WO2014053605A1 - Analogues de la coelenterazine emettant une lumiere decalee vers le rouge visant l'imagerie in vivo - Google Patents

Analogues de la coelenterazine emettant une lumiere decalee vers le rouge visant l'imagerie in vivo Download PDF

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WO2014053605A1
WO2014053605A1 PCT/EP2013/070644 EP2013070644W WO2014053605A1 WO 2014053605 A1 WO2014053605 A1 WO 2014053605A1 EP 2013070644 W EP2013070644 W EP 2013070644W WO 2014053605 A1 WO2014053605 A1 WO 2014053605A1
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WO
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clz
compound
coelenterazine
radical
bioluminescence
Prior art date
Application number
PCT/EP2013/070644
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English (en)
Inventor
Robert Dodd
Philippe Brulet
Sandrine Picaud
Ronan GEALAGEAS
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to the synthesis and use of novel coelenterazine analogs in the field of bioluminescence.
  • the new coelenterazine analogues according to the present invention cause a red shift of the bioluminescent light emitted by two luciferases, aequorin and Renilla. They also cause a red shift of the bioluminescent light emitted by the obelin.
  • the present invention relates to the use of novel bioluminescent probes that can visualize calcium dynamics in animals in motion in non-invasive modes of in vivo optical imaging.
  • Bioluminescence is the production and emission of light by a living organism resulting from a chemical reaction in which chemical energy is converted into light energy. Bioluminescence can be generated by symbiotic organisms hosted within a larger organism. Bioluminescence occurs when a chemical reaction between a protein (a luciferase) and its "substrate” (a luciferin) takes place. This emits light by oxidizing through the intervention of luciferase. The chemical reaction can take place inside or outside the cell. Some luciferases require binding to a substrate to produce light: they are called photoproteins. But in general, they must fix luciferin within an active site and form an initially stable complex. In this case, the luciferase precursor of photoprotein is called apoprotein.
  • the bioluminescence phenomenon is also often accompanied by a transfer of energy bioluminescence or BRET (Bio Luminescence Resonance Energy Transfer) from luciferase to fluorescent proteins: the light from luciferase will be picked up by another protein, which will then, by fluorescence phenomenon, re-emit light at a wavelength ( ⁇ ) higher.
  • BRET Bio Luminescence Resonance Energy Transfer
  • the most well-known fluorescent protein is certainly GFP (Green
  • a non-radiative energy transfer of the BRET type can take place from the photoprotein to the GFP protein which emits a green light. This is particularly the case in the jellyfish that has aequorin photoprotein.
  • the luciferin of interest is coelenterazine which is the natural cofactor of several luciferases of various origins, in particular Renilla luciferase (Rluc), derived from the thought of sea Renilla reniformis, and of ⁇ aequorin, luciferase produced by the aequorid jellyfish seen above, or Aequorea Victoria, or obelin. luciferase produced by Ohelia hydroids.
  • Rluc Renilla luciferase
  • ⁇ aequorin luciferase produced by the aequorid jellyfish seen above, or Aequorea Victoria, or obelin.
  • luciferase produced by Ohelia hydroids The chemical structure denoted CO of coelenterazine, or "native" coelenterazine, is represented below.
  • Equorin is a photoprotein composed of an apoprotein of 189 amino acid residues, apoaequorin, and its luciferin, the so-called coelenterazine.
  • Coelenterazine is stabilized as a hydroperoxide within the active site of apoaequorin [Head, JF; Inouye, S.; Terariishi, K.; Shimomura, O. Nature 2000, 405, 372-376], forming L "aequorin.
  • aequorin ⁇ is sensitive to calcium luciferase bioluminescence phenomenon which is triggered only in the presence of ions calcium in the medium
  • Aequorinc has three calcium binding sites [Inouye, S., Noguchi, M., Sakaki, Y., Takagi, Y., Miyata, T., Iwanaga, S., Miyata, T. Tsuji, FI, Fr Natl Acad Sci USA 1985, 82, 3154-3158]
  • the apoaequorincocelenterazine complex is stable until activated by calcium ions.
  • two calcium ions bind to aequorin [Shimomura, O. Biochem.
  • aequorin has not shown to date particular toxicity especially with respect to cellular or embryonic functioning which makes this photoprotein all the more relevant for applications in vivo imaging.
  • Renilla luciferase is not a photoprotein since it does not form a stable complex with coelenterazine. On the contrary, it acts as an enzyme catalyzing the oxidation of coelenterazine to coelenteramide, always presence of air [Cormier, MJ; Lee, J.; Wampler, I Annu. Rev. Biochem. 1975, 44, 255-272; Hori,. ; Wampler, JE; Matthews, J-; Cormier, M J. Biochemistry 1973, 12, 4462-4468], Unlike aequorin, click is not sensitive to calcium. Renilla luciferase is routinely used as a reporter for gene expression, particularly for the detection of cancer cells, the study of the development of organisms or the monitoring of transplanted stem cells.
  • Renilla luciferase can be linked, as is the case in nature, the CBP protein (coelenterazine B 'am' g Protein) [Charbonnea, H.; Cormier, MJJ Bio ⁇ . Chem. 1979, 254, 769-780], which can then in turn bind the coenzyenterazine and make the "Renilla - CBP - coelenterazine" system sensitive to calcium.
  • the CBP protein has three Ca 2+ binding sites.
  • Renilla-CBP association is therefore of interest since it gives rise to a bioluminescent system that is also calcium-dependent and also has the advantage of protecting coelenterazine or its analogues from direct oxidation, ie that is to say, not catalyzed by the enzyme: the coelenterazine once fixed at the site of the CBP protein is protected from direct oxidation.
  • Renilla luciferase has the advantage of being more "tolerant" to variations of structures of coelenterazine analogues accepted by the enzyme [Inouye, S.; Shimomura, O. Biochem. Biophys. Res. Common. 1997, 233, 349-353], especially compared to apoacquorin-accepted analogues: Renilla recognizes a wider variety of analogues than apoaequorin.
  • One of the objectives of the present invention is to improve the bioluminescence techniques and in particular bioluminescence-fluorescence coupling techniques in order to better image the expression of the luciferase gene in vivo and non-invasively, to better analyze the regulation.
  • an endogenous gene to better evaluate a gene therapy protocol or to better monitor the growth and migration of cancer cells.
  • the improvement of these techniques targeted by the present invention should allow the progress of drug monitoring in a living organism in real time and non-invasively, the more effective evaluation of the activity of therapeutic molecules and therefore the easier improvement of the latter.
  • the GFP-aequorin construct is already used for experiments conducted in particular on cell cultures, Drosophila [Martin, J. R.; Rogers, K. L.; Chagneau, C.; Burnlet, P. PLoSONE 2007, 2, c275] or zebrafish [Naumann, E.A .; Stammf, A. R.; Prober, D. A.; Schier, A.F .; Engert, F. Nat.Neurosci. 2010, 13, 513-520].
  • Patent applications relate, for example, to applications of this GFP-aequorin construct on in vitro cells or amphibian organisms such as those of the genus xenopus (WO 01/92300 and US 2003/0066095).
  • aequorin / fluorescent protein constructs are their use in mammals.
  • work has already been conducted from the chimeric GFP-aequorin construct introduced into living mice, but then localized in "surface" organs, in this case muscle fibers such as tibial muscle fibers. previous [Rogers, KL; Picaud, S.; Roncali, E.; Boisgard, R.; Colasante, C.; Stinnakre, J.; Tavitian, B.; Brûlet, P. PLoSONE 2007, 2, e974].
  • one of the major obstacles to the use of aequorin or Renilla luciferases in fundamental research, and more particularly for in vivo imaging, is the wavelength of the light emitted by these, respectively 471 and 477 nm, which are blue emissions (446 nm ⁇ ⁇ 520 nm). At such wavelengths, photons are absorbed and diffracted by tissue, bone and hemoglobin, which prohibits the non-invasive detection of bioluminescence produced in deep tissues (liver, heart ...) or in the brain.
  • the light emitted in the red (600 nm ⁇ ⁇ 780 rrm) and the infrared light (780 nm ⁇ ⁇ 500 ⁇ ) passes through the tissues and the cranial box.
  • the detection of a bioluminescence emitted in the red is possible and can allow the imaging of deep tissues including noninvasive functional brain imaging during the performance of cognitive task or learning.
  • the number of photons of the bioluminescent light is transferred from aequorin to the RFP is too low to obtain a detectable light emission within a living mammal: the areas of energy of the emission system coelenterazine - luciferase and fluorescent protein excitation do not overlap enough.
  • the present invention relates to an original approach that differs from the approaches of fusing aequorin to fluorescent proteins in that it is purely chemical.
  • the light is emitted by an intermediate excited state of coelenterazine.
  • the physicochemical characteristics of the emitted light are a function of the electron distribution in extended resonance (extended mesomerism) in this intermediate excited state.
  • the inventors thus formulated the original hypothesis according to which a red displacement of the bioluminescent light could be obtained by synthesizing coelenterazine analogs in which either the resonance level (mesomerism) of the molecule is increased or, according to the "push-pull" concept, electron-donor substituents are introduced on a part of the molecule (for example, on the nucleus phenolic) while electron-withdrawing substituents are inserted into another part of the molecule (for example, the benzylic ring).
  • Renilla mutant luciferases have been constructed, which can lead to a shift in the wavelengths of the 66 nm red-light bioluminescence spectrum (peak at 547 nm). These mutant luciferases have shown greater stability and higher output of emitted light than native luciferase.
  • the red-shifted emission was also obtained by the fusion of a bioluminescent protein (luciferase or photoprotein) with a suitable fluorescent protein (such as GFP for example). This approach is based on the BRET type energy transfer seen above.
  • Vysotski group also showed that an analogue of coelenterazine (noted C2 below) is an efficient substrate for a reaction catalyzed by mutant Renilla luciferases which then fluoresce in the "yellow" (575 nm ⁇ ⁇ 590 nm ). Displacement to longer bioluminescent wavelengths reaches 40 nm and allows application in vivo imaging.
  • C2 an analogue of coelenterazine
  • Coelenterazines carrying a benzyl group or an alkyl chain in place of the initial 4-hydroxybenzyl group are often used as simplified models for the study of determination of light-emitting species in the bioluminescence of aequorin [Hirano, T.; Gomi, Y .; Takahashi, T.; Kitahara, K.; Qi, FC; Mizoguchi, I.; yushin, S.; Ohashi, M. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 5771-5774; Mori, K.; Makis. ; Niwa, H.; Ikeda, H.; Hirano, T.
  • the S. Inouye group also evaluated the bioluminescence capacities of semi-synthetic aequorins using modified coelenterazines in the nature of the substituent (methyl, ethyl, triiloromethyl, methoxy) linked at the 3- or 4-position of the phenyl ring of the benzyl group or directly linked to the benzyl (methyl) position [Inouye, S.; silt, R.; Sahara, Y .; Hisada, S .; Hosaya, T. Anal. Biochem. 2010, 407, 247-252].
  • the literature reports only one analogue (noted C2 above) of coelenterazine bound to a non-mutant Juciferase capable of causing a red shift of at least 20 nm in the bioluminescence for the wavelength of the light emitted compared to native coelenterazine.
  • the relative maximum intensity of the bioluminescent beam with respect to aequorin is only 0.05%, which means that this molecule is practically inactive at this level and therefore unusable in vivo imaging in combination with non-mutant luciferase [Shimomura, O .; Musicki, B.; Kishi, Y. Biochem. J. 1989, 261, 913-920; Shimomura, O .; Musicki, B.; Kishi, Y. Biochem. J. 1988, 251, 405-410].
  • novel coelenterazine analogs useful in bioluminescence for in vivo imaging have been synthesized.
  • the synthetic route used to obtain these molecules is known to those skilled in the art. It refers in particular to the palladium catalyzed Negishi coupling reaction between (3,5-dibromo) aminopyrazinc and benzylzinc chloride, generated in situ from the corresponding Grignard reagent and zinc dichloride [M]. .
  • Adamczyk et al. [Adamczyk, M.; Akireddy, S.R .; Johnson, D.D .; Mattingly P.G. Pan, Y .; Reddy, R.T. Tetrahedron 2003, 59, 8129-8142].
  • the resulting aminopyrazine compound can then be involved in various palladium coupling reactions, including Suzuki couplings.
  • n is an integer from 0 to 4, preferably from 0 to 2;
  • EDG represents an electron donor group independently selected from hydroxy (-OH), hydroxy (C1-C6) alkyl, (C1-C6) alkoxy, amino (-N3 ⁇ 4), (C1-C6) alkylamino, (C1-C6) dialkylamino, thiol (-SH ), and C1-C6 alkylthio;
  • R represents a benzyl, ⁇ -styryl or naphthyl radical
  • X represents a hydroxy radical or a halogen selected from a chlorine, bromine, iodine or fluorine atom; with the proviso, however, that when X represents a hydroxyl radical and R a benzyl radical, then n is equal to 2 and the two EDG groups represent a hydroxyl radical, preferably in the 3 and 5 positions of the phenyl ring which carries them; and with the exception of those compounds for which X represents a fluorine or iodine atom, n is 0 and R represents a benzyl radical.
  • the term "electron-donor group” is intended to mean an atom or a group of atoms which has the capacity to polarize a ⁇ bond by inductive effect +1 by repelling the electrons and / or an atom or a group of atoms that has the ability to delocalize electrons of non-binding doublets and ⁇ -bonds by mesomere + M effect by repelling the electrons.
  • C 1 -C 6 alkyl is meant, in the sense of the present invention, a saturated monovalent hydrocarbon chain, linear or branched, having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms.
  • C 1 -C 6 hydroxyalkyl is meant, within the meaning of the present invention, an HOA- group with A representing a divalent hydrocarbon chain saturated, linear or branched, having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms.
  • A representing a divalent hydrocarbon chain saturated, linear or branched, having 1 to 6, preferably 1 to 4, carbon atoms.
  • C1-C6 alkoxy group means a C1-C6 alkyl group, as defined above, linked to the remainder of the molecule via a hydrogen atom. 'oxygen. By way of example, mention may be made of methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy or even tertiary-butoxy groups.
  • C1-C6 alkylamino group means an -NHA group with A representing a C1-C6 alkyl group as defined above.
  • A representing a C1-C6 alkyl group as defined above.
  • C 1 -C 6 dialkylamino group is meant, in the sense of the present invention, a group -NAB with A and B representing, independently of one another, a C 1 -C 6 alkyl group as defined herein. -above.
  • a and B representing, independently of one another, a C 1 -C 6 alkyl group as defined herein. -above.
  • C 1 -C 6 alkylthio group is meant, in the sense of the present invention, a C 1 -C 6 alkyl group, as defined above, linked to the remainder of the molecule via an atom. of sulfur.
  • ⁇ -styryl radical is intended to mean a monovalent styrene aromatic group which can bind to another molecule via the vinyl carbon atom directly attached to the phenyl ring.
  • the term "naphthyl radical” is intended to mean a monovalent aromatic group consisting of two benzene rings which together share two carbon atoms which are themselves bonded to one another, which group can then bind to each other. to another molecule via one of the carbon atoms directly bonded to one of the carbon atoms shared by the two benzene rings.
  • halogen is meant, in the sense of the present invention, the fluorine, chlorine, bromine and iodine atoms.
  • X in the compounds of formula (I) above represents a halogen chosen from a chlorine, bromine, iodine or fluorine atom, preferably a chlorine or fluorine atom, more preferably a fluorine atom.
  • the compounds of formula (1) according to the present invention may be characterized in that X represents a hydroxy radical.
  • X represents a hydroxy radical.
  • the compounds of formula (I) above are characterized in that n is between 0 and 4 and the EDG group (s) are (are) independently chosen from a hydroxy and (C1-C6) hydroxyalkyl radical.
  • R represents an ⁇ -styryl or naphthyl radical, preferably an ⁇ -styryl radical.
  • the compounds of formula (I) according to the present invention are characterized in that R represents a benzyl radical, n is equal to 2 and the two EDG groups represent a hydroxy radical, preferentially in the 3 and 5 position of the phenyl ring which carries them.
  • the novel compound of formula (1) above is characterized in that it is chosen from the following compounds:
  • compound 1 is a methoxy derivative of coelenterazine also called CLZ-1
  • compound 2 is a dihydroxy derivative of coelenterazine also called CLZ-074
  • compound 3 is a styrene derivative of coelenterazine also called CLZ- 136
  • compound 4 is a naphthalene derivative of coelenterazine also called CLZ-135
  • compound 5 is a methoxy derivative of coelenterazine also called CLZ-374
  • compound 6 is a me / a-hydroxy derivative of coelenterazine also called CLZ-370.
  • compound 7 for which, compound 7 is a nitro derivative of coelenterazine also called CLZ-121 and compound 8 is a carboxylate derivative of coelenterazine also called CLZ-132.
  • the term "electron-withdrawing group” is intended to mean an atom or a group of atoms which has the capacity to polarize an ⁇ bond by inductive effect -I by attracting the electrons and / or an atom or a group of atoms that has the ability to delocalize electrons from non-binding doublets and ⁇ -bonds by the mesomeric effect -M by attracting the electrons.
  • Another subject of the invention relates to a compound (s) of formula (I) above for its (their) use for a method of in vivo imaging by bioluminescence on an animal in an organ, a fluid or a body tissue.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to a compound (s) for its (their) use for monitoring calcium metabolism.
