R2为4-氟苯基，3-氟-4-氨基苯基，4-羟甲基苯基，4-腈基苯基，5-甲基呋喃基，呋喃基-3，萘基，苯并呋喃基-2，呋喃基-2，噻吩基-2,或者此时R4为氢，4-氟，3-氟，2-氟，3-甲基，3-羟基；或者此时R5为1-羟基乙基，1-羟基丙基，1-氟-乙基；R3为苄基，1-苯基乙烯基。
上述的具有通式(Ⅰ)的结构的腔肠素类似物，包括下述的化合物，其名称如下：
2-(苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B1),
2-(苯基甲基)-6-(3-氟-4-氨基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B2)
2-(苯基甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B3)
2-(苯基甲基)-6-(4-腈基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B4)
2-(苯基甲基)-6-(5-甲基呋喃基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B5)
2-(苯基甲基)-6-(呋喃基-3)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B6)
2-(苯基甲基)-6-(3-乙氧基羰基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B7)
2-(苯基甲基)-6-(苯并呋喃基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B8)
2-(苯基甲基)-6-(呋喃基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B9)
2-(苯基甲基)-6-(萘基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B10)
2-(苯基甲基)-6-(噻吩基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B11)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B12),
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(3-氟-4-氨基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B13)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B14)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(4-腈基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B15)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(5-甲基呋喃基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B16)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(呋喃基-3)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B17)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(呋喃基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B18)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(噻吩基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B19)
2-(苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B20),
2-(苯基甲基)-6-(3-氟-4-氨基苯基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B21)
2-(苯基甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B22)
2-(苯基甲基)-6-(4-腈基苯基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B23)
2-(苯基甲基)-6-(5-甲基呋喃基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B24)
2-(苯基甲基)-6-(4-甲氧基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B25)
2-(苯基甲基)-6-(呋喃基-3)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B26)
2-(苯基甲基)-6-(呋喃基-2)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B27)
2-(苯基甲基)-6-(苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A1)
2-(苯基甲基)-6-(4-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A2)
2-(苯基甲基)-6-(3-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A3)
2-(苯基甲基)-6-(2-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A4)
2-(苯基甲基)-6-(3-甲基-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A5)
2-(苯基甲基)-6-(3-羟基-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A6)
2-(苯基甲基)-6-(苯基炔基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A7)
2-(苯基甲基)-6-(4-氟-苯基炔基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A8)
2-(苯基甲基)-6-(3-氟-苯基炔基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A9)
2-(苯基甲基)-6-(2-氟-苯基炔基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A10)
2-(苯基甲基)-6-(3-甲基-苯基炔基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A11)
2-(苯基甲基)-6-(3-羟基-苯基炔基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A12)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A13)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(4-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A14)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(3-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A15)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(2-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A16)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(3-甲基-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A17)
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(3-羟基-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A18)
2-(苯基甲基)-6-[(1-羟基乙基)-1,2,3-三氮唑]-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T1)
2-(苯基甲基)-6-[(1-羟基丙基)-1,2,3-三氮唑]-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T2)
2-(苯基甲基)-6-[(1-氟-乙基)-1,2,3-三氮唑]-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T3)
2-(苯基甲基)-6-[(1-羟基乙基)-1,2,3-三氮唑]-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T4)
2-(苯基甲基)-6-[(1-羟基丙基)-1,2,3-三氮唑]-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T5)
2-(苯基甲基)-6-[(1-氟-乙基)-1,2,3-三氮唑]-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T6)
本发明的第二个方面，提供具有通式(Ⅰ)结构的腔肠素类似物的制备方法，当式(I)的化合物中R1为氢基，羟基；R2为4-氟苯基，3-氟-4-氨基苯基，4-羟甲基苯基，4-腈基苯基，5-甲基呋喃基，呋喃基-3，萘基，苯并呋喃基-2，呋喃基-2，噻吩基-2，或R3为苄基，1-苯基乙烯基时：
该腔肠类似物的制备方法包括以下步骤：
(1)中间体2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或者2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪的制备
首先将锌粉、碘和苄基卤素或者对羟基苄基卤素混合反应，然后将2-氨基-3,5二X吡嗪加入上述反应液中得到2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪；或者将2-氨基-3,5二X-吡嗪与钯催化剂混合，然后加入1-苯基乙烯基硼酸混合反应，得到2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪；
(2)中间体2-氨基-3苯基甲基-吡嗪类化合物或2-氨基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物的制备
将步骤(1)中的2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪与硼酸类化合物或苯乙炔类化合物混合反应得到中间体2-氨基-3苯基甲基-吡嗪类化合物或2-氨基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物；
(3)中间体3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮或者3-(4-羟基苯基)-1,1-二乙氧基丙酮的制备
将二乙氧基乙酸乙酯与苄基氯化镁或苄基溴化镁混合反应制备得到中间体3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮；或者将二乙氧基乙酸乙酯与4-(叔丁基二甲基硅氧基)苄基氯化镁或4-(叔丁基二甲基硅氧基)苄基溴化镁混合反应然后再与四丁基氟化铵混合反应制备得到中间体3-(4-羟基苯基)-1,1-二乙氧基丙酮；
(4)具有通式(Ⅰ)的结构的腔肠素类似物的制备
将步骤(2)中的中间体2-氨基-3苯基甲基-吡嗪类化合物或者2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪与步骤(3)中的中间体3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮或3-(4-羟基苯基)-1,1-二乙氧基丙酮混合反应，得到具有通式(Ⅰ)结构的腔肠素类似物；其中X表示卤素。
步骤(1)中，所述中间体2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪的结构通式(II)或者2-氨基-5-X-3-苯基乙 烯基-吡嗪(III)如下所示：
所述苄基卤素或对羟基苄基卤素的结构通式为式如(Ⅳ)所示：
式中，X为卤素，优选为溴苄和氯苄；
当所述中间体2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪的结构通式为(II)时；
优选的，2-氨基-3,5二X吡嗪包括2-氨基-3,5二溴吡嗪和2-氨基-3,5二氯吡嗪。
优选的，所述锌粉、苄基卤素或者对羟基苄基卤素和2-氨基-3,5二X吡嗪的摩尔比例为(1～2)：(1～2)：1。
