CN112513188B - 腔肠素类似物 - Google Patents

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Abstract

描述了腔肠素类似物、所述类似物的制造方法、包含所述类似物的试剂盒，以及在基于荧光素酶的测定中使用所述化合物检测发光的方法。所述化合物具有以下通用结构(I)和(II)，其中G为经1个、2个或3个RD基团取代的呋喃‑2‑基，6至12元芳基，或除呋喃‑2‑基以外的5至12元杂芳基，其中所述芳基和杂芳基任选地经1个、2个、3个、4个或5个RE基团取代。

Description

腔肠素类似物
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年8月23日提交的美国临时专利申请No.62/721,708的优先权，所述临时专利申请的整个内容以引用的方式完全并入本文中。
发明领域
本公开涉及腔肠素类似物、腔肠素类似物的制造方法，以及在基于荧光素酶的测定中使用腔肠素类似物的方法。
背景技术
在细胞生理学、尤其是与基因表达相关的过程的研究中广泛地使用生物发光测定。具体地说，在这个领域中荧光素酶报告酶是具有相当大价值的工具，并且迄今为止，为了获得可用于生物发光测定中的对环境不敏感的小型荧光素酶，已经进行了大量的蛋白质工程。有许多有效的荧光素酶报告物，它们能够进行全细胞生物传感器测量，通过高通过量筛检来发现药物，以及进行体内成像，这又允许去研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用、细胞凋亡以及细胞活力。由于腔肠素和腔肠素类似物亮度较高并且可用于全细胞应用中，所以使用腔肠素和腔肠素类似物作为底物的荧光素酶是最广泛使用的系统之一。
发明内容
许多已知的腔肠素类似物有不足之处，这限制了它们作为荧光素酶底物的有效性和在基于荧光素酶的测定中的有用性。这些不足包括细胞毒性、光敏性、热力学不稳定性、低水溶性和低细胞透性。因此，对具有改良特性的腔肠素类似物和所述类似物的合成方法存在着需要。
在一方面，公开了式(I)化合物，
或其互变异构体或盐，其中：
X为C1-10烷基、卤素、CN、硝基、C1-10卤代烷基、C1-4卤代亚烷基-OC1-4烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、-C(O)ORx1、-CONRx1Rx2、-OC(O)NRx1Rx2、-NRx3C(O)ORx1、-ORx1、-C1-10亚烷基-ORx1、-OC(O)Rx1、-NRx1Rx2、-C1-10亚烷基-NRx1Rx2；-NRx3C(O)Rx1、-NRx3C(O)NRx1Rx2、-SO2Rx1、-SO2NRx1Rx2、-NRx3SO2Rx1、-SO2ORx1、-OSO2Rx1、-OSO3Rx1、-OP(O)(OH)ORx1、-OSi(C1-10烷基)3、-ORx0、-OGE或-NRx1GE；
m为0、1、2、3或4；
R1在每次出现时独立地为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA1、-NRB1RC1、-OGE或-NRB1GE；
其中任选地两个相邻R1基团或者X和相邻R1基团连同其附连的碳原子一起形成选自以下的稠环：5至7元环烷基、5至7元环烯基、苯基、5至6元杂芳基或5至7元杂环基，所述任选的稠环任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA1和-NRB1RC1；
GE在每次出现时独立地包含酶底物，其中由酶进行的生物转化使GE转变成H；
n为0、1、2、3、4或5；
R2在每次出现时独立地为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA2或-NRB2RC2；其中两个相邻R2基团连同其附连的碳原子一起任选地形成选自以下的稠环：5至7元环烷基、5至7元环烯基、苯基、5至6元杂芳基或5至7元杂环基，所述任选的稠环任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA2和-NRB2RC2；
RA1和RA2在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)C3-12环烷基或-C(O)C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；
RB1、RB2、RC1和RC2在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)C3-12环烷基、-C(O)C1-3亚烷基-C3-12环烷基、-SO2C1-10烷基、-SO2C3-12环烷基或-SO2C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；
可替代地，RB1和RC1和/或RB2和RC2连同各自附连的氮原子一起形成4至8元饱和或部分不饱和杂环，任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、氧代基、-OH和-OC1-4烷基；
G为经1个、2个或3个RD基团取代的呋喃-2-基，6至12元芳基，或除呋喃-2-基以外的5至12元杂芳基，其中所述芳基和杂芳基任选地经1个、2个、3个、4个或5个RE基团取代；
RD和RE在每次出现时独立地为卤素、C1-10烷基、C1-10卤代烷基或-L-RW；
L为键、C1-10亚烷基或-OC1-10亚烷基-；
RW为-CN、-NO2、-ORx4、-NRx4Rx5、-C(O)ORx4、-OC(O)Rx4、-NRx6C(O)Rx2、-C(O)NRx4Rx5、-NRx6C(O)ORx4、-OC(O)NRx4Rx5、-SO2Rx4、-SO2NRx4Rx5、-NRx6SO2Rx4、-OSO2Rx4、-SO2ORx4、-OSO3Rx4、-OP(O)(OH)ORx4或-NRx6C(O)NRx4Rx5；
Rx1、Rx2、Rx3、Rx4、Rx5和Rx6在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基或-C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；
可替代地，Rx1和Rx2和/或Rx4和Rx5连同各自附连的氮原子一起形成4至8元饱和或部分不饱和杂环，任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、氧代基、-OH和-OC1-4烷基；
Rx0为糖部分；并且
条件是所述化合物不为
8-苯甲基-2-(4-羟基苯甲基)-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
6-(4-((8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-3-氧代基-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-基)甲基)-2-氯苯氧基)己烷-1-磺酸；或
6-(4-((8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-氧代基-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-2-基)甲基)-2-氯苯氧基)己烷-1-磺酸。
在另一方面，公开了式(II)化合物，
或其互变异构体或盐，其中：
Y为C1-10烷基、卤素、CN、硝基、C1-10卤代烷基、C1-4卤代亚烷基-OC1-4烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、-C(O)ORy1、-CONRy1Ry2、-OC(O)NRy1Ry2、-NRy3C(O)ORy1、-ORy1、-C1-10亚烷基-ORy1、-OC(O)Ry1、-NRy1Ry2、-C1-10亚烷基-NRy1Ry2；-NRy3C(O)Ry1、-NRy3C(O)NRy1Ry2、-SO2Ry1、-SO2NRy1Ry2、-NRy3SO2Ry1、-SO2ORy1、-OSO2Ry1、-OSO3Ry1、-OP(O)(OH)ORy1、-OSi(C1-10烷基)3、-ORy0、-OGE或-NRy1GE；
p为0、1、2、3或4；
q为0、1、2、3、4或5；
R3在每次出现时独立地为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA3、-NRB3RC3、-OGE或-NRB3GE；
其中任选地两个相邻R3基团或者Y和相邻R3基团连同其附连的碳原子一起形成选自以下的稠环：5至7元环烷基、5至7元环烯基、苯基、5至6元杂芳基或5至7元杂环基，所述任选的稠环任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA3和-NRB3RC3；
GE在每次出现时独立地包含酶底物，其中由酶进行的生物转化使GE转变成H；
R4在每次出现时独立地为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA4或-NRB4RC4；其中两个相邻R4基团连同其附连的碳原子一起任选地形成选自以下的稠环：5至7元环烷基、5至7元环烯基、苯基、5至6元杂芳基或5至7元杂环基，所述任选的稠环任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA4和-NRB4RC4；
RA3和RA4在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)C3-12环烷基或-C(O)C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；
RB3、RB4、RC3和RC4在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)C3-12环烷基、-C(O)C1-3亚烷基-C3-12环烷基、-SO2C1-10烷基、-SO2C3-12环烷基或-SO2C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；
可替代地，RB3和RC3和/或RB4和RC4连同其附连的氮原子一起形成4至8元饱和或部分不饱和杂环，任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、氧代基、-OH和-OC1-4烷基；
Ry1、Ry2和Ry3在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基或-C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；
可替代地，Ry1和Ry2连同各自附连的氮原子一起形成4至8元饱和或部分不饱和杂环，任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、氧代基、-OH和-OC1-4烷基；并且
Ry0为糖部分，
条件是所述化合物不为
8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-甲氧基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
6-(3-氨基苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(萘-1-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(萘-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
6-(蒽-9-基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(菲-9-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(喹啉-6-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮；
3-(8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-3-氧代基-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯甲酸叔丁酯；或
3-(8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-3-氧代基-3,7-二氢咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)苯甲酸。
还公开了所述化合物的制造方法、包含所述化合物的试剂盒以及在基于荧光素酶的测定中使用所述化合物作为荧光素酶底物的方法。
附图说明
图1展示在过滤之前(上清液)和过滤之后(滤液)于乙醇/丙二醇/羟丙基-β-环糊精/PEG 400/水(10:10:10:35:35)中的8.7mM JW-1040的UV吸收光谱。
图2展示在过滤之前(上清液)和过滤之后(滤液)于乙醇/丙二醇/羟丙基-β-环糊精/PEG 400/水(10:10:10:35:35)中的8.7mM呋喃马嗪(furimazine)的UV吸收光谱。
具体实施方式
本文公开了腔肠素类似物。腔肠素类似物可以是式(I)或式(II)的化合物，并且是利用腔肠素产生发光的蛋白质(“利用腔肠素的酶”)的有用的底物，所述蛋白质包括(但不限于)在例如刺细胞动物(例如海肾荧光素酶(Renilla luciferase))、水母(例如来自多管水母(Aequorea jellyfish)的水母发光蛋白)的多种海洋生物中发现的荧光素酶和发光蛋白，以及十足类动物荧光素酶(例如细角刺虾(Oplophorus gracilirostris)的荧光素酶复合物)。
在一些实施方案中，式(I)和式(II)的化合物显示与呋喃马嗪相比改良的水溶性。在一些实施方案中，式(I)和(II)的化合物显示与在6-苯基的对位处进行类似取代的腔肠素化合物相比改良的生物发光信号动力学。因此，式(I)和(II)的化合物可用于体内发光成像应用以及利用生物发光的其它应用。
1.定义
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本领域的一般技术人员通常所了解的含义相同的含义。万一发生矛盾，将以包括定义在内的本说明为准。以下描述了优选的方法和材料，不过与本文所述的方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本发明的实施或测试中。本文中提到的所有公布、专利申请、专利和其它参考文献均以引用的方式整体并入本文中。本文公开的材料、方法和实施例只是例示性的，并不意图限制。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有(“having”、“has”)”、“可”、“含有”和其变体意图为开放性的过渡短语、术语或词语，它们不排除额外动作或结构的可能性。除非上下文另外清楚规定，否则单数形式“一种(a/an)”和“所述”包括多个提及物。无论明确阐述与否，本公开还涵盖“包含”本文中呈现的实施方案或要素、“由其组成”或“基本上由其组成”的其它实施方案。
结合数量使用的修饰语“约”包括所述值，并且具有由上下文决定的含义(例如其包括至少与具体数量的测量相关的误差度)。修饰语“约”还被认为是公开由两个终点的绝对值界定的范围。举例来说，表述“约2至约4”还公开范围“2至4”。术语“约”可指加或减所指示的值的10％。举例来说，“约10％”可指示9％至11％的范围，并且“约1”可意指0.9-1.1。“约”的其它含义可以从上下文显而易见，例如舍入，因此，举例来说，“约1”还可能意指0.5至1.4。
以下更详细地描述了特定官能团和化学术语的定义。对本公开来说，化学元素是根据元素周期表(the Periodic Table of the Elements),CAS版,Handbook ofChemistry and Physics,第75版,里封面鉴定，并且特定官能团通常如其中所述来定义。另外，有机化学的一般原理以及特定官能部分和反应性描述以下中：Organic Chemistry,Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito,1999；Smith和March March’sAdvanced Organic Chemistry,第5版,John Wiley&Sons公司,New York,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers公司,New York,1989；Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,第3版,CambridgeUniversity Press,Cambridge,1987；每一个的全部内含以引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“烷基”意指直链或支链饱和烃链。术语“低级烷基”或“C1-6烷基”意指含有1至6个碳原子的直链或支链烃。术语“C1-4烷基”意指含有1至4个碳原子的直链或支链饱和烃。烷基的代表性实例包括(但不限于)甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基和正癸基。
如本文所用，术语“烯基”意指含有至少一个碳碳双键的直链或支链烃链。
如本文所用，术语“炔基”意指含有至少一个碳碳三键的烃链。
如本文所用，术语“亚烷基”是指衍生自例如具有1至6个碳原子的直链或支链饱和链烃的二价基团。亚烷基的代表性实例包括(但不限于)-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2CH2-。
如本文所用，术语“芳基”是指苯基或附加至母分子部分并与环烷基(例如茚满基)、苯基(即萘基)或非芳香族杂环(例如苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)稠合的苯基。
如本文所用，术语“环烷基”是指含有零个杂原子和零个双键的碳环系统。环烷基的代表性实例包括(但不限于)环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、金刚烷基和双环[1.1.1]戊烷基。
如本文所用，术语“环烯基”意指含有碳碳双键且优选地每个环具有5-10个碳原子的非芳香族单环或多环全碳环系统。示例性单环环烯基环包括环戊烯基、环己烯基或环庚烯基。
如本文所用，术语“卤素”或“卤基”意指Cl、Br、I或F。
如本文所用，术语“卤代烷基”意指如本文中定义的烷基，其中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氢原子被卤素置换。
如本文所用，术语“杂芳基”是指芳香族单环含杂原子环(单环杂芳基)或含有至少一个单环杂芳基的双环系统(双环杂芳基)。单环杂芳基是含有至少一个独立地选自由N、O和S组成的组的杂原子(例如1个、2个、3个或4个独立地选自O、S和N的杂原子)的五元环或六元环。五元芳香族单环具有两个双键并且六元芳香族单环具有三个双键。双环杂芳基是具有与单环芳香族、饱和或部分饱和碳环、单环杂芳基或单环杂环稠合的单环杂芳环的8至12元环系统。双环杂芳基在芳香族环原子处连接于母分子部分。杂芳基的代表性实例包括(但不限于)吲哚基(例如吲哚-1-基、吲哚-2-基、吲哚-4-基)、吡啶基(包括吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基)、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡唑基(例如吡唑-4-基)、吡咯基、苯并吡唑基、1,2,3-三唑基(例如三唑-4-基)、1,3,4-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、咪唑基、噻唑基(例如噻唑-4-基)、异噻唑基、噻吩基、苯并咪唑基(例如苯并咪唑-5-基)、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、嘌呤基、异吲哚基、喹喔啉基、吲唑基(例如吲唑-4-基、吲唑-5-基)、喹唑啉基、1,2,4-三嗪基、1,3,5-三嗪基、异喹啉基、喹啉基、6,7-二氢-1,3-苯并噻唑基、咪唑并[1,2-a]吡啶基(例如咪唑并[1,2-a]吡啶-6-基)、萘啶基、吡啶并咪唑基、噻唑并[5,4-b]吡啶-2-基、噻唑并[5,4-d]嘧啶-2-基。
如本文所用，术语“杂环”或“杂环的”意指单环杂环、双环杂环或三环杂环。单环杂环是含有至少一个独立地是选自由O、N和S组成的组的杂原子的三元、四元、五元、六元、七元或八元环。三元或四元环含有零个或一个双键和一个选自由O、N和S组成的组的杂原子。五元环含有零个或一个双键和一个、两个或三个选自由O、N和S组成的组的杂原子。六元环含有零个、一个或两个双键和一个、两个或三个选自由O、N和S组成的组的杂原子。七元环和八元环含有零个、一个、两个或三个双键和一个、两个或三个选自由O、N和S组成的组的杂原子。单环杂环的代表性实例包括(但不限于)氮杂环丁烷基、氮杂环庚烷基、氮杂环丙烯基、氮杂环丙烷基、二氧杂环庚烷基、1,3-二噁烷基、1,3-二氧杂环戊烷基、1,3-二硫杂环戊烷基、1,3-二噻烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑啉基、异噻唑烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、吗啉基、2-氧代基-3-哌啶基、2-氧代氮杂环庚烷-3-基、咪二唑啉基、咪二唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、氧杂环丁烷基、氧杂环庚烷基、氧杂环辛烷基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡唑啉基、吡唑烷基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢噻吩基、噻二唑啉基、噻二唑烷基、1,2-噻嗪烷基、1,3-噻嗪烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、硫吗啉基、1,1-二氧离子基硫吗啉基(硫吗啉砜)、硫吡喃基和三噻烷基。双环杂环是与苯基稠合的单环杂环，或与单环环烷基稠合的单环杂环，或与单环环烯基稠合的单环杂环，或与单环杂环稠合的单环杂环，与单环杂芳基稠合的单环杂环，或螺杂环基，或环的两个非相邻原子由1个、2个、3个或4个碳原子的亚烷基桥或两个、三个或四个碳原子的亚烯基桥连接的桥接单环杂环环系统。双环杂环在非芳香族环原子处连接于母分子部分(例如2-氧杂螺[3.3]庚烷-6-基、吲哚啉-1-基、六氢环戊并[b]吡咯-1(2H)-基)。双环杂环的代表性实例包括(但不限于)苯并吡喃基、苯并硫吡喃基、色满基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3-二氢苯并噻吩基、2,3-二氢异喹啉、2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基、2-氧杂-6-氮杂螺[3.3]庚烷-6-基、氮杂双环[2.2.1]庚基(包括2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)、氮杂双环[3.1.0]己烷基(包括3-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-基)、2,3-二氢-1H-吲哚基、异吲哚啉基、八氢环戊并[c]吡咯基、八氢吡咯并吡啶基和四氢异喹啉基。三环杂环例示为与苯基稠合的双环杂环，或与单环环烷基稠合的双环杂环，或与单环环烯基稠合的双环杂环，或与单环杂环稠合的双环杂环，或双环的两个非相邻原子由1个、2个、3个或4个碳原子的亚烷基桥或两个、三个或四个碳原子的亚烯基桥连接的双环杂环。三环杂环的实例包括(但不限于)八氢-2,5-环氧基并环戊二烯、六氢-2H-2,5-亚甲基环戊并[b]呋喃、六氢-1H-1,4-亚甲基环戊并[c]呋喃、氮杂-金刚烷(1-氮杂三环[3.3.1.13,7]癸烷)和氧杂-金刚烷(2-氧杂三环[3.3.1.13,7]癸烷)。单环、双环和三环杂环在非芳香族环原子处连接至母分子部分。
例如“烷基”、“环烷基”、“亚烷基”等术语前面可以放指示在具体情况下基团中存在的原子数目的名称(例如“C1-4烷基”、“C3-6环烷基”、“C1-4亚烷基”)。这些名称如本领域的技术人员通常所了解来使用。举例来说，后面为下标数字的表述“C”指示随后基团中存在的碳原子数目。因此，“C3烷基”是具有三个碳原子(即正丙基、异丙基)的烷基。在给出范围的情况下，如“C1-4”中，随后的基团的成员可具有所叙述范围内的任何数目的碳原子。“C1-4烷基”例如是具有1至4个碳原子的烷基，无论如何排列(即直链或支链)。
如本文所用，“动物”是指任何脊椎动物，包括(但不限于)哺乳动物、两栖动物、鸟类、鱼、昆虫、爬行动物等。哺乳动物可包括但不限于人类、非人类灵长类动物(例如大猩猩、猴子、狒狒和黑猩猩等)、犬、猫、山羊、马、猪、牛、绵羊等等，以及实验动物(例如大鼠、豚鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠等等。在一些实施方案中，动物可以是人类或非人类。合适的动物包括雄性和雌性和任何年龄的动物，包括胚胎期(例如在子宫内或胚胎内)、婴儿期、幼年期、青少年期、成年和老年动物。
