JP7036343B2

JP7036343B2 - 新規セレンテラジン誘導体

Info

Publication number: JP7036343B2
Application number: JP2018060762A
Authority: JP
Inventors: 正啓木山; 昌次郎牧; 誉平野; 智岩野; 敦史宮脇
Original assignee: THE UNIVERSITY OF ELECTRO-COMUNICATINS; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: THE UNIVERSITY OF ELECTRO-COMUNICATINS; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2018-03-27
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2038-03-27
Also published as: JP2018165265A

Description

本発明は、新規セレンテラジン誘導体に関し、特には、天然型のセレンテラジン（ＣＴＺ）よりも長波長光を発することが可能なセレンテラジン誘導体に関するものである。

生物発光系の中でも、海洋動物由来の発光系は、発光輝度が高いことが知られている。該海洋動物由来の発光系においては、発光基質である天然型のセレンテラジン（ＣＴＺ）が、発光酵素の海洋動物発光酵素を触媒とした酸化反応により、波長が４８０ｎｍ程度の光を発する。

一方、生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として、生物発光系の発光基質を利用する研究が進められている。ここで、海洋動物由来の発光系は、上述の通り、発光輝度が高いため、生体内深部の病巣の可視化に有望である。

Jiang, T.; Du, L.; Li, M. Photochem. Photobiol. Sci. 2016, 15 (4), 466-480. Kaskova, Z. M.; Tsarkova, A. S.; Yampolsky, I. V. Chem. Soc. Rev. 2016, 45 (21), 6048-6077. Nishihara, R.; Suzuki, H.; Hoshino, E.; Suganuma, S.; Sato, M.; Saitoh, T.; Nishiyama, S.; Iwasawa, N.; Citterio, D.; Suzuki, K. Chem. Commun. (Camb). 2015, 51 (2), 391-394.

ところで、生体内で発光した光は、生体を透過して、生体の外部で検出されることとなるが、生体内での透過率が低い光では、生体内深部の病巣を十分に可視化することができない。ここで、一般に、長波長光は生体内での透過率が高いため、生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として有望であるといえる。

しかしながら、上述の海洋動物由来の発光系から発せられる光は、波長が４８０ｎｍ程度と比較的短波長であり、生体内での透過率が高いとは言えない。

そこで、本発明は、上記従来技術の問題を解決し、天然型のセレンテラジンよりも長波長光を発することが可能で、海洋動物由来の発光系における発光基質として利用可能な新規セレンテラジン誘導体を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、特定構造のセレンテラジン誘導体が、海洋動物由来の発光系における発光基質として機能する上、天然型のセレンテラジンよりも長波長光を発することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明のセレンテラジン誘導体は、下記一般式（I）：

［式中、Ｒ^１は、窒素を含み且つ芳香環を含む基であり、Ｒ^２は、ベンゼン環、フラン環、ピロール環又はチオフェン環を含む基であり；ｎは、０～３の整数である］で表されることを特徴とする。
かかる本発明のセレンテラジン誘導体は、天然型のセレンテラジンよりも長波長光を発することが可能であり、海洋動物由来の発光系における発光基質として利用できる。

本発明のセレンテラジン誘導体は、下記一般式（II）：

［式中、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して－Ｈ、又は炭素数１～３のアルキル基であり、Ｒ^３及びＲ^４は、互いに結合して環を形成してもよく；Ｒ^５は、－Ｈ、－ＯＨ、又は－ＮＲ^６Ｒ^７であり（但し、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ独立して－Ｈ、又は炭素数１～３のアルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、互いに結合して環を形成してもよい）；ｎは、０～３の整数である］で表されることが好ましい。この場合、該セレンテラジン誘導体の合成が容易であることに加え、該セレンテラジン誘導体を用いた発光系からの発光強度が高い。

本発明のセレンテラジン誘導体の好適例においては、前記一般式（II）中のＲ^３及びＲ^４が、メチル基である。この場合、該セレンテラジン誘導体の合成が更に容易であることに加え、該セレンテラジン誘導体を用いた発光系からの発光強度が高い。

本発明のセレンテラジン誘導体の他の好適例においては、前記一般式（II）中のＲ^５が、－Ｈ、又は－ＯＨである。この場合、該セレンテラジン誘導体の合成が更に容易であることに加え、該セレンテラジン誘導体を用いた発光系からの発光強度が高い。