步骤(1)具体的方法为：在氮气保护条件下，将锌粉和碘粒混合，加入DMF，室温搅拌直至碘的颜色消失，然后加入苄基卤素或对羟基苄基卤素，在70～85℃反应2～4小时，冷却至室温，加入2-氨基-3,5二X吡嗪和三苯基磷二氯化钯，室温反应22～26小时。
或者，当所述中间体2-氨基-5-X-3-苯基乙烯基-吡嗪的结构通式为(III)时；
优选的，2-氨基-3,5二X吡嗪包括2-氨基-3,5二溴吡嗪和2-氨基-3,5二氯吡嗪。
优选的，所述2-氨基-3,5二X-吡嗪与1-苯基乙烯基硼酸的摩尔比例为1：(1～2)。
步骤(1)具体的方法为：将2-氨基-3,5二X吡嗪，(C6H5CN)2PdCl2溶于甲苯中，然后加入1-苯基乙烯基硼酸的甲苯溶液，加入K2CO3溶液，100～115℃反应7～9h。
步骤(2)中，所述2-氨基-3苯基甲基-吡嗪类化合物或2-氨基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物的结构通式如(Ⅴ)所示：
式中，R2为4-氟苯基，3-氟-4-氨基苯基，4-羟甲基苯基，4-腈基苯基，5-甲基呋喃基，呋喃基-3， 萘基，苯并呋喃基-2，呋喃基-2，噻吩基-2，或者R3为苄基，1-苯基乙烯基。
所述硼酸类化合物的结构通式如(Ⅵ)或(Ⅶ)所示：
式中，R2为4-氟苯基，3-氟-4-氨基苯基，4-羟甲基苯基，4-腈基苯基，5-甲基呋喃基，呋喃基-3，萘基，苯并呋喃基-2，呋喃基-2，噻吩基-2。
优选的，所述2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或2-氨基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物与硼酸类化合物的摩尔比例为1：(1～4)。进一步优选的，所述2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或2-氨基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物与硼酸类化合物的摩尔比例1：(1:2)；所述2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或者2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪与苯乙炔类化合物的摩尔比例为1：(2～4)。
步骤(2)的具体方法为：在氮气保护条件下，将2-氨基-5-X-3-苄基-吡嗪或2-氨基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物，Pd(dppb)Cl2，(C6H5CN)2PdCl2溶于甲苯中，然后加入硼酸类化合物的甲苯溶液，加入K2CO3溶液，100～115℃反应7～9h。
当R2为时，式中，R4为氢，4-氟，3-氟，2-氟，3-甲基，3-羟基。
此时2-氨基-3苯基甲基-吡嗪类化合物或2-氨基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物的结构通式(V)的具体形式为：
所述苯乙炔类化合物的结构通式如(VIII)所示：
步骤(2)的具体方法为：将2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或者2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪、 三苯基膦二氯化鈀、碘化亚铜、三苯基膦溶于甲苯中，然后加入苯乙炔类化合物和三乙胺，30～50℃反应5～7小时。
步骤(3)中，优选的，所述二乙氧基乙酸乙酯与苄基氯化镁或苄基溴化镁的摩尔比例为1：(1～2)。
步骤(3)的具体方法为：在氮气保护条件下，二乙氧基乙酸乙酯溶于四氢呋喃中，待温度降至-70～-85℃时，加入苄基氯化镁，-70～-85℃反应2～4小时。
步骤(4)中，优选的，所述2-氨基-3苯基甲基-吡嗪类化合物与3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮的摩尔比例为1：(1～2)。
步骤(4)的具体方法为：在氮气保护下，将2-氨基-3苯基甲基-吡嗪类化合物和3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮溶解于乙醇中，70～90℃反应8～10小时。
当R2为时，式中，R5为1-羟基乙基，1-羟基丙基，1-氟-乙基。此时具有结构通式(I)的化合物制备方法步骤如下：
(1)中间体2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或者2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪的制备，与前述相同。
(2)中间体2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-苄基-吡嗪或2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪的制备
将步骤(1)中的2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪与三甲基硅基乙炔混合反应得到2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-苄基-吡嗪或2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪；
(3)中间体2-氨基-5-炔基-3-苄基-吡嗪或2-氨基-5-炔基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪的制备
将步骤(2)中的2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-苄基-吡嗪或2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪与碳酸钾混合反应，得到2-氨基-5-炔基-3-苄基-吡嗪或2-氨基-5-炔基-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪；
(4)中间体1-叠氮基烷烃化合物的制备
将卤化物和叠氮化盐(优选叠氮化钠或叠氮化钾)混合反应得到1--叠氮基烷烃化合物；
(5)中间体2-氨基-6-[1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪类化合物或2-氨基-6-[1,2,3]-三氮唑-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物的制备
将步骤(3)中的2-氨基-5-炔基-3-苄基-吡嗪或2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪与步骤(4)中的1--叠氮基烷烃化合物混合反应制备得到2-氨基-6-[1,2,3]-三氮唑-3-苄基-吡嗪类化合物或2-氨基-6-[1,2,3]-三氮唑-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物；
(6)中间体3-苯基-1,1-二乙氧基丙酮或者3-(4-羟基苯基)-1,1-二乙氧基丙酮的制备，与前述相同。
(7)具有通式(I)的结构的腔肠素类似物的制备
将步骤(5)中的2-氨基-6-[1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪类化合物或2-氨基-6-[1,2,3]-三氮唑-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物与步骤(6)中的3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮或者3-(4-羟基苯基)-1,1-二乙氧基 丙酮混合反应，制备得到具有通式(I)的结构的腔肠素类似物。
步骤(2)中，2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪与三甲基硅基乙炔的摩尔比例为1：(2～4)。
步骤(2)的具体方法为：在氮气保护下，将2-氨基-5-X-3-苯基甲基-吡嗪或2-氨基-5-X-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪、三苯基膦二氯化鈀、碘化亚铜、三苯基膦溶于甲苯中，然后加入三甲基硅基乙炔和三乙胺，30～50℃反应8～10小时。
步骤(3)中，所述2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-苄基-吡嗪与碳酸钾的摩尔比例为(1～2)：1。
步骤(3)的具体方法为：将2-氨基-5-三甲基硅基炔基-3-苄基-吡嗪或2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪和碳酸钾溶于甲醇中，室温反应1～3小时。
步骤(4)中，所述1-叠氮基烷烃化合物的结构通式如(IⅩ)所示：
式中，R5为1-羟基乙基，1-羟基丙基，1-氟-乙基。
所述卤化物的结构通式如(Ⅹ)所示：
式中，R5为1-羟基乙基，1-羟基丙基，1-氟-乙基；X为卤素。
优选的，所述卤化物和叠氮化盐的摩尔比例为1：(1～3)。
步骤(5)中，所述结构通式(V)的具体形式为2-氨基-6-[1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪类化合物，如下所示：
式中，R3为氢基，羟基；R5为1-羟基乙基，1-羟基丙基，1-氟-乙基。
优选的，所述2-氨基-5-炔基-3-苄基-吡嗪或2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪与1--叠氮基烷烃化合物的摩尔比例为1：(1～2)。
步骤(5)的具体方法为：在氮气保护条件下，将2-氨基-6-炔基-8-苄基-吡嗪或2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪、1--叠氮基烷烃化合物、五水硫酸铜、抗坏血酸钠溶于四氢呋喃和水混合溶液中，然后加入三乙胺，室温反应7～9小时。
步骤(7)中，所述2-氨基-6-[1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪类化合物或2-氨基-6-[1,2,3]-三氮唑-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物与3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮的摩尔比例为1：(1～3)。
步骤(7)的具体方法为：在氮气保护条件下，将2-氨基-6-[1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪类化合物或 2-氨基-6-[1,2,3]-三氮唑-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪类化合物和3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮溶于乙醇中，70～90℃反应7～9小时。
本发明的第三个方面，提供所述腔肠素类似物的应用，具体如下：
(1)本发明的化合物作为生物发光的底物应用。
(2)本发明的化合物能利用生物发光检测萤光素酶的存在和数量(包括酶水平、细胞水平和动物水平)，检测萤光素酶在体外，细胞和体内分布成像的应用，其中萤光素酶的种类包括海肾萤光素酶(Renilla luciferase)、Gaussia萤光素酶、Oplophorus萤光素酶和Aequorea萤光素酶。
(3)本发明的化合物在Aequorea luciferase存在条件下，用于检测Ca2+的存在和数量以及检测Ca2+在体外、细胞和体内分布成像的用途。
(4)本发明的化合物能够在萤光素酶的存在下作为报告信号检测药物在酶水平、细胞水平、动物水平的药理作用和毒性作用。
(5)本发明的化合物具有化学发光的性质，也可应用于化学发光领域。
本发明的有益效果：1.本发明的化合物均是腔肠素的类似物，扩大了腔肠素衍生物的范围，增加了腔肠素类似物的种类。2.本发明的部分化合物与现行通用的腔肠素类底物相比，在相同环境下具有发光强度更强或发光持续时间延长或波长红移等特点。3.本发明的部分化合物与现行通用的腔肠素类底物相比，化合物溶液对萤光素酶具有较低的检测限，在作为探针应用时拥有较高的灵敏性。4.本发明的部分化合物与腔肠素与现行通用的腔肠素类底物相比，稳定性有所提高。可适用于研究细胞水平的生命活动或体内药物代谢实时检测。5.本发明的化合物的合成方法简单，经济适用，对于生物发光在体内的应用有着较大的推进作用。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
反应1：反应试剂与条件:(a)锌粉，碘粒,DMF,80℃回流,3h；(b)(Ph3P)2PdCl2，DMF，室温搅拌10h；(c)Pd(dppb)Cl2,(C6H5CN)2PdCl2,K2CO3，甲苯回流，8h；(d)-78℃，四氢呋喃；(e)con.HCl，乙醇，80℃ 回流，8h。
【实例1：2-(苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B1)的制备】
中间体2-氨基-5-溴-3-苯基甲基-吡嗪(1-1)的制备