如本文所用，“融合蛋白”和“融合多肽”是指一种融合物，所述融合物包含至少一种生物发光蛋白与例如荧光蛋白的所关注的异源蛋白组合，形成链在自然界中不存在的氨基酸的单一连续链的一部分。
如本文所用，“可操作地连接”意指基因的表达处于其在空间上连接的启动子的控制之下。启动子可以位于处于其控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可大约与在启动子所源自的基因中启动子与其控制的基因之间的距离相同。如本领域中已知，可以在不丧失启动子功能下使所述距离发生变化。
如本文所用，“转基因”是指含有已经从一种生物体分离和/或操纵并引入不同生物体中的基因序列的基因或遗传物质。转基因可以含有转基因序列或天然或野生型DNA序列。DNA的这个非天然区段可以保留在转基因生物体中产生RNA或蛋白质的能力。举例来说，转基因可以编码融合蛋白，例如包含荧光素酶的融合蛋白。转基因序列可以是部分或完全物种异源的，即转基因序列或其一部分可以来自于与其引入的细胞不同的物种。
“转基因动物”是指基因工程化动物或基因工程化动物的后代。转基因动物通常含有来自至少一种无关生物体，例如来自病毒、植物或其它动物的遗传物质。
在本文中可互换使用的术语“转化”、“转染”和“转导”是指例如遗传物质的异源核酸分子引入细胞中。这种引入细胞中可以是稳定的或短暂的。因此，在一些实施方案中，宿主细胞或宿主生物体稳定地用异源核酸分子、例如遗传物质转化。在其它实施方案中，宿主细胞或宿主生物体短暂地用异源核酸分子、例如遗传物质转化。在多核苷酸的上下文中“短暂转化”意指多核苷酸引入细胞中并且不整合至细胞的基因组中。在引入细胞中的多核苷酸的上下文中“稳定地引入”或“稳定引入”意图所引入的多核苷酸稳定地并入细胞的基因组中，因此细胞稳定地经多核苷酸转化。如本文所用，“稳定转化”或“稳定地转化”意指核酸分子引入细胞中并且整合至细胞的基因组中。因而，所整合的核酸分子能够被其后代遗传，更具体地说，被多个连续世代的后代遗传。如本文所用，“基因组”还包括核、质粒和质体基因组，因此，包括核酸构建体整合至例如叶绿体或线粒体基因组中。如本文所用，稳定转化还可以指在染色体外维持，例如呈极微染色体或质粒的转基因。在一些实施方案中，核苷酸序列、构建体、表达盒可以短暂地表达和/或其可以稳定地并入宿主生物体的基因组中。
对于本文所述的化合物，可以根据原子和取代基所允许的价数选择基团和其取代基，使得所述选择和取代产生稳定化合物，例如所述稳定化合物不自发地例如通过重排、环化、消除等进行转化。
关于本文中数值范围的叙述，明确地涵盖相同精确度下其间的每个介入数字。举例来说，对于6-9的范围，除6和9外，涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
2.化合物
本发明的第一方面提供了式(I)化合物，其中R1、R2、X、G、m和n如本文中所定义。在本文描述变数R1、R2、X、G、m和n，包括子变数例如Rx1、Rx2、RD等时，本文提供的式(I)的实施方案包括这些变数的任何组合。
在一些实施方案中，G为经1个、2个或3个RD基团取代的呋喃-2-基，其中RD如本文中所定义。在一些实施方案中，呋喃-2-基经单个RD基团取代(例如 )。在其它实施方案中，RD为C1-4烷基(例如CH3)或C1-4卤代烷基(例如CF3)。
在一些实施方案中，G为6至12元芳基，任选地经1个、2个、3个、4个或5个RE基团取代，其中RE如本文中所定义。在其它实施方案中，6至12元芳基为苯基。在其它实施方案中，6至12元芳基为与含有1-2个氧原子的5至7元杂环(例如苯并二氧杂环戊烯)稠合的苯基。在其它实施方案中，芳基(例如苯基)任选地经1-3个RE，例如卤素、C1-4烷基、-OC1-4烷基和-C1-10亚烷基-OC1-4烷基取代(例如 )。在其它实施方案中，苯基任选地经1-3个独立地选自由以下组成的组的RE基团取代：卤素、-ORx4、C1-10亚烷基-ORx4和-OC1-10亚烷基-SO2ORx4(例如-OC6亚烷基-SO3H)。
在其它实施方案中，G为除呋喃-2-基以外的5至12元杂芳基，任选地经1个、2个、3个、4个或5个RE基团取代。在其它实施方案中，杂芳基为噻吩基、咪唑基、吡啶基或噻唑基，例如 每一个任选地经1个、2个或3个RE基团取代。
在其它实施方案中，G选自由以下组成的组：
在一些实施方案中，X为ORx1或NRx1Rx2，其中Rx1和Rx2如本文中所定义。在其它实施方案中，X为ORx1。在其它实施方案中，X为NRx1Rx2。在这些实施方案中，存在其它实施方案，其中Rx1和Rx2为氢。在其它实施方案中，X为-OSi(C1-10烷基)3(例如-OSi(t-Bu)(Me)2。
在一些实施方案中，R1在每次出现时为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA1或-NRB1RC1，其中RA1、RB1和RC1如本文中所定义。在其它实施方案中，R1为卤素、CN、硝基、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)、-ORA1或-NRB1RC1，其中RA1、RB1和RC1在每次出现时独立地为H、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)或C3-6环烷基(例如环丙基)。
在一些实施方案中，R2在每次出现时独立地为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA2或-NRB2RC2，其中RA2、RB2和RC2如本文中所定义。在其它实施方案中，R2为卤素、CN、硝基、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)、-ORA2或-NRB2RC2，其中RA2、RB2和RC2在每次出现时独立地为H、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)或C3-6环烷基(例如环丙基)。
在本文所述的式(I)的实施方案中，为如下实施方案，其中m为0并且R2、X、G和n如本文中所定义。在本文所述的式(I)的实施方案中，为如下实施方案，其中n为0并且R1、X、G和m如本文中所定义。举例来说，在式(I)的一些实施方案中，m为0并且n为0，并且X和G如本文中所定义。
在一示例性组合中，m为0并且n为0，X为OH或NH2，并且G如本文中所定义。在另一示例性组合中，G为经单个RD基团取代的呋喃-2-基；每一个任选地经1-3个RE基团取代；或任选地经1-3个RE基团取代的芳基，其中芳基为苯基或与含有1-2个氧原子的5至7元杂环(例如苯并二氧杂环戊烯)稠合的苯基。RD和RE取代基的数目和身份如本文中其它地方所述。
在式(I)的实施方案中，本文描述了如下实施方案，其中m为1，R1为卤素，并且R2、X、G和n如本文中所定义。举例来说，在式(I)的一些实施方案中，m为1并且n为0，并且X和G如本文中所定义。在示例性实施方案中，m为1，R1为氟，n为0，X为OH或NH2，并且G如本文中所定义。
代表性式(I)化合物包括/>
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本发明的另一方面提供了式(II)化合物，其中R3、R4、Y、p和q如本文中所定义。在本文描述了变数R3、R4、Y、p和q，包括子变数例如Ry1、Ry2、RA3等时，本文提供的式(II)的实施方案包括这些变数的任何组合。
在一些实施方案中，任选地两个相邻R3基团或者Y和相邻R3基团连同其附连的碳原子一起形成选自以下的稠环：5至7元环烷基、5至7元环烯基或5至7元杂环基，所述任选的稠环任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA3和-NRB3RC3。
在一些实施方案中，p+q为0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一些实施方案中，p+q为1、2、3、4、5、6、7、8或9。在一些实施方案中，p为1、2、3或4。在一些实施方案中，q为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，p为0。在一些实施方案中，q为0。在一些实施方案中，p+q为0、1或2。在一些实施方案中，p+q为1或2。在一些实施方案中，p+q为1。在一些实施方案中，p+q为2。在一些实施方案中，p+q为3。
在一些实施方案中，Y为硝基、ORy1或NRy1Ry2，其中Ry1和Ry2如本文中所定义。在一些实施方案中，Y为ORy1或NRy1Ry2，其中Ry1和Ry2如本文中所定义。在其它实施方案中，Y为硝基。在其它实施方案中，Y为ORy1。在其它实施方案中，Y为NRy1Ry2。在这些实施方案中，为其它实施方案，其中Ry1和Ry2为氢。
在一些实施方案中，R3在每次出现时为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA3或-NRB3RC3，其中RA3、RB3和RC3如本文中所定义。在其它实施方案中，R3为卤素、CN、硝基、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)、-ORA3或-NRB3RC3，其中RA3、RB3和RC3在每次出现时独立地为H、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)或C3-6环烷基(例如环丙基)。在一些实施方案中，p为1并且R3为卤素或C1-4烷基(例如甲基)。在一些实施方案中，p为1并且R3为卤素。在示例性实施方案中，p为1并且R3为氟或氯。在其它示例性实施方案中，p为1并且R3为氟。在其它示例性实施方案中，p为1并且R3为氯。在其它示例性实施方案中，p为1并且R3为C1-4烷基。在其它示例性实施方案中，p为1并且R3为甲基。
在一些实施方案中，R4在每次出现时独立地为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA4或-NRB4RC4，其中RA4、RB4和RC4如本文中所定义。在其它实施方案中，R4为卤素、CN、硝基、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)、-ORA4或-NRB4RC4，其中RA4、RB4和RC4在每次出现时独立地为H、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)或C3-6环烷基(例如环丙基)。在一些实施方案中，q为1或2并且每个R4独立地为卤素或C1-4烷基。在一些实施方案中，q为1并且R4为C1-4烷基。
在一些实施方案中，R4在每次出现时为卤素。在一些实施方案中，R4为氟。在示例性实施方案中，q为1或2并且R4为氟。在一些实施方案中，q为1并且R4为氟。在其它实施方案中，q为2并且每个R4为氟。
在式(II)的实施方案中，本文描述了如下实施方案，其中p为1、2、3或4，并且R3、R4、Y和q如本文中所定义。在其它实施方案中，p为1或2并且R3、R4、Y和q如本文中所定义。在其它实施方案中，p为1并且R3、R4、Y和q如本文中所定义。
在式(II)的实施方案中，本文描述了如下实施方案，其中q为0、1、2、3、4或5，并且R3、R4、Y和p如本文中所定义。在式(II)的实施方案中，本文描述了如下实施方案，其中q为1、2、3、4或5，并且R3、R4、Y和p如本文中所定义。在其它实施方案中，q为1或2并且R3、R4、Y和p如本文中所定义。在其它实施方案中，q为0并且R3、Y和p如本文中所定义。在其它实施方案中，q为1并且R3、R4、Y和p如本文中所定义。
在式(II)的一些实施方案中，p为1，q为1，并且R3、R4和Y如本文中所定义。在式(II)的一些实施方案中，p为1，q为2，并且R3、R4和Y如本文中所定义。在式(II)的一些实施方案中，p为1，q为0，并且R3、R4和Y如本文中所定义。
在一示例性组合中，p为0或1并且q为0或1，Y为硝基、OH或NH2，R3和R4独立地为卤素、CN、硝基、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)、-ORA4或-NRB4RC4，其中RA4、RB4和RC4在每次出现时独立地为H、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)或C3-6环烷基(例如环丙基)。
在一示例性组合中，p为0或1并且q为0或1，Y为OH或NH2，R3和R4独立地为卤素、CN、硝基、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)、-ORA4或-NRB4RC4，其中RA4、RB4和RC4在每次出现时独立地为H、C1-4烷基(例如甲基、乙基)、C1-4卤代烷基(例如CF3)或C3-6环烷基(例如环丙基)。
在一示例性组合中，p为1并且q为1或2，Y为OH或NH2，并且R3和R4为卤素。
代表性式(II)化合物包括
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在其它实施方案中，式(I)或(II)的化合物可以是荧光素酶的前驱底物，即当与荧光素酶组合时不直接支持发光，而是能够通过例如用第二酶进行生物转化来转变成荧光素酶底物的化合物。前驱底物包括例如经-OGE、-NRx1GE、-NRy1GE、-NRB1GE或-NRB3GE取代的式(I)或(II)的化合物。
GE包含酶底物，其中酶底物通过酶发生的生物转化使GE转变成H。在一些实施方案中，GE为GE1-L1-；GE1是酶底物并且L1是将GE1连接至式(I)或(II)的化合物的其余部分(即母分子部分)的连接基团。
在一些实施方案中，L1为键或由在中性环境条件下稳定的原子排列构成的二价基团，所述原子选自碳、氢、氮、氧、硫、磷和硅。二价基团可以包括单键(例如CH2-CH2、CH2-O)、双键(例如C＝O)或三键(例如C≡C)，并且可以含有或包括环结构(例如环烷基)。在一些实施方案中，二价基团为以下一个或多个的排列：-C1-10亚烷基-、-C2-10亚烷基-O-、C3-8亚环烷基、-C(O)-、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NH-、-N(C1-4烷基)-、-N(COC1-4烷基)-、氨基酸部分、受保护的氨基酸部分和亚苯基，其中C3-8亚环烷基和亚苯基任选地独立地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4烷氧基、卤基、氰基或羟基。在一些实施方案中，L1为C1-C10亚烷基(例如C2-C3亚烷基)。
连接基团L1可以是前驱底物与酶底物之间的连接基团，如以引用的方式整体并入本文中的WO2006/130551、WO2014/159044、US2007/0015790或US2014/0304842中所公开。举例来说，L1可以是无痕连接基团，例如三甲基锁、醌的甲基化物、二肽基、对氨基苯甲氧羰基或亚烷基二氨基羰基连接基团，如方案1中所示。GE1的酶促生物转化引起与GE1连接的杂原子的键裂解，从而释放可以自发地自我牺牲而释放苯并噻唑荧光素类似物的连接基团。一些无痕连接基团(例如亚烷基连接基团)可以自发地通过β-消除来消除，如WO2006/130551中所述。
方案1
酶底物GE1的代表性实例包括蛋白酶、细胞色素(CYP)P450还原酶、单胺氧化酶(MAO)、黄素单加氧酶(FMO)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、脱烷基酶(例如脱甲基酶)、脱乙酰酶、脱甲酰基酶、硫酸酯酶、磷酸酶(例如碱性磷酸酶(AP))、β-内酰胺酶和乙醇脱氢酶的底物，如以引用的方式整体并入本文中的WO2006/130551或US2007/0015790中所述。
代表性蛋白酶底物包括(但不限于)如以引用的方式整体并入本文中的Cosby等人Cell Notes(2007)18,第9-11页中所述的肽Z-DEVD-、Z-LETD-、GP-、Suc-LLVY-、Z-LRR-、Z-nLPnLD-、Z-QEVY-、VP-、Z-VDVAD-、Z-VEID-、Z-ATAD-、Z-IEPD-、Z-IETD-、Z-TSAVLQ-和Z-VNSTLQ-。在这些蛋白酶底物的情况下，L1为键，因为酶底物直接在X或Y处连接至O或N并直接裂解。
方案2中示出具有无痕连接基团的GE的代表性实例。
方案2
通过使用作为ULTRA的一部分的Struct＝Name命名算法指定化合物名称。
化合物可以呈存在不对称或手性中心的立体异构体形式存在。立体异构体为“R”或“S”，取决于手性碳原子周围的取代基的构型。本文中使用的术语“R”和“S”为如IUPAC1974Recommendations for Section E,Fundamental Stereochemistry,PureAppl.Chem.,1976,45:13-30中定义的构型。本公开涵盖多种立体异构体和其混合物，并且这些都特别地包括在本发明的范围内。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体以及对映异构体或非对映异构体的混合物。化合物的单独的立体异构体可以用含有不对称或手性中心的市售起始物质合成制备，或者通过制备外消旋混合物，然后着通过本领域的一般技术人员众所周知的拆分方法来制备。这些拆分方法例示如下：(1)如Furniss,Hannaford,Smith和Tatchell,“Vogel′s Textbook of Practical Organic Chemistry”,第5版(1989),Longman Scientific&Technical,Essex CM20 2JE,England中所述，将对映异构体混合物连接至手性助剂，通过再结晶或色谱法分离非对映异构体的所得混合物，以及任选地从助剂释放光学纯的产物；或(2)在手性色谱柱上直接分离光学对映异构体的混合物；或者(3)分步结晶法。
应了解，化合物可具有互变异构形式以及几何异构体，并且这些也构成本发明的方面。本发明的化合物或其互变异构体或盐包括：化合物、化合物的盐、化合物的互变异构体和化合物的盐的互变异构体。
本公开还包括同位素标记化合物，除了一个或多个原子被原子质量或质量数不同于在自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子置换外，所述化合物与式(I)中所述的化合物一致。适合于包括在本发明化合物中的同位素的实例为氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯，分别例如但不限于2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。用例如氘(即2H)的重同位素取代可提供由更大代谢稳定性产生的某些治疗优点，例如体内半衰期延长或剂量需求减少，由此在一些情况下可能是优选的。化合物可以掺入正电子发射同位素，用于医学成像和正电子发射断层扫描(PET)研究，以确定受体的分布。可以掺入式(I)化合物中的合适正电子发射同位素为11C、13N、15O和18F。同位素标记的式(I)化合物一般可以通过本领域的技术人员已知的常规技术，或者通过与随附实施例中描述的方法类似的方法，使用适当同位素标记的试剂代替未进行同位素标记的试剂来制备。
本文所述的化合物可以呈盐形式。选择适合与人类和低等动物的组织接触使用，无过度毒性、刺激、过敏反应等等并且与合理益处/风险比相称的盐在合理的医学判断范围内。药学上可接受的盐是本领域中众所周知的。举例来说，S.M.Berge等人在以引用的方式并入本文中的J Pharmaceutical Sciences,1977,66,1-19中详细地描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的可接受的盐包括衍生自合适的无机酸和碱以及有机酸和碱的盐。可接受的无毒的酸加成盐的实例为氨基与例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸的无机酸或与例如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、丁二酸或丙二酸的有机酸或通过使用本领域中使用的例如离子交换的其它方法形成的盐。其它可接受的盐包括：己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。碱加成盐可以在所公开化合物的最终分离和纯化期间，通过羧基与合适碱，例如如锂、钠、钾、钙、镁或铝的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或与有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。可以制备季胺盐，例如衍生自甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因(procaine)、二苄基胺、N,N-二苄基苯基乙胺、1-二苯羟甲胺和N,N′-二苄基乙二胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等的季胺盐。
A.化合物的特性
式(I)和式(II)的化合物可以是荧光素酶的底物以产生发光。所述化合物可以具有改良的水溶性、改良的稳定性、改良的细胞透性、增加的与细胞的生物相容性、减少的自发光和/或减少的毒性。
“发光”是指荧光素酶在适当条件下，例如在例如腔肠素类似物的合适底物存在下的光输出。光输出可以被测量为发光反应开始时光输出的瞬时或接近瞬时的量度(有时称为“T＝0”发光或“闪光”)，发光反应可能在加入腔肠素底物时就开启。在多个实施方案中，发光反应在溶液中进行。在其它实施方案中，发光反应在固体载体上进行。溶液可以含有例如来自原核或真核表达系统中的细胞的溶解产物。在其它实施方案中，表达发生在无细胞系统中，或荧光素酶蛋白质被分泌至胞外培养基中，使得在后一情况下，无需产生溶解产物。在一些实施方案中，通过将例如腔肠素类似物、缓冲液等适当材料注射至含有发光蛋白的反应室(例如例如96孔板的多孔板的孔)中使反应开始。在其它实施方案中，将荧光素酶和/或腔肠素类似物(例如式(I)和(II)的化合物)引入宿主中，并且在可以包括整个生物体或其细胞、组织、外植体或提取物的宿主或其一部分上测量发光。反应室可以位于读数装置中，所述读数装置可以例如使用光度计或光电倍增管测量光输出。还可以测量随着时间过去，例如在相同反应室中历时数秒、数分钟、数小时等的时间段的光输出或发光。光输出或发光可以被报告为随着时间过去的平均值、信号衰变的半衰期、在一段时间内的信号总和或最大输出。发光可以用相对光单位(RLU)来测量。
式(I)和式(II)的化合物可以具有相对于腔肠素或例如呋喃马嗪的已知腔肠素类似物，大于或等于1、大于或等于2、大于或等于3、大于或等于4、大于或等于5、大于或等于10、大于或等于20、大于或等于30、大于或等于40、大于或等于50、或大于或等于100的RLU。
式(I)和式(II)的化合物可以具有450-700纳米、460-600纳米、470-600纳米、480-600纳米、490-600纳米、500-600纳米、510-600纳米、520-600纳米、530-600纳米、540-600纳米、550-600纳米、560-600纳米、570-600纳米、580-600纳米、590-600纳米、470-590纳米、480-580纳米、490-570纳米、500-560纳米或510-550纳米的λmax。式(I)和式(II)的化合物可以具有大于或等于450纳米、大于或等于460纳米、大于或等于470纳米、大于或等于480纳米、大于或等于490纳米、大于或等于500纳米、大于或等于510纳米、大于或等于520纳米、大于或等于530纳米、大于或等于540纳米、大于或等于550纳米、大于或等于560纳米、大于或等于570纳米、大于或等于580纳米、大于或等于590纳米、大于或等于600纳米、大于或等于610纳米、大于或等于620纳米、大于或等于630纳米、大于或等于640纳米、大于或等于650纳米、大于或等于660纳米、大于或等于670纳米、大于或等于680纳米、大于或等于690纳米或大于或等于700纳米的λmax。
“生物相容性”是指细胞(例如原核或真核)对腔肠素类似物(例如式(I)化合物)的耐受性。腔肠素类似物的生物相容性与其在宿主细胞上引起的应力有关。
增强的腔肠素类似物(例如式(I)化合物)的生物相容性可以通过测量细胞活力和/或细胞生长速率来确定。举例来说，增强的腔肠素类似物的生物相容性可以通过与天然或已知腔肠素相比测量暴露于腔肠素类似物的细胞缺少荧光素酶表达时的细胞活力来确定，以确定腔肠素类似物对细胞来说将如何相容和/或有毒。
具体地说，增强的生物相容性可以使用细胞活力分析(例如使用发光细胞活力测定)、细胞凋亡测定(例如使用/>技术)或本领域中已知的另一方法确定。所公开化合物对细胞活力或细胞凋亡的作用可以与天然或已知的腔肠素类似物对细胞活力或细胞凋亡的作用相比。
增强的生物相容性还可以通过测量腔肠素类似物(例如式(I)化合物)对细胞生长或基因表达的作用来确定。举例来说，增强的式(I)或式(II)的化合物的生物相容性可以通过测量一段时间后的细胞数目，或者通过与暴露于天然或已知的腔肠素或不暴露于腔肠素的细胞相比确定暴露于式(I)或式(II)的化合物的细胞样品中应力反应基因的表达来确定。所公开化合物对细胞生长或基因表达的作用可以与天然或已知的腔肠素相比。
B.合成方法
式(I)和式(II)的化合物可以通过合成方法或通过代谢过程制备。通过代谢过程制备化合物包括人类或动物体(体内)中存在的代谢过程或体外存在的过程。