  • said organ, fluid or body tissue of an animal is the brain.
  • said animal is a mammal.
  • the term "animal” means vertebrates, more particularly mammals and primates. In a particular embodiment of the present invention the mammals are humans.
  • the term "organ” means a set of tissues contributing to the achievement of a physiological function in an animal.
  • the organ according to the present invention may be in particular, the brain, the spinal cord, the liver, the stomach, the heart, the lungs, the esophagus, the spleen, the pancreas, the kidneys or the bladder.
  • the term "body fluid” is intended to mean any liquid produced by a living animal.
  • the body fluid according to the present invention can be, in particular, blood, lymph, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, pericardial fluid, peritoneal fluid, urine, saliva , bile, pancreatic juice, gastric juice or amniotic fluid.
  • body tissue is understood to mean any set of cells that are similar and of the same origin, grouped into a functional group, that is to say, contributing to the same function in an animal.
  • the body tissue according to the present invention may include, epithelial, lining or glandular tissue, connective tissue, muscle tissue or nerve tissue.
  • imaging method is meant, for the purposes of the present invention, the means for acquiring and restoring optical images of an organ, fluid or animal body tissue, from the measurement of physical phenomena such as the optical path of light.
  • in vivo searches or examinations performed on an animal living organism, which may be advantageously moving or immobilized using a yoke, as opposed to in vitro or ex vivo.
  • Another object of the present invention relates to the use of a compound (s) selected from the derivatives of coelenterazine of formula. (I) above, in an in vivo bioluminescent imaging method in an organ, fluid or animal body tissue.
  • a preferred embodiment of the present invention relates to the use of a compound (s) chosen from the derivatives of coelenterazine of formula (I) above, for the monitoring of calcium metabolism, the organ , the fluid or body tissue being preferably the brain.
  • Another preferred embodiment of the present invention relates to the use of a compound (s) chosen from the coelenterazine derivatives of formula (I) above, characterized in that the method is applied to an animal, preferentially a mammal.
  • Another subject of the invention relates to a method for the optical detection of the activity of an organ, a fluid or a body tissue of an animal, comprising:
  • the non-invasive recording of the light signals emitted by the polypeptide in the presence or absence of calcium said light signals having a wavelength between 470 nm and 780 nm, preferably between 500 nm and 690 nm, and even more preferably between 600 nm and 650 nm.
  • the method according to the present invention may also be characterized in that the fluorescent protein is chosen from the group consisting of the GFP (green fluorescent protein), CFP (cyan fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein) and RFP (red fluorescent protein) proteins. ), preferably GFP or RFP.
  • the step (1) of synthesis and production of the polypeptide in the case of apoaequorin or apo-obelin can be carried out by incubation of at least one coelenterazine, chosen from the coelenterazines of the present invention in cells expressing aequorin or the chimera of interest.
  • these cells are obtained by genetic modification techniques, described in particular in patent EP1292613, capable of being extended to any luciferase dependent on coelenterazine, which include the setting of point of a calcium-sensitive recombinant polypeptide or a nucleic acid sequence encoding said recombinant polypeptide.
  • the recombinant polypeptide then consists of aequorin or luciferase and the coupled fluorescent protein to allow BRET.
  • the incubation according to the process of the invention is equivalent to exchanging the native coelenterazine by at least one of its synthetic analogues chosen from the compounds of the invention.
  • US Pat. No. 8,263,821 which relates to non-invasive imaging with this type of probe.
  • patent applications EPI 714155 and US2007 / 0274923 also relate to this type of genetic probes.
  • the step (1) of synthesis and production of the polypeptide in the case of the luciferase Renifla can be carried out without incubation by adding at least one coelenterazine, selected from the coelenterazines of the present invention, to a solution of luciferase Renifla.
  • the luciferase is cosurally bound to the fluorescent protein, which is advantageously GFP or RFP. This link between the two proteins allows the bioluminescence by energy transfer type BRET.
  • a luminous image is then recorded in the animal organ, fluid or animal tissue, said organ, fluid or body tissue being preferentially the brain, and said animal being preferably a mammal.
  • the inventors have shown that it is possible to obtain original synthetic analogues of native coelenterazinc capable of displacing vivo up to 114 nm the bioluminescent wavelength emitted by an associated luciferase. Such a result has never been presented before.
  • the present invention relates to a calcium-sensitive or non-sensitive polypeptide, characterized in that it consists of a luciferase bound to a fluorescent protein, wherein said luciferase is selected from the group consisting of an apoacquorin or apo-obejne linked to at least one compound according to the invention, and Renilla luciferase, linked to at least one compound according to the invention, or linked to a CBP protein (coelenterazine binding protein) itself linked to at least one compound according to invention, and wherein said fluorescent protein is peptide-bound to said luciferase for energy transfer by BRET, particularly for parenteral, intraperitoneal or intramuscular administration.
  • BRET calcium-sensitive or non-sensitive polypeptide
  • the fluorescent protein is chosen from the group consisting of the GFP (green fluorescent protein), CFP (cyan fluorescent protein), YFP (yellow fluorescent protein) and RFP (red fluorescent protein) proteins, preferentially GFP or RFP.
  • the present invention also relates to said polypetide for use in optically detecting the activity of an organ, fluid or body tissue of an animal, including non-invasive recording of light signals emitted by the animal.
  • polypeptide in the presence or absence of calcium said light signals having a wavelength of between 470 nm and 780 ⁇ m, preferably between 500 nm and 690 nm, and even more preferentially between 600 nm and 650 nm.
  • Figure 1 Emission spectra of the RFP-Aequorinc molecule with the native coelenterazine (RA / CLZ-native) and the synthetic analog CLZ-136 (RA / CLZ-136).
  • Figure 2 Emission spectra of Renilla reniformis (Rluc) with native coelenterazine (Rluc / CLZ-nativc), and synthetic analogues CLZ-1 (Rluc / CLZ- ⁇ ⁇ ), CLZ-74 (Rluc / CLZ -074) and CLZ-370 (luc / CLZ-370).
  • Figure 3 Standardized emission spectra of bioluminescence (A) and fluorescence (B) of semi-synthetic obeiine (left) and semi-synthetic aequorin (right) with native coelenterazine (1), and compounds CLZ-110 (2), CLZ-136 (3), CLZ-135 (4), CLZ-370 (5), and CLZ-374 (6).
  • the x-axis represents the wavelength in nm, and the y-axis the relative intensity of bioluminescence or fluorescence.
  • Figure 4 Ca 2+ concentration effect curve for semisynthetic photoproteins bound to CLZ-136 ( ⁇ ) or CLZ-095 ()), compared with aequorin (left) and obeiine ( right) complexed with native coelenterazine (a).
  • the ordinate axis represents the log (L / L) value in which L represents the light intensity at a particular Ca 2 ion concentration and L i nt , the total light intensity at the Ca 2+ saturating concentration, and
  • the abscissa represents the log ([Ca 2+ ]) value, the [Ca 2+ ] concentration being expressed in mol.L "1 (M) .
  • the saturating Ca 2+ concentration corresponds to the concentration of Ca 2 'ion that saturates the protein.
  • FIG. 5 Dose-response curve for activation with ATP of the P2Y2 receptor of CHO cells expressing apo-aequorin in a complexed manner with the compound CLZ-136 (circles, Y axis, left) and native coelenterazine ( squares, right Y axis).
  • ATP concentrations are 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, and 30.0 ⁇ , respectively.
  • Each point represents the mean ⁇ the standard error of 10 experiments.
  • This curve represents the light intensity expressed in 10 5 RLU depending on the value of the logarithm of the concentration of ATP, said concentration being itself expressed in M.
  • Figure 6 Use of the CLZ-136 compound-linked GFP-aequorin fusion protein as a reporter of post-synaptic rapid dynamics in [Ca 2 '] j in brain tissue.
  • Slices of cerebral hyppocampus were prepared from transgenic PSDGA mice, said slices being pre-incubated with native coelenterazine or CLZ-136 and maintained in ACSF (36 ° C) in the presence of Gabazine ( GABA channel) (1 M).
  • the collateral axons of Schaffer (se) were electrically stimulated (100 ⁇ , 0.6 ms), which briefly elevates the post-synaptic concentration [Ca 2+ ] i in the pyramidal neurons CAL A) individual experience with GA related to dials CLZ-136.
  • Bioluminescence PSDGA bioluminescence (mean on a interval 100 ms after stimulation), averaged over 36 double-pulse stimulations of the axons se.
  • Biolumincscence is confined to Stratum Oriens (SO), reflecting the connection of axons with CA1 neurons.
  • the TTX (1 ⁇ M) completely blocks the response.
  • Two stimulations of the sc axon (SI, S2) at 25 ms intervals improve the postsynaptic response [Ca2] by synaptic facilitation.
  • the chemiluminescence of the synthetic coelenterazine analogs described above is evaluated.
  • the measurement of the chemiluminescence emission corresponds to the measurement of the light emitted directly during the oxidation of coelenterazine or these analogues, in solution and without the intervention of a luciferase, triggered by an oxidation promoter.
  • the oxidation promoter may be DMSO. This method is known to those skilled in the art and is one of the most used in the study of synthetic coelenterazine: it is in particular one of the easiest to implement.
  • chemiluminescence emission wavelengths may depend on the pH of the solution, it appears that the trend of variation in emission wavelengths of different coelenterazines is comparable.
  • the measurement of the chemiluminescence emission of the synthetic analogues according to the present invention was therefore carried out in neutral solutions and buffered at a pH of between 6 and 7.
  • the amounts of light emitted as a function of the wavelength were recorded for six analogues of native coelenterazine above and also for native coelenterazine, of commercial origin.
  • Table 1 below shows wavelengths, light quantities and relative intensities of the chemiluminence and bioluminescence emission peaks for the Aequorin-RFP / CLZ and Rluc / CLZ systems involving the native coelenterazine (CLZ) or synthetic coelenterazine.
  • ⁇ " ⁇ represents the wavelength of the peak of maximum intensity.
  • I re i represents the relative maximum intensity, in percentage of that of the native coelenterazine.
  • ND means that the corresponding values have not been or could not be determined and "a” refers to a detection of a signal light too weak to be undoubted.
  • Table 1 In Table 1, we first note a large disparity in the light emission intensity of the various coelenterazines, since they range from 0.3 to more than 838% of the light emission intensity. the native coelenterazinc, our reference. We can therefore compare the results obtained in terms of red displacement of the X max and emission intensity of the original molecules revealed by the present invention, that is to say CLZ-110, CLZ-121, CLZ- 132, CLZ-136 and CLZ-135, CLZ-074, CLZ-370 and CLZ-374 although the information on the chemiluminescence emission intensity is not transposable, as we have seen, to bioluminescence.
  • the CLZ-121 nitrocoelenterazin analogue emits virtually no light, although a very small peak seems visible around 758 nm.
  • the carboxycoelenterazine analog CLZ-132 has very low light emission, barely 3% of the reference emission, but a red shift of more than 20 nm. Given the pH of the tested solution (buffered between 6 and 7), it should be considered in its carboxylate form, and its electronic effects do not allow to conclude as to a direct link between the electronic properties of the substituent groups the cycle Phenyl of the imidazopyrazine nucleus of coelenterazine and the resulting wavelength of chemo-luminescence emission. In addition, the coelenterazines CLZ-370 and CLZ-374 show a shift towards relatively weak red (12 and 4 nm respectively) and a quantity of light that could not be determined in each case.
  • the compounds CLZ-36 and CLZ-35 carrying a group conjugated to the central nucleus at position 8 ( ⁇ -styryl and 1-naphthyl), both exhibit a significant redshift of the wavelength of their maximum emission, around 90 and 20 nm respectively.
  • the chemiluminescence produced by 8 synthetic coelenterazines, CLZ-110, CLZ-074, CLZ-121, CLZ-132, CLZ-36 and CLZ-35 was measured according to the present invention.
  • the data collected for the CLZ-074, CLZ-12, CLZ-121 and CLZ-132 analogs show contradictory or poorly exploitable trends, which do not allow us to conclude as to the influence of the electronic effects of the 4- group substituents.
  • the preparation of semisynthetic aequorins or aequorin-RFP (RA) constructs is done by incubation of the coelenterazines to be tested in cells expressing aequorin or the chimera of interest. The cells are then lysed, and the cell extract diluted in 10 mM TrisHCI buffer solution at pH 7.5. The bioluminescence is triggered by the addition of a 0.1 mM solution of calcium.
  • bioluminescence emission wavelengths of semidynthetic aequorin constructs of interest (RFP-aequorin) integrating the coelenterazine studied are then measured (Table 1, Figure 1).
  • Table 1 reports a bioluminescence emission peak detected for each of the RA / CLZ-1 10, RA / CLZ-136, RA / CLZ-135 and CLZ-370 constructs.
  • each of the four coelenterazines of interest CLZ-1, CLZ-136 and CLZ-135 and CLZ-370 result in a red shift of 7 to more than 30 nm from the bioluminescence emission of the corresponding aequorins.
  • the highest wavelength is obtained for RA / CLZ-1 10 but it must be put in perspective since the intensity of the emission peak is low (2.4%), just like that obtained with coelenterazine CLZ-370 (0.7%) which results in a 41 nm red shift of the RA / CLZ-370 system.
  • coelenterazine CLZ-136 has the highest relative intensity (24.1%), compared to its analogues, as well as a red shift of nearly 30 nm from the wavelength of its maximum. emission observed at 499 nm ( Figure 1).
  • This coelenterazine CLZ-1 6 represents the "hit" of this first series of tests on aequorin.
  • the intensity of light emitted at 607 nm visible by the presence of a shoulder ( Figure 1), which corresponds to a detectable wavelength that can cross a living tissue (for example, the skull), was evaluated. a mouse).
  • This intensity can then be related to the amount of light transmitted from Aequorin to the RFP associated with it.
  • the ratio of the emission intensity at 607 nm of the RA / CLZ-Native construction compared to that of the peak emission peak at 460 nm is 12%.
  • this ratio is 31%.
  • the intensity of the light emitted at 607 mn by RA / CLZ-136 is 55% of that emitted by RA / CLZ-Native, and this despite a relative peak emission intensity of only 24 %.
  • the present invention thus shows that a shift of the Aequorin bioluminescence emission spectrum of about 30 nm to the red, obtained by the RA / CLZ-136 construct, significantly improves (35). %) the amount of light transmitted to the RFP, even with a maximum light emission intensity greatly reduced compared to that obtained using the native coelenterazine.
  • the present invention reveals that the extension of the resonance to the right part of the molecule, via for example the replacement of the benzyl group of the imidazopyrazine ring with an ⁇ -styryl group (analog CLZ-136), causes the displacement of the light emitted towards the red, without, however, penalizing the detection of the intensity of the bioluminescent emission.
  • the synthesized coelenterazines are also tested on Renilla renifarmis luciferase (Rluc). Renilla luciferase has the advantage of generally emit more intense light than the aequorinc and more acceptable to the active site of chemical modifications.
  • the analogs C.LZ-1 10, CLZ-074, CLZ-136, CLZ-374 are active in the presence of Renilla, just like the analog CLZ-121.
  • the latter does not present the group 4- hydroxyphenyl linked to the imidazopyrazine nucleus. This demonstrates a greater tolerance of Renilla luciferase compared to Faequorin, with respect to functional changes on coelenterazine.
  • the coelenterazine CLZ-370 which enables the Rluc / CLZ-370 system to emit a biolument wavelength around 530 nm, that is to say displaced by approximately 53 nm compared to the Rluc / CLZ-system; native; the relative intensity of this emission is equivalent to that observed with CLZ-110, that is to say between 4 and 5% of the bioluminescent intensity recorded for the Rluc / CLZ-native system,
  • the bioluminescence was measured at room temperature by injection of 50 ⁇ l of a 100 mM CaCl 2 solution , and 100 mM Tris-HCl and pH 8.8, into a well plate, each well containing 100 ⁇ l. ⁇ of a 5 mM EDTA solution, 100 mM Tris-HCl and pH 8.8 and an aliquot of the photoprotein.
  • the bioluminescence signal was counted with a Mithras LB940 luminometer plate (Berthold Technologies) for one minute.
  • the specific activity (expressed in RLU / mg) is expressed as the total light emission in relative units (RLU), normalized to the protein concentration.
  • the decay of the bio-luminescence signal was modeled using a single or double exponential function in order to estimate the decay rate constant (average of 3 decay curves per semisynthetic photoprotein).
  • the relative contribution of the rate constants k1 and k2 are expressed as respectively a] / (aj + a 2 ) and a / (a] + a 2 ), where y and a2 are the amplitudes of the two exponential functions.
  • the measurements were carried out at room temperature.
  • the bioluminescence and fluorescence spectra were obtained at room temperature using a Varian Cary Eclipse spectrofluorometer (Agitating Technologies, USA) (slit width: 5 nm, scanning speed: 200 nm / s).
  • the bioluminescence spectra were measured in a solution of 1 mM EDTA and 20 mM Tris-HCl pH 7.2, the initialization being obtained by injection of a 20 mM CaCl 2 solution of Tris-HCl fold. 7.2.
  • the concentration of free Ca + calcium ion ([Ca 2+ ]) was calculated to obtain a free calcium ion Ca concentration of 0.5 ⁇ M, which ensures a quasi-constant light intensity during scanning. spectral.