在氮气保护条件下，将锌粉(235mg，3.6mmol)和碘粒(12mg)混合，加入DMF，室温搅拌直至碘的颜色消失。然后加入苄溴(0.57mg，3mmol)，移至80℃回流搅拌约3小时。此反应液放凉至室温后，加入2-氨基-3,5二溴吡嗪(506mg，2mmol)和三苯基磷二氯化钯(70mg，0.1mmol)。室温反应24小时。反应液用硅藻土过滤，加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯相用饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥、过滤、200-300目硅胶柱层析纯化，即得中间体化合物1-1为黄色固体313mg，产率59％。 1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.65(s,1H),7.30～7.25(m,5H),6.56(s,1H),3.98(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 264.01,266.01,found 264.2,266.3。
中间体2-氨基-5-(4-氟苯基)-3-苯基甲基-吡嗪(2-1)的制备
在氮气保护条件下，将2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(500mg，1.89mmol)，Pd(dppb)Cl2(68mg，0.11mmol)，(C6H5CN)2PdCl2(43mg，0.11mmol)溶于甲苯6ml中，然后加入4-氟苯硼酸(397mg，2.84mmol)的甲苯溶液，加入K2CO3溶液(2M，0.6ml)，109℃回流反应8h。反应终止后，浓缩反应液，然后加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥、过滤、200-300目硅胶柱层析纯化，干燥后即得中间体化合物2-1为白色固体395mg，产率75％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.42(s,1H),7.97～7.93(m,2H),7.3～7.18(m,7H)6.48(s,2H),4.09(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 280.13,found280.1。
中间体3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮(3-1)的制备
在氮气保护条件下，二乙氧基乙酸乙酯(500mg，2.84mmol)溶于新制的四氢呋喃中。待温度降至-78℃时，加入苄基氯化镁(642mg，4.26mmol)。-78℃反应3小时。待反应液升至室温时，用保护氯化铵水溶液淬灭反应。旋蒸除去有机溶剂，加入乙酸乙酯萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析，得无色油状物380mg，产率60％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.31～7.16(m,6H),4.80(s,1H)3.87(s,2H),3.66～3.53(m,4H).ESI-MS:m/z[M+NH4]+calcd for 240.16,found 240.5。
2-(苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B1)的制备
在氮气保护下，将2-氨基-5-(4-氟苯基)-3-苄基-吡嗪(2-1)(100mg，0.35mmol)和3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮(3-1)(160mg，0.72mmol)溶解于3ml乙醇中。室温搅拌5分钟。0.2ml的浓盐酸溶解于2ml乙醇中，然后加入到上述反应液中。移至油浴80℃反应9小时。反应停止后待降至室温，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄白色固体44mg，产率30％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.58(s,1H),8.02～7.98(m,2H),7.40～7.39(m,2H),7.34～7.22(m,10H),4.55(s,2H),4.30(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ165.16,162.69,136.62,135.52,128.95,128.82,128.53,128.36,128.16,126.90,126.79,115.70,115.48,110.07,37.74,29.24.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 410.1669,found 410.1663。
【实例2：2-(苯基甲基)-6-(3-氟-4-氨基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B2)的制备】
中间体2-氨基-5-(4-氨基-3-氟-苯基)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(200mg，0.756mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(20mg，0.050mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(30mg，0.050mmol)溶解于8mL甲苯中，然后加入3-氟-4-氨基-苯硼酸频哪醇酯(240mg，1.058mmol)和碳酸钾水溶液(2M，0.6mL)。109℃回流搅拌10小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体133mg，产率60％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.31(s,1H),7.54～7.46(m,2H),7.34～7.26(m,4H),7.21～7.17(m,1H),6.80～6.75(t,J＝10Hz,2H),6.21(s,2H),5.26(s,2H),4.04(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 295.14,found 295.3。
2-(苯基甲基)-6-(3-氟-4-氨基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B2)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(3-氟-4-氨基-苯基)-3-苄基-吡嗪(100mg，0.339mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(113mg，0.509mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得深黄色固体60mg，产率42％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.97(s,1H),8.14～8.08(m,2H),7.69(t,J＝8Hz,1H),7.45～7.26(m,10H),4.62(s,2H),4.38(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ157.32,154.85,148.15,139.14,137.88,136.45,135.43,129.09,128.33,128.12,126.87,126.81,125.25,123.29,123.26,119.49,114.78,114.57,111.29,38.24,28.76.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcdfor425.1778,found 425.1777。
【实例3：2-(苯基甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B3)的制备】
中间体2-氨基-5(4-羟甲基苯基)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(100mg，0.378mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(10mg，0.026mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(20mg，0.033mmol)溶解于6mL甲苯中，然后加入4-羟甲基苯硼酸(85mg，0.559mmol)和碳酸钠水溶液(1M，0.4mL)。109℃回流搅拌10小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体70mg，产率64％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.41(s,1H),7.87(d,J＝8Hz,2H),7.35(d,J＝8Hz,4H),7.28(t,J＝8Hz,2H),7.21～7.17(t,J＝8Hz,1H),6.37(s,2H),5.19(t,J＝6Hz,1H),4.51(d,J＝8Hz,2H),4.08(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 292.15,found 292.4。
2-(苯基甲基)-6-(4-羟甲基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B3)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(4-羟甲基苯基)-3-苄基-吡嗪(63mg，0.216mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(96mg，0.432mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体29mg，产率32％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ7.65(s,1H),7.50～7.18(m,14H),4.67(s,2H),4.44(s,2H),4.20(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ147.40,143.52,139.81,136.76,132.53,129.13,128.96,128.72,128.51,128.39,128.26,127.49,127.17,127.12,126.94,126.73,125.25,125.19,110.18,63.23,37.42,29.58.ESI-HRMS:m/z[M+H+]calcd for 422.1869,found 422.1865。
【实例4：2-(苯基甲基)-6-(4-腈基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B4)的制备】
中间体2-氨基-5-(4-腈基苯基)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(100mg，0.378mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(10mg，0.026mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(20mg，0.033mmol)溶解于6mL甲苯中，然后加入4-腈基苯硼酸(150mg，0.529mmol)和碳酸钾水溶液(2M，0.4mL)。109℃回流搅拌10小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体58mg，产率54％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.45(s,1H),8.11(d,J＝8Hz,2H),7.76(d,J＝8Hz,2H),7.32～7.23(m,5H),4.16(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for287.13,found287.4。
2-(苯基甲基)-6-(4-腈基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B4)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(4-腈基苯基)-3-苄基-吡嗪(60mg，0.209mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(90mg，0.419mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得浅褐色固体34mg，产率39％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.88(s,1H),8.23(d,J＝8Hz,2H),7.86(d,J＝8Hz,2H),7.42～7.25(m,10H),4.58(s,2H),4.34(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ150.66,148.14,139.69,138.99,137.93,135.46,132.52,132.46,129.06,128.59,128.36,128.16,127.18,126.90,126.87,121.90,121.90,118.00,112.70,111.61,38.19,28.84.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcdfor417.1715,found 417.1717。