式(I)和式(II)的化合物可以如方案1-3所示合成，其中基团。合适的合成方法还可以包括例如2016年2月15日提交的Shakhmin等人的美国序列号62/295,363“COELENTERAZINE ANALOGUES”(代理人案号016026-9574)(其以引用的方式整体并入本文中)中公开的合成方法。
在随后的方案的描述中使用的缩写为：ACN，乙腈；CDI，羰基二咪唑；DCM，二氯甲烷；DMF，二甲基甲酰胺；eq，当量；EtOH，乙醇；h或hr，小时；HWE，霍纳尔-沃兹沃思-埃蒙斯反应(Horner-Wadsworth-Emmons)；MeOH，甲醇；min.，分钟；RT/rt/r.t.，室温；TBDMS，叔丁基二甲基甲硅烷基；TMG，1,1,3,3-四甲基胍；TFA，三氟乙酸；THF，四氢呋喃；TMG，1,1,3,3-四甲基胍。
方案3
方案3展示了合成式(I)的含酚腔肠素的通用途径。
方案4
方案4展示了式(I)的经取代的含呋喃化合物的通用合成。
方案5
方案5展示式(II)的含呋喃化合物的通用合成。
通用程序
通用程序A(碳烯插入)：向2-氨基-吡嗪(1当量)于氯苯中的溶液中加入2-重氮基-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(或叔丁酯)(2-3当量)和乙酸铑二聚体(5mol％)。将混合物在通风烧瓶中加热至100℃，保持24-48小时。使反应冷却，用乙酸乙酯稀释，加入硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化。
通用程序B(HWE反应)：向醛(1当量)和甲基(或叔丁基)膦酸酯衍生物(1当量)于甲醇中的溶液中加入1,1,3,3-四甲基胍(3当量)。将溶液在室温下搅拌0.5-2小时。将混合物用二氯甲烷和约0.1M HCl稀释，并将水层用二氯甲烷萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化。
通用程序C(铃木偶合(Suzuki coupling))：向溴化物(1当量)溶液中加入硼酸酯(1.2-1.5当量)。在溶液用氮气净化的同时，加入[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(0.1当量)和1M碳酸铯水溶液(3当量)。将反应在60-85℃下搅拌2-18小时。将混合物用乙酸乙酯和水稀释，并将水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化。
通用程序D(脱除TFA保护基)：向腔肠素类似物于二氯甲烷(10mL)中的溶液中加入三氟乙酸(1mL)。将溶液在室温下搅拌2-6小时。将混合物用甲苯稀释，浓缩，悬浮于甲苯中，并且浓缩。重复此两次，得到粗产物。
通用程序E(CDI环化)：向羧酸酯(1当量)于二氯甲烷中的溶液中加入羰基二咪唑(2当量)。将混合物在室温下搅拌0.5-1小时。将混合物用二氯甲烷和约0.1M HCl稀释，并将水层用二氯甲烷萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，并且浓缩，得到粗产物。
通用程序F(还原)：将去氢-腔肠素(1当量)于二氯甲烷和甲醇(1:1)中的悬浮液用冰浴冷却。加入硼氢化钠(5当量)，并且将混合物搅拌0.5-2小时。将混合物用二氯甲烷和约0.1M HCl稀释，并将水层用二氯甲烷萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化。
通用程序G(HCl脱除保护基)：向腔肠素类似物于甲醇(10mL)中的溶液中加入HCl水溶液(6M，1mL)。将溶液在室温下搅拌2-6小时。将混合物用二氯甲烷和水稀释，并将水层用二氯甲烷萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化。
通用程序H(硝基还原)：向硝基腔肠素于乙醇中的溶液中加入催化剂钯/碳(10％)。将溶液用氮气净化。加入氢气(1atm)，且将悬浮液在室温下搅拌2-8小时。将溶液用氮气净化并经硅藻土过滤。收集滤液，加入硅藻土，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化。
每个单独步骤的最佳反应条件和反应时间可以取决于采用的具体反应物和所用反应物中存在的取代基变化。实施例章节中提供特定的程序。反应可以用常规的方式处理，例如通过从残余物消除溶剂并根据例如但不限于结晶、蒸馏、萃取、湿磨和色谱法的本领域中通常已知的方法进一步纯化。除非另外描述，起始物质和试剂可购得，或者可以通过本领域的技术人员使用化学文献中描述的方法从市售材料制备。起始物质如果无法购得，那么可以通过选自标准有机化学技术、与已知的在结构上类似的化合物的合成类似的技术或与以上描述的方案或合成实施例章节中描述的程序类似的技术制备。
常规实验，包括合成途径的反应条件、试剂和顺序的适当操纵、不能与反应条件相容的任何化学官能团的保护和在方法的反应顺序中的合适点处脱除保护基，都包括在本发明的范围中。关于使用此类合适保护基保护不同取代基和脱除保护基的合适保护基和方法是本领域的技术人员众所周知的；其实例可见于PGM Wuts和TW Greene,标题为ProtectiveGroups in Organic Synthesis的Greene的书(第4版),John Wiley&Sons,NY(2006)，其以引用的方式整体并入本文中。本发明化合物的合成可以通过与上文和特定实施例中描述的合成方案中所述的方法实现。
当需要所公开化合物的光学活性形式时，其可以通过使用光学活性的起始物质(例如通过合适反应步骤的不对称诱导来制备)进行本文所述的程序之一或通过使用标准程序(例如色谱分离、再结晶或酶法拆分)拆分化合物的立体异构体或中间体的混合物来获得。
类似地，当需要化合物的纯几何异构体时，其可以通过使用纯的几何异构体作为起始物质进行以上程序之一或通过使用例如色谱分离的标准程序拆分化合物的几何异构体或中间体的混合物来获得。
应了解，如所述的合成方案和特定实施例是例示性的并且不应被视为限制本发明的范围，因为本发明的范围在随附权利要求书中界定。合成方法和特定实施例的所有替代物、修改和等效物都包括在权利要求书的范围内。
3.使用方法和试剂盒
本公开的化合物可以用已经使用荧光素酶底物、例如腔肠素类似物的任何方式使用。举例来说，其可以用于生物发光方法中，所述生物发光方法采用腔肠素的类似物检测样品中的一种或多种分子，例如酶、酶促反应的辅因子、酶底物、酶抑制剂、酶活化剂或OH自由基，或一种或多种条件，例如氧化还原条件。样品可以包括动物(例如脊椎动物)、植物、真菌、生理体液(例如血液、血浆、尿、粘液分泌物)、细胞、细胞溶解产物、细胞上清液或细胞纯化部分(例如亚细胞部分)。可以检测或定量这类分子的存在、量、光谱分布、发射动力学或比活性。可以在包括多相溶液(例如乳液或悬浮液)的溶液中或在固体载体(例如颗粒、毛细管或测定容器)上检测或定量所述分子。
在某些实施方案中，式(I)或式(II)的化合物可以用于定量所关注分子。在一些实施方案中，腔肠素类似物(例如天然或已知的腔肠素或式(I)或式(II)的化合物)可以用作特定生化活性、例如细胞凋亡或药物代谢的探针。
在某些实施方案中，式(I)或式(II)的化合物可以与刺虾(Oplophorus)衍生的荧光素酶和/或刺虾-荧光素酶衍生的生物发光复合物的抑制剂一起使用。刺虾衍生的荧光素酶和/或刺虾-荧光素酶衍生的生物发光复合物的示例性抑制剂描述于例如国际专利公布No.WO2016/210294和WO2018/125992以及2018年6月1日提交的美国专利申请序列号62/679,205和2018年5月1日提交的美国专利申请序列号62/665,346中，均以引用的方式整体并入本文中。
在某些实施方案中，式(I)或式(II)的化合物可以用于检测活细胞、例如体内的发光。在一些实施方案中，荧光素酶可以在细胞中表达(表达成报告物或以其它方式)，并且用在培养物中将渗透细胞的腔肠素类似物(例如式(I)或式(II)的化合物)处理的细胞与荧光素酶反应，并产生发光。除渗透细胞外，在细胞活力方面，式(I)或式(II)的化合物展示与天然腔肠素相当的生物相容性。在一些实施方案中，可以合成含有已知增加天然腔肠素在培养基中的稳定性的化学修饰的式(I)或式(II)的化合物并用于更稳固的基于活细胞荧光素酶的报告物测定。在其它实施方案中，可以使用多种显微术和成像技术，例如体内成像来测定含有荧光素酶和式(I)或式(II)的化合物的样品(包括细胞、组织、动物等)。在其它实施方案中，可分泌的荧光素酶在细胞中表达成活细胞报告系统的一部分。
在某些实施方案中，本文公开的式(I)或式(II)的化合物可以提供为试剂盒的一部分。在一些实施方案中，试剂盒可以包括一种或多种荧光素酶(呈多肽、多核苷酸或两种形式)和式(I)或式(II)的腔肠素类似物，以及合适试剂和使使用者能够进行例如本文公开的测定的测定的说明书。试剂盒还可以包括一种或多种缓冲液，例如本文公开的缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括如上所述的刺虾衍生的荧光素酶和/或刺虾-荧光素酶衍生的生物发光复合物的抑制剂。
缓冲液包括柠檬酸或柠檬酸盐缓冲液、MES、1,4-哌嗪二乙烷磺酸或HEPES；无机磷酸盐，例如呈焦磷酸盐或磷酸钾形式；螯合剂，例如EDTA、CDTA或1,2-二氨基环己烷四乙酸；盐，例如氟化钠、硫酸镁；表面活性剂或洗涤剂，例如(例如非离子型壬基酚乙氧基化物)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)或/>(羟基聚乙氧基十二烷)；消泡剂，例如/>DF204(有机消泡剂)或/>DF(硅酮消泡剂)；蛋白质稳定剂，例如明胶、/>10％(明胶，A型)或白蛋白(例如BSA、HSA)或丙三醇；三磷酸腺苷(ATP)或一磷酸腺苷(AMP)。其它组分可以包括聚乙二醇、聚乙烯吡啶、冠醚或环糊精。
A体内成像
本公开的化合物可以用于活细胞成像，例如体内和离体生物发光成像。举例来说，本公开的化合物可以与利用腔肠素的荧光素酶一起用于使组织切片或活的动物中的细胞进行生物发光成像。体内生物发光成像是一种基于从细胞或组织检测发射的光的通用而灵敏的工具。生物发光已经用于以无创的方式追踪肿瘤细胞、细菌和病毒感染、基因表达和治疗反应。生物发光成像提供了对同一动物中的疾病过程的纵向监测，这是在疾病过程中的许多个时间点分析多个动物的理想替换方法。在一些实施方案中，本公开的化合物可在体内用于在多种动物模型中监测生物过程，例如细胞运动、肿瘤进展、基因表达和病毒感染。在一些实施方案中，本公开的化合物可以用于转基因动物、例如转基因小鼠中的成像。包括细胞或组织在内的转基因动物可以代表细胞功能和人类中疾病的模型。因此，这些动物可用于研究细胞功能和相关事件背后的机制，产生和测试产品(例如抗体、小分子等)以及治疗和诊断相关人类疾病，包括癌症和自身免疫疾患。在一些实施方案中，转基因动物还可以指示具体剂施用于人类的安全性。剂的作用可以通过向特定细胞或全身施用具体剂和本公开的化合物并进行生物发光成像来寻找特定作用而研究。基于动物和细胞的模型和本公开的化合物可以用于鉴定可能有效治疗疾病的药物、药品、疗法和介入。
在一些实施方案中，本公开的化合物可以用于使已经转化成表达融合蛋白、例如包含荧光素酶的融合蛋白的细胞或动物进行生物发光成像。在一些实施方案中，转基因动物或细胞可以表达包含荧光素酶的融合蛋白。在一些实施方案中，荧光素酶可以是利用腔肠素的荧光素酶，例如刺虾或刺虾衍生的荧光素酶；海肾荧光素酶；高斯荧光素酶(Gaussialuciferase)，例如高斯普林荧光素酶(Gaussia princeps luciferase)；长腹水蚤荧光素酶(Metridia luciferase)，例如细长长腹水蚤(Metridia longa)和太平洋长腹水蚤(Metridia pacifica)荧光素酶；弯喉海萤荧光素酶(Vargula luciferase)，例如希氏弯喉海萤(Vargula hilgendorfii)荧光素酶；剑乳点水蚤(Pleuromamma xiphias)荧光素酶；和其变体、重组体和突变体。在一些实施方案中，编码融合蛋白的多核苷酸序列可操作地连接于启动子。在一些实施方案中，启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子、可抑型启动子或可调控型启动子。在一些实施方案中，启动子还可以是组织特异性启动子。
在一些实施方案中，生物发光蛋白与所关注异源蛋白质、例如荧光蛋白的融合蛋白可以彼此直接通过肽键连接或可以被介入的氨基酸序列隔开。在一些实施方案中，融合多肽还可以含有对生物发光蛋白和所关注异源蛋白质、例如荧光蛋白来说是外源性的序列。举例来说，融合蛋白可以包括靶向或定位序列、标签序列、其它荧光蛋白或生物发光蛋白的序列或其它发色团。在一些实施方案中，靶向序列可以指导融合蛋白定位至特定组织、细胞类型(例如肌肉、心脏或神经细胞)、细胞区室(例如线粒体或其它细胞器、细胞核、细胞质或质膜)或蛋白质。此外，融合物可以含有来自多种荧光或生物发光蛋白或其变体和/或其它精选蛋白质的序列。在一些实施方案中，荧光素酶与蛋白质或荧光蛋白、例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或橙红色荧光蛋白融合。
在细胞内，例如在转基因动物的细胞中产生的生物发光能够通过本领域中众所周知的多种方式来成像或检测。举例来说，已经集中至转基因动物中的预定部位的融合蛋白和本公开的化合物可以通过许多方式来成像。本领域的技术人员可以合理估计实现定位的时间。此外，定位状态随时间而变，接着可以使从融合蛋白和本公开的化合物产生的生物发光成像。因为成像或测量来自受试者的光子发射可能持续长达数十分钟，所以可以在成像过程期间固定转基因动物。
可以使用肉眼或相机的任何种类(静止或录像)进行体内成像。生物发光的成像涉及例如光检测器的使用，所述光检测器能够检测极其低水平的光，典型地单个光子事件，并整合光子发射直至可以构建图像。这类灵敏光检测器的实例包括在相机检测事件之前加强单个光子事件的装置，和能够克服检测系统中固有的背景杂音来检测单个光子的相机(例如用液氮冷却)。所用的“光检测器装置”具有足够高的灵敏性而能够在合理量的时间内使来自哺乳动物内的微光成像，并使用来自这类装置的信号构建图像。
生物发光信号可以用高灵敏度的加强电荷耦合装置(CCD)相机来检测。在某些实施方案中，足够灵敏地检测生物发光信号并且具有足够宽的动态范围以同时检测荧光信号的加强CCD相机用于成像。合适的相机是本领域中已知的并且包括(但不限于)OlympusLV200生物发光成像系统、使用LivingImageTM软件(Caliper Life Sciences)控制的积分成像系统(IVISTM成像系统,Caliper Life Sciences)或定制的双光子荧光寿命成像显微镜(Yasuda Curr Opin Neurobiol.2006；16:551-561)。在一些实施方案中，相机安装在不透光的容器中，所述容器提供了麻醉、例如小鼠的动物用平台和内部的光照。
体内成像可以是已经描述的无创全动物成像(Contag,C.,美国专利No.5,650,135,1997年7月22日)，以引用的方式并入本文中；Contag,P.等人,Nature Medicine 4(2):245-247,1998；Contag,C.等人,OSA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy andDiagnostics 3:220-224,1996；Contag,C.H.,Photochemistry and Photobiology 66(4):523-531,1997；Contag,C.H.等人,Molecular Microbiology 18(4):593-603,1995)。检测从内脏发出的光的灵敏度取决于几个因素，包括荧光素酶表达的水平、体内标记细胞的深度(光子必须穿过组织的距离)和检测系统的灵敏度。
“光子放大装置”在光子撞击检测筛网前扩大光子。这类包括具有增强器、例如微通道增强器的CCD相机。微通道增强器典型地含有与相机的检测筛网垂直并且共同扩展的金属通道阵列。微通道阵列位于有待成像的样品、受试者或动物与相机之间。大部分进入阵列通道的光子都在离开前接触通道的侧面。施加在阵列两侧的电压使许多电子从每次光子碰撞释放。来自这类碰撞的电子以“猎枪”模式离开其来源通道，并用相机检测。
图象处理机处理由光检测器装置产生的信号，所述装置计数光子以构建可以显示在监测器上或打印在视频打印机上的图像。这类图像处理机典型地作为包括上述灵敏光子计数相机并因此从相同来源获得的系统的一部分出售。图像处理机通常连接至个人电脑，例如IBM兼容PC或苹果Macintosh(Apple Computer,Cupertino,Calif.)，其可以或可以不作为所购买的成像系统的一部分包括。一旦图像呈数字化文件形式，其可以被多种图像处理程序(例如“ADOBE PHOTOSHOP”,Adobe Systems,Adobe Systems,Mt.View,Calif.)操纵和打印。
应了解整个动物或受试者不一定需要在光检测装置的检测视场。举例来说，如果测量靶向受试者特定区域的融合蛋白，那么仅仅需要测量来自所述区域的光和足够的周围“深色”区带。
一旦产生光子发射图像，其典型地叠加在受试者的“正常”反射光图像上以提供所发射光子来源的参考框(即融合蛋白相对于受试者定位)。然后分析由光子发射图像叠加在反射光图像上所形成的“复合”图像以确定受试者中标靶的位置和/或量。
B.生物发光共振能量转移(BRET)
所公开化合物可用于检测配体-蛋白质和/或蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法中。在一些实施方案中，本公开的化合物可用于体内或体外生物发光共振能量转移(BRET)系统。关于BRET，从生物发光供体至荧光接受体的能量转移引起光线发射的光谱分布变化。这种能量转移能够实时监测体外或体内蛋白质-蛋白质或配体-蛋白质相互作用，例如搭配物的相互作用和解离作用。BRET系统、例如NanoBRETTM系统的实例描述于例如美国专利No.10,024,862、美国专利公布No.2014/0194307、美国专利No.10,067,149和美国专利公布No.2014/0194325中。
在一些实施方案中，BRET分析中所用的发光酶可以用于确定两个分子是否能够彼此结合或共同定位于细胞中。举例来说，发光酶可以用作生物发光供体分子，与所关注的分子或蛋白质组合建立第一融合蛋白。在一些实施方案中，发光酶可以与抗体、蛋白质、受体、药物、药物载体、肽、糖、脂肪酸、纳米粒子或其它生物分子缀合。在多个实施方案中，第一融合蛋白含有发光酶和所关注的蛋白质。在多个实施方案中，含有发光酶的第一融合蛋白可用于BRET分析中以在包括但不限于细胞溶解产物、完整细胞和活动物的系统中检测蛋白质/蛋白质相互作用。在一些实施方案中，BRET分析还可以包括如上所述的刺虾衍生的荧光素酶和/或刺虾-荧光素酶衍生的生物发光复合物的抑制剂。
在一些实施方案中，荧光接受体可以是荧光团，例如荧光蛋白、荧光分子、荧光标记或荧光示踪剂。在一些实施方案中，荧光示踪剂可以是连至荧光团的小分子。在一些实施方案中，荧光接受体可以是包括与抗体、蛋白质、受体、药物、药物载体、肽、糖、脂肪酸、纳米粒子或其它生物分子缀合的荧光接受体的第二融合蛋白。
在多个实施方案中，可以用作荧光接受体分子。在一些实施方案中，/>或可以与所关注的第二蛋白质或与发光酶融合。举例来说，发光酶可以与/>融合，在细胞或动物中表达，并用荧光/>配体、例如TMR配体标记。在另一个实例中，发光酶可以与荧光蛋白融合并在细胞或动物中表达。在一些实施方案中，BRET可以使用发光酶与包括但不限于GFP、RFP、橙红色荧光蛋白的荧光蛋白或包括荧光素、罗丹明绿(rhodamine green)、俄勒冈绿(Oregon green)或Alexa 488的荧光标记组合进行，仅举几个例子作为非限制性实例。
在一些实施方案中，所公开的化合物可用于标靶接合测定，例如NANOBRETTM标靶接合(TE)测定，以在完整细胞中实时测量化合物在精选标靶蛋白处的结合，例如药物:标靶相互作用。举例来说，NANOBRETTMTE测定可以包括四种组分：表达的细胞标靶蛋白，其与明亮荧光素酶融合；细胞可渗透的荧光示踪剂，其特异性地结合于标靶蛋白；所公开化合物中的一种或多种，其用作/>荧光素酶的底物；以及针对/>荧光素酶的细胞不能渗透的抑制剂。测定使用生物发光共振能量转移(BRET)，这是通过发光能量从/>荧光素酶转移至结合于标靶蛋白-/>融合物的荧光示踪剂实现的。所述能量转移使直接测量化合物结合亲和力以及化合物-标靶保留时间成为可能。
在一些实施方案中，施加至细胞的化合物可以特异性地接合胞内标靶蛋白质-融合物并引起BRET下降。在一些实施方案中，为了确保胞内标靶接合的准确评定，可以使用/>抑制剂减轻可能由处理期间受损的细胞产生的任何胞外信号，同时不会不利地影响在健康活细胞内表达的/>荧光素酶。
BRET系统还可以包含用于检测从生物发光融合蛋白发出的光的光检测器或成像装置，例如但不限于光学显微镜、数字显微镜、光度计、电荷耦合装置(CCD)图像传感器、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或数码相机。
C.制剂和施用
对于全动物研究，所公开的成像探针优选地被配制用于不经肠施用。不经肠制剂可以使用本领域中已知的技术制备成水性组合物。典型地，这类组合物制备成溶液或悬浮液；适于在加入复原培养基后制备溶液或悬浮液的固体形式；乳液，例如油包水(w/o)乳液、水包油(o/w)乳液和其微乳液、脂质体或乳脂体。
如本文所用，术语“不经肠”是指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注的施用模式。
载体可以是含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇)、油类、例如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等)和它们的组合的溶剂或分散介质。
呈游离酸或碱或其药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液和分散液可以在水或适合与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合的另一溶剂或分散剂中制备，所述赋形剂包括(但不限于)表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH值调节剂和它们的组合。
合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子型表面活性剂。合适的阴离子型表面活性剂包括(但不限于)含有羧酸盐、磺酸盐和硫酸盐离子的表面活性剂。阴离子型表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐的钠盐、钾盐、铵盐，例如十二烷基苯磺酸钠；磺基丁二酸二烷基钠，例如十二烷基苯磺酸钠；磺基丁二酸二烷基钠，例如双-(2-乙基亚硫酰基)磺基丁二酸钠；和烷基硫酸盐，例如十二烷基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括(但不限于)季铵化合物，例如氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂酰二甲苯甲基氯化铵、聚氧化乙烯和椰油胺。非离子型表面活性剂的实例包括单硬脂酸乙二醇酯、肉豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油基-4-油酸酯、脱水山梨糖醇酰化物、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧化乙烯单月桂酸酯、聚山梨酸酯、聚氧化乙烯辛基苯基醚、PEG-1000鲸蜡醚、聚氧化乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧化乙烯氢化油脂胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻酰两性基乙酸盐、月桂基甜菜碱和月桂基硫代甜菜碱。
制剂可以含有防腐剂以防微生物生长。合适的防腐剂包括(但不限于)对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。制剂还可以含有抗氧化剂以防活性剂降解。
制剂典型地在复原后缓冲至pH 3-8以供不经肠施用。合适的缓冲液包括(但不限于)磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。
水溶性聚合物常常用于供不经肠施用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。
无菌可注射溶液可以通过将需要量的活性化合物并入根据需要具有以上列举的赋形剂中的一种或多种的适当溶剂或分散介质中，接着过滤灭菌来制备。一般地，分散液通过将多种灭菌活性成分并入含有基础分散介质和来自以上列举的成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，这从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。粉末可以用使颗粒呈多孔性的方式制备，这可以增加颗粒的溶解。用于制造多孔颗粒的方法是本领域中众所周知的。
4.实施例
实施例1. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0372)
步骤1. 3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-胺(JRW-0218)