本発明のセレンテラジン誘導体の中でも、下記一般式（III）又は（IV）：

［式（III）及び（IV）中、ｎは、０～３の整数である］で表されるセレンテラジン誘導体が特に好ましい。この場合、該セレンテラジン誘導体の合成が更に容易であることに加え、該セレンテラジン誘導体を用いた発光系からの発光強度が高い。

本発明によれば、天然型のセレンテラジンよりも長波長光を発することが可能で、海洋動物由来の発光系における発光基質として利用可能な新規セレンテラジン誘導体を提供することができる。

酵素としてＲ－ｌｕｃを用いた場合の、天然型セレンテラジン及び本発明に従うセレンテラジン誘導体の発光スペクトルである。酵素としてＲ－ｌｕｃ８を用いた場合の、天然型セレンテラジン及び本発明に従うセレンテラジン誘導体の発光スペクトルである。酵素としてＲ－ｌｕｃ８．６_５４７を用いた場合の、天然型セレンテラジン及び本発明に従うセレンテラジン誘導体の発光スペクトルである。

以下に、本発明のセレンテラジン誘導体を、その実施形態に基づき、詳細に例示説明する。

本発明のセレンテラジン誘導体は、上記一般式（I）で表されることを特徴とする。本発明のセレンテラジン誘導体は、窒素を含み且つ芳香環を含む基を有する点で、天然型のセレンテラジンと相違し、該化学構造の相違に基づき、天然型のセレンテラジンよりも長波長光を発することが可能であり、海洋動物由来の発光系における発光基質として利用できる。

上記一般式（I）中、Ｒ^１は、窒素を含み且つ芳香環を含む基である。ここで、Ｒ^１としては、置換又は無置換のアミノフェニル基、ピリジル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等が挙げられ、これらの中でも、置換又は無置換のアミノフェニル基が好ましい。なお、該置換又は無置換のアミノフェニル基としては、アミノフェニル基、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノフェニル基、Ｎ，Ｎ－ジエチルアミノフェニル基、Ｎ－エチル－Ｎ－メチルアミノフェニル基等が挙げられる。

上記一般式（I）中、Ｒ^２は、ベンゼン環、フラン環、ピロール環又はチオフェン環を含む基である。ここで、Ｒ^２としては、フェニル基、ヒドロキシフェニル基、置換又は無置換のアミノフェニル基、フリル基、ピロリル基、チエニル基等が挙げられ、これらの中でも、フェニル基及びヒドロキシフェニル基が好ましい。

上記一般式（I）中、ｎは、ビニレン単位（－ＣＨ＝ＣＨ－）の繰り返し数を示し、０～３の整数である。ここで、ｎの数が大きい程、発光波長が長くなるため、生体内深部の可視化の観点から、ｎは１～３であることが好ましく、２又は３であることが更に好ましく、また、合成の容易性の観点から、ｎは２であることが好ましい。

上述した一般式（I）で表されるセレンテラジン誘導体の中でも、発光強度や合成の容易性の観点から、上記一般式（II）で表されるセレンテラジン誘導体が特に好ましい。

上記一般式（II）中、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して－Ｈ、又は炭素数１～３のアルキル基であり、また、Ｒ^３及びＲ^４は、互いに結合して環を形成してもよい。ここで、炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。また、－ＮＲ^３Ｒ^４中のＲ^３及びＲ^４が結合して形成される基としては、１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－ヘキサメチレンイミノ基等の環状アミノ基が挙げられる。なお、Ｒ^３及びＲ^４が結合して形成する環は、５員環又は６員環であることが好ましい。これらの中でも、発光強度や合成の容易性の観点から、上記一般式（II）中のＲ^３及びＲ^４としては、メチル基が好ましい。

上記一般式（II）中、Ｒ^５は、－Ｈ、－ＯＨ（ヒドロキシ基）、又は－ＮＲ^６Ｒ^７である。ここで、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ独立して－Ｈ、又は炭素数１～３のアルキル基であり、また、Ｒ^６及びＲ^７は、互いに結合して環を形成してもよい。なお、Ｒ^６及びＲ^７に関して、炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基が挙げられる。また、－ＮＲ^６Ｒ^７中のＲ^６及びＲ^７が結合して形成される基としては、１－ピロリジニル基、１－ピペリジニル基、１－ヘキサメチレンイミノ基等の環状アミノ基が挙げられる。なお、Ｒ^６及びＲ^７が結合して形成する環としては、５員環、６員環が好ましい。これらの中でも、発光強度や合成の容易性の観点から、上記一般式（II）中のＲ^５としては、－Ｈ及び－ＯＨが好ましい。