【实例5：2-(苯基甲基)-6-(5-甲基呋喃基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B5)的制备】
中间体2-氨基-5-(5-甲基呋喃基)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-6-溴-8-苄基-吡嗪(110mg，0.416mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(10mg，0.026mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(20mg，0.033mmol)溶解于6mL甲苯中，然后加入5-甲基呋喃-2-硼酸频哪醇酯(120mg，0.624mmol)和碳酸钾水溶液(2M，0.4mL)。109℃回流搅拌10小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体26mg，产率24％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.18(s,1H),7.32～7.21(m,5H),6.71(d,J＝3.2Hz,1H),6.13(d,J＝2.4Hz,1H),4.13(s,2H),2.38(s,3H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 266.13,found 266.4。
2-(苯基甲基)-6-(5-甲基呋喃基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B5)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(5-甲基呋喃基)-3-苄基-吡嗪(82mg，0.309mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(137mg，0.618mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得浅褐色固体36mg，产率30％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ7.72(s,1H),7.27～7.09(m,10H),6.72(d,J＝3.2Hz,1H),6.07(d,J＝2.8Hz,1H),4.31(s,2H),4.07(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ154.69,148.05,147.26,137.90,136.59,135.44,133.87,128.89,128.53,128.34,128.21,126.88,126.78,121.91,111.74,108.23,106.75,37.70,29.12.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 396.1712,found 396.1704。
【实例6：2-(苯基甲基)-6-(呋喃基-3)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B6)的制备】
中间体2-氨基-5-(呋喃基-3)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(400mg，1.51mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(40mg，0.104mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(80mg，0.132mmol)溶解于6mL甲苯中，然后加入呋喃-3-硼酸(255mg，2.27mmol)和碳酸钾水溶液(2M，0.8mL)。109℃回流搅拌10小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得浅黄色固体289mg，产率76％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.19(s,1H),8.07(s,1H),7.70(s,1H),7.32～7.19(m,5H),6.91(s,1H),6.27(s,1H),4.04(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcdfor 252.11,found 252.1。
2-(苯基甲基)-6-(呋喃基-3)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B6)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(呋喃基-3)-3-苄基-吡嗪(200mg，0.796mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(283mg，1.19mmol)溶于6mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.4mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体130mg，产率43％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.54(s,1H),8.19(s,1H),7.65(s,1H),7.43(d,J＝8Hz,2H),7.37～7.23(m,8H),7.02(d,J＝4Hz,1H),4.58(s,2H),4.34(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ147.66,144.55,142.33,136.67,135.47,128.89,128.51,128.34,128.18,126.89,126.75,121.69,109.12,107.73,37.44,29.34.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 382.1556,found382.1557。
【实例7：2-(苯基甲基)-6-(3-乙氧基羰基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B7)的制备】
中间体2-氨基-5-(3-甲氧基羰基苯基)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(100mg，0.378mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(10mg，0.026mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(20mg，0.033mmol)溶解于6mL甲苯中，然后加入3-甲氧基羰基硼酸(110mg，0.576mmol)和碳酸钾水溶液(2M，0.3mL)。109℃回流搅拌6小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体90mg，产率74％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.50(d,J＝4Hz,2H),8.19(d,J＝8Hz,1H),7.88(d,J＝8Hz,1H),7.56(t,J＝8Hz,1H),7.31(m,4H),6.55(s,2H),4.11(s,2H),3.88(s,3H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 320.1,found 320.5。
2-(苯基甲基)-6-(3-乙氧基羰基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B7)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(3-甲氧基羰基苯基)-3-苄基-吡嗪(80mg，0.250mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(111mg，0.501mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，深黄色固体36mg，产率31％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.78(s,1H),8.65(s,1H),8.23(d,J＝8Hz,1H),8.07(d,J＝8Hz,1H),7.46(d,J＝4Hz,2H),7.39～7.24(m,9H),4.61(s,2H),4.42(q,J＝8Hz,2H),4.40～4.34(m,2H),1.43(t,J＝8Hz,3H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ166.15,150.35, 147.80,140.06,138.00,136.57,135.46,134.79,130.82,129.04,128.57,128.36,128.19,126.90,126.83,110.61,61.15,37.92,29.08,13.29.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 464.1974,found 464.1964。
【实例8：2-(苯基甲基)-6-(苯并呋喃基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B8)的制备】
中间体2-氨基-5-(苯并呋喃基-2)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(218mg，0.826mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(27mg，0.070mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(50mg，0.083mmol)溶解于6mL甲苯中，然后加入苯并呋喃硼酸(200mg，1.24mmol)和碳酸钾水溶液(2M，0.4mL)。109℃回流搅拌6小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体90mg，产率37％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.41(s,1H),7.65～7.59(m,2H),7.36～7.18(m,7H),6.72(s,2H),4.11(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 302.13,[M+Na]+calcdfor 324.11,found 302.5,324.4。
2-(苯基甲基)-6-(苯并呋喃基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B8)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(苯并呋喃基)-3-苄基-吡嗪(200mg，0.686mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(244mg，1.10mmol)溶于6mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.4mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，深黄色固体172mg，产率58％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.55(s,1H),7.57(t,J＝6Hz,4H),7.47(d,J＝8Hz,3H),7.31(t,J＝8Hz,4H),7.24(m,3H),7.13(s,1H),4.63(s,2H),4.36(s,2H). 13CNMR(100MHz,CD3OD):δ154.98,151.55,149.08,138.04,137.74,136.66,132.77,129.87,129.11,129.04,128.93,128.70,128.37,127.41,127.26,127.11,126.37,124.13,122.34,120.50,111.84,110.34,106.71,100.00,38.12,29.15.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 432.1712,found432.1703。
【实例9：2-(苯基甲基)-6-(呋喃基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B9)的制备】