向3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-胺(300mg，1.14mmol)于二噁烷(5mL)中的溶液中加入(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)硼酸(430mg，1.70mmol)。在溶液用氮气净化的同时，加入[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(93mg，0.11mmol)和碳酸铯(3.4mL，1M，3.4mmol)。将反应在60℃下搅拌30分钟。将混合物用乙酸乙酯和水稀释，并将水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化，得到呈棕色固体状的粗产物(490mg)。ESI MS m/z 392[M+H]+。
步骤2. 2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(JRW-0226)
根据通用程序A，使3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-胺(450mg，1.15mmol)与2-重氮基-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(814mg，3.45mmol)反应，得到呈棕色固体状的所需产物(500mg，72％)。ESI MS m/z 600[M+H]+。
步骤3. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-0370)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(275mg，0.46mmol)与3-(甲氧基甲基)苯甲醛(75mg，0.50mmol)反应，得到呈紫黑色固体状的产物与脱甲硅烷基化产物(157mg)的混合物。ESI MS m/z 564,450[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0372)
根据通用程序F，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(155mg，0.27mmol)与硼氢化钠(52mg，1.37mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(81mg，52％)。ESI MS m/z 566[M+H]+。
实施例2. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0373)
根据通用程序D，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(70mg，0.12mmol)与TFA(1mL)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(23mg，42％)。ESI MS m/z 452[M+H]+。
实施例3. 2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0777)
步骤1. 2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-0775)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(72mg，0.12mmol)与苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-甲醛(20mg，0.13mmol)反应，得到呈黑红色固体状的产物与脱甲硅烷基化产物的混合物(20mg)。ESI MS m/z 564,450[M+H]+。
步骤2. 2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0776)
根据通用程序F，使2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基亚甲基)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(20mg，0.035mmol)与硼氢化钠(7mg，0.18mmol)反应，得到呈黄色玻璃状的粗产物。ESI MS m/z566[M+H]+。
步骤3. 2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0777)
根据通用程序D，使2-(苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基甲基)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.035mmol)与TFA(1mL)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(5mg，三步9％)。ESI MS m/z 452[M+H]+。
实施例4. 8-苯甲基-2-(4-氟苯甲基)-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0786)
步骤1. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(4-氟苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-0784)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(130mg，0.22mmol)与4-氟苯甲醛(32mg，0.26mmol)反应，得到呈黑红色固体状的产物与脱甲硅烷基化产物的混合物(110mg)。ESIMS m/z 538,424[M+H]+。
步骤2. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0785)
根据通用程序F，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(4-氟苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(110mg，0.20mmol)与硼氢化钠(39mg，1.0mmol)反应，得到呈橙色泡沫状的粗产物(98mg)。ESI MS m/z 540[M+H]+。
步骤3. 8-苯甲基-2-(4-氟苯甲基)-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-0786)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(98mg，0.18mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(50mg，三步54％)。ESI MS m/z 426[M+H]+。
实施例5. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1040)
步骤1. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(噻吩-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1038)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(110mg，0.18mmol)与噻吩-2-甲醛(25mg，0.22mmol)反应，得到呈黑红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 526[M+H]+。
步骤2. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1039)
根据通用程序F，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(噻吩-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.18mmol)与硼氢化钠(20mg，0.54mmol)反应，得到呈橙色泡沫状的所需产物(20mg，21％)。ESI MS m/z 528[M+H]+。
步骤3. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1040)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(20mg，0.038mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈黄色固体状的所需产物(9mg，60％)。ESI MS m/z 414[M+H]+。
实施例6. 2,8-二苯甲基-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1043)
步骤1. 8-苯甲基-2-苯亚甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1041)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(100mg，0.16mmol)与苯甲醛(21mg，0.20mmol)反应，得到呈红色固体状的产物与脱甲硅烷基化产物的混合物。ESI MS m/z520,406[M+H]+。
步骤2. 2,8-二苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1042)
根据通用程序F，使8-苯甲基-2-苯亚甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.16mmol)与硼氢化钠(31mg，0.83mmol)反应，得到呈橙色泡沫状的粗产物。ESI MS m/z 522[M+H]+。
步骤3. 2,8-二苯甲基-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1043)
根据通用程序G，使2,8-二苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(40mg，0.077mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙黄色固体状的所需产物(41mg，三步61％)。ESI MS m/z 408[M+H]+。
实施例7. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-(3-甲氧基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1047)
步骤1. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-甲氧基苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1045)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(125mg，0.21mmol)与3-甲氧基苯甲醛(34mg，0.25mmol)反应，得到呈红色固体状的产物与脱甲硅烷基化产物的混合物。ESI MSm/z 550,436[M+H]+。
步骤2. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-甲氧基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1046)
根据通用程序F，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-甲氧基苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.21mmol)与硼氢化钠(38mg，1.0mmol)反应，得到呈橙色泡沫状的粗产物。ESI MS m/z 552[M+H]+。
步骤3. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-(3-甲氧基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1047)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(3-甲氧基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.21mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(58mg，三步63％)。ESI MS m/z 438[M+H]+。
实施例8. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1052)
步骤1. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(4-甲氧基苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1049)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(100mg，0.16mmol)与4-甲氧基苯甲醛(27mg，0.20mmol)反应，得到呈红色固体状的产物与脱甲硅烷基化产物的混合物。ESI MSm/z 550,436[M+H]+。
步骤2. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(4-甲氧基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1051)
根据通用程序F，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(4-甲氧基苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.16mmol)与硼氢化钠(31mg，0.83mmol)反应，得到呈橙色固体状的粗产物。ESI MS m/z 552[M+H]+。
步骤3. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-(4-甲氧基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1052)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(4-甲氧基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.16mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(41mg，三步57％)。ESI MS m/z 438[M+H]+。
实施例9. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-((5-甲基呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1056)
步骤1. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-((5-甲基呋喃-2-基)亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1054)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸甲酯(100mg，0.16mmol)与5-甲基呋喃-2-甲醛(22mg，0.20mmol)反应，得到呈红色固体状的产物与脱甲硅烷基化产物的混合物。ESI MSm/z 524,410[M+H]+。
步骤2. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-((5-甲基呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1055)
根据通用程序F，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-((5-甲基呋喃-2-基)亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.16mmol)与硼氢化钠(31mg，0.83mmol)反应，得到呈黄色固体状的粗产物。ESI MS m/z 526[M+H]+。
步骤3. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-((5-甲基呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1056)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-((5-甲基呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.16mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(17mg，三步25％)。ESI MS m/z 412[M+H]+。
实施例10. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1180)
步骤1. 2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(JRW-1165)
根据通用程序A，使3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-胺(410mg，1.05mmol)与2-重氮基-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(582mg，2.1mmol)反应，得到呈棕色固体状的所需产物(580mg，86％)。ESI MS m/z 642[M+H]+。
步骤2. 2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1168)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(250mg，0.39mmol)与5-三氟甲基呋喃-2-甲醛(70mg，0.43mmol)反应，得到呈紫色泡沫状的所需产物(180mg，71％)。ESI MS m/z 652[M+H]+。
步骤3. 2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙酸叔丁酯(JRW-1170)
向2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(180mg，0.27mmol)于乙醇(25mL)中的溶液中加入威尔金森催化剂(Wilkinson′s catalyst)[氯化三(三苯基磷烷)铑(I)](25mg，0.027mmol)。将溶液放在钢制反应容器中并馈入80psi氢气。将反应在室温下搅拌48小时。然后混合物经硅藻土过滤，用乙醇洗涤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化，得到呈橙色油状的所需产物(123mg，68％)。ESI MS m/z 654[M+H]+。
步骤4. 2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙酸(JRW-1176)
根据通用程序D，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙酸叔丁酯(123mg，0.18mmol)与TFA(1mL)反应，得到呈橙色凝胶状的粗产物。ESI MS m/z 598[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1178)
根据通用程序E，使2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙酸(0.18mmol)与CDI(58mg，0.36mmol)反应，得到呈橙色泡沫状的所需产物(70mg，67％)。ESI MS m/z 579[M+H]+。
步骤6. 8-苯甲基-6-(3-羟基苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1180)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(70mg，0.12mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(46mg，82％)。ESI MS m/z 465[M+H]+。
实施例11. 2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-羟基苯基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1368)
步骤1. 5-溴-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-胺(JRW-1341)
在用氮气净化的同时向3,5-二溴吡嗪-2-胺(2.5g，9.9mmol)于DMF/THF(1:1，40mL)中的溶液中加入二氯化双(三苯基膦)钯(II)(346mg，0.49mmol)。加入(3-甲基苯甲基)氯化锌(II)(45mL，0.5M于THF中)并将反应加热至50℃，保持1小时。将混合物用乙酸乙酯和水稀释，并将水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化，得到呈黄色油状的所需产物(2.45g，89％)。ESI MS m/z 279[M+H]+。
步骤2. 2-((5-溴-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(JRW-1348)
根据通用程序A，使5-溴-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-胺(2.45g，8.8mmol)与2-重氮基-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(3.68g，13.2mmol)反应，得到呈橙色油状的所需产物(3.38g，72％)。ESI MS m/z 529[M+H]+。
步骤3. 2-((5-溴-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1349)
根据通用程序B，使2-((5-溴-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(3.38g，6.4mmol)与糠醛(737mg，7.7mmol)反应，得到呈橙色油状的所需产物(2.8g，93％)。ESI MS m/z 471[M+H]+。
步骤4. 2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1352)
向2-((5-溴-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(230mg，0.49mmol)于二噁烷(5mL)中的溶液中加入(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)硼酸(185mg，0.73mmol)。在溶液用氮气净化的同时，加入[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(39mg，0.049mmol)和碳酸铯(0.98mL，1M，0.98mmol)。将反应在60℃下搅拌18小时。将混合物用乙酸乙酯和水稀释，并将水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化，得到呈黄色油状的粗产物(241mg)。ESI MS m/z 598[M+H]+。
步骤5. 2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1358)
根据通用程序D，使2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(240mg，0.40mmol)与TFA(1mL)反应，得到呈橙棕色凝胶状的粗产物。ESI MS m/z 542[M+H]+。
步骤6. 6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1364)
根据通用程序E，使2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.40mmol)与CDI(130mg，0.80mmol)反应，得到呈黑红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 524[M+H]+。
步骤7. 6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1366)