上記一般式（II）中、ｎは、上記一般式（I）中のｎと同義であり、生体内深部の可視化の観点から、ｎは１～３であることが好ましく、２又は３であることが更に好ましく、また、合成の容易性の観点から、ｎは２であることが好ましい。

上述した一般式（II）で表されるセレンテラジン誘導体の中でも、発光強度や合成の容易性の観点から、上記一般式（III）又は（IV）で表されるセレンテラジン誘導体が特に好ましい。なお、上記一般式（III）及び（IV）中、ｎは、上記一般式（I）中のｎと同義であり、生体内深部の可視化の観点から、ｎは１～３であることが好ましく、２又は３であることが更に好ましく、また、合成の容易性の観点から、ｎは２であることが好ましい。

上記一般式（I）で表されるセレンテラジン誘導体は、特に限定されるものではないが、例えば、以下のようにして合成することができる。
（１）まず、オレフィン部分の数（即ち、ビニレン単位の繰り返し数）が異なる、ジメチルアミノフェニル基等の置換又は無置換のアミノフェニル基や、ピリジル基等の窒素を含み且つ芳香環を含む基を有するボラン誘導体を合成する。ここで、該ボラン誘導体の合成は、例えば、Ｍａｒｋｅｎｅらの開発したＢｏｒｏｎ－Ｗｉｔｔｉｇ反応で合成することができる。なお、ｎが０の場合は、市販のジメチルアミノフェニルボロン酸等のボラン誘導体を利用することもできる。
（２）次に、市販のジメチルアミノフェニルボロン酸や上記で合成したボラン誘導体を用いて、別途合成した２－アミノ－３－ベンジル－５－ブロモアミノピラジンと鈴木カップリングを行い、５位にオレフィン部分を有するアミノピラジン誘導体を合成する。
（３）次に、得られたアミノピラジン誘導体と、別途合成したケトアセタール体とを、塩酸条件下で縮合環化することにより、目的物質であるセレンテラジン誘導体を合成することができる。

本発明のセレンテラジン誘導体は、海洋動物発光酵素を触媒とした酸化反応により、発光する。そのため、本発明のセレンテラジン誘導体は、生物学的測定／検出における発光標識として利用でき、例えば、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、核酸等を標識するために使用できる。なお、本発明のセレンテラジン誘導体をこれらの物質に結合させる方法は、当業者に周知であり、例えば、当業者に周知の方法を使用して、目的の物質のカルボキシル基やアミノ基に対して本発明のセレンテラジン誘導体を結合させることができる。

また、本発明のセレンテラジン誘導体は、発光基質の発光によって、海洋動物発光酵素活性を検出することを利用した測定／検出に利用することもできる。例えば、海洋動物発光酵素遺伝子を導入した細胞又は動物に対して、本発明のセレンテラジン誘導体を投与することにより、インビボにおける標的遺伝子又はタンパク質の発現等を測定／検出することができる。

ここで、本発明のセレンテラジン誘導体は、天然型のセレンテラジンよりも長波長光を発することが可能であり、長波長光は生体内での透過率が高いため、生体内深部の病巣を可視化するための標識材料として有用である。

海洋動物発光酵素を産生可能な遺伝子の生体内への組み込み方法は、特に限定されず、例えば、ベクターを用いた方法を利用することができる。かかる海洋動物発光酵素をコードするベクターの作製も、特に限定されず、公知の方法で作製することができる。また、かかるベクターとしては、市販品を使用することもでき、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社製の「Ｒ－ｌｕｃ」や、Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｇａｍｂｈｉｒｌａｂ．製の「Ｒ－ｌｕｃ８」、「Ｒ－ｌｕｃ８．６_５４７」等を使用することもできる。

なお、海洋動物発光酵素は、分子サイズが小さく、生体内に導入しても、生体への負荷が小さく、また、生体内に遺伝子を導入した場合の発現効率が高いという利点もある。なお、海洋動物発光酵素としては、ウミシイタケルシフェラーゼ、ウミサボテンルシフェラーゼ等が挙げられる。

なお、本発明のセレンテラジン誘導体は、溶液として使用することが好ましい。ここで、溶液の調製に使用する溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール等のアルコールが挙げられる。また、溶液中のセレンテラジン誘導体の濃度は、目的に応じて適宜選択できるが、例えば、１ｍＭ～５ｍＭの範囲が好ましい。