  • the expression plasmid pcDNA3-Aeq7 was generated by subcloning the coding sequences for apo-aequorin from pET19-Aq7 [Deng et al., (2005) Protein Sci 14: 663-675] into the EcoRl / NotI + site.
  • pcDNA3 (Invitrogen).
  • Transfection of CHO cells with pcDNA3-Aeq7 was performed with Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol.
  • Transfected cells were cultured in DMEM / F12 medium supplemented with 10% S VF at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 h.
  • the transfected cells were seeded on 6-well plates and cultured in the same medium after addition of 1 mg ml of G-418 (Gibco, UK) under the same conditions. replacing the culture medium with fresh medium every 2 days. After 10 days of selection, the CHO cells were transferred to antibiotic-free medium. To select clones with the greatest bioluminescence activity, two successive series of limiting dilutions were performed.
  • CHO cells stably expressing apo-aequorin were seeded on 96-well plates (approximately 0.5 to 1.0 cells per well) and cultured in DMEM / F12 medium supplemented with 10% FCS at 37 ° C and 5% from C0 2 to 80-90% confluence. On the day of the recording, the medium was removed and the cells were loaded with 3 M native coelenterazine in a 130 mM aqueous solution of NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 2 mM CaCl 2 , 5 mM NaHCO 3 , 20 mM HEPES, pH 7.4 for 4 hours at 37 ° C.
  • Selection identified several CHO cell clones with high bioluminescence activity, one of which was used to test the CLZ-136 compound in an intracellular assay.
  • hippocampal slices of 300 ⁇ thick double mutant mice aged 19 to 25 days were cut in a chilled solution (87 mM NaCl, 25 mM NaHCO 3 , 25 mM glucose, 75 mM sucrose, 0.5 mM CaCl 2 , 2.5 mM KCl, 7 mM MgCl 2 , 1.25 mM NaH 2 P0 4, 95% 0 2/5% C0 2, pH 7.5), followed by 1 hour incubation with 5 mM solution of native coelenterazine or CLZ- 136-32 ° C.
  • the light was collected by means of a 20X objective mounted on an Axioscop 2FS word microscope (Cari Zeiss, Germany) and projected onto a single photon imaging (IPD) sensor (Mepsicron II, Quantars Technology Inc., USA).
  • IPD photon imaging
  • an iXon I EMCCD camera was used instead of the IPD.
  • Each individual experience averages 15-30 stimuli applied at 60 s intervals.
  • Chemiluminescence properties of analogues according to the invention Compound (CLZ) Native 110 136 135 074 121 370 374 ⁇ ⁇ ( ⁇ ) 460 451 551 582 458 ND b ND ND
  • the specific bioluminescence activity for the different photoproteins was determined at the calcium ion saturation [Ca 2+ ] concentration.
  • the activities of the purified semithnetic photoproteins, expressed as a percentage of the specific activity of said photoprotein bound to native coelenterazine, are shown in Table 2.
  • the specific activities of unactivated semi-synthetic obeline and aequorin, ie not related to a compound, are significantly lower compared to photoproteins related to native coelenterazine. The exception is the obelin or aequorin complex with the compound CLZ-095 (100-97% of activity with native coelenterazine).
  • the ability of synthesized compounds to produce a red wavelength shift can be classified as: CLZ-1>CLZ-136>CLZ-135> CLZ-370 when complexed with obelin ( offset equal to 44, 38, 32 and 17 nm respectively) and CLZ-1 10> CLZ-370 / CLZ-136> CLZ-135 when complexed with aequorin (offset equal to 47, 29/30, and 15 nm respectively).
  • aequorin and obclin with respect to the same analogue is probably due to structural differences between the coelenterazine binding sites.
  • the semi-synthetic photoprotein complexes with comoxies CLZ-074 and CLZ-374 showed detectable but lower bioluminescence activity.
  • the calcium ion activated photoproteins become fluorescent at visible wavelengths after the bioluminescence reaction and when coelenteramide, the product of between coelenterazine (or its derivative) and photoprotein, is still bound.
  • the fluorescence spectrum of aequorin-free aequorin aequorin is almost similar to the bioluminescence spectrum.
  • the fluorescence spectrum of the uncharged Ca 2+ obelin is shifted to red about 25 nm from the bioluminescenec spectrum.
  • the semi-synthetic obesities not loaded with Ca2 + behave similarly to those incubated with native coelenterazine ( Figure 2, Table 2).
  • the fluorescence intensity of the uncharged Ca2 + photoproteins complexed with the compounds CLZ-074 and CLZ-374 is quite detectable, and show large redshifts: ⁇ [ ⁇ complexes with aequorin (37 and 81 nm respectively) and withobelelin (21 and 28 nm respectively) relative to native coelcenterazine.
  • aequorin and pobelin complexed to compound CLZ-136 were evaluated (Fig. 4). As can be seen in FIG. 4, aequorins and semi-synthetic obelines give a detectable response in a concentration range of Ca 2+ ion ranging from 10 8 M to approximately 10 -4 M, ie similar to that observed for complexes of these same photoproteins with native coelenterazine.
  • the concentration effect curve of Ca 21 extends over a vertical range of 4.5-5.5 log units (7 log units for the photoprotein complex with native coelenterazine).
  • the maximum slope of the curve is 1.6- 1.8 (about 2.5 for the photoprotein complex with native coelenterazine), indicating that only two calcium ions are needed to trigger the bioluminescence reaction, unlike to the photoprotcine complex with native coelcenterazine for which three calcium ions are needed.
  • CHO cells as described in Example 4 stably expressing Papoacorin were incubated with the compound CLZ-136.
  • a stantdard was also prepared by incubation of CHO cells as described in Example 4 stably expressing Papo aequorin with native coelenterazine.
  • activation of the endogenous P2P2 PATP purinoceptor increases the concentration of free calcium ions [Ca 2+ ] j.
  • Figure 5 shows the bioluminescence of CHO cells incubated respectively with CLZ-136 and with native coelenterazine as a function of ATP concentration.
  • the EC50 value for activation of the P2Y2 receptor was estimated from these curves for the CLZ-136 compound, the EC5 0 is 2.2 ⁇ ; for the native coelenterazine EC 5 0 of 5.5 ⁇ .
  • the experiment also shows that the CLZ-136 compound readily penetrates into CHO cells, forming a complex with semi-synthetic aequorin without compromising cell viability.
  • the aequorin complex with the CLZ-136 compound has advantages for standard high throughput cell screening assays. Indeed, the decay phase of the bioluminescence of aequorin complece with the compound CLZ-136 being approximately three times slower compared to the complex with the native coelenterazine (Table 2), we can assume that it will result in a better accuracy in determining the EC50.
  • GFP-aequorin (GA) fusion protein [Baubet and Brûlet et al (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 7260-7265] in the post-compartment.
  • synaptic neurons PSDGA mice
  • This compartment when electrically activated, shows a rapid increase in [Ca 2 '], which returns to normal in about 100 ms.
  • the post-synaptic response generally covers a [Ca 2+ ] j of between 10 " M and 10 " M.
  • FIG. 6A shows the experimental setup and an example of recording with GA complexed with compound CLZ-136
  • the native coelenterazine CLZ-136 exhibit the same value of ⁇ ⁇ 1 ⁇ 1 ⁇
  • Figures 6B and C show the bioluminescence reactions respectively after one or two electrical stimuli, the second causing a response about 5 times greater than the first, as well as for the in vitro results.
  • amplitude of the signal recorded with the CLZ-136 compound is approximately one third of the signal with native coelenterazine.
  • the specificity of the response is demonstrated using a tetrodotoxin (TTX) bath (Tocris Bioscience Ltd, UK), a blocker of synaptic activity.
  • Figure 6D shows the responses obtained with GA complexes with compound CLZ-136 and native coelenterazine. This demonstrates that the kinetic differences in light emission according to analogous compounds of The coelenterazine of the invention (e.g., see Table 2) is not relevant at the ten millisecond scale studied here.
  • Figure 6E summarizes our results. Surprisingly, the ratio between the amplitude of the response to the second and the first stimulus, covering a five-fold increase in [Ca] j, is identical with the compound CLZ-136 and the native coelenterazine.

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Abstract

La présente invention concerne un composé de formule générale (I) dans laquelle: n est un entier compris entre 0 et 4, de préférence entre 0 et 2; EDG représente un groupe électrodonneur indépendamment choisi parmi un radical hydroxy (-OH), hydroxyalkyle en C1-C6, alcoxy en C1-C6, amino (-NH2), alkylamino en C1-C6, dialkylamino en C1-C6, thiol (-SH), et alkylthio en C1-C6; R représente un radical benzyîc, α-styryle ou naphtyle; X représente un radical hydroxy ou un halogène choisi parmi un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor; à condition toutefois que lorsque X représente un radical hydroxy et R un radical ben/yle, alors n est égal à 2 et les deux groupes EDG représentent un radical hydroxy, préfércntiellement en position 3 et 5 du noyau phényle qui les porte; et à l'exception des composés pour lesquels X représente un atome de fluor ou d'iode, n est égal à 0 et R représente un radical benzyle.

Description

ANALOGUES DE LA COELENTERAZINE EMETTANT UNE LUMIERE DECALEE VERS LE ROUGE VISANT L'IMAGERIE IN VIVO
La présente invention concerne la synthèse et l'utilisation de nouveaux analogues de la coelentérazine dans le domaine de la bioluminescence. Les nouveaux analogues de la coelentérazine selon la présente invention provoquent un déplacement vers le rouge de la lumière bioluminescente émise par deux luciférases, l'aequorine et la Renilla. Ils provoquent également un déplacement vers le rouge de la lumière bioluminescente émise par l'obeline. La présente invention concerne l'utilisation de nouvelles sondes bioluminescentes qui permettent de visualiser la dynamique calcique chez l'animal en mouvement dans des modalités non-invasives d'imagerie optique in vivo.
La bioluminescence est la production et l'émission de lumière par un organisme vivant résultant d'une réaction chimique au cours de laquelle l'énergie chimique est convertie en énergie lumineuse. La bioluminescence peut être générée par des organismes symbiotiques héberges au sein d'un organisme plus grand. La bioluminescence se produit lorsqu'une réaction chimique entre une protéine (une luciférase) et son « substrat » (une luciférine) a lieu. Celle-ci émet de la lumière en s'oxydant grâce à l'intervention de la luciférase. La réaction chimique peut avoir lieu à l'intérieur ou à l'extérieur de la cellule. Certaines luciférases nécessitent des liaisons à un substrat pour produire de la lumière : elles sont appelées photoprotéines. Mais de manière générale, elles doivent fixer la luciférine au sein d'un site actif et former un complexe initialement stable. Dans ce cas, la luciférase précurseur de photoprotéine est appelée apoprotéine.
Dans la nature, le phénomène de bioluminescence est également souvent accompagne d'un transfert d'énergie de bioluminescence ou BRET (Bio luminescence Résonance Energy Transfer) depuis les luciférases vers des protéines fluorescentes : la lumière émise par les luciférases va être captée par une autre protéine, qui va alors, par phénomène de fluorescence, réémettre une lumière à une longueur d'onde (λ) plus élevée. La protéine fluorescente la plus connue est certainement la GFP (Green
Fluorescent Protein) découverte par O. Shimomura et coll. en 1962 chez la méduse Aequorea Victoria [Shimomura, O. ; Johnson, F. H. ; Saiga, Y. J. Cell. Comp. Physiol. 1962, 59, 223-240].
En présence de GFP clans une configuration spatiale adéquate, un transfert d'énergie non radiative du type BRET peut s'opérer à partir de la photoprotéine vers la protéine GFP qui émet une lumière verte. C'est ce qui se produit notamment chez la méduse qui présente la photoprotéine aequorine.
Dans le cadre de la présente invention, la luciférine d'intérêt est la coelentérazine qui est le cofacteur naturel de plusieurs luciférases d'origines diverses, en particulier de la luciférase Renilla (Rluc), issue de la pensée de mer Renilla reniformis, et de Γ aequorine, luciférase produite par les méduses aequoridées vu ci- dessus, ou Aequorea Victoria, ou de l'obeline. luciférase produite par les hydroïdes Ohelia. La structure chimique notée C0 de la coelentérazine, ou coelentérazine « native », est représentée ci-dessous.
Figure imgf000004_0001
L' equorine est une photoprotéine composée d'une apoprotéine de 189 résidus acides aminés, l'apoaequorine, et de sa luciférine, la dite coelentérazine. La coelentérazine est stabilisée sous forme d 'hydroperoxyde à l'intérieur du site actif de l'apoaequorine [Head, J. F. ; Inouye, S. ; Terariishi, K. ; Shimomura, O. Nature 2000, 405, 372-376], formant ainsi L" aequorine. Contrairement à la luciférase Renilla, Γ aequorine est une luciférase sensible au calcium dont le phénomène de bioluminescence n'est déclenché qu'en présence d'ions calcium dans le milieu. L'aequorinc possède trois sites de fixation du calcium [inouye, S. ; Noguchi, M. ; Sakaki, Y. ; Takagi, Y. ; Miyata, T. ; Iwanaga, S. ; Miyata, T. ; Tsuji, F. I. Froc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 82, 3154-3158]. Le complexe apoaequorinc- coelentérazine est stable jusqu'à son activation par des ions calcium. Lorsqu'au moins deux ions calcium se fixent à l'aequorine [Shimomura, O. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995, 211 , 359-363], un changement de conformation spatiale de la j^hotoprotéine s'opère et entraîne l'oxydation de la coelentérazine en coelentéramide, dégageant une molécule de dioxyde de carbone en émettant de manière concomitante une lumière bleue à une longueur d'onde d'environ 470 nanomètres (nm).
Une fois la coelentérazine oxydée, le coelentéramide résultant est également libéré et il est alors possible de régénérer l'aequorine dans un milieu contenant de la coelentérazine libre et de l'oxygène [Shimomura, O. Johnson, F. H. Nature 1975, 256, 236-238]. Le calcium est un second messager ubiquitaire en biologie connu pour intervenir dans presque toutes les fonctions cellulaires comme la fertilisation, la sécrétion, la contraction-relaxation, la motilité cellulaire, le métabolisme cytoplasmique et mitochondrial, la synthèse et la production des protéines, l'expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et l'apoptose [Rizzuto, R. ; Pozzan, T. Physiol. Rev. 2006, 86, 369-408]. Parcc-que le calcium, et en particulier Ca2+, est directement ou indirectement associé à presque tous les chemins de signalisation cellulaire, sa détection optique est une mesure universelle de l'activité biologique à l'échelle moléculaire ou cellulaire, ou encore à l'échelle d'un tissu animal ou d'un organisme animal dans son ensemble. L'enregistrement du calcium en temps réel peut notamment aider à améliorer la compréhension du développement, de la plasticité et du fonctionnement d'un système biologique, par exemple le système nerveux central, sain ou malade.
Cette sensibilité au calcium fait de l'aequorine (couple apoaequorine - coelentérazine) un outil de prédilection pour l'étude in vivo non-invasive de processus physiologiques médiés par le calcium. Il en est de même de Pobeline.
En outre, l'aequorine n'a pas montré à ce jour de toxicité particulière notamment vis-à-vis du fonctionnement cellulaire ou embryonnaire ce qui rend cette photoprotéine d'autant plus pertinente pour des applications en imagerie in vivo.
La luciferase Renilla n'est pas quant à elle une photoprotéine puisqu'elle ne forme pas de complexe stable avec la coelentérazine. Elle agit au contraire comme une enzyme catalysant l'oxydation de la coelentérazine en coelentéramide, toujours en présence d'air [Cormier, M. J. ; Lee, J. ; Wampler, J. E. Annu. Rev. Biochem. 1975, 44, 255-272 ; Hori, . ; Wampler, J. E. ; Matthews, J- C. ; Cormier, M J. Biochemistry 1973, 12, 4462-4468], Contrairement à l'aequorine, clic n'est pas sensible au calcium. La luciférase Renilla est utilisée en routine comme rapporteur de l'expression de gène, notamment pour la détection de cellules cancéreuses, l'étude du développement d'organismes ou le suivi de cellules souches transplantées.
Néanmoins, la luciférase Renilla peut être liée, comme c'est le cas dans la nature, à la protéine CBP (Coelentérazine B' àm' g Protein) [Charbonnea , H. ; Cormier, M. J. J. Bioï. Chem. 1979, 254, 769-780], qui peut alors fixer à son tour la coeîentérazine et rendre le système « Renilla - CBP - coelentérazine » sensible au calcium. En effet, la protéine CBP possède trois sites de fixation des ions Ca2+.
L'association Renilla - CBP présente donc un intérêt puisqu'elle donne lieu à un système bioluminescent lui aussi calcium-dépendant et présentant l'avantage en outre de protéger la coelentérazine, ou ses analogues, d'une oxydation directe, c'est-à-dire non catalysée par l'enzyme : la coelentérazine une fois fixée au site de la protéine CBP est protégée de l'oxydation directe.
En outre, la luciférase Renilla présente l'avantage d'être plus « tolérante » aux variations de structures d'analogues de la coelentérazine acceptés par Y enzyme [Inouye, S. ; Shimomura, O. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997, 233, 349-353], en particulier comparés aux analogues acceptés par l'apoacquorine : la Renilla reconnaît une variété d'analogues plus vaste que l'apoaequorine.