中间体2-氨基-5-(呋喃基-2)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(400mg，1.51mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(40mg，0.104mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(80mg，0.132mmol)溶解于6mL甲苯中，然后加入呋喃-2-硼酸(255mg，2.26mmol)和碳酸钾水溶液(2M，0.8mL)。109℃回流搅拌6小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体50mg，产率13％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.21(s,1H),7.69(s,1H),7.32～7.18(m,5H),6.74(d,J＝3.2Hz,1H),6.56(d,J＝1.2Hz,1H),6.45(s,2H),4.06(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 252.11,found 252.1。
2-(苯基甲基)-6-(呋喃基-2)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B9)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(呋喃基-2)-3-苄基-吡嗪(88mg，0.350mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(120mg，0.525mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，深黄色固体40mg，产率30％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.50(s,1H),7.69(s, 1H),7.43～7.27(m,10H),7.08(d,J＝4Hz,1H),6.60(s,1H),4.56(s,2H),4.34(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ149.19,148.16,144.34,138.00,136.50,135.38,134.00,128.56,128.34,128.11,121.04,111.94,110.45,107.63,37.82,28.97.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 382.1556,found 382.1545。
【实例10：2-(苯基甲基)-6-(4-甲氧基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B25)的制备】
中间体2-氨基-5-(4-甲氧基-苯基)-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(100mg，0.378mmol)，双苄腈二氯化鈀(II)(10mg，0.025mmol)，[1,4-双(二苯基膦基)丁烷]二氯化钯(II)(15mg，0.025mmol)溶解于6mL甲苯中，然后加入对甲氧基苯硼酸(85mg，0.530mmol)和碳酸钠水溶液(1M，0.39mL)。109℃回流搅拌4小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体40mg，产率36％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.34(s,1H),7.90～7.87(d,J＝12Hz,2H),7.34～7.24(m,5H),7.01～6.98(d,J＝12Hz,2H),4.35(s,2H)4.18(s,2H),3.86(s,3H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 292.15,found 292.5。
2-(苯基甲基)-6-(4-甲氧基-苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B25)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(4-甲氧基-苯基)-3-苄基-吡嗪(40mg，0.137mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(61mg，0.274mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体30mg，产率52％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ7.91(s,1H),7.68～7.66(d,J＝8Hz,2H),7.40～7.38(d,J＝8Hz,2H),7.32～7.17(m,8H),7.04～7.02(d,J＝8Hz,2H),4.46(s,2H),4.21(s,2H),3.83(s,3H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ161.37,139.59,138.38,136.80,135.56,128.93,128.49,128.39,128.24,128.17,126.94,126.71,125.77,114.19,109.27,54.64,37.35,29.67.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 422.1869,found 422.1863。
反应2：反应试剂与条件:(a)(C6H5CN)2PdCl2,K2CO3，甲苯回流，8h；(b)Pd(dppb)Cl2,(C6H5CN)2PdCl2,K2CO3，甲苯回流，8h；(c)con.HCl，乙醇，80℃回流，8h。
【实例11：2-(苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B20) 的制备】
中间体2-氨基-5-溴-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪(1-2)的制备
在氮气保护条件下，2-氨基-3,5二溴吡嗪(500mg，1.98mmol)和(C6H5CN)2PdCl2(43mg，0.11mmol)。溶于甲苯6ml中，然后加入1-苯基乙烯基硼酸(321mg，2.17mmol)的甲苯溶液，加入K2CO3溶液(2M，1ml)，109℃回流反应8h。反应终止后，浓缩反应液，然后加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥、过滤、200-300目硅胶柱层析纯化，干燥后即得中间体化合物1-2为白色固体300mg，产率55％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.65(s,1H),7.30～7.25(m,5H),6.56(s,1H),5.90(d,J＝2.0Hz,1H),5.62(d,J＝2.0Hz,1H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 276.01,277.13,found 276.2,277.3。
中间体2-氨基-5-(4-氟苯基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪(2-18)的制备
在氮气保护条件下，将2-氨基-5-溴-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪(1-2)(500mg，1.81mmol)，Pd(dppb)Cl2(68mg，0.11mmol)，(C6H5CN)2PdCl2(43mg，0.11mmol)溶于甲苯6ml中，然后加入4-氟苯硼酸(380mg，2.72mmol)的甲苯溶液，加入K2CO3溶液(2M，1ml)，109℃回流反应8h。反应终止后，浓缩反应液，然后加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯相用无水硫酸钠干燥、过滤、200-300目硅胶柱层析纯化，干燥后即得中间体化合物2-1为白色固体400mg，产率75％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.42(s,1H),7.97～7.93(m,2H),7.3～7.18(m,7H)6.48(s,2H),5.90(d,J＝2.0Hz,1H),5.62(d,J＝2.0Hz,1H),4.09(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 292.13,found 292.1。
2-(苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-(1-苯基乙烯基)-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B20)的制备
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-(4-氟苯基)-3-(1-苯基乙烯基)-吡嗪(2-18)(100mg，0.34mmol)和3-苯基-l,l-二乙氧基丙酮(3-1)(114mg，0.51mmol)溶解于3ml乙醇中。室温搅拌5分钟。0.2ml的浓盐酸溶解于2ml乙醇中，然后加入到上述反应液中。移至油浴80℃反应9小时。反应停止后待降至室温，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄白色固体45mg，产率31％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.58(s,1H),8.02～7.98(m,2H),7.40～7.39(m,2H),7.34～7.22(m,10H),5.96(d,J＝2.0Hz,1H),5.69(d,J＝2.0Hz,1H),4.55(s,2H),4.30(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ165.16,162.69,149.2,136.62,135.52,128.95,128.82,128.53,128.36,128.16,126.90,126.79,115.70,115.48,115.1,110.07,29.24.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 422.1669,found 422.1665。
反应3：反应条件与试剂:(p)TBDMSCl,咪唑,THF,rt,12h；NaBH4,MeOH,0℃,2h,86％；(q)SOCl2,CH2Cl2,0°,2h,81％；(d)Mg,EtBr2；THF,-78℃,6h,34％；(o)Bu4NF,THF,0℃,1h,88％；(c)con.HCl，EtOH，80℃回流，8h。
【实例12：2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B12)的制备】
中间体4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基甲醇的制备：
在氩气保护下，4-羟基苯甲醛(1.15g,9.42mmol)和咪唑(1.3g,18.96mmol)混合于干燥的二氯甲烷中，然后加入叔丁基二甲基氯硅烷(1.6g,10.4mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，反应液倒入水中，油层用水洗，饱和食盐水洗，然后干燥过滤得粗品。粗品溶于甲醇中，并在0℃下加入硼氢化钠(0.5g,12mmol),反应室温搅拌3小时，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析纯化，干燥后得浅黄色油状物1.9g，产率86％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.22(d,J＝8.6Hz,2H)，6.82(d,J＝8.6Hz,2H)，4.60(s,2H)，0.99(s,9H)，0.20(s,6H)。
中间体4-(叔丁基二甲基硅氧基)苄基氯的制备：在氩气保护，0℃下，中间体4-(叔丁基二甲基硅氧基)苯基甲醇(1.06g，4.03mmol)溶于干燥的二氯甲烷中，二氯亚砜(0.46mL，6.3mmol)缓慢加入到反应液中，然后室温搅拌，反应持续2.5小时后加入水淬灭反应。有机层多次水洗，饱和氯化钠溶液洗，干燥，浓缩，200-300目硅胶柱层析纯化得浅黄色油状物0.86g，产率81％。1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ7.26(d,J＝8.6Hz,2H)，6.83(d,J＝8.6Hz,2H)，4.57(s,2H)，1.00(s,9H)，0.22(s,6H)。
中间体3-(4-叔丁基二甲基硅氧基苯基)-1,1-二乙氧基丙酮的制备：
镁粉(1.1g,44mmol)和中间体4-(叔丁基二甲基硅氧基)苄基氯(2.15g,8.4mmol)混悬于干燥的四氢呋喃中，加入1,2-二溴乙烷(13微升，0.15mmol)，反应液50℃反应2小时，放凉至室温。在氩气保护下，二乙氧基乙酸乙酯(2mL，11.2mmol)溶于四氢呋喃，降温至-78℃，然后用针抽取新制的格式试剂加入到反应液中，反应4小时。待反应液升至室温时，用保护氯化铵水溶液淬灭反应。旋蒸除去有机溶剂，加入乙酸乙酯萃取，有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300 目硅胶柱层析，得浅黄色油状物1g，产率34％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.07(d,J＝8.0Hz,2H)，6.78(d,J＝8.0Hz,2H)，4.62(s,1H)，3.80(s,2H)，3.70～3.51(m,4H)，1.24(t,J,＝7.0Hz,6H)，0.97(s,9H)，0.18(s,6H)。