根据通用程序F，使6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.40mmol)与硼氢化钠(45mg，1.2mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(160mg，两步75％)。ESI MS m/z 526[M+H]+。
步骤8. 2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-羟基苯基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1368)
根据通用程序G，使6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(160mg，0.30mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(83mg，66％)。ESI MS m/z 412[M+H]+。
实施例12. 6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1370)
步骤1. 2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1353)
向2-((5-溴-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(200mg，0.43mmol)于二噁烷(5mL)中的溶液中加入(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)硼酸(172mg，0.64mmol)。在溶液用氮气净化的同时，加入[1,1′-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(II)(34mg，0.043mmol)和碳酸铯(0.85mL，1M,0.85mmol)。将反应在60℃下搅拌18小时。将混合物用乙酸乙酯和水稀释，并将水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化，得到呈黄色泡沫状的粗产物(210mg，80％)。ESI MS m/z 616[M+H]+。
步骤2. 2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1359)
根据通用程序D，使2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(210mg，0.34mmol)与TFA(1mL)反应，得到呈棕色油状的粗产物。ESI MS m/z 560[M+H]+。
步骤3. 6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1367)
根据通用程序E，使2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.34mmol)与CDI(110mg，0.68mmol)反应，得到呈黑红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 542[M+H]+。
步骤4. 6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1369)
根据通用程序F，使6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.34mmol)与硼氢化钠(38mg，1.0mmol)反应，得到呈橙色固体状的粗产物。ESI MS m/z 544[M+H]+。
步骤5. 6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1370)
根据通用程序G，使6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)-8-(3-甲基苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.34mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(88mg，4步60％)。ESI MS m/z 430[M+H]+。
实施例13. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1404)
步骤1. 2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(JRW-1350)
根据通用程序A，使5-溴-3-(3-甲基苯甲基)吡嗪-2-胺(1.0g，3.8mmol)与2-重氮基-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(1.26g，4.5mmol)反应，得到呈棕色油状的所需产物(1.7g，87％)。ESI MS m/z 514[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1372)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(1.1g，3.3mmol)与糠醛(0.47g，5.0mmol)反应，得到呈橙色油状的所需产物(1.3g，74％)。ESI MS m/z 456[M+H]+。
步骤3.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1394)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)硼酸(0.18g，0.66mmol)反应，得到呈黄色泡沫状的所需产物(0.16g，59％)。ESI MS m/z 602[M+H]+。
步骤4.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1398)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.16g，0.26mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈棕色油状的粗产物。ESI MS m/z 546[M+H]+。
步骤5.(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1400)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.26mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.084g，0.52mmol)反应，得到呈红棕色固体状的粗产物。ESI MS m/z 528[M+H]+。
步骤6. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1402)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.26mmol)与硼氢化钠(0.049g，1.3mmol)反应，得到呈棕色泡沫状的粗产物。ESI MS m/z 530[M+H]+。
步骤7. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1404)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.26mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙棕色泡沫状的所需产物(0.071g，4步65％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.72(s,1H),7.47-7.38(m,3H),7.36-7.29(m,2H),7.29-7.22(m,1H),7.16-7.01(m,3H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.13(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.42(s,2H),4.22(s,2H)；ESI MS m/z 416[M+H]+。
实施例14. 8-苯甲基-6-(2-氟-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1405)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1395)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)硼酸(0.18g，0.66mmol)反应，得到呈黄色泡沫状的所需产物(0.18g，67％)。ESI MS m/z 602[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1399)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.18g，0.29mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈棕色油状的粗产物。ESI MS m/z 546[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1401)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.29mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.094g，0.58mmol)反应，得到呈紫黑色固体状的粗产物。ESI MS m/z 528[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1403)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.29mmol)与硼氢化钠(0.054g，1.4mmol)反应，得到呈橙棕色泡沫状的粗产物。ESI MS m/z 530[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(2-氟-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1405)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.29mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙棕色泡沫状的所需产物(0.083g，4步69％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.49-7.37(m,3H),7.37-7.21(m,3H),7.16-6.99(m,2H),6.94-6.85(m,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.19-6.06(m,1H),4.42(s,2H),4.21(s,2H)；ESI MS m/z 416[M+H]+。
实施例15. 6-(5-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1411)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(5-((叔丁氧羰基)氨基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1406)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.25g，0.55mmol)与(5-((叔丁氧羰基)氨基)-2-氟苯基)硼酸(0.21g，0.82mmol)反应，得到呈淡黄色泡沫状的所需产物(0.30g，94％)。ESI MS m/z 587[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((5-(5-氨基-2-氟苯基)-3-苯甲基吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1408)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(5-((叔丁氧羰基)氨基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.30g，0.51mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈黑绿色固体状的粗产物。ESI MS m/z 431[M+H]+。
步骤3.(Z)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1410)
根据通用程序E，使(Z)-2-((5-(5-氨基-2-氟苯基)-3-苯甲基吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.51mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.25g，1.5mmol)反应，得到呈黑红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 413[M+H]+。
步骤4. 6-(5-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1411)
根据通用程序F，使(Z)-6-(5-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.51mmol)与硼氢化钠(0.058g，1.5mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(0.006g，三步2％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.70(s,1H),7.47-7.36(m,3H),7.36-7.19(m,4H),7.07-6.87(m,2H),6.84-6.77(m,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.12(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.41(s,2H),4.21(s,2H)；ESI MS m/z 415[M+H]+。
实施例16. 8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1424)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1417)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.34g，0.74mmol)与(3-硝基苯基)硼酸(0.19g，1.1mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(0.37g，99％)。ESI MS m/z 499[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1421)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.26g，0.52mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈棕色固体状的粗产物。ESI MS m/z 443[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基亚甲基)-6-(3-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1423)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.52mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.17g，1.0mmol)反应，得到呈黑红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 425[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1424)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基亚甲基)-6-(3-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.52mmol)与硼氢化钠(0.098g，2.6mmol)反应，得到呈深橙色固体状的所需产物(0.13g，三步60％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.75(s,1H),8.35-8.12(m,3H),7.74(t,J＝8.0Hz,1H),7.49-7.38(m,3H),7.37-7.29(m,2H),7.29-7.20(m,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.12(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.49(s,2H),4.22(s,2H)；ESI MS m/z 427[M+H]+。
实施例17. 8-苯甲基-6-(3-氯-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1479)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1470)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)硼酸(0.25g，0.87mmol)反应，得到呈淡棕色泡沫状的所需产物(0.24g，88％)。ESI MS m/z 618[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1474)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.24g，0.39mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈棕色油状的粗产物。ESI MS m/z 562[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1476)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.39mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.13g，0.78mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 544[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1477)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.39mmol)与硼氢化钠(0.044g，1.2mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 546[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(3-氯-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1479)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-5-氯苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.39mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙色泡沫状的所需产物(0.12g，4步71％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.85(s,1H),7.47-7.36(m,3H),7.36-7.29(m,2H),7.29-7.17(m,2H),7.08(s,1H),6.90(t,J＝2.1Hz,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.12(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.44(s,2H),4.21(s,2H)；ESIMS m/z 432[M+H]+。
实施例18. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1482)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1469)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与(2-氟-3-硝基苯基)硼酸(0.12g，0.66mmol)反应，得到呈黄色固体状的所需产物(0.22g，97％)。ESI MS m/z 517[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1471)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.22g，0.42mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈橙色固体状的粗产物。ESI MS m/z 461[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1473)
根据通用程序E，使Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.43mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.14g，0.85mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 443[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1475)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.42mmol)与硼氢化钠(0.048g，1.3mmol)反应，得到所需产物(0.17g，三步90％)。ESI MS m/z 445[M+H]+。
步骤5. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1482)
根据通用程序H，使8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.17g，0.38mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈橙色固体状的所需产物(0.058g，37％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.67(s,1H),7.47-7.38(m,3H),7.37-7.29(m,2H),7.29-7.19(m,1H),7.07-6.99(m,1H),6.96(td,J＝8.2,1.8Hz,1H),6.83(s,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.13(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.41(s,2H),4.22(s,2H)；ESIMS m/z 415[M+H]+。