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。

＜生成物の同定＞
生成物の同定は、以下の方法で行った。

（１）^１Ｈ核磁気共鳴スペクトル（^１Ｈ－ＮＭＲ）
日本電子社製ＥＣＡ５００（５００ＭＨｚ）を使用して測定し、“^１Ｈ－ＮＭＲ（測定周波数，測定溶媒）：ケミカルシフト値（水素の数，多重度，スピン結合定数）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）はテトラメチルシラン（δ＝０）を内部基準とし、ｐｐｍで表記した。多重度は、ｓ（単一線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線あるいは複雑に重なったシグナル）で表示し、幅広いシグナルについては、ｂｒと付記した。スピン結合定数（Ｊ）は、Ｈｚで記載した。

（２）^１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（^１３Ｃ－ＮＭＲ）
日本電子社製ＥＣＡ５００（１２５ＭＨｚ）を使用して測定し、“^１３Ｃ－ＮＭＲ（測定周波数，測定溶媒）：ケミカルシフト値（多重度）”と記載した。ケミカルシフト値（δ）はテトラメチルシラン（δ＝０）を内部基準とし、ｐｐｍで表記した。

（３）質量スペクトル（ＭＳ）：エレクトロンスプレーイオン法（ＥＳＩ）
日本電子社製ＪＭＳ－Ｔ１００ＬＣ型ＴＯＦ質量分析計ＡｃｃｕＴＯＦを用い、エレクトロンスプレーイオン化法（ＥＳＩ）により測定した。なお、装置の設定は、脱溶媒ガス２５０℃、オリフィス１温度８０℃、ニードル電圧２０００Ｖ、リングレンズ電圧１０Ｖ、オリフィス１電圧８５Ｖ、オリフィス２電圧５Ｖとした。サンプル送液は、インフュージョン法で行い、流速３０μｌ／ｍｉｎとした。“ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ質量数（Ｍ＋付加イオン）”と記載した。

＜ＣＴＺ誘導体１の合成＞
３－ベンジル－５－ブロモピラジン－２－アミン（０．３ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノフェニルボロン酸（０．４５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．００１５ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加えて、９０℃で３時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮を行った。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて分取し、３－ベンジル－５－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ピラジン－２－アミン（７３ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、収率８０％）を黄色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 8.31 (s, 1H), 7.84 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.24-7.32 (m, 5H), 6.80 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 4.30 (s, 2H), 4.16 (s, 2H), 2.99 (d, J = 4.6 Hz, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_１９Ｈ_２１Ｎ_４の計算値 [M+H]+：305.17662、実測値：305.17697

３－ベンジル－５－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ピラジン－２－アミン（０．１ｍｍｏｌ）、１－（４－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジエトキシ－２－プロパノン（０．１５ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解し、１２Ｍの塩酸（１００μＬ）を加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＝１／９－９／１）で分取し、８－ベンジル－６－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）－２－（４－ヒドロキシベンジル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン（ＣＴＺ誘導体１）（２６ｍｇ）を赤色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, メタノール－Ｄ３）：δ 7.91 (s, 1H), 7.44 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.28-7.31 (m, 2H), 7.23 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.79 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 6.69 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 2H), 4.40 (s, 2H), 4.06 (s, 2H), 2.97 (d, J = 12.0 Hz, 6H)
^１３Ｃ－ＮＭＲ（126 MHz, メタノール－Ｄ３）：δ 155.66, 151.51, 136.76, 129.47, 129.28, 128.45, 128.39, 127.26, 126.86, 114.85, 112.05, 105.63, 72.19, 60.92, 39.07
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_２８Ｈ_２６Ｎ_４Ｏ_２Ｎａの計算値 [M+Na]+：473.19534、実測値：473.19480

＜ＣＴＺ誘導体２の合成＞
２，２，６，６－テトラメチルピペリジン（ＴＭＰ）（３．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液に、アルゴン雰囲気下、０℃で、１．６Ｍのｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（３．０ｍｍｏｌ）を加え、５分撹拌した。この反応混合溶液に、ビス［（ピナコラト）ボリル］メタン（３．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液を加え、５分撹拌した。続いて、この反応混合物を－７８℃に冷却し、４－ジメチルアミノベンズアルデヒド（２．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液をゆっくり加え、４時間撹拌した。その後、室温に昇温し、トルエンを加えて減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて分取し、（Ｅ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－（２－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ビニル）アニリン（２６８ｍｇ、０．９８ｍｍｏｌ、収率４９％）を黄色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 7.36 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 17.8 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 5.91 (d, J = 18.3 Hz, 1H), 2.91 (s, 6H), 1.28 (d, J = 3.7 Hz, 12H)
^１３Ｃ－ＮＭＲ（126 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 151.05, 149.99, 128.49, 125.94, 112.04, 83.06, 40.34, 24.96
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_１６Ｈ_２５ＢＮＯ_２Ｎａの計算値 [M+Na]+：274.19783、実測値：274.19916