Un des objectifs de la présente invention consiste à améliorer les techniques de bioluminescence et notamment des techniques de couplage bioluminescence- fluorescence afin de parvenir à mieux imager l'expression du gène de la luciférase in vivo et de manière non invasive, à mieux analyser la régulation d'un gène endogène, à mieux évaluer un protocole de thérapie génique ou encore à mieux suivre la croissance et la migration de cellules cancéreuses. En outre, l'amélioration de ces techniques visée par la présente invention doit permettre le progrès du suivi de drogues dans un organisme vivant en temps réel et de manière non invasive, l'évaluation plus efficace de l'activité de molécules thérapeutiques et donc le perfectionnement plus aisé de ces dernières. Depuis le début du 21eine siècle, des travaux de recherche ont abouti à la production d'organismes animaux exprimant des constructions chimériques, associations hybrides d'apoaequorine liée à des protéines fluorescentes de type GFP ou RFP (Red Fluorescent Protein) [Baubct, V. ; Le Mouellic, H. ; Campbell, A. K. ; Lucas- Meunier, E. ; Fossier, P. ; Brûlet, P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97, 7260-7265]. Ces résultats ont notamment permis, grâce aux ciblages génétiques intracellulaires et de types cellulaires in vivo, d'améliorer le ciblage des organes à l'intérieur desquels le phénomène de bioluminescence doit avoir lieu, mais également de bénéficier, directement dans ces organes, du BRET en direction de la protéine fluorescente émettant alors une lumière légèrement déplacée vers le rouge.
La construction GFP- aequorine est déjà utilisée pour des expériences menées notamment sur des cultures cellulaires, des drosophiles [Martin, J. R. ; Rogcrs, K. L. ; Chagneau, C. ; Brûlet, P. PLoSONE 2007, 2, c275] ou des poissons zèbres [Naumann, E. A. ; Kampff, A. R. ; Prober, D. A. ; Schier, A. F. ; Engert, F. Nat.Neurosci. 2010, 13, 513-520]. Des demandes de brevet portent par exemple sur des applications de cette construction GFP-aequorine sur des cellules in vitro ou des organismes d'amphibiens comme ceux du genre xenopus (WO 01/92300 et US 2003/0066095).
Cependant, la difficulté principale des constructions aequorine /protéine fluorescente est leur utilisation chez les mammifères. Des travaux ont néanmoins déjà été menés à partir de la construction chimérique GFP-aequorine introduite à l'intérieur de souris vivantes, mais localisée alors dans des organes « de surface », en l'occurrence des fibres de muscles comme les fibres du muscle tibial antérieur [Rogers, K. L. ; Picaud, S. ; Roncali, E. ; Boisgard, R. ; Colasante, C. ; Stinnakre, J. ; Tavitian, B. ; Brûlet, P. PLoSONE 2007, 2, e974]. De manière générale, l'un des obstacles majeurs à l'utilisation des luciférases aequorine ou Renilla en recherche fondamentale, et plus particulièrement pour l'imagerie in vivo, est la longueur d'onde de la lumière émise par celles-ci, respectivement 471 et 477 nm, qui sont des émissions dans le bleu (446 nm < λ < 520 nm). A de telles longueurs d'ondes, les photons sont absorbés et diffractés par les tissus, les os et l'hémoglobine, ce qui interdit la détection non-invasive de la bioluminescence produite dans des tissus profonds (foie, cœur...) ou dans le cerveau. En revanche, la lumière émise dans le rouge (600 nm < λ < 780 rrm) et l'infrarouge (780 nm < λ < 500 μιη) traverse les tissus et la boîte crânienne. Dans ce cas, la détection d'une bioluminescence émise dans le rouge est possible et peut permettre l'imagerie de tissus profonds et notamment l'imagerie cérébrale fonctionnelle non- invasive pendant l'exécution de tâche cognitive ou d'apprentissage.
A ce jour, il existe quatre méthodes couramment mises en œuvre pour parvenir à déplacer vers le rouge les longueurs d'onde chimioluminescentes et/ou bioluminescentes émises par les luciferases qui sont : la mutation génétique de la luciférase, la modification chimique de la coelentérazine, la construction d'une protéine hybride permettant un processus de BRET, la combinaison des trois techniques précédentes associée à une mutagenèse des protéines afin de les adapter aux modifications chimiques de la coelentérazine.
Grâce aux travaux de P. Brûlet et coll., il a pu être montré que la lumière émise par la construction RFP-aequorine émet à une longueur d'onde supérieure à 600 mu et qu'elle peut être détectée notamment à travers le crâne et le cerveau de souris [Curie, T. ; Rogers, K. L. ; Colasante, C. ; Brûlet, P. Molecular Imaging 2007, 6, 30-42]. Deux demandes de brevet ont également rapporté les résultats de ces travaux (US 2007/0274923 et US 2008/0282362). Malheureusement, la quantité de photons de la lumière bioluminescente qui est transférée de l'aequorine vers la RFP est trop faible pour obtenir une émission de lumière détectable à l'intérieur d'un mammifère vivant : les domaines d'énergie d'émission du système coelentérazine - luciférase et d'excitation de la protéine fluorescente ne se recouvrent alors pas suffisamment.
La présente invention concerne une approche originale qui se distingue des approches consistant à fusionner l'aequorine à des protéines fluorescentes en ce qu'elle est purement chimique.
En effet, lors de l'oxydation dans le site actif de la luciférase, la lumière est émise par un état excité intermédiaire de la coelentérazine. Les caractéristiques physico-chimiques de la lumière émise sont fonction de la distribution des électrons en résonance étendue (mésomérie étendue) dans cet état excité intermédiaii'e. Les inventeurs ont ainsi émis l'hypothèse originale selon laquelle un déplacement vers le rouge de la lumière bioluminescente pourrait être obtenu en synthétisant des analogues de la coelentérazine dans lesquels soit le niveau de résonance (mésomérie) de la molécule est augmenté soit, selon le concept « push-pull », des substituants électrodonneurs sont introduits sur une partie de la molécule (par exemple, sur le noyau phénolique) tandis que des substituants électroattracteurs sont insérés dans une autre partie de la molécule (par exemple, le noyau benzylique).
Toujours selon l'hypothèse originale de la présente invention, des modifications chimiques adaptées de la coelentérazine devraient déplacer les longueurs d'onde des photons émis vers les valeurs souhaitées, c'est-à-dire le rouge. D'autre part, un analogue de la coelentérazine dans les protéines hybrides du type RFP- aequorine, émettant davantage vers le rouge, favoriserait le chevauchement des domaines d'excitation et d'émission.
En revanche, une des difficultés qui peut être rencontrée en bioluminescence est l'inactivité in vivo d'un composé qui pourtant est actif, voire très actif, en chimioluminescence. Par exemple, O. Shimomura et coll. ont décrit le composé ci- dessous noté Cl qui a permis de déplacer de Π 5 nm vers le rouge (« shift rouge ») la longueur d'onde de la lumière émise en chimioluminescence. Or, ce composé est inactif en bioluminescence en présence de plusieurs luciférases et semble donc inappropriée pour une utilisation en imagerie in vivo [Wu, C. ; Nakamura, H. ; Murai, A. ; Shimomura, O. Tetrahedron Letî. 2001, 42, 2997-3000].
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C1
Toutefois, des luciférases mutantes de Renilla ont pu être construites, celles-ci pouvant conduire à un déplacement des longueurs d'onde du spectre de bioluminescence vers le rouge de 66 nm (pic à 547 nm). Ces luciférases mutantes ont révélé une plus grande stabilité et une production de quantité de lumière émise plus importante que la luciférase native. L'émission déplacée vers le rouge a également été obtenue par la fusion d'une protéine bioluminescente (luciférase ou photoprotéine) avec une protéine fluorescente appropriée (telle que GFP par exemple). Cette approche est fondée sur le transfert d'énergie de type BRET vu ci-dessus. Des succès du BRET ont été rapportés pour diverses paires de donneur/accepteur : aequorine/GFP, aequorine ou Rluc/protéine fluorescente jaune améliorée (YFP), aequorine ou Rluc/diverses protéines fluorescentes rouges [Baubet, V. ; Le Mouellic, H. ; Campbell, A. K. ; Lucas-Meunier, E. ; Fossier, P. ; Brûlet, P. Proc. Natl. Acad. ScL USA 2000, 97, 7260-7265 ; Curie, T. ; Rogers, K.L. ; Coiasantc, C. ; Brûler, P. Mol. Imaging 2007, 6, 30-42 ; Bakayan A. ; Vaquera CF. ; Picazo F ; Llopis J. PLoS One 2011, 6(5):el9520]. Le groupe de Vysotski a également montré qu'un analogue de la coelentérazine (noté C2 ci-dessous) est un substrat efficace pour une réaction catalysée par des luciférases Renilla mutantes qui fluorescent alors dans le « jaune » (575 nm < λ < 590 nm). Le déplacement vers des longueurs d'onde bioluminescentes plus longues atteint 40 nm et permet une application en imagerie in vivo. L'instabilité de la coelentérazine observée en solution et dans les tissus biologiques est maîtrisée en liant la coelentérazine à une protéine CBP, sensible au Ca2+, issue de la Renilla muelleri [Stepanyuk, G. A. ; Unch, J. ; Malikova, N. ; Markova, S. V. ; Lee, J. ; Vysotski, E. S. Anal Bioanal. Chem. 2010, 398, 1809-1817].
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C2
Dans la littérature, plusieurs analogues synthétiques de la coelentérazine native sont décrits. Notamment, certains sont issus du remplacement du groupe 4- hydroxybenzyle de la coelentérazine native par des groupes tels que méthyle, phényle, phénylpropyle, phénéthyle [Qi, C. F. ; Gomi, Y. ; Hirano, T. ; Ohashi, M. ; Ohmiya, Y. ; Tsuji, F. I. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1992, 13, 1607-1611], sec-butyle [Ohmiya, Y. ; Teranishi, K. ; Akutagawa, M. ; Ohashi, M. ; Tsuji, F. I. Chem. Lett. 1993, 2149- 2152] ou encore méthyladamantylc [Hirano, T. ; Negishi, R. ; Yamaguchi, M. ; Qi, F, C. ; Ohmiya, Y. ; Tsuji, F. ï. ; Ohashi, M. Tetrahedron 1997, 53, 12903-12916] et ont abouti à des aequorines résultantes inactives ou très peu actives en bioluminescence. Les coelentérazines portant un groupe benzyle ou une chaîne alkyle à la place du groupe initial 4-hydroxybenzyle sont souvent utilisées comme modèles simplifiés pour l'étude de détermination des espèces émettrices de lumière dans la bioluminescence de l'aequorine [Hirano, T. ; Gomi, Y. ; Takahashi, T. ; Kitahara, K. ; Qi, F. C. ; Mizoguchi, I. ; yushin, S. ; Ohashi, M. Tetrahedron Lett. 1992, 33, 5771-5774 ; Mori, K. ; Maki, S. ; Niwa, H. ; Ikeda, H. ; Hirano, T. Tetrahedron 2006, 62, 6272-6288], ou pour l'étude en chimioluminesccnce de l'influence des effets électroniques des substituants du noyau pyrazine de la coelentérazinc [Saito, R. ; Hirano, T. ; Niwa, H. ; Ohashi, M. Chem Lett. 1998, 95-96 ; Saito, R. ; Hirano, T. ; Maki, S. ; Niwa, H. ; Ohashi, M. Bull. Chem. Soc. Jpn. 201 1 , 84, 90-99].
Le groupe de S. Inouye a également évalué les capacités en bioluminescence d'aequorines semi-synthétiques en utilisant des coelentérazines modifiées au niveau de la nature du substituant (méthyle, éthyle, triiluorométhyle, méthoxy) lié en position 3 ou 4 du cycle phényle du groupe benzyle ou directement lié à la position benzylique (méthyle) [Inouye, S. ; limon, R. ; Sahara, Y. ; Hisada, S, ; Hosaya, T. Anal. Biochem. 2010, 407, 247-252]. Cependant, bien que ces analogues présentent pour la plupart un déplacement vers le rouge de la longueur d'onde émise (de 1 à 13,5 nm), il est observé une nette diminution de l'intensité (jusqu'à 98%) et de la quantité (jusqu'à 99%) de lumière bioluminescente par rapport à celle résultante de la coelentérazine native,
Dans la littérature, il existe peu de description d'analogues de la coelentérazine native qui présentent une modification du groupe 4-hydroxyphényie lié au noyau imidazopyrazinone, et encore moins si l'on se réfère aux travaux qui concernent des tests de bioluminescence. Par exemple, certaines études ont remplacé le groupe 4-hydroxyphé yle par le groupe 4-pyridinyle [Devillers, L ; Arrault, A. ; Olive, G. ; Marchand-Brynaert, J. Tetrahedron Lett. 2002, 43, 3161 -3164], 4-fluorophényle, 2-thiophène, ou encore β- styryle [Phakhodee, W. ; Toyoda, M. ; Chou, C.-M. ; Khunnawutmanotham, N. ; Isobe, M. Tetrahedron 2011, 67, 1150-1157]. Mais aucun de ces composés n'a été testé en combinaison aux luciférases qui intéressent la présente invention. D'autres travaux ont permis la synthèse d'analogues qui conservent le groupe 4- hydroxyphényle mais sur lequel sont ajoutés des substituants, en particulier un atome de fluor sur les positions 1 et/ou 2 du cycle phénylique [Hirano, T. ; Ohmiya, Y. ; Maki, S. ; Niwa, H. ; Ohashi, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 5541 -5544]. Mais ces analogues de ïa coelentérazine n'ont présenté aucun déplacement vers le rouge de leur lumière bioluminescente par rapport à celle émise par la coelentérazine.
En définitive, la littérature ne rapporte qu'un seul analogue (noté C2 ci-dessus) de la coelentérazine lié à une Juciferase non mutante capable de provoquer en bioluminescence un déplacement vers le rouge d'au moins 20 nm pour la longueur d'onde de la lumière émise par rapport à la coelentérazine native. Toutefois, l'intensité maximale relative du faisceau bioluminescent par rapport à l'aequorine n'est que de 0,05%, ce qui signifie que cette molécule est pratiquement inactive au niveau de cet enzyme et donc inutilisable en imagerie in vivo en association à une luciférase non mutante [Shimomura, O. ; Musicki, B. ; Kishi, Y. Biochem. J. 1989, 261, 913-920 ; Shimomura, O. ; Musicki, B. ; Kishi, Y. Biochem. J. 1988, 251, 405-410].
Selon la présente invention, de nouveaux analogues de ta coelentérazine, utilisables en bioluminescence pour l'imagerie in vivo, ont été synthétisés. La voie de synthèse employée pour obtenir ces molécules est connue de l'homme du métier. Elle se réfère notamment à la réaction de couplage de Negishi, catalysée par le palladium, entre le (3,5-dibromo)aminopyrazinc et le chlorure de bcnzylzincique, générés in situ à partir du réactif de Grignard correspondant et du dichlorure de zinc [M. Adamczyk et al. [Adamczyk, M. ; Akireddy, S. R. ; Johnson, D. D. ; Mattingly P. G. ; Pan, Y. ; Reddy, R. E. Tetrahedron 2003, 59, 8129-8142]. Le composé aminopyrazine résultant peut alors être engagé dans diverses réactions de couplage palladié, notamment des couplages de Suzuki.
Les composés selon la présente invention ont une formule générale (I) suivante :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle : n est un entier compris entre 0 et 4, de préférence entre 0 et 2 ;
EDG représente un groupe électrodonneur indépendamment choisi parmi un radical hydroxy (-OH), hydroxyalkyle en C1-C6, alcoxy en C1-C6, amino (-N¾), alkylamino en C1-C6, dialkylamino en C1-C6, thiol (-SH), et alkylthio en C1-C6 ;
R représente un radical benzyle, α-styryle ou naphtyle ;
X représente un radical hydroxy ou un halogène choisi parmi un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor ; à condition toutefois que lorsque X représente un radical hydroxy et R un radical benzyle, alors n est égal à 2 et les deux groupes EDG représentent un radical hydroxy, préférentiellement en position 3 et 5 du noyau phényle qui les porte ; et à l'exception des composés pour lesquels X représente un atome de fluor ou d'iode, n est égal à 0 et R représente un radical benzyle.
Par « groupe électrodonneur », on entend, au sens de la présente invention, un atome ou un groupe d'atomes qui a la capacité de polariser une liaison σ par effet inductif +1 en repoussant les électrons et/ou un atome ou un groupe d'atomes qui a la capacité de délocaliser des électrons des doublets non liants et des liaisons π par effet mesomère +M en repoussant les électrons.
Par groupement « alkyle en C1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, une chaîne hydrocarbonée monovalente saturée, linéaire ou ramifiée, comportant 1 à 6, de préférence 1 à 4, atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthyle, éfhyîe, propyle, isopropyle, butyle, isobuiyle, sec-butyle, iert- butyle, pentyle ou encore hexyle.
Par groupement « hydroxyalkyle en C1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe HOA- avec A représentant une chaîne hydrocarbonée divalente saturée, linéaire ou ramifiée, comportant 1 à 6, de préférence 1 à 4, atomes de carbone. A titre d'exemple, on peut citer les groupes hydroxyméthyle, hydroxyéthyle, hydroxypropylc, hydroxyisopropylc, hydroxybutyle ou encore hydroxy-/£?r/-butylc.