实施例19. 8-苯甲基-6-(4-氯-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1483)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1472)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)硼酸(0.25g，0.88mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(0.23g，84％)。ESI MS m/z 618[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1478)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.23g，0.37mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 562[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1480)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.37mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.12g，0.74mmol)反应，得到呈黑色固体状的粗产物。ESI MS m/z 544[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1481)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.37mmol)与硼氢化钠(0.070g，1.8mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 546[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(4-氯-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1483)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-4-氯苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.37mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈深橙色固体状的所需产物(0.11g，4步66％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.49-7.36(m,5H),7.36-7.21(m,4H),7.18(s,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.16-6.09(m,1H),4.44(s,2H),4.21(s,2H)；ESI MS m/z 432[M+H]+。
实施例20. 8-苯甲基-6-(2-氯-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1488)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1484)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与叔丁基(2-氯-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)二甲基硅烷(0.24g，0.66mmol)反应，得到呈黄色固体状的所需产物(0.19g，69％)。ESI MS m/z 618[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氯-3-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1485)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氯苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.18g，0.29mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 448[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(2-氯-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1487)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氯-3-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.29mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.094g，0.58mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 430[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(2-氯-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1488)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(2-氯-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.29mmol)与硼氢化钠(0.055g，1.4mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(0.076g，3步60％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.50(s,1H),7.45-7.38(m,3H),7.36-7.22(m,4H),7.09(dd,J＝8.3,1.5Hz,1H),7.03(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.14(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.39(s,2H),4.23(s,2H)；ESI MS m/z 432[M+H]+。
实施例21. 8-(4-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1498)
步骤1. 5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-胺(JRW-1407)
根据通用程序C，使5-溴吡嗪-2-胺(1.0g，5.7mmol)与(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)硼酸反应(1.7g，6.9mmol)，得到呈白色固体状的所需产物(1.56g，90％)。ESI MS m/z 302[M+H]+。
步骤2. 3-溴-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-胺(JRW-1409)
制备5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-胺(1.56g，5.2mmol)于DMF(20mL)中的溶液并用冰浴冷却，加入N-溴代丁二酸酰胺(1.0g，5.7mmol)，并将反应搅拌30分钟。将混合物用乙酸乙酯和水稀释，并将水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化，得到呈棕色固体状的所需产物(1.5g，76％)。ESI MS m/z 380[M+H]+。
步骤3. 5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(4-氟苯甲基)吡嗪-2-胺(JRW-1412)
根据通用程序C，使3-溴-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)吡嗪-2-胺(0.50g，1.3mmol)与2-(4-氟苯甲基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环(0.47g，2.0mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(0.28g，52％)。ESI MS m/z 410[M+H]+。
步骤4. 2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(4-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(JRW-1489)
根据通用程序A，使5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(4-氟苯甲基)吡嗪-2-胺(0.28g，0.68mmol)与2-重氮基-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(0.28g，1.0mmol)反应，得到呈棕色油状的所需产物(0.28g，62％)。ESI MS m/z 660[M+H]+。
步骤5.(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(4-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1490)
根据通用程序B，使2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(4-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(0.28g，0.42mmol)与糠醛(0.081g，0.84mmol)反应，得到所需产物(0.15g，59％)。ESI MS m/z 602[M+H]+。
步骤6.(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(4-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1493)
根据通用程序D，使(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(4-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.15g，0.25mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 546[M+H]+。
步骤7.(Z)-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-8-(4-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1495)
根据通用程序E，使(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-3-(4-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.25mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.081g，0.50mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 528[M+H]+。
步骤8. 6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-8-(4-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1497)
根据通用程序F，使(Z)-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-8-(4-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.25mmol)与硼氢化钠(0.047g，1.2mmol)反应，得到呈橙红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 530[M+H]+。
步骤9. 8-(4-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-羟基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1498)
根据通用程序G，使6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)-8-(4-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.25mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到呈橙棕色泡沫状的所需产物(0.083g，4步77％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.74(s,1H),7.50-7.37(m,3H),7.32(t,J＝7.9Hz,1H),7.20-7.00(m,4H),6.93-6.88(m,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.13(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.42(s,2H),4.21(s,2H)；ESI MS m/z 416[M+H]+。
实施例22. 8-苯甲基-6-(2-氯-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1525)
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步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氯-5-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1515)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与(2-氯-5-羟基苯基)硼酸(0.15g，0.088mmol)反应，得到呈黄色泡沫状的所需产物(0.22g，99％)。ESI MS m/z 504[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氯-5-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1519)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氯-5-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.22g，0.44mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到粗产物。ESIMS m/z 448[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(2-氯-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1523)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氯-5-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.44mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.14g，0.089mmol)反应，得到呈黑红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 430[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(2-氯-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1525)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(2-氯-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.44mmol)与硼氢化钠(0.051g，1.3mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(0.12g，三步64％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.84(s,1H),7.47-7.37(m,3H),7.36-7.29(m,2H),7.29-7.21(m,1H),7.03-6.88(m,2H),6.62(dt,J＝10.5,1.9Hz,1H),6.33(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.12(dd,J＝3.2,0.9Hz,1H),4.44(s,2H),4.21(s,2H)；ESI MS m/z 432[M+H]+。
实施例23. 8-苯甲基-6-(3-氟-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1526)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-氟-5-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1516)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与(3-氟-5-羟基苯基)硼酸(0.14g，0.088mmol)反应，得到呈黄色泡沫状的所需产物(0.20g，94％)。ESI MS m/z 488[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-氟-5-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1520)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-氟-5-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.41mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到粗产物。ESIMS m/z 432[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(3-氟-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1524)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-氟-5-羟基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.41mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.13g，0.082mmol)反应，得到呈紫黑色固体状的粗产物。ESI MS m/z 414[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(3-氟-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1526)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(3-氟-5-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.41mmol)与硼氢化钠(0.047g，1.2mmol)反应，得到呈橙棕色泡沫状的所需产物(0.13g，三步76％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.50(s,1H),7.45-7.37(m,3H),7.37-7.18(m,4H),6.97(d,J＝2.9Hz,1H),6.92(dd,J＝8.7,2.9Hz,1H),6.34(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.14(dt,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.39(s,2H),4.22(s,2H)；ESI MS m/z 416[M+H]+。
实施例24. 6-(3-氨基-5-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1535)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-氟-5-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1527)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与2-(3-氟-5-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环(0.23g，0.088mmol)反应，得到呈橙黄色泡沫状的所需产物(0.21g，92％)。ESI MS m/z517[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-氟-5-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1529)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-氟-5-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.21g，0.41mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到粗产物。ESIMS m/z 461[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(3-氟-5-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1531)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-氟-5-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.41mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.13g，0.081mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 443[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(3-氟-5-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1533)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(3-氟-5-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.41mmol)与硼氢化钠(0.076g，2.0mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 445[M+H]+。
步骤5. 6-(3-氨基-5-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1535)
根据通用程序H，使8-苯甲基-6-(3-氟-5-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.41mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈橙棕色泡沫状的所需产物(0.037g，4步22％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.74(s,1H),7.47-7.36(m,3H),7.36-7.28(m,2H),7.28-7.18(m,1H),6.85-6.70(m,1H),6.70-6.57(m,1H),6.48(dt,J＝11.0,2.2Hz,1H),6.33(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.12(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.43(s,2H),4.21(s,2H)；ESI MS m/z 415[M+H]+。