中间体3-(4-羟基苯基)-1,1-二乙氧基丙酮(3-2)的制备：
在氩气保护下，0摄氏度下，中间体3-(4-叔丁基二甲基硅氧基苯基)-1,1-二乙氧基丙酮(1.5g，4.25mmol)溶于四氢呋喃中，加入四丁基氟化铵(2.2mmol)，反应持续1小时后，反应用饱和氯化铵淬灭。反应液用二氯甲烷萃取，干燥，200-300目柱层析纯化，得浅黄色油状物900mg，产率88％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.26(d,J＝8.0Hz,2H)，6.78(d,J＝8.0Hz,2H)，4.69(s,1H)，4.63(s,2H)，3.82(s,2H)，3.72～3.53(m,4H)，1.25(t,6H)。ESI-MS:m/z[M+NH4]+calcd for 256.15,found:256.16。
2-(4-羟基-苯基甲基)-6-(4-氟苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(B12)的制备：
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-(4-氟苯基)-3-(1-苯基甲基)-吡嗪(2-1)(100mg，0.34mmol)和3-(4-羟基苯基)-1,1-二乙氧基丙酮(3-2)(111mg，0.46mmol)溶解于3ml乙醇中。室温搅拌5分钟。0.2ml的浓盐酸溶解于2ml乙醇中，然后加入到上述反应液中。移至油浴80℃反应9小时。反应停止后待降至室温，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体40mg，产率26％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.58(s,1H),8.02～7.98(m,2H),7.40～7.39(m,2H),7.34～7.22(m,10H),4.55(s,2H),4.30(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ165.16,162.69,149.2,136.62,135.52,128.95,128.82,128.53,128.36,128.16,126.90,126.79,115.1,110.07,37.20，29.24.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 426.1618,found426.1645。
反应4：反应试剂与条件:(f)Pd(PPh3)Cl2,PPh3,CuI,TEA,40℃,6h；(g)con.HCl，乙醇，80℃回流，8h。
【实例13：2-(苯基甲基)-6-(苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A1)的制备】
中间体2-氨基-5-(苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-1)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(200mg，0.76mmol)、三苯基膦二氯化鈀(27mg，0.038mmol)、碘化亚铜(29mg，0.151mmol)、三苯基膦(20mg，0.076mmol)溶于5mL甲苯 中，然后加入苯乙炔(232mg，2.27mmol)和三乙胺0.7mL。40℃搅拌反应6小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体165mg，产率77％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.09(s,1H),7.43～7.41(m,6H),7.29～7.28(m,4H),6.81(s,2H),4.04(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 286.13,found 286.4。
2-(苯基甲基)-6-(苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A1)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-苯基炔基-3-苄基-吡嗪(4-1)(80mg，0.28mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(124mg，0.56mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得浅棕色固体30mg，产率26％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.47(s,1H),7.58～7.24(m,15H),4.59(s,2H),4.34(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ147.24,137.12,134.94,131.58,129.75,128.94,128.60,128.45,128.42,127.28,126.60,120.68,117.41,94.22,80.17,35.89,31.07.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 416.1763,found 416.1757。[150925-JTY-061-003]
【实例14：2-(苯基甲基)-6-(4-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A2)的制备】
中间体2-氨基-5-(4-氟-苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-2)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(90mg，0.34mmol)、三苯基膦二氯化鈀(12mg，0.017mmol)、碘化亚铜(13mg，0.068mmol)、三苯基膦(9mg，0.034mmol)溶于5mL甲苯中，然后加入4-氟-苯乙炔(125mg，1.02mmol)和三乙胺0.4mL。40℃搅拌反应10小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体52mg，产率50％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.09(s,1H),7.61～7.58(m,2H),7.48～7.43(m,2H),7.30～7.21(m,5H).6.82(s,2H),4.03(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 304.13,found304.1。
2-(苯基甲基)-6-(4-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A2)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(4-氟苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-2)(40mg，0.099mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(44mg，0.198mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体15mg，产率35％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.07(s,1H),7.64～7.60(m,2H),7.38～7.36(m,2H),7.29～7.21(m,7H),7.19～7.15(m,3H),4.42(s,2H),4.22(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ164.74,162.25,147.35,140.52,137.03,134.98,134.07,134.03,133.98,128.85,128.38,128.34,127.23,127.10,126.57,117.39,115.84,115.61,92.98,80.05,35.85,30.94.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 434.1669,found 434.1663。
【实例15：2-(苯基甲基)-6-(3-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A3)的制备】
中间体2-氨基-5-(3-氟-苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-3)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(200mg，0.758mmol)、三苯基膦二氯化鈀(35mg，0.050mmol)、碘化亚铜(35mg，0.183mmol)、三苯基膦(20mg，0.076mmol)溶于10mL甲苯中，然后加入3-氟-苯乙炔(260mg，2.16mmol)和三乙胺0.6mL。40℃搅拌反应24小时。停止反应后， 反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体102mg，产率45％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.11(s,1H),7.49～7.38(m,3H),7.32～7.19(m,6H),6.86(s,2H),4.04(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 304.13,found304.4。
2-(苯基甲基)-6-(3-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A3)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(3-氟苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-3)(60mg，0.198mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(90mg，0.395mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体26mg，产率30％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.58(s,1H),7.46～7.20(m,14H),4.59(s,2H),4.34(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ163.64,161.19,147.39,137.00,134.98,130.58,130.49,128.56,128.40,128.34,127.75,127.22,126.60,118.19,117.95,117.72,117.04,116.82,92.29,81.25,35.98,30.83.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 434.1669,found 434.1664。
【实例16：2-(苯基甲基)-6-(2-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A4)的制备】
中间体2-氨基-5-(2-氟-苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-4)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(200mg，0.758mmol)、三苯基膦二氯化鈀(35mg，0.050mmol)、碘化亚铜(35mg，0.183mmol)、三苯基膦(20mg，0.076mmol)溶于10mL甲苯中，然后加入2-氟-苯乙炔(260mg，2.16mmol)和三乙胺0.6mL。40℃搅拌反应24小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体100mg，产率44％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.11(s,1H),7.64～7.60(td,J＝7.53Hz,1.6Hz,1H),7.48～7.46(m,1H),7.36～7.20(m,7H),6.88(s,2H),4.04(s,2H).[M+H]+calcd for 304.13,found 304.4。