Par groupement « alcoxy en C1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe alkyie en C1-C6, tel que défini ci-dessus, lié au reste de ia molécule par l'intermédiaire d'un atome d'oxygène. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthoxy, éthoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy ou encore teri-butoxy.
Par groupement « alkylamino en C1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe -NHA avec A représentant un groupe alkyie en C1-C6 tel que défini ci-dessus. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthylamino, éthylamino, propylamino, isopropylamino, butylamino ou encore fôri-butylamino.
Par groupement « dialkylamino en C1 -C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe -NAB avec A et B représentant, indépendamment l'un de l'autre, un groupe alkyie en C1-C6 tel que défini ci-dessus. A titre d'exemple, on peut citer les groupes diméthylamino, diéthylamino ou encore méthyléthylamino.
Par groupement « alkylthio en C 1-C6 », on entend, au sens de la présente invention, un groupe alkyie en C1 -C6, tel que défini ci-dessus, lié au reste de la molécule par l'intermédiaire d'un atome de soufre. A titre d'exemple, on peut citer les groupes méthylthio, éthylthio, propylthio, ou encore butylthio.
Par « radical a-styryîe », on entend, au sens de la présente invention, un groupe aromatique styrène monovalent, qui peut se lier à une autre molécule par l'intermédiaire de l'atome de carbone vinylique directement lié au cycle phénylique.
Par « radical naphtyle », on entend, au sens de la présente invention, un groupe aromatique monovalent constitué de deux cycles benzéniques qui partagent ensemble deux atomes de carbone eux-mêmes liés l'un à l'autre, ce groupe pouvant alors se lier à une autre molécule par l'intermédiaire d'un des atomes de carbone directement liés à un des atomes de carbone mis en commun par les deux cycles benzéniques.
Par « halogène », on entend, au sens de la présente invention, les atomes de fluor, de chlore, de brome et d'iode.
De manière avantageuse, X dans les composés de formule (I) ci-dessus représente un halogène choisi parmi un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor, préférentiellement un atome de chlore ou de fluor, encore plus préférentiellement un atome de fluor.
Egalement, les composés de formule (1) scion la présente invention peuvent être caractérisés en ce que X représente un radical hydroxy. De manière avantageuse, les composés de formule (I) ci-dessus, sont caractérisés en ce que n est compris entre 0 et 4 et le ou les groupes EDG sont indépendamment choisis parmi un radical hydroxy et hydroxyalkyle en C1-C6.
De manière particulièrement avantageuse, dans les composés de formule (1) selon la présente invention, R représente un radical α-styryle ou naphtyle, de préférence un radical a-styryle.
De manière encore plus avantageuse, les composés de formule (I) selon la présente invention, et pour lesquels X est un radical hydroxy, sont caractérisés en ce que R représente un radical benzyle, n est égal à 2 et les deux groupes EDG représentent un radical hydroxy, préférentiellement en position 3 et 5 du noyau phényle qui les porte. Selon un mode de réalisation particulier de la présente invention, le nouveau composé de formule (1) ci-dessus, est caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les composés suivants :
Figure imgf000016_0001
pour lesquels, le composé 1 est un dérivé méthoxy de la coelentérazine aussi appelé CLZ-1 10, le composé 2 est un dérivé dihydroxy de la coelentérazine aussi appelé CLZ-074, le composé 3 est un dérivé styrène de la coelentérazine aussi appelé CLZ- 136, le composé 4 est un dérivé naphtalène de la coelentérazine aussi appelé CLZ- 135, le composé 5 est un dérivé méthoxy de la coelentérazine aussi appelé CLZ-374 et le composé 6 est un dérivé me/a-hydroxy de la coelentérazine aussi appelé CLZ- 370.
D'autres dérivés de la coelentérazine, ayant valeur de contre-exemple dans le cadre de la présente invention, ont également été synthétisés. Ces dérivés possèdent un groupe électroattracteur qui remplace le groupement hydroxy électrodonneur du noyau phcnolique de la coelentérazine native. Ce sont les composés 7 et 8 de formules suivantes :
Figure imgf000017_0001
7 pour lesquels, le composé 7 est un dérivé nitro de la coelentérazine aussi appelé CLZ-121 et le composé 8 est un dérivé carboxylate de la coelentérazine aussi appelé CLZ-132.
Par « groupe électroattracteur », on entend, au sens de la présente invention, un atome ou un groupe d'atomes qui a la capacité de polariser une liaison σ par effet inductif -I en attirant les électrons et/ou un atome ou un groupe d'atomes qui a la capacité de délocaliser des électrons des doublets non liants et des liaisons π par effet mésomère -M en attirant les électrons.
Un autre objet de l'invention concerne un (des) composé(s) de formule (I) ci- dessus pour son (leur) utilisation pour une méthode d'imagerie in vivo par bioluminescence sur un animal dans un organe, un fluide ou un tissu corporel. Un mode de réalisation privilégié de la présente invention concerne un (des) composc(s) pour son (leur) utilisation pour le suivi du métabolisme du calcium.
De manière avantageuse, selon la présente invention, ledit organe, ledit fluide ou ledit tissu corporel d'un animal est le cerveau.
De manière particulièrement avantageuse, ledit animal est un mammifère.
Par le tenue « animal », on entend, au sens de la présente invention, les vertébrés, plus particulièrement les mammifères et les primates. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention les mammifères sont des humains.
Par le terme « organe », on entend, au sens de la présente invention un ensemble de tissus concourant à la réalisation d'une fonction physiologique chez un animal. De manière non restrictive, l'organe, selon la présente invention, peut être notamment, le cerveau, ia moelle épinière, le foie, l'estomac, le cœur, les poumons, l'œsophage, la rate, le pancréas, les reins ou encore la vessie.
Par le terme « fluide corporel », on entend, au sens de la présente invention tout liquide produit par un animal vivant. De manière non restrictive, le fluide corporel, selon la présente invention, peut être notamment, le sang, la lymphe, le liquide cérébrospinal, le liquide synovial, le liquide pleural, le liquide péricardique, le liquide péritonéal, l'urine, la salive, la bile, le suc pancréatique, le suc gastrique ou encore le liquide amniotique.
Par 1e terme « tissu corporel », on entend, au sens de la présente invention tout ensemble de cellules semblables et de même origine, regroupées en ensemble fonctionnel, c'est-à-dire concourant à une même fonction chez un animal. De manière non restrictive, le tissu corporel, selon la présente invention, peut être notamment, le tissu épithélial, de revêtement ou glandulaire, le tissu conjonctif, le tissu musculaire ou le tissu nerveux.
Par le terme « méthode d'imagerie », on entend désigner, au sens de la présente invention, les moyens d'acquisition et de restitution d'images optiques d'un organe, d'un fluide ou d'un tissu corporel animal, à partir de la mesure de phénomènes physiques tel que le chemin optique de la lumière.
Par le terme « in vivo », on entend désigner, au sens de la présente invention, les recherches ou les examens pratiqués sur un organisme vivant animal, qui peut être avantageusement en mouvement ou immobilisé à l'aide d'un carcan, par opposition à in vitro ou ex vivo.
XJn autre objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un (de) composé(s) choisi parmi les dérivés de la coelentérazine de formule. (I) ci-dessus, dans un procédé d'imagerie in vivo par bioluminescence dans un organe, un fluide ou un tissu corporel animal.
Un mode de réalisation privilégié de la présente invention concerne l'utilisation d'un (de) eomposé(s) choisi parmi les dérivés de la coelentérazine de formule (I) ci- dessus, pour le suivi du métabolisme du calcium, l'organe, le fluide ou le tissu corporel étant de préférence le cerveau.
Un autre mode de réalisation privilégié de la présente invention concerne l'utilisation d'un (de) composées) choisi parmi les dérivés de la coelentérazine de formule (I) ci-dessus, caractérisée en ce que le procédé est appliqué à un animal, préférentiellement un mammifère.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection optique de l'activité d'un organe, d'un fluide ou d'un tissu corporel d'un animal, comprenant :
(1) la synthèse d'un polypeptide sensible ou non au calcium constitué d'une luciférase, en particulier une photoprotéine, liée à une protéine fluorescente, où ladite luciférase est choisie parmi le groupe formé d'une apoaequorine ou d'une apo- obeline liée à au moins un composé choisi parmi les dérivés de la coelentérazine de formule (1) ci-dessus, et de la luciférase Renilla, liée à au moins un composé choisi parmi les dérivés de la coelentérazine de formule (i) ci-dessus, ou liée à une protéine CBP (coelentérazine binding protein) elle-même liée à au moins un composé choisi parmi les dérivés de la coelentérazine de formule (I) ci-dessus, et où ladite protéine fluorescente est liée par un pqitide à ladite luciférase permettant le transfert d'énergie par B ET ;
(2) l'administration dudit polypeptide audit animal, préférentiellement par voie parentérale, intrapéritonéale ou intramusculaire, et
(3) l'enregistrement non-invasif des signaux lumineux émis par le polypeptide en présence ou non de calcium, lesdits signaux lumineux présentant une longueur d'onde comprise entre 470 nm et 780 nm, préférentiellement entre 500 nm et 690 nm, et encore plus préférentiellement entre 600 nm et 650 nm. Le procédé selon la présente invention peut également être caractérisé en ce que la protéine fluorescente est choisie parmi le groupe formé des protéines GFP (green fluorescente protein), CFP (cyan fluorescente protein), YFP (yellow fluorescente protein) et RFP (red fluorescente protein), préférentiellement GFP ou RFP.
Selon le procédé de la présente invention, l'étape (1) de synthèse et de production du polypeptide dans le cas de l'apoaequorine ou de l'apo-obeline peut être réalisée par incubation d'au moins une coelentérazine, choisie parmi les coelentérazines de la présente invention, dans des cellules exprimant l'aequorine ou la chimère d'intérêt. Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, ces cellules sont obtenues par des techniques de modifications génétiques, décrites notamment dans le brevet EP1292613, susceptibles d'être étendues à n'importe quelle luciférase dépendante de la coelentérazine, qui comprennent la mise au point d'un polypeptide recombinant sensible au calcium ou une séquence d'acide nucléique codant pour ledit polypeptide recombinant. Le polypeptide recombinant consiste alors en l'aequorine ou une luciférase et la protéine fluorescente couplée pour permettre le BRET. L'incubation selon le procédé de l'invention revient à échanger la coelentérazine native par au moins un de ses analogues synthétiques choisi parmi les composés de l'invention. Nous pouvons également citer le brevet US 8,263,821 qui concerne l'imagerie non-invasive avec ce type de sondes. Enfin, les demandes de brevet EPI 714155 et US2007/0274923 portent également sur ce type de sondes génétiques.
Selon le procédé de la présente invention, l'étape (1) de synthèse et de production du polypeptide dans le cas de la luciférase Renifla peut être réalisée sans incubation en ajoutant au moins une coelentérazine, choisie parmi les coelentérazines de la présente invention, à une solution de luciférase Renifla.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, la luciférase est liée de manière co val ente à la protéine fluorescente, qui est avantageusement la GFP ou la RFP. Ce lien entre les deux protéines permet la bioluminescence par transfert d'énergie de type BRET.
Selon la présente invention, une image lumineuse est alors enregistrée dans l'organe, le fluide ou le tissu corporel animal, ledit organe, ledit fluide ou ledit tissu corporel étant préférentiellement le cerveau, et ledit animal étant préférentiellement un mammifère. En particulier, selon la présente invention, les inventeurs ont montré qu'il est possible d'obtenir des analogues synthétiques originaux de la coelentérazinc native capables de déplacer vivo jusqu'à 114 nm la longueur d'onde bioluminescente émise par une luciférase associée. Un tel résultat n'a encore jamais été présenté. En outre, la présente invention concerne un polypeptide sensible ou non au calcium, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une luciférase liée à une protéine fluorescente, où ladite luciférase est choisie parmi le groupe formé d'une apoacquorine ou apo-obeJjne liée à au moins un composé selon l'invention, et de la luciférase Renilla, liée à au moins un composé selon l'invention, ou liée à une protéine CBP (coelenterazine binding protein) elle-même liée à au moins un composé selon l'invention, et où ladite protéine fluorescente est liée par un peptide à ladite luciférase permettant le transfert d'énergie par BRET, en particulier destiné à une administration par voie parentérale, intrapéritonéale ou intramusculaire.
Avantageusement, la protéine fluorescente est choisie parmi le groupe formé des protéines GFP (green fluorescente protein), CFP (cyan fluorescente protein), YFP (yellow fluorescente protein) et RFP (red fluorescente protein), préférenticllement GFP ou RFP.
La présente invention concerne également ledit polypetide pour son utilisation pour la détection optique de l'activité d'un organe, d'un fluide ou d'un tissu corporel d'un animal, comprenant Γ enregistrement non-invasif des signaux lumineux émis par le polypeptide en présence ou non de calcium, lesdits signaux lumineux présentant une longueur d'onde comprise entre 470 nm et 780 mu, préférenticllement entre 500 n et 690 nm, et encore plus préférentiellement entre 600 nm et 650 nm.
Les résultats obtenus dans le cadre de la présente invention impliquent des progrès déterminants dans le domaine de la bioluminescence.
Les exemples montrés ci-après servent à illustrer la présente invention mais ne doivent pas être considérés comme limitatifs.
Légende des figures :
Figure 1 : Spectres d'émission de la molécule RFP-Aequorinc avec la coélentérazine native (RA/CLZ-native) et l'analogue synthétique CLZ-136 (RA/CLZ-136). Figure 2 : Spectres d'émission de la Renilla reniformis (Rluc) avec la coélentérazine native (Rluc/CLZ-nativc), et les analogues synthétiques CLZ-1 10 (Rluc/CLZ-Π Ο), CLZ-74 (Rluc/CLZ-074) et CLZ-370 ( luc/CLZ-370).
Figure 3 : Spectres d'émission normalisés de bioluminescence (A) et fluorescence (B) de l'obeiine semi-synthetique (gauche) et de l'aequorine semi-synthétique (droite) avec la coelentérazine native (1), et les composés CLZ-110 (2), CLZ-136 (3), CLZ-135 (4), CLZ- 370 (5), et CLZ-374 (6). L'axe des abscisses représente la longueur d'onde en nm, et l'axe des ordonnées l'intensité relative de bioluminescence ou de fluorescence.
Figure 4 : Courbe d'effet de concentration en Ca2+ pour les photoprotéines semi- synthétiques liées aux composés CLZ-136 (Â) ou CLZ-095 (®), par comparaison avec l'aequorine (gauche) and l'obeiine (droite) complexées à la coelentérazine native (a). L'axe des ordonnées représente la valeur log(L/Ljllt) dans laquelle L représente l'intensité lumineuseà une concentration en ion Ca2 particulière et Ljnt, l'intensité lumineuse totale à la concentration saturante en Ca2+, et l'ace des abscisses représente la valeur log([Ca2+]), la concentration [Ca2+] étant exprimée en mol.L"1 (M). La concentration saturante en Ca2+ correspond à la concentration en ion Ca2 ' pemnettant de saturer la protéine.
Figure 5: Courbe dose-réponse pour l'activation avec l'ATP du récepteur P2Y2 des cellules CHO exprimant l'apo-aequorine de manière complexée avec le composé CLZ-136 (cercles, axe des Y, gauche) et la coelentérazine native (carrés, axe des Y droite). Les concentrations en ATP sont 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10.0, and 30.0 μΜ, respectivement. Chaque point représente la moyenne ± l'erreur standard de 10 expériences. Cette courbe représente l'intensité lumineuse exprimée en 105 RLU en fonction de la valeur du logarithme de la concentration en ATP, ladite concentration étant elle-même exprimée en M.
Figure 6 : Utilisation de la protéine de fusion GFP-aequorine liée au compose CLZ- 136 en tant que rapporteur de la dynamique rapide post-synaptique en [Ca2']j dans le tissu cérébral. Des tranches de hyppocampe cérébral ont été préparées à partir de souris transgéniques PSDGA, lesdites tranches étant pré-încubées avec la coelentérazine native ou le composé CLZ-136 et maintenue dans de l'ACSF (36° C) en présence de Gabazine (bloqueur du canal GABA) (1 M). Les axones collatéraux de Schaffer (se) ont été stimulés électriquement (100 ιτιΑ, 0,6 ms), ce qui élève brièvement la concentration post-synaptique [Ca2+]i dans les neurones pyramidaux CAL A) expérience individuelle avec GA liée au compose CLZ-136. La bioluminescence PSDGA bioluminescence (moyenne sur un intervalle de 100 ms après stimulation), moyennée sur 36 stimulations à double impulsion des axones se. La biolumincscence est confinée au Stratum Oriens (SO), reflétant la connexion des axones se avec les neurones CA1. B) moyennes de temps de bioluminescence (noir) pour SO (boîte en A) pour une seule stimulation de s.c. (si, vert) pour les tranches incubées avec la coelentérazine native (à gauche) et CLZ-136 (à droite). Le TTX (1 uM) bloque complètement la réponse. Deux stimulations de l'axone s.c. (SI, S2) à 25 ms d'intervalle améliore la réponse post-synaptique [Ca2] par facilitation synaptique. Le même résultat est obtenu pour la bioluminescence bioluminescence (C; gauche: coelentérazine native, à droite: CLZ-136). D) Données pour les panneaux B et C, mis à l'échelle du pic d'amplitude de réponse si (mis à 1 pour les expériences individuelles). E) Comparaison des amplitudes de réponse si et s2 (bioluminescence moyenne sur un intervalle de 100 ms suivant le début de la réponse). Panneau inférieur: rapport de réponse s2/sï (valeurs moyennes ± erreur standard) Exemple 1 : Tests de chimioluminescence des nouvelles coelentérazines synthétisées.