实施例25. 6-(3-氨基-4-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1536)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(4-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1528)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.44mmol)与(4-氟-3-硝基苯基)硼酸(0.16g，0.088mmol)反应，得到呈黄色泡沫状的所需产物(0.20g，88％)。ESI MS m/z 517[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(4-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1530)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(4-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.39mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到粗产物。ESIMS m/z 461[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(4-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1532)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(4-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.39mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.12g，0.077mmol)反应，得到呈黑红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 443[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(4-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1534)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(4-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.39mmol)与硼氢化钠(0.073g，1.9mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 445[M+H]+。
步骤5. 6-(3-氨基-4-氟苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1536)
根据通用程序H，使8-苯甲基-6-(4-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.41mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈橙棕色泡沫状的所需产物(0.028g，4步17％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.65(s,1H),7.47-7.38(m,3H),7.36-7.28(m,2H),7.28-7.20(m,1H),7.17-7.01(m,2H),6.95-6.82(m,1H),6.33(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.13(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.43(s,2H),4.21(s,2H)；ESI MS m/z 415[M+H]+。
实施例26. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(3-(甲氧基甲基)苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1609)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(3-(甲氧基甲基)苯基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1598)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(0.33g，0.64mmol)与3-(甲氧基甲基)苯甲醛(0.12g，0.77mmol)反应，得到所需产物(0.094g，28％)。ESI MS m/z 511[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(3-(甲氧基甲基)苯基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1600)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(3-(甲氧基甲基)苯基)丙烯酸叔丁酯(0.09g，0.18mmol)与2-(2-氟-3-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环(0.070g，0.26mmol)反应，得到呈黄色固体状的所需产物(0.077g，77％)。ESIMS m/z 571[M+H]+。
步骤3.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(3-(甲氧基甲基)苯基)丙烯酸(JRW-1601)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(3-(甲氧基甲基)苯基)丙烯酸叔丁酯(0.077g，0.13mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈淡红色油状的粗产物。ESI MS m/z 515[M+H]+。
步骤4.(Z)-8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1603)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(3-(甲氧基甲基)苯基)丙烯酸(0.14mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.044g，0.27mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 497[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1604)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.14mmol)与硼氢化钠(0.025g，0.67mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(0.040g，三步59％)。ESI MS m/z 499[M+H]+。
步骤6. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(3-(甲氧基甲基)苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1609)
根据通用程序H，使8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(3-(甲氧基甲基)苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.040g，0.080mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈橙色固体状的所需产物(0.018g，48％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.73-7.58(m,1H),7.45-7.38(m,2H),7.37-7.14(m,8H),7.06-6.99(m,1H),6.95(td,J＝8.2,1.8Hz,1H),6.88-6.76(m,1H),4.43(s,2H),4.40(s,2H),4.21(s,2H),3.36(s,3H)；ESI MS m/z 467[M+H]+。
实施例27. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1610)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1602)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(0.38g，0.74mmol)与5-(三氟甲基)呋喃-2-甲醛(0.15g，0.89mmol)反应，得到呈红色泡沫状的所需产物(0.21g，54％)。ESI MS m/z 525[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1605)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.080g，0.15mmol)与2-(2-氟-3-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环(0.061g，0.23mmol)反应，得到呈淡棕色固体状的所需产物(0.080g，89％)。ESI MS m/z 585[M+H]+。
步骤3.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1606)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.10g，0.17mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈紫色固体状的粗产物。ESI MS m/z 529[M+H]+。
步骤4.(Z)-8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1607)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸(0.17mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.055g，0.34mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 511[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1608)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.17mmol)与硼氢化钠(0.032g，0.85mmol)反应，得到呈橙色固体状的所需产物(0.071g，三步81％)。ESI MS m/z 513[M+H]+。
步骤6. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1610)
根据通用程序H，使8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.071g，0.14mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈橙棕色固体状的所需产物(0.012g，18％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.68(s,1H),7.49-7.37(m,2H),7.35-7.22(m,3H),7.08-7.00(m,1H),6.96(td,J＝8.2,1.8Hz,1H),6.93-6.77(m,2H),6.33(d,J＝3.4Hz,1H),4.42(s,2H),4.29(s,2H)；ESI MS m/z 483[M+H]+。
实施例28. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1619)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1611)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.130g，0.25mmol)与叔丁基(2-氟-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)二甲基硅烷(0.13g，0.37mmol)反应，得到呈淡棕色泡沫状的所需产物(0.12g，75％)。ESI MS m/z 700[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1612)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.12g，0.19mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈红色油状的粗产物。ESI MS m/z 614[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1615)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(5-(三氟甲基)呋喃-2-基)丙烯酸(0.19mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.060g，0.37mmol)反应，得到呈紫色固体状的粗产物。ESI MS m/z 596[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1618)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.19mmol)与硼氢化钠(0.035g，0.93mmol)反应，得到呈黄色固体状的粗产物。ESI MS m/z 598[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1619)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-((5-(三氟甲基)呋喃-2-基)甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.19mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到所需产物(0.059g，4步66％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.71(s,1H),7.48-7.39(m,2H),7.36-7.21(m,3H),7.16-6.98(m,3H),6.92-6.88(m,1H),6.38-6.28(m,1H),4.42(s,2H),4.29(s,2H)；ESI MS m/z 484[M+H]+。
实施例29. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1624)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(噻吩-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1595)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(0.32g，0.62mmol)与噻吩-2-甲醛(0.084g，0.75mmol)反应，得到呈粉色固体状的所需产物(0.24g，83％)。ESI MS m/z 473[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(噻吩-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1613)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(噻吩-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.10g，0.21mmol)与叔丁基(2-氟-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)二甲基硅烷(0.11g，0.32mmol)反应，得到呈黄色油状的所需产物(0.10g，77％)。ESI MS m/z 618[M+H]+。
步骤3.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(噻吩-2-基)丙烯酸(JRW-1616)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(噻吩-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.10g，0.16mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈橙色玻璃状的粗产物。ESI MS m/z 562[M+H]+。
步骤4.(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(噻吩-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1620)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(噻吩-2-基)丙烯酸(0.16mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.052g，0.32mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 544[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1622)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(噻吩-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.16mmol)与硼氢化钠(0.030g，0.80mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 546[M+H]+。
步骤6. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1624)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(噻吩-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.16mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到所需产物(0.042g，4步61％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.69(s,1H),7.48-7.39(m,2H),7.36-7.20(m,4H),7.15-7.00(m,3H),7.00-6.90(m,2H),4.41(s,2H),4.39(s,2H)；ESI MSm/z 432[M+H]+。
实施例30. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1634)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1596)
根据通用程序B，使2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(0.32g，0.62mmol)与4-氟苯甲醛(0.093g，0.75mmol)反应，得到呈淡红色固体状的所需产物(0.22g，73％)。ESI MS m/z 485[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1626)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸叔丁酯(0.10g，0.21mmol)与叔丁基(2-氟-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)二甲基硅烷(0.11g，0.31mmol)反应，得到呈白色泡沫状的所需产物(0.080g，61％)。ESI MS m/z 630[M+H]+。
步骤3.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸(JRW-1628)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸叔丁酯(0.080g，0.13mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈橙色凝胶状的粗产物。ESI MS m/z 574[M+H]+。
步骤4.(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(4-氟苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1630)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸(0.13mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.041g，0.25mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 556[M+H]+。
步骤5. 8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1632)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(4-氟苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.13mmol)与硼氢化钠(0.024g，0.63mmol)反应，得到呈橙色油状的粗产物。ESI MS m/z 558[M+H]+。
步骤6. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1634)
根据通用程序G，使8-苯甲基-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.13mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到所需产物(0.040g，4步71％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.68(s,1H),7.44-7.20(m,7H),7.16-6.95(m,5H),4.40(s,2H),4.18(s,2H)；ESI MS m/z 432[M+H]+。
实施例31. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1635)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1627)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸叔丁酯(0.11g，0.23mmol)与2-(2-氟-3-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环(0.091g，0.34mmol)反应，得到呈淡棕色固体状的所需产物(0.10g，81％)。ESI MS m/z 545[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸(JRW-1629)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸叔丁酯(0.10g，0.18mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈橙色油状的粗产物。ESI MS m/z 489[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(4-氟苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1631)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(4-氟苯基)丙烯酸(0.19mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.060g，0.37mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 471[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1633)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(4-氟苯亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.19mmol)与硼氢化钠(0.035g，0.93mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 473[M+H]+。