２－アミノ－３－ベンジル－５－ブロモピラジン（０．５ｍｍｏｌ）、（Ｅ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－（２－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ビニル）アニリン（０．６ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．００２５ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加えて、９０℃で３時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を合わせ硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮を行った。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて分取し、（Ｅ）－３－ベンジル－５－（４－（ジメチルアミノ）スチリル）ピラジン－２－アミン（１４０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、収率８４％）を黄色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 7.99 (s, 1H), 7.45 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.42 (d, 16.0 Hz, 1H), 7.23-7.33 (m, 5H), 6.91 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.29 (s, 2H), 4.15 (s, 2H), 3.00 (s, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_２１Ｈ_２３Ｎ_４の計算値 [M+H]+：331.19227、実測値：331.19267

（Ｅ）－３－ベンジル－５－（４－（ジメチルアミノ）スチリル）ピラジン－２－アミン（０．１ｍｍｏｌ）、１－（４－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジエトキシ－２－プロパノン（０．１５ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解し、１２Ｍの塩酸（１００μＬ）を加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＝１／９－９／１）で分取し、（Ｅ）－８－ベンジル－６－（４－（ジメチルアミノ）スチリル）－２－（４－ヒドロキシベンジル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン（ＣＴＺ誘導体２）（３７ｍｇ）を赤色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, メタノール－Ｄ３）：δ 7.51 (s, 1H), 7.37 (t, J = 7.7 Hz, 4H), 7.30 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.23 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.14 (t, J = 8.3 Hz, 3H), 6.68-6.73 (m, 5H), 4.40 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 2.97 (s, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_３０Ｈ_２８Ｎ_４Ｏ_２Ｎａの計算値 [M+Na]+：499.21099、実測値：499.20943

＜ＣＴＺ誘導体３の合成＞
２，２，６，６－テトラメチルピペリジン（ＴＭＰ）（１．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液に、アルゴン雰囲気下、０℃で１．６Ｍのｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（１．５ｍｍｏｌ）を加え、５分撹拌した。この反応混合溶液に、ビス［（ピナコラト）ボリル］メタン（１．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液を加え、５分撹拌した。続いて、この反応混合物を－７８℃に冷却し、４－ジメチルアミノシンナムアルデヒド（１．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液をゆっくり加え、４時間撹拌した。その後、室温に昇温し、トルエンを加えて減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて分取し、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－（（１Ｅ，３Ｅ）－４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ブタ－１，３－ジエン－１－イル）アニリン（１１０ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、収率３７％）を黄色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 7.30 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.16 (dd, J = 9.0 Hz, 1H), 6.60-6.67 (m, 4H), 5.54 (d, J = 17.8 Hz, 1H), 5.25 (s, 1H), 2.94 (t, J = 4.6 Hz, 6H), 1.27 (dd, J = 26.3, 16.0 Hz, 13H)
^１３Ｃ－ＮＭＲ（126 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 150.96, 150.56, 136.90, 128.22, 127.62, 126.52, 125.59, 125.10, 112.31, 83.13, 83.02, 53.56, 40.43, 25.07, 24.91
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_１８Ｈ_２７ＢＮＯ_２の計算値 [M+H]+：300.21348、実測値：300.21389

２－アミノ－３－ベンジル－５－ブロモピラジン（０．２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－（（１Ｅ，３Ｅ）－４－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ブタ－１，３－ジエン－１－イル）アニリン（０．２４ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．００１ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加えて、９０℃で３時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を合わせ硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮を行った。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて分取し、３－ベンジル－５－（（１Ｅ，３Ｅ）－４－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ブタ－１，３－ジエン－１－イル）ピラジン－２－アミン（６１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、収率８５％）を黄色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 7.90 (s, 1H), 7.23-7.35 (m, 8H), 6.80 (dd, J = 15.5, 10.9 Hz, 1H), 6.65-6.69 (m, 3H), 6.55 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.11 (s, 2H), 2.96 (s, 6H)
^１３Ｃ－ＮＭＲ（126 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 151.25, 150.25, 142.05, 141.06, 139.05, 136.86, 134.38, 131.31, 129.10, 128.65, 127.76, 127.15, 126.38, 125.90, 124.92, 112.50, 41.43, 40.53
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_２３Ｈ_２５Ｎ_４の計算値 [M+H]+：357.20792、実測値：357.20733