Dans le cadre de la présente invention, la chimioluminescence des analogues synthétiques de la coelentérazine décrits ci-dessus est évaluée. La mesure de l'émission de chimioluminescence correspond à la mesure de la lumière émise directement durant l'oxydation de la coelentérazine ou de ces analogues, en solution et sans intervention d'une luciférase, déclenchée par un promoteur d'oxydation. De manière avantageuse, le promoteur d'oxydation peut être le DMSO. Cette méthode est connue de l'homme du métier et est une des plus utilisées en ce qui concerne l'étude des coelentérazines synthétiques : elle est notamment l'une des plus faciles à mettre en œuvre.
Bien que les longueurs d'onde d'émission de ehimioluminescence puissent dépendre du pH de la solution, il semble que la tendance de variation des longueurs d'ondes d'émission de différentes coelentérazines soit comparable.
La mesure de l'émission de chimioluminescence des analogues synthétiques selon la présente invention a donc été réalisée en solutions neutres et tamponnées à un pH compris entre 6 et 7. Les quantités de lumière émise en fonction de la longueur d'onde ont été enregistrées pour six analogues de la coelentérazine native présentés ci- dessus et également pour la coelentérazine native, d'origine commerciale. Le tableau 1 ci-après les longueurs d'onde, les quantités de lumière et les intensités relatives des pics d'émission de chimiolumineseence et de bioluminescence pour les systèmes Aequorine-RFP/CLZ et Rluc/CLZ impliquant la coelentérazine (CLZ) native ou les coelentérazines synthétiques. λ,„αχ représente la longueur d'onde du pic d'intensité maximum. Irei, représente l'intensité maximale relative, en pourcentage de celle de la coelentérazine native. Dans ce tableau 1, « ND » signifie que les valeurs correspondantes n'ont pas été ou n'ont pas pu être déterminées et « a » fait référence à une détection d'un signal lumineux trop faible pour être non douteux.
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Tableau 1 Dans le tableau 1 , nous constatons tout d'abord une grande disparité concernant l'intensité des émissions de lumière des différentes coelenterazines, puisque celles-ci s'échelonnent entre 0,3 et plus de 838 % de l'intensité d'émission de la coelentérazinc native, notre référence. Nous pouvons donc comparer les résultats obtenus en termes de déplacement vers le rouge du Xmax et d'intensité d'émission des molécules originales révélées par la présente invention, c'est-à-dire CLZ-110, CLZ-121, CLZ-132, CLZ-136 et CLZ-135, CLZ-074, CLZ-370 et CLZ-374 bien que les informations concernant l'intensité d'émission par chimioluminescence ne soient pas transposables, comme nous l'avons vu, à la bioluminescence.
L'analogue nitrocoelentérazinc CLZ-121 n'émet pratiquement pas de lumière, même si un très faible pic semble visible autour de 758 nm. Le groupe nitro, fortement électroattracteur, semble donc provoquer un déplacement vers le rouge intense de l'émission de chimioluminescence mais la diminution drastique du signal détectable ne permet pas de conclure réellement sur l'intérêt de cette modification.
Pour poursuivre cette analyse de l'influence des effets électroniques liés aux substituants du groupe 4-hydroxyphényle, les analogues CLZ-1 10 et CLZ-074, portant respectivement un groupe méthoxy et deux groupes hydroxy supplémentaires, présentent, une courbe d'émission de chimioluminescence légèrement déplacée vers le bleu (9 et 2 nm), et ce malgré des effets électroniques opposés. L'intensité de l'émission de lumière de ces deux molécules est également fortement réduite, particulièrement en ce qui concerne l'analogue CLZ-074 avec 93% de diminution.
L'analogue carboxycoelenterazine CLZ-132 présente une émission de lumière très faible, d'à peine 3 % de l'émission de référence, mais un déplacement vers le rouge de plus de 20 nm. Etant donné le pH de la solution testée (tamponnée entre 6 et 7), celui- ci doit être considéré sous sa forme carboxylate, et ses effets électroniques ne permettent pas de conclure quant à un lien direct entre les propriétés électroniques des groupements substituants le cycle phényle du noyau imidazopyrazine de la coelentérazine et la longueur d'onde résultante de l'émission chimioJuminescentc. En outre, les coelentérazines CLZ-370 et CLZ-374 présentent un déplacement vers le rouge relativement faible (12 et 4 nm respectivement) et une quantité de lumière qui n'a pas pu être déterminée dans chacun des cas.
En revanche, les composés CLZ- 36 et CLZ- l 35, portant un groupement conjugué au noyau central en position 8 (α-styryl et 1-naphtyl), présentent tous deux un déplacement vers le rouge important de la longueur d'onde de leur maximum d'émission, autour de 90 et 20 nm respectivement.
Ceci valide l 'hypothè e initiale de la présente invention visant à étendre la résonance électronique à la « partie droite » de la coelentérazine native (c 'est-à-dire vers le groupe benzyle du noyau imidazopyrazine) afin d'obtenir un déplacement vers le rouge de la longueur d'onde luminescente.
En tableau 1 , il est également possible de constater que les molécules CLZ-l 36 et CLZ-l 35 présentent un deuxième avantage par rapport aux autres analogues de la série puisqu'elles émettent une intensité relative de lumière près de 8 fois plus intense que celle émise par la coelentérazine native. Ce résultat est prometteur notamment pour les expériences en bioluminescence, même si le phénomène observé en chimioluminesccnce n'est pas forcément transposable à la bioluminescence.
Ainsi, il a été mesuré dans cet exemple la chimioluminescence produite par 8 coelentérazines synthétiques, CLZ-l 1 0, CLZ-074, CLZ-121 , CLZ-132, CLZ-l 36 et CLZ- l 35, selon la présente invention. Les données recueillies pour les analogues CLZ-074, CLZ- l 2 , CLZ- 121 et CLZ- 132 montrent des tendances contradictoires ou peu exploitables, qui ne permettent pas de conclure quant à l'influence des effets électroniques des substituants du groupe 4-hydoxyphényle du noyau imidazopyrazine de la coelentérazine sur la longueur d'onde du pic d'intensité maximum (kmax) de l'émission de lumière.
En revanche, les résultats obtenus pour les analogues CLZ-l 36 et CLZ-Î 35 permettent de valider la méthode d'extension de résonance comme moyen privilégié pour obtenir un analogue de la coelentérazine avec un Xmax déplacé vers le rouge.
Les premières mesures de bioluminescence ont alors été menées sur l'apoaequorine et les hybrides de protéines fluorescentes. Exemple 2 : Tests de bioluminescence des aequorines et hybrides en présence des nouvelles coelentérazines synthétisées.
La préparation des aequorines semi -synthétiques ou des constructions aequorine-RFP (RA) se fait par incubation des coelentérazines à tester dans des cellules exprimant î'aequorine ou la chimère d'intérêt. Les cellules sont ensuite lysées, et l'extrait cellulaire dilué dans une solution tampon TrisHCI 10 mM à pH 7,5. La bioluminescence est déclenchée par l'ajout d'une solution à 0,1 mM de calcium.
Les longueurs d'ondes d'émission de bioluminescence des constructions aequorines semi- synthétiques d'intérêt (RFP-aequorine) intégrant la coelentérazine étudiée sont ensuite mesurées (Tableau 1 , Figure 1).
Des signau nuls sont obtenus pour les constructions Aequorine-RFP réalisées à partir des analogues CLZ-074, CLZ- 121 , CLZ- 132, et CLZ-374.
En revanche, le tableau 1 rapporte un pic d'émission de bioluminescence détecté pour chacune des constructions RA/CLZ-1 10, RA/CLZ-136, RA/CLZ-135 et CLZ-370.
Ainsi, chacune des quatre coelentérazines d'intérêt CLZ-1 10, CLZ-136 et CLZ- 135 et CLZ-370 entraînent un déplacement vers le rouge de 7 à plus de 30 nm de l'émission de bioluminescence des aequorines correspondantes. La longueur d'onde la plus haute est obtenue pour RA/CLZ-1 10 mais elle doit être relativisée puisque l'intensité du pic d'émission est faible (2,4%), tout comme celle obtenue avec la coelentérazine CLZ-370 (0,7%) qui entraîne pourtant un déplacement vers le rouge de 41 nm du système RA/CLZ-370.
En tableau 1 , la coelentérazine CLZ-136 présente la plus forte intensité relative (24,1 %), comparée à ses analogues, ainsi qu'un déplacement vers le rouge de près de 30 nm de la longueur d'onde de son maximum d'émission observé à 499 nm (Figure 1). Cette coelentérazine CLZ-1 6 représente le « hit » de cette première série de tests sur I'aequorine.
De plus, il a été évalué Fintensité de la lumière émise à 607 nm visible par la présence d'un épaulement (Figure 1.), qui correspond à une longueur d'onde détectable pouvant franchir un tissu vivant (par exemple le crâne d'une souris). Cette intensité peut, alors être reliée à la quantité de lumière transmise de l'Aequorine à Ja RFP qui lui est liée. Ainsi, dans le cas de l'Aequorine native, le rapport de l'intensité d'émission à 607 nm de la construction RA/CLZ-Native comparée à celle du pic d'émission maximale à 460 nm est de 12%. Dans le cas de la construction RA/CLZ- 136, ce rapport est de 3 1%. Par ailleurs, l'intensité de la lumière émise à 607 mn par RA/CLZ-136 s'élève à 55% de celle émise par RA/CLZ-Native, et ce malgré une intensité relative du pic d'émission maximale de seulement 24%.
La présente invention montre donc qu'un déplacement du spectre d'émission de biolumincsccn.ee de l'Aequorine d'environ 30 nm vers le rouge, obtenu par la construction RA/CLZ-136, permet d'améliorer de façon significative (35%) la quantité de lumière transmise à la RFP, et ce même avec une intensité d'émission de lumière maximale largement réduite par rapport à celle obtenue en utilisant la coelentérazine native.
De plus, la présente invention révèle que l'extension de la résonance à la partie droite de la molécule, via par exemple le remplacement du groupe benzyle du noyau imidazopyrazine par un groupe α-styryle (analogue CLZ-136), provoque le déplacement de la lumière émise vers le rouge, sans toutefois diminuer de manière pénalisante pour la détection l'intensité de l'émission bioluminescente.
Exemple 3 : Tests de bioluminescence de la luciférase Renilla (Rluc) en présence des nouvelles coelentérazines synthétisées.
Selon la présente invention, les coelentérazines synthétisées sont également testées sur la luciférase Renilla renifarmis (Rluc). La luciférase Renilla présente l'avantage d'émettre une lumière généralement plus intense que l'aequorinc et d'un site actif plus acceptable envers des modifications chimiques.
Cette fois, l'expérience s'effectue sans incubation préalable, puisqu'il n'est pas nécessaire de former une photoprotéine, la Rcnilla luciférase agissant comme une enzyme. L'émission de lumière est alors enregistrée à partir de l'ajout à la solution de luciférase d'un des analogues de la coelentérazine. Les résultats sont présentés dans le Tableau 1 et en Figure 2.
A partir des données du tableau 1 , il est possible de constater que, à l'instar du comportement des aequorines (voir exemple 2 ci-dessus), l'intensité de l'émission de lumière des analogues synthétiques est largement plus faible que celle produite par la coelentérazine native. En particulier, la coelentérazine CLZ-132 ne montre toujours pas d'activité, au même titre, plus étonnamment, que l'analogue CLZ-135 qui montre pourtant une activité relativement importante lorsqu'il est lié à F aequorine.
Les analogues C.LZ-1 10, CLZ-074, CLZ-136, CLZ-374 sont quant à eux actifs en présence de la Renilla, tout comme l'analogue CLZ- 121. Ce dernier ne présente pourtant pas le groupe 4-hydroxyphényie lié au noyau imidazopyrazine. Cela démontre une tolérance plus importante de la luciférase Renilla par rapport à Faequorine, vis-à-vis des changements fonctionnels sur la coelentérazine. Le système Rluc/CLZ-374 présente une activité importante puisque l'intensité relative de son émission bioluminescente s'élève à 60,4% de celle mesurée pour le système Rluc/CLZ-native. Cependant, le système Rluc/CLZ-374 ne permet pas le déplacement de la longueur d'onde d'émission vers le rouge (Xmax = 477 nm).
En revanche, certains résultats du tableau 1 sont surprenants, en particulier ceux obtenus pour trois coelentérazines particulièrement actives en association avec la luciférase Renilla :
l'association Rluc avec la coelentérazine CLZ-110 (Rluc/CLZ-110), qui présente un déplacement vers le rouge de la bioluminescence d'environ 33 nm par rapport au système Rluc CLZ-native, avec une intensité d'émission qui, bien que faible en comparaison de celle obtenue avec la coelentérazine native, reste détectable (autour de 37000 photons ; à titre comparatif, nous mentionnons que la construction RA/CLZ-Native émet environ 23000 photons),
- la coelentérazine CLZ-370 qui permet au système Rluc/CLZ-370 d'émettre une longueur d'onde biolummescente autour de 530 nm, c'est-à-dire déplacée d'environ 53 nm par rapport au système Rluc/CLZ-native ; l'intensité relative de cette émission est équivalente à celle observée avec CLZ-110, c'est-à-dire entre 4 et 5% de l'intensité bioluminescente enregistrée pour le système Rluc/CLZ-native,
- la coelentérazine CLZ-074, qui permet quant à elle au système Rluc/CLZ-074 d'émettre une lumière bioluminescente assez faible (1000 photons au-dessus du bruit de fond) mais suffisamment significative pour être détectée et pour que sa longueur d'onde d'émission puisse être estimée autour de 595-600 nm avec une fiabilité suffisante : ce déplacement de longueur d'onde situe cette émission de lumière directement dans le rouge, ce qui représente alors un déplacement vers le rouge de près de 114 nm (Figure 2). Exemple 4
Mesure de la biuluminescence
La bioluminescence a été mesurée à température ambiante par injection de 50 μ] d'une solution à 100 mM en CaCl2, et à 100 mM en Tris-HCl et à pH 8,8, dans une plaque à puits, chaque puits contenant 100 μΐ d'une solution d'EDTA 5 mM, Tris-HCl 100 mM et à pH 8,8 et un aliquot de la photoprotéine. Le signal de bioluminescence a été comptabilisé avec une plaque de luminomètrc Mithras LB940 (Berthold Technologies) pendant une minute. L'activité spécifique (exprimée en RLU/mg) est exprimée comme étant l'émission totale de lumière en unités relatives (RLU), normalisée à la concentration en protéines.
La décroissance du signal de bio luminescence a été modélisée à l'aide d'une fonction exponentielle simple ou double afin d'estimer la constante du taux de décroissance (moyenne de 3 courbes de décroissance par Photoprotéine semi- synthétique). Pour la modélisation de la double exponentielle, la contribution relative des constantes de vitesse kl et k2 sont exprimées comme respectivement a]/(aj+a2) et a /(a]+a2), où &\ et a2 sont les amplitudes des deux fonctions exponentielles. Les mesures ont été réalisées à température ambiante.
Mesures spectrales de Bioluminescence et fluorescence
Les spectres de bioluminescence et de fluorescence ont été obtenus à température ambiante à l'aide d'un spectrofluorimètre Varian Cary Eclipse (Agitant Technologies, USA) (largeur de la fente: 5 nm; vitesse de balayage : 200 nm/s). Les spectres de bioluminescence ont été mesurés dans une solution d'EDTA 1 mM et de Tris-HCl 20 mM à pH 7,2, L'initation étant obtenue par injection d'une solution de CaCl2 à 20 mM de Tris- HC1 pli 7,2. La concentration en ion calcium Ca + libre ([Ca2+]) a été calculée de manière à obtenir une concentration en ion calcium Ca libre de 0,5 pM, ce qui permet d'assurer une intensité lumineuse quasi- constante pendant le balayage spectral. Dans les cas où une modification substantielle de l'intensité de la bioluminescence a eu lieu, les points de données ont été corrigés pour la décroissance de la bioluminescence. Les spectres de fluorescence ont été déterminés 30 minutes après l'extinction du signal de bioîuminescenc. Les spectres de bioluminescence et de fluorescence ont été corriges pour la sensibilité spectrale du détecteur à l'aide du programme fourni avec l'instrument. Courbes d 'effet de la concentration en calcium libre
Les mesures ont été effectuées avec des solutions de photoproteinc dépourvues d'EDTA. L'EDTA a été retiré des solutions de photoprotéinc par filtration sur gel sur une colonne de plastique DSalt (Pierce). La colonne a été équilibrée et éluée avec une solution aqueuse 150 mM KC1, 5 mM PIPES et à pH 7,0 préalablement purifiée deux fois par passage à travers des lits fraîchement lavés résine de chélation Chelex-100. Les tractions contenant la photoprotéine ont été identifiées par le test de bioluminescence. Pour éviter toute contamination avec EDTA, seules les premières fractions protéiques isolées ont été combinées et utilisées pour la détermination des courbes de l'effet de la concentration en ion Ca2+ libre.