2-(苯基甲基)-6-(2-氟-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A4)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(2-氟苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-4)(56mg，0.185mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(80mg，0.360mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体11mg，产率14％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.57(s,1H),7.69～7.65(td,J＝7.36Hz,1.6Hz,1H),7.52～7.43(m,3H),7.34～7.22(m,10H),4.59(s,2H),4.34(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ164.06,161.55,147.41,140.59,136.99,134.98,133.59,128.80,128.40,128.31,127.21,126.60,124.42,124.39,117.71,115.55,15.34,109.38,109.22,87.15,85.15,35.96,30.82.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 434.1669,found 434.1662。
【实例17：2-(苯基甲基)-6-(3-甲基-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A5)的制备】
中间体2-氨基-5-(3-甲基-苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-5)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(100mg，0.379mmol)、三苯基膦二氯化鈀(15mg，0.021mmol)、碘化亚铜(15mg，0.079mmol)、三苯基膦(10mg，0.038mmol)溶于5mL甲苯中，然后加入3-甲基-苯乙炔(130mg，1.121mmol)和三乙胺0.4mL。40℃搅拌反应24小时。停止反应 后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体62mg，产率62％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.07(s,1H),7.36～7.19(m,9H),6.77(s,2H),4.03(s,2H),2.31(s,3H).ESI-MS:m/z[M+h]+calcd for 300.15,found 300.5。
2-(苯基甲基)-6-(3-甲基-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A5)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(3-甲基-苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-5)(120mg，0.401mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(180mg，0.810mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体70mg，产率40％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ7.70(s,1H),7.40～7.18(m,14H),4.34(s,2H),4.18(s,2H),2.36(s,3H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ147.24,140.63,138.54,138.47,137.10,134.99,134.95,134.02,131.94,130.95,130.58,128.86,128.79,128.72,128.56,128.37,128.22,128.12,127.24,126.56,120.95,120.57,117.28,94.50,79.72,35.73,31.06,20.1.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 430.1919,found430.1914。
【实例18：2-(苯基甲基)-6-(3-羟基-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A6)的制备】
中间体2-氨基-5-(3-羟基-苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-6)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(150mg，0.568mmol)、三苯基膦二氯化鈀(30mg，0.043mmol)、碘化亚铜(20mg，0.105mmol)、三苯基膦(10mg，0.038mmol)溶于5mL甲苯中，然后加入3-甲基-苯乙炔(100mg，0.847mmol)和三乙胺0.4mL。40℃搅拌反应24小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得黄色固体62mg，产率62％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.69(s,1H),8.07(s,1H),7.29～7.26(m,3H),7.22～7.18(t,J＝8Hz,2H),6.95(d,J＝8Hz,1H),6.87(s,1H),6.82～6.79(m,1H),6.77(s,2H),4.03(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 302.13,found 302.5。
2-(苯基甲基)-6-(3-羟基-苯基炔基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(A6)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-(3-羟基-苯基炔基)-3-苄基-吡嗪(4-6)(70mg，0.232mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(3-1)(90mg，0.405mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体15mg，产率15％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ7.69(s,1H),7.41～7.18(m,14H),4.33(s,2H),4.18(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ157.37,147.15,137.09,134.96,129.59,128.80,128.57,128.36,127.25,126.56,122.87,121.52,117.94,117.28,94.44,79.38,35.66,31.11.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 432.1712,found432.1701。
反应5：反应试剂与条件:(h)Pd(PPh3)Cl2,PPh3,CuI,TEA,40℃,7h；(i)K2CO3,CH3OH，r.t.2h；(j)NaN3,THF,80℃,8h；(k)CuSO4·5H2O,VcNa,THF/H2O,r.t.overnight；(m)con.HCl，EtOH，80℃回流，8h。
【实例19：2-(苯基甲基)-6-[(1-羟基乙基)-1,2,3-三氮唑]--8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T1)的制备】
中间体2-氨基-5-(三甲基硅基炔基)-3-苄基-吡嗪(5)的合成
在氮气保护下，将中间体2-氨基-5-溴-3-苄基-吡嗪(200mg，0.76mmol)、三苯基膦二氯化鈀(27mg，0.038mmol)、碘化亚铜(29mg，0.151mmol)、三苯基膦(20mg，0.076mmol)溶于5mL甲苯中，然后加入三甲基硅基乙炔(223mg，2.27mmol)和三乙胺0.8mL。40℃搅拌反应9小时。停止反应后，反应液过滤，滤液浓缩，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠溶液，萃取后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得浅黄色固体129mg，产率60％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.98(s,1H),7.29～7.20(m,5H),6.79(s,2H),3.99(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 282.14,found 282.5。
中间体2-氨基-5-炔基-3-苄基-吡嗪(6)的制备
中间体2-氨基-5-三甲基硅基炔基-3-苄基-吡嗪(100mg，0.356mmol)，碳酸钾(40mg，0.284mmol)溶于3mL甲醇中，室温搅拌2小时。停止反应后，旋干溶剂，加入乙酸乙酯和饱和氯化钠水溶液，进行萃取。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体50mg，产率67％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.98(s,1H),7.30～7.20(m,5H),6.76(s,2H),4.15(s,2H),3.99(s,2H).ESI-MS:m/z[M++]calcd for 210.10,found210.3。
中间体1-叠氮基-2-乙醇(7-1)的制备
溴乙醇(1.76g，14.08mmol)溶于3mL水中，室温搅拌下逐步加入叠氮化钠(1.83g，28.17mmol)，室温搅拌20小时。反应停止后，加入乙醚萃取，乙醚层用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤、旋干溶剂得粗品，不必进行精制，直接投入下步反应。
中间体2-氨基-5-[(1-羟基乙基)-1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪(8-1)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-6-炔基-8-苄基-吡嗪(30mg，0.143mmol)，1-叠氮基-2-乙醇 (16mg，0.186mmol)，五水硫酸铜(2mg，7.15μmol)，抗坏血酸钠(4mg，21.45μmol)溶于1:1的四氢呋喃和水混合溶液中，然后加入2微升三乙胺。室温反应8小时。停止反应后，旋去有机溶剂，然后加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液洗涤，然后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得淡黄色固体40mg，产率95％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.70(s,1H),8.10(s,1H),7.34～7.28(m,2H),7.26～7.22(m,3H),4.55(t,J＝4Hz,2H),4.49(s,2H),4.13(m,4H).ESI-MS:m/z[M++]calcd for 297.1464,found。
2-(苯基甲基)-6-[(1-羟基乙基)-1,2,3-三氮唑]-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T1)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-[(1-羟基乙基)-1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪(60mg，0.202mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(90mg，0.404mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体60mg，产率69％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.35(s,1H),8.02(s,1H),7.24～7.05(m,10H),4.44(t,J＝6Hz,2H),4.32(s,2H),4.04(s,2H),3.86(t,J＝6Hz,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ148.40,143.06,138.07,136.52,135.47,133.85,128.86,128.54,128.37,128.17,126.88,126.80,124.56,109.73,60.10,52.93,37.81,29.08.ESI-HRMS:m/z[M++]calcd for 427.1882,found427.1876。
【实例20：2-(苯基甲基)-6-[(1-羟基丙基)-1,2,3-三氮唑]--8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T2)的制备】
中间体1-叠氮基-3-丙醇的制备
1-溴-3-丙醇(1g，7.19mmol)溶于3mL水和DMF为1:1的混合溶剂中，室温搅拌下逐步加入叠氮化钠(0.9g，14.39mmol)，80℃回流8小时。反应停止后，加入乙醚萃取，乙醚层用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤、旋干溶剂得粗品，不必进行精制，直接投入下步反应。