３－ベンジル－５－（（１Ｅ，３Ｅ）－４－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ブタ－１，３－ジエン－１－イル）ピラジン－２－アミン（０．１ｍｍｏｌ）、１－（４－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジエトキシ－２－プロパノン（０．１５ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解し、１２Ｍの塩酸（１００μＬ）を加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＝１／９－９／１）で分取し、８－ベンジル－６－（（１Ｅ，３Ｅ）－４－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ブタ－１，３－ジエン－１－イル）－２－（４－ヒドロキシベンジル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン（ＣＴＺ誘導体３）（２０ｍｇ）を赤色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, メタノール－Ｄ３）：δ 7.47 (s, 1H), 7.36 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.27-7.33 (m, 4H), 7.23 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.02-7.09 (m, 1H), 6.77 (dd, J = 15.2, 10.6 Hz, 1H), 6.62-6.71 (m, 5H), 6.33 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.38 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 3.87 (d, J = 14.9 Hz, 0H), 2.95 (s, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_３２Ｈ_３０Ｎ_４Ｏ_２Ｎａの計算値 [M+Na]+：525.22664、実測値：525.22449

＜ＣＴＺ誘導体４の合成＞
２，２，６，６－テトラメチルピペリジン（ＴＭＰ）（１．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液に、アルゴン雰囲気下、０℃で１．６Ｍのｎ－ブチルリチウムのヘキサン溶液（１．５ｍｍｏｌ）を加え、５分撹拌した。この反応混合溶液に、ビス［（ピナコラト）ボリル］メタン（１．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液を加え、５分撹拌した。続いて、この反応混合物を－７８℃に冷却し、（２Ｅ，４Ｅ）－５－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ペンタ－２，４－ジエナール（１．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１ｍＬ）溶液をゆっくり加え、４時間撹拌した。その後、室温に昇温し、トルエンを加えて減圧濃縮した。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４／１）にて分取し、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）アニリン（６８ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 7.31 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.09 (dd, J = 17.5, 10.6 Hz, 1H), 6.74-6.44 (comp., 5H), 6.34 (dd, J = 14.9, 10.9 Hz, 1H), 5.53 (d, J = 17.2 Hz, 1H), 2.98 (s, 6H), 1.28 (s, 12H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_２０Ｈ_２９ＢＮＯ_２の計算値 [M+H]+：326.2291、実測値：326.2297

２－アミノ－３－ベンジル－５－ブロモピラジン（０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－４－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロラン－２－イル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）アニリン（０．５ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．００２ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（１ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（１ｍＬ）を加えて、９０℃で３時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ×２）で抽出し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を合わせ硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮を行った。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝１／１）にて分取し、３－ベンジル－５－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）ピラジン－２－アミン（１７０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、収率８９％）を黄色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, クロロホルム－Ｄ）：δ 7.90 (s, 1H), 7.33-7.22 (comp., 8H), 6.73 (dd, 15.5, 10.9 Hz, 1H), 6.67 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.61-6.41 (m, 4H), 4.48-4.35 (2H), 4.17-4.06 (2H), 2.96 (s, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_２５Ｈ_２７Ｎ_４の計算値 [M+H]+：383.2236、実測値：383.2229

３－ベンジル－５－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）ピラジン－２－アミン（０．０５ｍｍｏｌ）、１－（４－ヒドロキシフェニル）－３，３－ジエトキシ－２－プロパノン（０．１ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解し、１２Ｍの塩酸（１００μＬ）を加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＝１／９－９／１）で分取し、８－ベンジル－６－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）－２－（４－ヒドロキシベンジル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン（ＣＴＺ誘導体４）（２１ｍｇ）を赤色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, メタノール－Ｄ３）：δ 7.47 (s, 1H), 7.27-7.37 (comp., 7H), 7.23 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.02-7.09 (m, 2H), 6.77 (dd, J = 15.2, 10.6 Hz, 1H), 6.62-6.71 (m, 6H), 6.33 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.38 (s, 2H), 4.03 (s, 2H), 2.95 (s, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_３４Ｈ_３３Ｎ_４Ｏ_２の計算値 [M+H]+：529.2604、実測値：529.2637、Ｃ_３４Ｈ_３２Ｎ_４Ｏ_２Ｎａの計算値 [M+Na]+：551.2423、実測値：551.2409、Ｃ_３４Ｈ_３２Ｎ_４Ｏ_２Ｋの計算値[M+K]+：567.2162、実測値：567.2144