Pour la gamme allant de 10"6 M à 10 2M en ion calcium libre[Ca2+], des dilutions simples de CaC12 dans une solution de KC1 150 mM , 5 mM PIPES , pH 7,0 nettoyée au préalable sur résine Chelex ont été utilisés. Pour des concentrations inférieures à 10"6M , les concentrations en Ca2+ ont été fixées des tampons Ca-EGTA (concentration totale en EGTA [EGTA]toia] - 2 mM). Les tampons Ca2+ ont été préparés par la méthode des deux solutions stock décrite par [45]. L'intensité lumineuse de crête (L) a été mesurée après injection de 10 μΐ d'une solution de photoprotéine dans 1 ml de la solution de test. Toutes les mesures ont été effectuées à 20°C, la température étant maintenue en utilisant le bloc-cuvette à température stabilisée du luminornètre. Les courbes de l'effet de la concentration en ion Ca2 1 libre ont été exprimées en [Ca2+] vs L/Lint, où L est l'intensité de la bioluminescence de crête pour une valeur donnée de la concentration [Ca2+] et L;!lt la bioluminescence totale enregistrée pour une dose saturée en Ca2+ dose pour le même échantillon.
Mesures de bio luminescence dans des cellules CHO
Le plasmide d'expression pcDNA3- Aeq7 a été généré par sous-clonage des séquences codantes pour l'apo-aequorine de pET19 - Aq7 [Deng et al, (2005) Protein Sci 14:663- 675] dans le site EcoRl/Notl+ de pcDNA3 (Invitrogen). La transfection de cellules CHO avec pcDNA3- Aeq7 a été réalisée avec le réactif Lipofectamine 2000 (Invitrogene) selon le protocole du fabricant. Les cellules transfectées ont été cultivées dans du milieu DMEM/F12 supplémenté avec 10 % de S VF à 37°C et 5% de C02 pendant 24 h. Pour sélectionner des cellules CHO exprimant de façon stable apo- aequorine, les cellules transfectées ont été ensemencées sur des plaques à 6 puits et cultivées dans le même milieu après ajout de 1 mg ml de G-418 (Gibco, UK) dans les mêmes conditions en remplaçant le milieu de culture par du milieu frais tous les 2 jours. Après 10 jours de sélection, les cellules CHO ont été transférées dans un milieu sans antibiotique. Pour sélectionner des clones avec la plus grande activité de bioluminescence, deux séries successives de dilutions limitantes ont été effectuées. Les cellules CHO exprimant de façon stable l'apo- aequorine ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits (environ 0.5 à 1.0 cellule par puits) et cultivées en milieu DMEM/F12 supplémenté avec 10% de SVF à 37°C et 5 % de C02 jusqu'à 80-90 % confluence. Le jour de l'enregistrement, le milieu a été éliminé et les cellules ont été chargées avec 3 M de coelentérazine native dans une solution aqueuse à 130 mM en NaCl, 5 mM en KC1 , 1 mM MgCl2, 2 mM en CaCl2, 5 mM en NaHC03 , 20 mM en HEPES, pH 7,4 pendant 4 h à 37°C. Ensuite, la plaque et a été placée dans la plaque de luminomètre (Mithras LB 940) à température ambiante et 1 % de Triton X-100 dans une solution aqueuse à 130 mM en NaCl, 5 mM en KC1 , 1 mM MgCl2; 2 mM en CaCl2, 5 mM en NaHC03, 20 mM en HEPES, pH 7,4 a été ajouté pour déclencher la réaction de bioluminescence. La sélection a permis d'identifier plusieurs clones de cellules CHO avec une forte activité de bioluminescence, l'un d'entre eux a été utilisé pour tester le composé CLZ-136 dans un dosage intracellulaire.
La veille des mesures, les cellules exprimant de façon stable la protéine apo-acquorine ont été ensemencées sur des plaques à 96 puits et cultivées à 37 ° C avec 5 % de C02. Le jour de l'enregistrement, le milieu a été éliminé et les cellules ont été chargées avec 3 μΜ CLZ du composé CLZ- 1 6 ou de coelentérazine native dans une solution aqueuse à 130 mM en NaCl, 5 mM en KC1 , 1 mM MgCl2, 2 mM en CaC , 5 mM en NaHC<¼ , 20 mM en HEPES, pH 7,4 pendant 4 h à température ambiante. Ensuite, les plaques à puits ont été placées dans une plaque du luminomètre (Mithras LB 940) à température ambiante et de l'ATP a été ajouté à une concentration suffisante pour déclencher une réponse à la concentration [Ca2"]j dans les cellules CHO. Le signal de bioluminescence a été intégré sur 30 s, en commençant immédiatement après l'addition d' ATP. Mesures de bioluminescence dans des coupes d'hippocampe fraîchement préparées Les souris transgéniques avec une protéine de fusion post-synaptique ciblée contre la GFP-aequorine (PSDGA) transgénique [46] ont été croisées avec des souris Camkcrc4 [47], activant ainsi le transgène dans le compartiment subcellulaire post-synaptique des neurones pyramidaux CA1 de l'hippocampe. Pour une expérience (réalisée conformément à la directive 2010/63/UE du Conseil pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire), des tranches d'hippocampe de 300 μηι d'épaisseur de souris double mutant âgées de 19 à 25 jours ont été coupés dans une solution réfrigérée (87 raM NaCl, 25 mM NaHC03, 25 mM de glucose, 75 mM de saccharose, 0.5 mM CaCl2, 2,5 mM de KC1, 7 mM MgCl2, 1 ,25 mM NaH2P04, 95% 02/5% C02, pH 7,5), suivie par 1 heure d'incubation avec une solution 5 mM de coelentérazine native ou de CLZ- 136 à 32 ° C. Apres le transfert à ia chambre d'enregistrement contenant du liquide céphalorachidien artificiel standard (ACSF : NaCl 125 mM, 25 mM NaHC03, 25 mM de glucose, 2 mM de CaCl2, 3 mM de KC1, 1 mM de MgCl2, et 1 ,25 mM NaH2P04, pH 7,5; écoulement approximativement 2 ml/min , 36 ° C) et 1 μΜ de gabazine (Tocris Bioscience Ltd , UK) pour augmenter la réponse, une électrode (~ 3 mil) a été placée dans la région colatérale de Schaffer de la tranche. Ainsi, les réponses de bioluminescence stables ont été provoquées pour plus de cent stimulations électriques (100 mA, durée d'impulsion bipolaire 0,6 ms). La lumière a été recueillie au moyen d'un objectif 20X monté sur un microscope Axioscop 2FS mot (Cari Zeiss , Allemagne) et projetée sur un capteur d'imagerie monophotonique (IPD) (Mepsicron II, Quantars tcchnology Inc. , USA). Pour les images en champ clair, une caméra iXon I EMCCD (Andor Technologies) a été utilisée au lieu de l'IPD. Chaque expérience individuelle est en moyenne de 15-30 stimuli appliqués à des intervalles de 60 s.
Résultats
Il est bien connu que la chimioluminescence et la capacité de bioluminescence de composés ne sont pas systématiquement corrélées. Par conséquent, nous avons testé la capacité de bioluminescence de tous les composés selon l'invention avec des apophotoproteincs aequorine et obéline recombinante régulée par Ca2+.
Tableau 1
Propriétés de chimioluminescence des analogues selon l'invention Composé (CLZ) Native 110 136 135 074 121 370 374 λιΜΧ (ηΐΉ) 460 451 551 582 458 NDb ND ND
Lumière Totale (%) 100 21.6 975 935 7.5 0.5 ND ND b ND- non-détecté
Propriétés de bioluminescence avec les obéline et aequorine semi- synthétiques
Huit aequorins semi- synthétiques et huit obelins semi- synthétiques ont été préparées par une incubation des analogues CLZ avec les apophotoprotéines respectives pendant une nuit. Pour comparer leurs propriétés de bioluminescence et de fluorescence, les photoprotéines activées ont d'abord été séparés des apophotoprotéines non activées, des composés CLZ non liés et deséventuels produits de dégradation, ladite séparation étant conduite par chromatographie sur colonne Mono Q. Un bon rendement en photoprotéine activée a été obtenu pour l'analogue CLZ-136, un rendement raisonnable pour le composé CLZ-135, et un faible rendement pour les autres composés selon l'invention.
L'activité de bioluminescence spécifique pour les différentes photoprotéines a été déterminée à la concentration de saturation en ion calcium [Ca2+]. Les activités des photoprotéines semi- ynthétiques purifiées, exprimée en pourcentage de l'activité spécifique de ladite photoprotéine liée à la coelentérazine native sont présentés dans le Tableau 2. Les activités spécifiques de obéline et de l'aequorine semi-synthétique non activées, i.e. non liées à un composé, sont nettement inférieurs par rapport aux photoprotéines liées à la coelentérazine native. L'exception est le complexe obéline ou aequorin avec le composé CLZ-095 (100-97 % de l'activité avec Coelentérazine native). Parmi les meilleurs rendements de bioluminescence, on peut citer le complexe aequorine avec le composé CLZ-136 (30%) et obéline avec le composé CLZ- 121 (23%), CLZ-136 (12%), et CLZ-110 (10%). Il convient de noter que, pour un composé CLZ donné, les activités de bioluminescence de l'aequorine et de 1 Obéline diffèrent presque toujours. Par exemple, l'activité de l'aequorine avec le composé CLZ-136 est 2,5 fois plus élevé que celle du complexe correspondant avec obéline et, vice versa, l'activité de l'obéline avec le composé CLZ-121 est 7,5 fois plus élevé que celle du complexe correspondant avec l'aequorine. A noter également, tandis que les analogues CLZ-370 et CLZ-374 n'émettent pas de chimiluminescence mesurable (tableau 1), les deux photoprotéincs (aequorine et obéline) semi-synthétiques liées à ces composés affichent une émission de lumière dépendante de la concentration en ion Ca2+ détectable (voir tableau 2).
Tableau 2 Propriétés de bioluminescence des complexes de photoprotéines semi- synthétiques
Activité de
Bioluminescence Fluorescence Bioluminescence
max, (nm)
fque (%)
Figure imgf000035_0001
(nm) spécii
CLZ
aequorine obeline aequorine obeline aequorine obeline native 100 100 470 480 471 512
CLZ-110 1 10 517 524 ND ND
CLZ-136 30 12 499 518 495 530
CLZ-135 0.6 1 485 512 483 522/440
CLZ-074 <0.1 <0.1 ND b ND 508 533
CLZ- 121 3 23 470 463 ND ND
CLZ-370 1.5 7 500 497 ND ND
CLZ-374 0.2 0.5 ND ND 552 540 a La contribution relative de chaque constant de décroissance est indiquée entre parenthèse
' ND- non-detecté
Propriétés spectrales des photoprotéines semi- synthétiques et de leurs produits fluorescents .
Les pics d'émission corrigés des photoprotéines semi-synthétiques et de leurs produits fluorescents sont rapportés dans le tableau 2. Il convient de noter que l'obéline semi- synthétique complexée au composé CLZ-121 affiche un court décalage de longueur d'onde d'émission de lumière (6 et 17 nm respectivement) par rapport à l'obéline complexée avec la coelentérazine native. Les spectres de bioluminescence de aequorines complexées avec ces mêmes composés restent en revanche inchangés. Avec le composé CLZ-110, CLZ-136, CLZ-135, et CLZ-370 l'obéline ainsi que l'aequorine montrent une émission de lumière décalée vers le rouge (Fig.3, tableau 2). La capacité des composés synthétisés pour produire un décalage de longueur d'onde vers le rouge peut-être classée comme suit : CLZ-1 10 > CLZ-136 > CLZ-135 > CLZ-370 lorsqu'ils sont complexés avec l'obéline (décalage égal à 44, 38, 32 et 17 nm respectivement) et CLZ-1 10 > CLZ-370/CLZ-136 > CLZ-135 lorsqu'ils sont complexés avec I'aequorine (décalage égal à 47, 29/30, et 15 nm respectivement). Le comportement légèrement différent de I'aequorine et de l'obclinc vis-à-vis d'un même analogue est probablement dû à des différences structurelles entre les sites de liaison à la coelentérazine. Lesz complexes de photoprotéines semi-synthétiques avec les comopsés CLZ-074 et CLZ- 374 ont montré une activité de bioluminescence détectable mais plus faible.
Les photoprotéines activées par l'ion calcium deviennent fluorescentes aux longueurs d'onde visibles après la réaction de bioluminescence et lorsque la coelentéramirîe, produit de la entre la coelentérazine (ou son dérivé) et la photoprotéine, sont encore liés. Le spectre de fluorescence de I'aequorine non chargée en Ca2+ aequorine est presque similaire au spectre de bioluminescence. En revanche, le spectre de fluorescence de l'obéline non chargée en Ca2+ est décalé vers le rouge d'environ 25 nm par rapport au spectre de bioluminescenec. À cet égard, les obéîmes semi-synthétiques non chargées en Ca2+ ont un comportement similaire à celles incubées avec la coelentérazine native (figure 2, tableau 2). La seule exception semble être obtenue avec le composé CLZ-135, portant un substituant naphtyle à la position C8. Un épaulement dans le spectre de fluorescence de l'obéline non chargée en Ca2+ est observé à environ 440 nm, avec un pic principal à 522 nm. Pour les aequorines semi-synthétiques non chargées en Ca2+, la longueur d'onde de bioluminescence maximale () et de fluorescence maximale (différence entre les λ1ΜΧ) avec les composés CLZ-136 et CLZ-135 diffèrent d'environ 10 nm (tableau 2). Aucune fluorescence n'est détectée dans les complexes de l'obéline ou de I'aequorine non chargée en Ca2 + avec les composés CLZ-1 10, CLZ-121 et CLZ- 370, ce qui indique que les produits de la réaction de bioluminescence ne forment pas un complexe fort avec les apophotoproteins mais plus se dissocient probablement en solution après la réaction.
L'intensité de fluorescence des photoprotéines non chargées en Ca2+ complexées avec les composés CLZ-074 et CLZ-374 est tout à fait détectable, et présentent de grands décalages vers le rouge : λ[ΜΧ des complexes avec I'aequorine (37 et 81 nm respectivement) et avec Pobéline (21 et 28 nm respectivement) par rapport à la coelcntérazine native.
Sensibilité des photoprotéines semi-synthétiques à le présence de Ca2+
La sensibilité de l'aequorine et de Pobéline complexées au composé CLZ-136 a été évaluée (Fig. 4). Comme il ressort de la figure 4, les aequorines et obelines semi- synthétiques donnent une réponse détectable dans une gamme de concentration en ion Ca2+ allant de 10 8 M à environ 10"4 M, c'est à dire similaire à celle observée pour aux complexes de ces mêmes photoprotéines avec la coelentérazine native.
Pour les complexes de photoprotéines semi- synthétiques avec le composé CLZ-136, les résultats obtenus sont clairement différents pour l'aequorine et Pobéline. Tout d'abord, la courbe d'effet de concentration de Ca21 s'étend sur une plage verticale de 4,5-5,5 unités logarithmiques (7 unités logarithmiques pour le complexe des photoprotéines avec la coelentérazine native). Deuxièmement, la pente maximale de la courbe est 1,6- 1,8 (environ 2,5 pour le complexe des photoprotéines avec la coelentérazine native), ce qui indique que seuls deux ions calcium sont nécessaires pour déclencher la réaction de bioluminescence, contrairement au complexe des photoprotcines avec la coelcntérazine native pour lequel trois ions calcium sont nécessaires. Exemple 5
Tests fonctionnels du composé CLZ-136 dans un dosage intracellulaire
La sensibilité du composé CLZ-136 pour détecter une élévation de la concentration en ion Ca2+ libre [Ca2+]i dans les cellules vivantes a également été testée.
Des cellules CHO telles que décrites dans l'exemple 4 exprimant de façon stable Papo- acquorine ont été incubées avec le composé CLZ-136. Un stantdard a également été préparé par incubation de cellules CHO telles que décrites dans l'exemple 4 exprimant de façon stable Papo-aequorine avec la coelentérazine native. Dans les cellules CHO, l'activation du purinorécepteur endogène à PATP P2Y2 augmente la concentration en ions calcium libres [Ca2+]j. La figure 5 montre la bioluminescence de cellules CHO incubées respectivement avec le composé CLZ-136 et avec la coelentérazine native en fonction de la concentration en ATP. La valeur de CE50 pour l'activation du récepteur P2Y2 a été estimée à partir de ces courbes : pour le composé CLZ-136, la CE50 est de 2,2 μΜ ; pour la coelentérazine native de la CE50 est de 5,5 μΜ. L'expérience montre également que le composé CLZ-136 pénètre facilement dans les cellules CHO, formant un complee avec l'aequorin semi-synthétique sans compromettre la viabilité des cellules.
II est à noter que le complexe de l'aequorine avec le composé CLZ- 136 présente des avantages pour des essais standard de criblage cellulaire à haut débit. En effet, la phase de décroissance de la bioluminescence de l'aequorine complece avec le composé CLZ- 136 étant environ trois fois plus lente par rapport au complexe avec la coelentérazine native (tableau 2), on peut présumer qu'il en résultera une meilleure précision dans la détermination de la CE50.