中间体2-氨基-5-[(1-羟基丙基)-1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-炔基-3-苄基-吡嗪(45mg，0.215mmol)，1-叠氮基-3-丙醇(28mg，0.279mmol)，五水硫酸铜(4mg，0.016mmol)，抗坏血酸钠(7mg，0.035mmol)溶于1:1的四氢呋喃和水混合溶液中，然后加入3.5微升三乙胺。30℃反应8小时。停止反应后，旋去有机溶剂，然后加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液洗涤，然后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得淡黄色固体55mg，产率83％。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.76(s,1H),8.04(s,1H),7.33～7.28(m,2H),7.26～7.22(m,3H),4.59(t,J＝6Hz,2H),4.48(s,2H),4.14(s,2H),3.70(m,J＝6Hz,2H),2.19(m,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcd for 311.16,found 311.3。
2-(苯基甲基)-6-[(1-羟基丙基)-1,2,3-三氮唑]-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T2)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-[(1-羟基丙基)-1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪(60mg，0.202mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(90mg，0.404mmol)溶于3mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体20mg，产率23％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.44(s,1H), 8.15(s,1H),7.35～7.12(m,10H),4.57(t,J＝8Hz,2H),4.44(s,2H),4.14(s,2H),3.58(t,J＝8Hz,2H),2.13(m,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ148.42,143.09,136.51,135.48,133.72,128.84,128.55,128.39,128.16,126.88,126.80,124.19,109.90,65.52,57.92,37.84,32.49,29.07.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 441.2039,found 441.2034。
【实例21：2-(苯基甲基)-6-[(1-氟-乙基)-1,2,3-三氮唑]--8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T3)的制备】
中间体1-叠氮基-2-氟-乙烷的制备
1-溴-2-氟-乙烷(1.5g，11.82mmol)溶于3mL水和DMF为1:1的混合溶剂中，室温搅拌下逐步加入叠氮化钠(2.3g，35.45mmol)，80℃回流8小时。反应停止后，加入乙醚萃取，乙醚层用饱和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥、过滤、旋干溶剂得粗品，不必进行精制，直接投入下步反应。
中间体2-氨基-5-[(1-氟-乙基)-1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-炔基-3-苄基-吡嗪(40mg，0.191mmol)，1-叠氮基-2-氟乙烷(34mg，0.382mmol)，五水硫酸铜(3mg，0.012mmol)，抗坏血酸钠(6mg，0.030mmol)溶于1:1的四氢呋喃和水混合溶液中，然后加入3微升三乙胺。30℃反应8小时。停止反应后，旋去有机溶剂，然后加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液洗涤，然后乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥，过滤，200-300目硅胶柱层析得淡黄色固体45mg，产率79％。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.45(s,1H),8.39(s,1H),7.33～7.19(m,5H),6.46(s,2H),4.93(t,J＝4Hz,1H),4.80(m,2H),4.73(m,2H),4.07(s,2H).ESI-MS:m/z[M+H]+calcdfor 299.14,found 299.5。
2-(苯基甲基)-6-[(1-氟-乙基)-1,2,3-三氮唑]-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮(T3)的制备
在氮气保护条件下，将中间体2-氨基-5-[(1-氟-乙基)-1,2,3-三氮唑]-3-苄基-吡嗪(80mg，0.268mmol)和中间体3-苯基-1,1-二乙氧基-丙酮(120mg，0.536mmol)溶于4mL乙醇中，室温搅拌5分钟。0.2mL浓盐酸溶解于1mL乙醇，缓慢加入到上述反应液中。移至80℃回流搅拌8小时。反应停止后，浓缩反应液，200-300目硅胶柱层析，得黄色固体29mg，产率25％。1HNMR(400MHz,CD3OD):δ8.47(s,1H),8.26(s,1H),7.41～7.20(m,10H),4.92(m,1H),4.85(m,3H),4.46(s,2H),4.21(s,2H).13CNMR(100MHz,CD3OD):δ148.43,143.66,138.03,136.52,135.46,134.00,128.86,128.55,128.38,128.17,126.88,126.81,124.36,109.68,82.24,80.54,37.85,29.03.ESI-HRMS:m/z[M+H]+calcd for 429.1839,found 429.1833。
【实例22：腔肠素衍生物与Renilla luciferase的体外酶活性研究】
1、生物发光强度及米氏常数的测定：将50μL用Tris-HCl(50mM,pH7.42)溶解的不同浓度目标化合物，腔肠素Deep Blue，腔肠素h，腔肠素分别加入到50μLRenillaluciferase(1μg/ml)于全黑的96孔板中，用IVIS Kinetic小动物活体成像系统进行生物发光强度的测定。根据测试结果用GraphPad Prism计算出不同化合物的米氏常数。以腔肠素Deep Blue(2μM)的测试结果为基准，折算所有化合物的生物发光强度值。
2、生物发光最大波长的测定：向0.5mL用Tris-HCl(50mM,pH7.42)溶解的不同的目标化合物，腔肠素Deep Blue，腔肠素h，腔肠素(25μM)中分别加入0.5mLRenillaluciferase(1μg/ml)，用F-1200 荧光分光光度计在lamp off的luminescence模式下，response time为2s，扫描其生物发光光谱，得到最大生物发光波长。
3、生物发光Half life的测定：向0.5mL用Tris-HCl(50mM,pH7.42)溶解的不同的目标化合物，腔肠素Deep Blue，腔肠素h，腔肠素(25μM)中分别加入0.5mLRenillaluciferase(1μg/ml)，用F-1200荧光分光光度计在lamp off的time scan模式下测定300s的生物发光曲线。用GraphPad Prism计算生物发光Half life。
表1.腔肠素类似物与Renilla luciferase的体外生物发光性质
结果表明，相较于腔肠素Deep Blue，部分目标化合物显示出了生物发光强度更强，生物发光半衰期更长或者是具有较好的动力学特性等特点。部分化合物如B2，B9,B5的生物发光性质良好，具有潜力可以作为生物发光体系中底物的选择。
【实例23：腔肠素衍生物与Gaussialuciferase的体外酶活性研究】
1、生物发光强度及米氏常数的测定：将50μL用Tris-HCl(25mM,pH7.8，含600mMNaCl,1mM EDTA,0.05％BSA)溶解的不同浓度目标化合物，腔肠素Deep Blue，腔肠素h，腔肠素分别加入到50μL Gaussialuciferase(2μg/ml,用pH7.8，含600mM NaCl,1mM EDTA,0.05％BSA的25mM Tris-HCl溶解)于全黑的96孔板中，用Ω酶标仪进行生物发光强度的测定。根据测试结果用GraphPad Prism计算出不同化合物的米氏常数。以腔肠素Deep Blue(5μM)的测试结果为基准，折算所有化合物的生物发光强度值。
2、生物发光最大波长的测定：向0.5mL用Tris-HCl(25mM,pH7.8，含600mM NaCl,1mM EDTA,0.05％BSA)溶解的不同的目标化合物，腔肠素Deep Blue，腔肠素h，腔肠素(25μM)中分别加入0.5mL Gaussialuciferase(2μg/ml，用Tris-HCl(pH7.8，含600mM NaCl,1mMEDTA,0.05％BSA的25mM Tris-HCl溶解)，用F-1200荧光分光光度计在lamp off的luminescence模式下，response time为2s，扫描其生物发光光谱，得到最大生物发光波长。
3、生物发光Half life的测定：将50μL用Tris-HCl(25mM,pH7.8，含600mM NaCl,1mM EDTA,0.05％BSA)溶解的不同的目标化合物，腔肠素Deep Blue，腔肠素h，腔肠素(25μM)中分别加入50μLGaussialuciferase(2μg/ml,pH7.8，含600mM NaCl,1mM EDTA,0.05％BSA的25mM Tris-HCl溶解)，用Ω酶标仪测定300s的生物发光曲线。用GraphPad Prism计算生物发光Half life。
表2：腔肠素类似物与Gaussia luciferase的体外生物发光性质
结果表明，相较于腔肠素Deep Blue，部分目标化合物如B2，B3，B5显示出了生物发光强度更强，生物发光半衰期更长或者是具有较好的动力学特性等特点。
【实例24：腔肠素衍生物的细胞活性研究(细胞水平)】
在黑色的96孔板中每孔加入100μL稳定转染表达Renilla luciferase的ES-2细胞悬液(4×105/孔)，于37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育24h。之后吸出培养基，加入100μL用0.9％NaCl溶液溶解的不同浓度目标化合物，腔肠素Deep Blue，腔肠素h，腔肠素(0，0.25，0.5，1，2，5，10，25μM)，用IVISKinetic小动物活体成像系统测试，得结果如下表：
表3.腔肠素衍生物的细胞水平的生物发光性质
结果表明，部分化合物如B2，B5，B9在细胞水平具有较好的生物发光活性。特别是B2的发光强 度已经和腔肠素h基本一致。
【实例25:腔肠素衍生物的化学发光波长测定】
像200μL用无水乙醇配制成的1mM目标化合物或腔肠素Deep Blue的溶液中加入2mL的含0.05％的1M的NaOH溶液的DMSO，用F-1200荧光分光光度计在lamp off模式下测定化学发光光谱。得到其各自的化学发光最大波长，见表3。
【实例26:腔肠素衍生物的荧光性质测定】
将200μL用Tris-HCl(50mM，pH7.42)配制的100μM的化合物置于全黑的96孔板中。用Thermo Scientific Varioskan Flash microplate reader测试荧光激发光谱和荧光发射光谱。结果见表4。
表4.腔肠素衍生物的化学发光和荧光性质
【实例27:腔肠素衍生物的动物体内活性研究】
选取在酶水平和细胞水平表现良好的化合物B2和B5，进一步进行动物体内活性研究。将目标化合物和腔肠素配制成为1mM和5mM的氯化钠溶液，选取荷瘤2周的裸鼠进行体内成像实验。腹腔注射化合物100μL，用活体成像仪进行成像。比较目标化合物和阳性对照腔肠素的最大发光强度。结果见表5。
表5.腔肠素类似物的体内最大生物发光强度比
结果表明，化合物B2和B5的体内的最大生物发光比阳性对照腔肠素的强度要强3～6倍。这说明该化合物具有在体内成像的潜力。
实例22至27所涉及的化合物结构如下：
。
Claims (1)
1.腔肠素类似物在作为生物发光的底物中的应用，其特征是，所述腔肠素类似物为B2：2-(苯基甲基)-6-(3-氟-4-氨基苯基)-8-苄基-咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-(7H)-酮；
在黑色的96孔板中每孔加入100 μL稳定转染表达Renillaluciferase的ES-2细胞悬液，于37 ℃，5％CO2细胞培养箱中孵育24 h，之后吸出培养基，加入100μL用0.9% NaCl溶液溶解的25μΜ B2，用IVIS Kinetic 小动物活体成像系统测试。
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