＜ＣＴＺ誘導体５の合成＞
＜ＣＴＺ誘導体２の合成＞の項に記載の方法で、（Ｅ）－３－ベンジル－５－（４－（ジメチルアミノ）スチリル）ピラジン－２－アミンを得た。
（Ｅ）－３－ベンジル－５－（４－（ジメチルアミノ）スチリル）ピラジン－２－アミン（０．１ｍｍｏｌ）、１－フェニル－３，３－ジエトキシ－２－プロパノン（０．１５ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解し、１２Ｍの塩酸（１００μＬ）を加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＝１／９－９／１）で分取し、（Ｅ）－２，８－ジベンジル－６－（４－（ジメチルアミノ）スチリル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン（ＣＴＺ誘導体５）（３７ｍｇ）を赤色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, メタノール－Ｄ３）：δ 7.15-7.40 (comp., 14H), 6.70-6.75 (comp., 3H), 4.40 (s, 2H), 4.15 (s, 2H), 2.96 (q, J = 2.9 Hz, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_３０Ｈ_２９Ｎ_４Ｏの計算値 [M+H]+：461.2341、実測値：461.2351

＜ＣＴＺ誘導体６の合成＞
＜ＣＴＺ誘導体３の合成＞の項に記載の方法で、３－ベンジル－５－（（１Ｅ，３Ｅ）－４－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ブタ－１，３－ジエン－１－イル）ピラジン－２－アミンを得た。
３－ベンジル－５－（（１Ｅ，３Ｅ）－４－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ブタ－１，３－ジエン－１－イル）ピラジン－２－アミン（０．１ｍｍｏｌ）、１－フェニル－３，３－ジエトキシ－２－プロパノン（０．１５ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解し、１２Ｍの塩酸（１００μＬ）を加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＝１／９－９／１）で分取し、２，８－ジベンジル－６－（（１Ｅ，３Ｅ）－４－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ブタ－１，３－ジエン－１－イル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン（ＣＴＺ誘導体６）（２０ｍｇ）を赤色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, メタノール－Ｄ３）：δ 7.18-7.36 (comp., 16H), 6.65-6.71 (comp., 3H), 4.36 (s, 2H), 4.12 (s, 2H), 2.94 (s, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_３２Ｈ_３１Ｎ_４Ｏの計算値 [M+H]+：487.2498、実測値：487.2504

＜ＣＴＺ誘導体７の合成＞
＜ＣＴＺ誘導体４の合成＞の項に記載の方法で、３－ベンジル－５－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）ピラジン－２－アミンを得た。
３－ベンジル－５－（（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ）－６－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）ピラジン－２－アミン（０．０５ｍｍｏｌ）、１－フェニル－３，３－ジエトキシ－２－プロパノン（０．１ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶解し、１２Ｍの塩酸（１００μＬ）を加え、６０℃で１２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を減圧濃縮した。得られた残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ＝１／９－９／１）で分取し、２，８－ジベンジル－６－（（１Ｅ，３Ｅ,５Ｅ）－６－（４－（ジメチルアミノ）フェニル）ヘキサ－１，３，５－トリエン－１－イル）イミダゾ［１，２－ａ］ピラジン－３（７Ｈ）－オン（ＣＴＺ誘導体７）（２１ｍｇ）を赤色固体として得た。反応スキーム及び生成物の同定結果を以下に示す。

^１Ｈ－ＮＭＲ（500 MHz, メタノール－Ｄ３）：δ 7.06-7.36 (comp., 18H), 6.61-6.73 (comp., 3H), 4.36 (s, 2H), 4.12 (s, 2H), 2.95 (s, 6H)
ＨＲ－ＭＳ（ＥＳＩ）： m/z Ｃ_３４Ｈ_３３Ｎ_４Ｏの計算値 [M+H]+：513.2654、実測値：513.2682

＜基質溶液の調製＞
上記のようにして合成したＣＴＺ誘導体を、メタノール（ＭｅＯＨ）に加え、２．５ｍＭの基質溶液を調製した。また、比較のために、下記化学式：

で表わされる天然型のセレンテラジン（天然型ＣＴＺ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いた基質溶液も調製した。