Tests fonctionnels du composé CLZ-136 dans un tissu cérébral
Des tranches de l'hippocampe du cerveau de souris transgéniques exprimant de manière sélective la protéine de fusion GFP- aequorine (GA) [Baubet et Brûlet et al (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:7260-7265] dans le compartiment post- synaptique de ses neurones (souris PSDGA) ont été préparées. Ce compartiment, lorsqu'il est activé électriquement, montre une augmentation rapide de la [Ca2 '], qui revient à la normale en environ 100 ms. La réponse post-synaptique couvre généralement une [Ca2+]j comprise entre 10" M et 10' M. La figure 6A montre le dispositif expérimental et un exemple d'enregistrement avec GA complexée au composé CLZ-136. Les spectres de bioluminescence du complexe de GA avec le composé CLZ-136 et la coelentérazine native sont également représentées (partie de droite; expérience in vitro, N = 5 par état, ιηαχ à 1). Comme prévu, le la coelentérazine native composé CLZ-136 présentent la même valeur de λη1ί1χ. Les figures 6 B et C montrent les réactions de bioluminescence respectivement après un ou deux stimuli électriques, le second provoquant une réponse environ 5 fois plus importante que le premier. De même que pour les résultats in vitro, l'amplitude du signal enregistré avec le composé CLZ-136 est à peu près le tiers du signal avec la coelentérazine native. La spécificité de la réponse est démontrée à l'aide d'un bain de tétrodotoxine (TTX) (Tocris Bioscience Ltd, UK), un bloqueur de l'activité synaptique. La figure 6D montre les réponses obtenues avec des complexes de GA avec le composé CLZ-136 et la coelentérazine native. Celle-ci démontre que les différences cinétiques dans l'émission de lumière en fonction des composés analogues de coelentérazine de l'invention (par exemple^ voir le tableau 2) ne sont pas pertinents à l'échelle de la dizaine de millisecondes étudiée ici.
La figure 6E résume nos résultats. Étonnamment, le rapport entre l'amplitude de la réponse au deuxième et au premier stimulus, couvrant une multiplication par cinq en [Ca ]j, est identique avec le composé CLZ-136 et la coelentérazine native.
Ces résultats démontrent bien le fait que les composés selon l'invention, et en particulier les composés CLZ-135 et CLZ-136, permettent d'obtenir un décalage vers le rouge des longueurs d'ondes émises lorsque les composés selon l'invention sont incubés en présence de photoprotéines telles que l'aequorine et l'obeline, aussi bien lors d'expériences in vitro dans un milieu de culture artificiel (exemple 4) que dans des cellules exprimant îesdites photoproteines (exemple 5).

Claims

REVENDICATIONS 1. Composé d
Figure imgf000040_0001
(I) dans laquelle :
n est un entier compris entre 0 et 4, de préférence entre 0 et 2 ;
EDG représente un groupe électrodonneur indépendamment choisi parmi un radical hydroxy (-OH), hydroxyalkyle en C1-C6, alcoxy en Cl -C6, amino (-NH2), alkylamino en C1-C6, dialkylamino en C1 -C6, thiol (-SH), et alkylthio en C1-C6 ;
R représente un radical benzyle, α-styryle ou naphtyle ;
X représente un radical hydroxy ou un halogène choisi parmi un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor ;
à condition toutefois que lorsque X représente un radical hydroxy et R un radical benzyle, alors n est égal à 2 et les deux groupes EDG représentent un radical hydroxy, préférentiellement en position 3 et 5 du noyau phénylc qui les porte;
et à l'exception des composés pour lesquels X représente un atome de fluor ou d'iode, n est égal à 0 et R représente un radical benzyle.
2. Composés selon la revendication 1, caractérisé en ce que X représente un halogène choisi parmi un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor, préférentiellement un atome de chlore ou de fluor, encore plus préférentiellement un atome de fluor.
3. Composé selon la revendication 1, caractérisé en ce que X représente un radical hydroxy.
4. Compose selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que n est compris entre 0 et 4 et le ou les groupes EDG sont indépendamment choisis parmi un radical hydroxy et hydroxyalkyle en C1-C6.
5. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que R représente un radical α-styryle ou naphtyle, de préférence un radical a- styryle.
6. Composé selon la revendication 3, caractérisé en ce que R représente un radical benzyle, n est égal à 2 et les deux groupes EDG représentent un radical hydroxy, préfèrent! ellement en position 3 et 5 du noyau phényle qui les porte.
:
Figure imgf000041_0001
de préférence parmi :
Figure imgf000042_0001
et
Figure imgf000042_0002
3
8. Composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour son utilisation pour une méthode d'imagerie in vivo par bioluminescencc sur un animal dans un organe, un lluide ou un tissu corporel.
9. Composé pour son utilisation selon la revendication 8, pour le suivi du métabolisme du calcium.
10. Composé pour son utilisation scion la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que l'organe, le fluide ou le tissu corporel est le cerveau.
1 1. Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que l'animal est un mammifère.
12. Utilisation d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans un procédé d'imagerie in vivo par bioluminescence dans un organe, un fluide ou un tissu corporel animal.
13. Utilisation selon la revendication 12, pour le suivi du métabolisme du calcium, l'organe, le fluide ou le tissu corporel étant de préférence le cerveau.
14. Utilisation selon la revendication 12 ou 13, caractérisée en ce que le procédé est appliqué à un animal, préférentiellement un mammifère.
15. Polypeptide sensible ou non au calcium, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une luciférase liée à une protéine fluorescente, où ladite luciférase est choisie parmi le groupe formé d'une apoaequorine ou de l'apo-obeîine liée à au moins un composé défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, et de la luciférase Renilla, liée à au moins un composé défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, ou liée à une protéine CBP (coelentcrazine binding protein) elle-même liée à au moins un composé défini à l'une quelconque des revendications 1 à 7, et où ladite protéine fluorescente est liée par un peptide à ladite luciférase permettant le transfert d'énergie par BRET, en particulier destiné à une administration par voie parentérale, intrapéritonéale ou intramusculaire.
16. Polypeptide selon la revendication 15, caractérisé en ce que la protéine fluorescente est choisie parmi le groupe formé des protéines GFP (green fluorescente protein), CFP (cyan fluorescente protein), YFP (yellow fluorescente protein) et RFP (red fluorescente protein), préf rent! ellement GFP ou RFP.
17. Polypeptide selon la revendication 15 ou 16, pour son utilisation pour la détection optique de l'activité d'un organe, d'un fluide ou d'un tissu corporel d'un animal, comprenant l'enregistrement non-invasif des signaux lumineux émis par le polypeptide en présence ou non de calcium, lesdits signaux lumineux présentant une longueur d'onde comprise entre 470 nm et 780 nm, préférentiellement entre 500 nm et 690 nm, et encore plus préférentiellement entre 600 nm et 650 nm.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018165265A (ja) * 2017-03-28 2018-10-25 国立大学法人電気通信大学 新規セレンテラジン誘導体
WO2020041579A1 (fr) * 2018-08-23 2020-02-27 Promega Corporation Analogues de coelentérazine
CN114836427A (zh) * 2022-05-13 2022-08-02 杭州师范大学 一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092300A2 (fr) 2000-06-01 2001-12-06 Institut Pasteur Aequorine-gfp chimere utilisee comme reporter de ca++ bioluminescent au niveau de la cellule unitaire
US20030066095A1 (en) 2000-06-01 2003-04-03 Valerie Baubet Chimeric GFP-aequorin as bioluminescent Ca++ reporters at the single cell level
EP1714155A1 (fr) 2004-02-12 2006-10-25 Institut Pasteur Imagerie par bioluminescence in vivo en temps reel non vulnerante de la dynamique locale de ca2+ dans des organismes vivants
US20070274923A1 (en) 2005-01-11 2007-11-29 Philippe Brulet Non-invasive real-time in vivo bioluminescence imaging of local Ca2+ dynamics in living organisms
US20080282362A1 (en) 2004-02-12 2008-11-13 Philippe Brulet Non-invasive real-time in vivo bioluminescence imaging of local Ca2+ dynamics in living organisms

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001092300A2 (fr) 2000-06-01 2001-12-06 Institut Pasteur Aequorine-gfp chimere utilisee comme reporter de ca++ bioluminescent au niveau de la cellule unitaire
EP1292613A2 (fr) 2000-06-01 2003-03-19 Institut Pasteur Aequorine-gfp chimere utilisee comme reporter de ca?++ bioluminescent au niveau de la cellule unitaire
US20030066095A1 (en) 2000-06-01 2003-04-03 Valerie Baubet Chimeric GFP-aequorin as bioluminescent Ca++ reporters at the single cell level
EP1714155A1 (fr) 2004-02-12 2006-10-25 Institut Pasteur Imagerie par bioluminescence in vivo en temps reel non vulnerante de la dynamique locale de ca2+ dans des organismes vivants
US20080282362A1 (en) 2004-02-12 2008-11-13 Philippe Brulet Non-invasive real-time in vivo bioluminescence imaging of local Ca2+ dynamics in living organisms
US8263821B2 (en) 2004-02-12 2012-09-11 Institut Pasteur Non-invasive real-time in vivo bioluminescence imaging of local CaÂ2+ dynamics in living organisms
US20070274923A1 (en) 2005-01-11 2007-11-29 Philippe Brulet Non-invasive real-time in vivo bioluminescence imaging of local Ca2+ dynamics in living organisms

Non-Patent Citations (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ADAMCZYK, M.; AKIREDDY, S. R.; JOHNSON, D. D.; MATTINGLY P. G.; PAN, Y.; REDDY, R. E., TETRAHEDRON, vol. 59, 2003, pages 8129 - 8142
BAKAYAN A.; VAQUERO C.F.; PICAZO F; LLOPIS J., PLOS ONE, vol. 6, no. 5, 2011, pages E19520
BAUBET, V.; LE MOUELLIC, H.; CAMPBELL, A. K.; LUCAS- MEUNIER, E.; FOSSIER, P.; BRÛLET, P., PROC. NATL. ACAD. SEI. USA, vol. 97, 2000, pages 7260 - 7265
BAUBET, V.; LE MOUELLIC, H.; CAMPBELL, A. K.; LUCAS-MEUNIER, E.; FOSSIER, P.; BRÛLET, P., PROC. NATL. ACAD. SEI. USA, vol. 97, 2000, pages 7260 - 7265
BAUBET; BRÛLET ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 97, 2000, pages 7260 - 7265
CHARBONNEAU, H.; CORMIER, M. J., J BIOL. CHEM., vol. 254, 1979, pages 769 - 780
CONNIER, M. J.; LEE, J.; WAMPLER, J. E., ANNU. REV. BIOCHEM., vol. 44, 1975, pages 255 - 272
CURIE, T.; ROGERS, K. L.; COLASANTE, C.; BRÛLET, P., MOLECULAR IMAGING, vol. 6, 2007, pages 30 - 42
CURIE, T.; ROGERS, K.L.; COLASANTC, C.; BRÛLET, P., MOL. IMAGING, vol. 6, 2007, pages 30 - 42
DENG ET AL., PROTEIN SCI, vol. 14, 2005, pages 663 - 675
DEVILLERS, 1.; ARRAULT, A.; OLIVE, G.; MARCHAND-BRYNAERT, J., TETRAHEDRON LETT., vol. 43, 2002, pages 3161 - 3164
HEAD, J. F.; INOUYE, S.; TERANISHI, K.; SHIMOMURA, O., NATURE, vol. 405, 2000, pages 372 - 376
HIRANO T ET AL: "Bioluminescent Properties of Fluorinated Semi-synthetic Aequorins", TETRAHEDRON LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 39, no. 31, 30 July 1998 (1998-07-30), pages 5541 - 5544, XP004124111, ISSN: 0040-4039, DOI: 10.1016/S0040-4039(98)01115-0 *
HIRANO, T.; GOMI, Y.; TAKAHASHI, T.; KITAHARA, K.; QI, F. C.; MIZOGUCHI, I.; KYUSHIN, S.; OHASHI, M., TETRAHEDRON LETT., vol. 33, 1992, pages 5771 - 5774
HIRANO, T.; NEGISHI, R.; YAMAGUCHI, M.; QI, F. C.; OHMIYA, Y.; TSUJI, F. I.; OHASHI, M., TETRAHEDRON, vol. 53, 1997, pages 12903 - 12916
HIRANO, T.; OHMIYA, Y.; MAKI, S.; NIWA, H.; OHASHI, M., TETRAHEDRON LETT., vol. 39, 1998, pages 5541 - 5544
HORI, K.; WAMPLER, J. E.; MATTHEWS, J. C.; CORMIER, M. J., BIOCHEMISTRY, vol. 12, 1973, pages 4462 - 4468
INOUYE, S.; LIMON, R.; SAHARA, Y.; HISADA, S.; HOSAYA, T., ANAL. BIOCHEM., vol. 407, 2010, pages 247 - 252
INOUYE, S.; NOGUCHI, M.; SAKAKI, Y.; TAKAGI, Y.; MIYATA, T.; IWANAGA, S.; MIYATA, T.; TSUJI, F. I., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 82, 1985, pages 3154 - 3158
INOUYE, S.; SHIMOMURA, O., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 233, 1997, pages 349 - 353
MARTIN, J. R.; ROGERS, K. L.; CHAGNEAU, C.; BRÛLCT, P., PLOSONE, vol. 2, 2007, pages C275
MORI, K.; MAKI, S.; NIWA, H.; IKEDA, H.; HIRANO, T., TETRAHEDRON, vol. 62, 2006, pages 6272 - 6288
NAUMANN, E. A.; KAMPFF, A. R.; PROBER, D. A.; SCHIER, A. F.; ENGERT, F., NAT.NEUROSCI., vol. 13, 2010, pages 513 - 520
OHMIYA, Y.; TERANISHI, K.; AKUTAGAWA, M.; OHASHI, M.; TSUJI, F. 1., CHEM. LETT., 1993, pages 2149 - 2152
PHAKHODEE, W.; TOYODA, M.; CHOU, C.-M.; KHUNNAWUTMANOTHAM, N.; ISOBE, M., TETRAHEDRON, vol. 67, 2011, pages 1150 - 1157
QI, C. F.; GOMI, Y.; HIRANO, T.; OHASHI, M.; OHMIYA, Y.; TSUJI, F. I., J CHEM. SOC. PERKIN TRANS., vol. 13, 1992, pages 1607 - 1611
RIZZUTO, R.; POZZAN, T., PHYSIOL. REV., vol. 86, 2006, pages 369 - 408
ROGERS, K. L.; PICAUD, S.; RONCALI, E.; BOISGARD, R.; COLASANTE, C.; STINNAKRE, J.; TAVITIAN, B.; BRÛLET, P., PLOSONE, vol. 2, 2007, pages E974
SAITO, R.; HIRANO, T.; MAKI, S.; NIWA, H.; OHASHI, M., BULL. CHEM. SOC. JPN., vol. 84, 2011, pages 90 - 99
SAITO, R.; HIRANO, T.; NIWA, H.; OHASHI, M., CHEM LETT., 1998, pages 95 - 96
SHIMOMURA O ET AL: "Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium", CELL CALCIUM (EDINBURGH), CHURCHILL LIVINGSTONE MEDICAL JOURNALS, EDINBURGH, GB, vol. 14, no. 5, 1 May 1993 (1993-05-01), pages 373 - 378, XP026181845, ISSN: 0143-4160, [retrieved on 19930501], DOI: 10.1016/0143-4160(93)90041-4 *
SHIMOMURA O ET AL: "SEMI-SYNTHETIC AEQUORINS WITH IMPROVED SENSITIVITY TO CA2+ IONS", BIOCHEMICAL JOURNAL, THE BIOCHEMICAL SOCIETY, LONDON, GB, vol. 261, no. 3, 1 August 1989 (1989-08-01), pages 913 - 920, XP001007915, ISSN: 0264-6021 *
SHIMOMURA, O., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 211, 1995, pages 359 - 363
SHIMOMURA, O.; JOHNSON, F. H., NATURE, vol. 256, 1975, pages 236 - 238
SHIMOMURA, O.; JOHNSON, F. H.; SAIGA, Y., J CELL. COMP. PHYSIOL., vol. 59, 1962, pages 223 - 240
SHIMOMURA, O.; MUSICKI, B.; KISHI, Y., BIOCHEM. J, vol. 251, 1988, pages 405 - 410
SHIMOMURA, O.; MUSICKI, B.; KISHI, Y., BIOCHEM. J., vol. 261, 1989, pages 913 - 920
STEPANYUK, G. A.; UNCH, J.; MALIKOVA, N.; MARKOVA, S. V.; LEE, J.; VYSOTSKI, E. S., ANAL. BIOANAL. CHEM., vol. 398, 2010, pages 1809 - 1817
WU, C.; NAKAMURA, H.; MURAI, A.; SHIMOMURA, O., TETRAHEDRON LETT., vol. 42, 2001, pages 2997 - 3000

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018165265A (ja) * 2017-03-28 2018-10-25 国立大学法人電気通信大学 新規セレンテラジン誘導体
JP7036343B2 (ja) 2017-03-28 2022-03-15 国立大学法人電気通信大学 新規セレンテラジン誘導体
WO2020041579A1 (fr) * 2018-08-23 2020-02-27 Promega Corporation Analogues de coelentérazine
CN112513188A (zh) * 2018-08-23 2021-03-16 普洛麦格公司 腔肠素类似物
US11691976B2 (en) 2018-08-23 2023-07-04 Promega Corporation Coelenterazine analogues
CN112513188B (zh) * 2018-08-23 2024-01-26 普洛麦格公司 腔肠素类似物
CN114836427A (zh) * 2022-05-13 2022-08-02 杭州师范大学 一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用

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