＜使用したルシフェラーゼ＞
ルシフェラーゼ（酵素）としては、Ｒ－ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製のベクター）、Ｒ－ｌｕｃ８（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｇａｍｂｈｉｒｌａｂ．製のベクター）、Ｒ－ｌｕｃ８．６_５４７（Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｇａｍｂｈｉｒｌａｂ．製のベクター）を用いた。

＜ルシフェラーゼの調製＞
哺乳細胞へのトランスフェクションは、ＨｅＬａＳ３細胞を用いた。Ｄ－ＭＥＭ（低グルコース、含１０％ＦＢＳ、含１％ペニシリンストレプトマイシン、和光純薬工業）で培養したＨｅｌａ細胞を、８０％コンフレントの状態でトランスフェクション試薬Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，Ｌｉｎｅａｒ（ＭＷ２５，０００、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）と各種ルシフェラーゼが挿入されたＤＮＡ（０．３μｇ）を混合し、トランスフェクションを行った。
トランスフェクションから２４時間後、細胞をトリプシン処理し、細胞剥離し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１０％ＦＢＳ、ｇｉｂｃｏ）に懸濁した後、遠心分離を行い、上清を取り除いた後に、５００μＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２で再度懸濁し、各種ルシフェラーゼ発現細胞として使用した。

＜発光測定法＞
以下の方法で、発光系の発光強度と発光波長を測定した。

（１）発光強度
発光強度の測定には、アトー株式会社製のルミノメーターＡＢ－２２８０を用いた。
１．５ｍＬのエッペンチューブに、作製したルシフェラーゼ発現細胞１８μＬと、２．５ｍＭの基質溶液（ＭｅＯＨで調製）２μＬを混合し、その発光を２０秒間測定し、その２０秒間の積算値を発光強度とした。結果は、天然型ＣＴＺを使用した例の発光強度を基準とし、該基準に対する割合を百分率で表示した。天然型ＣＴＺ及びＣＴＺ誘導体１～３に対する結果を表１～３に示す。

（２）発光波長
発光波長の測定には、アトー株式会社製の微弱発光スペクトロメーターＡＢ－１８５０を用いた。
２００μＬのＰＣＲチューブに、作製したルシフェラーゼ発現細胞１８μＬと、２．５ｍＭの基質溶液（ＭｅＯＨで調製）２μＬを混合し、その発光スペクトルとピーク波長を測定した。天然型ＣＴＺ及びＣＴＺ誘導体１～３に対する結果を表１～３、図１～３に示す。また、ＣＴＺ誘導体４～７に対する結果を表４に示す。

表１～４及び図１～３から、本発明のセレンテラジン誘導体は、天然型のセレンテラジンよりも長波長光を発することが可能であり、海洋動物由来の発光系における発光基質として有用であることが分かる。

本発明のセレンテラジン誘導体は、海洋動物由来の発光系における発光基質として利用できる。

Claims

下記一般式（I）：

［式中、Ｒ^１は、窒素を含み且つ芳香環を含む基であり、Ｒ^２は、ベンゼン環、フラン環、ピロール環又はチオフェン環を含む基であり；ｎは、１～３の整数である］で表されることを特徴とする、セレンテラジン誘導体。
下記一般式（II）：

［式中、Ｒ^３及びＲ^４は、それぞれ独立して－Ｈ、又は炭素数１～３のアルキル基であり、Ｒ^３及びＲ^４は、互いに結合して環を形成してもよく；Ｒ^５は、－Ｈ、－ＯＨ、又は－ＮＲ^６Ｒ^７であり（但し、Ｒ^６及びＲ^７は、それぞれ独立して－Ｈ、又は炭素数１～３のアルキル基であり、Ｒ^６及びＲ^７は、互いに結合して環を形成してもよい）；ｎは、１～３の整数である］で表される、請求項１に記載のセレンテラジン誘導体。
前記一般式（II）中のＲ^３及びＲ^４が、メチル基である、請求項２に記載のセレンテラジン誘導体。
前記一般式（II）中のＲ^５が、－Ｈ、又は－ＯＨである、請求項２又は３に記載のセレンテラジン誘導体。
下記一般式（III）又は（IV）：

［式（III）及び（IV）中、ｎは、１～３の整数である］で表される、請求項２～４のいずれか一項に記載のセレンテラジン誘導体。