步骤5. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-苯甲基-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1635)
根据通用程序H，使8-苯甲基-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(4-氟苯甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.19mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈橙色固体状的所需产物(0.029g，4步35％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.64(s,1H),7.45-7.34(m,4H),7.34-7.20(m,3H),7.07-6.91(m,4H),6.88-6.77(m,1H),4.40(s,2H),4.18(s,2H)；ESI MS m/z 443[M+H]+。
实施例32. 6-(3-氨基-2-甲基苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1642)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-甲基-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1637)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.13g，0.28mmol)与4,4,5,5-四甲基-2-(2-甲基-3-硝基苯基)-1,3,2-二氧硼戊环(0.11g，0.42mmol)反应，得到呈淡橙色固体状的所需产物(0.14g，98％)。ESI MS m/z513[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-甲基-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1639)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-甲基-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.14g，0.27mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈橙色油状的粗产物。ESI MS m/z 457[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基亚甲基)-6-(2-甲基-3-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1640)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(2-甲基-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.27mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.087g，0.54mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 439[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2-甲基-3-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1641)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基亚甲基)-6-(2-甲基-3-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.27mmol)与硼氢化钠(0.051g，1.3mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 441[M+H]+。
步骤5. 6-(3-氨基-2-甲基苯基)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1642)
根据通用程序H，使8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(2-甲基-3-硝基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.27mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈棕橙色固体状的所需产物(0.061g，4步55％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.45-7.35(m,4H),7.35-7.20(m,3H),7.07(t,J＝7.8Hz,1H),6.87(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),6.74(dd,J＝7.4,1.3Hz,1H),6.35(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.15(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.37(s,2H),4.23(s,2H),1.97(s,3H)；ESIMS m/z 411[M+H]+。
实施例33. 8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-羟基-2-甲基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1645)
步骤1.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-羟基-2-甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1636)
根据通用程序C，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-溴吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.19g，0.42mmol)与2-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯酚(0.14g，0.62mmol)反应，得到呈淡红色泡沫状的所需产物(0.17g，84％)。ESI MS m/z484[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-羟基-2-甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1643)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-羟基-2-甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.35mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈棕橙色油状的粗产物。ESI MS m/z 428[M+H]+。
步骤3.(Z)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基亚甲基)-6-(3-羟基-2-甲基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1644)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-苯甲基-5-(3-羟基-2-甲基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.35mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.056g，0.35mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 410[M+H]+。
步骤4. 8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-(3-羟基-2-甲基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1645)
根据通用程序F，使(Z)-8-苯甲基-2-(呋喃-2-基亚甲基)-6-(3-羟基-2-甲基苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.35mmol)与硼氢化钠(0.066g，1.7mmol)反应，得到所需产物(0.10g，三步71％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.45-7.35(m,4H),7.35-7.20(m,3H),7.12(t,J＝7.8Hz,1H),6.94-6.83(m,2H),6.35(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.15(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.37(s,2H),4.23(s,2H),2.03(s,3H)；ESI MS m/z 412[M+H]+。
实施例34. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1667)
步骤1. 5-溴-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-胺(JRW-1648)
将锌粉(5.2g，79.4mmol)于HCl(20mL，1M)中的悬浮液搅拌10分钟。将固体过滤，用甲醇和THF洗涤，转移至烧瓶，且真空干燥18小时。将1-(溴甲基)-2-氟苯(5.0g，26.5mmol)于THF(50mL)中的溶液加入至锌粉中。将混合物加热至回流，保持2小时，接着冷却且使之静置。将上清液加入至3,5-二溴吡嗪-2-胺(3.0g，12.0mmol)和双(三苯基膦)二氯化钯(II)(0.42g，0.60mmol)于THF(50mL)中的溶液中。将悬浮液加热至50℃，保持18小时。将混合物用乙酸乙酯和水稀释，并将水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化，获得呈淡黄色固体状的所需产物(1.3g，38％)。ESI MS m/z283[M+H]+。
步骤2. 2-((5-溴-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(JRW-1652)
根据通用程序A，使5-溴-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-胺(1.3g，4.6mmol)与2-重氮基-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(1.9g，6.9mmol)反应，得到呈棕色固体状的所需产物(2.2g，87％)。ESI MS m/z 533[M+H]+。
步骤3.(Z)-2-((5-溴-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(TU-1301)
根据通用程序B，使2-((5-溴-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(1.1g，2.1mmol)与糠醛(0.25g，2.6mmol)反应，得到呈黄色油状的所需产物(0.61g，61％)。ESI MS m/z 475[M+H]+。
步骤4.(Z)-2-((5-(2-氟-3-硝基苯基)-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1657)
根据通用程序C，使(Z)-2-((5-溴-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.42mmol)与2-(2-氟-3-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环(0.17g，0.63mmol)反应，得到呈橙色泡沫状的所需产物(0.14g，62％)。ESI MS m/z 535[M+H]+。
步骤5.(Z)-2-((5-(2-氟-3-硝基苯基)-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1659)
根据通用程序D，使(Z)-2-((5-(2-氟-3-硝基苯基)-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.14g，0.26mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈棕色油状的粗产物。ESI MS m/z 479[M+H]+。
步骤6.(Z)-6-(2-氟-3-硝基苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1661)
根据通用程序E，使(Z)-2-((5-(2-氟-3-硝基苯基)-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.26mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.084g，0.52mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 461[M+H]+。
步骤7. 6-(2-氟-3-硝基苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1663)
根据通用程序F，使(Z)-6-(2-氟-3-硝基苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.26mmol)与硼氢化钠(0.049g，1.3mmol)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 463[M+H]+。
步骤8. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1667)
根据通用程序H，使6-(2-氟-3-硝基苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.26mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈橙棕色泡沫状的所需产物(0.023g，4步20％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.81(s,1H),7.39(d,J＝1.8Hz,1H),7.36-7.25(m,2H),7.19-7.08(m,2H),7.06-6.81(m,3H),6.33(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.11(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.49(s,2H),4.20(s,2H)；ESI MS m/z 433[M+H]+。
实施例35. 6-(2-氟-3-羟基苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1668)
步骤1.(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1658)
根据通用程序C，使(Z)-2-((5-溴-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.42mmol)与叔丁基(2-氟-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)二甲基硅烷(0.22g，0.63mmol)反应，得到呈橙色油状的所需产物(0.21g，80％)。ESI MS m/z 620[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1660)
根据通用程序D，使(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.21g，0.34mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈红色油状的粗产物。ESI MS m/z 564[M+H]+。
步骤3.(Z)-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1662)
根据通用程序E，使(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(2-氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.34mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.11g，0.67mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 546[M+H]+。
步骤4. 6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1664)
根据通用程序F，使(Z)-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.34mmol)与硼氢化钠(0.064g，1.7mmol)反应，得到呈橙色固体状的粗产物。ESI MS m/z 548[M+H]+。
步骤5. 6-(2-氟-3-羟基苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1668)
根据通用程序G，使6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-8-(2-氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.34mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到所需产物(0.050g，4步34％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.88(s,1H),7.40(d,J＝2.0Hz,1H),7.36-7.26(m,2H),7.19-6.97(m,5H),6.33(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.12(dd,J＝3.2,1.0Hz,1H),4.50(s,2H),4.20(s,2H)；ESI MS m/z 434[M+H]+。
实施例36. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-(2,6-二氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1747)
步骤1. 5-溴-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-胺(JRW-1727)
将锌粉(9.5g，145mmol)于HCl(20mL，1M)中的悬浮液搅拌10分钟。将固体过滤，用甲醇和THF洗涤，转移至烧瓶，且真空干燥18小时。将2-(溴甲基)-1,3-二氟苯(10.0g，48.3mmol)于THF(50mL)中的溶液加入至锌粉中。将混合物加热至回流，保持2小时，接着冷却且使之静置。将上清液加入至3,5-二溴吡嗪-2-胺(5.6g，22.0mmol)和双(三苯基膦)钯(II)二氯化(0.77g，1.1mmol)于THF(50mL)中的溶液中。将悬浮液加热至50℃，保持18小时。将混合物用乙酸乙酯和水稀释，并将水层用乙酸乙酯萃取。将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤，浓缩，并用硅胶色谱法来纯化，获得呈淡黄色固体状的所需产物(4.2g，63％)。ESI MSm/z 301[M+H]+。
步骤2. 2-((5-溴-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(JRW-1730)
根据通用程序A，使5-溴-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-胺(1.0g，3.3mmol)与2-重氮基-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(1.4g，5.0mmol)反应，得到呈棕色固体状的所需产物。ESI MS m/z 551[M+H]+。
步骤3.(Z)-2-((5-溴-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1733)
根据通用程序B，使2-((5-溴-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-2-(二乙氧基磷酰基)乙酸叔丁酯(3.3mmol)与糠醛(0.38g，4.0mmol)反应，得到呈红色泡沫状的所需产物(1.0g，两步65％)。ESI MS m/z 493[M+H]+。
步骤4.(Z)-2-((3-(2,6-二氟苯甲基)-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1740)
根据通用程序C，使(Z)-2-((5-溴-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.21g，0.42mmol)与2-(2-氟-3-硝基苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环(0.17g，0.64mmol)反应，得到呈橙色油状的所需产物(0.087g，37％)。ESI MSm/z 553[M+H]+。
步骤5.(Z)-2-((3-(2,6-二氟苯甲基)-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1742)
根据通用程序D，使(Z)-2-((3-(2,6-二氟苯甲基)-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.087g，0.16mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到粗产物。ESI MS m/z 497[M+H]+。
步骤6.(Z)-8-(2,6-二氟苯甲基)-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1745)
根据通用程序E，使(Z)-2-((3-(2,6-二氟苯甲基)-5-(2-氟-3-硝基苯基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.16mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.051g，0.31mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 479[M+H]+。
步骤7. 8-(2,6-二氟苯甲基)-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1746)
根据通用程序F，使(Z)-8-(2,6-二氟苯甲基)-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.16mmol)与硼氢化钠(0.018g，0.47mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 481[M+H]+。
步骤8. 6-(3-氨基-2-氟苯基)-8-(2,6-二氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1747)
根据通用程序H，使8-(2,6-二氟苯甲基)-6-(2-氟-3-硝基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.16mmol)与氢气(1atm)反应，获得呈橙色固体状的所需产物(0.014g，4步20％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.45-7.78(m,1H),7.45-7.30(m,2H),7.07-6.84(m,5H),6.34(t,J＝2.6Hz,1H),6.11(d,J＝3.2Hz,1H),4.53(s,2H),4.19(s,2H)；ESI MS m/z 451[M+H]+。
实施例37. 8-(2,6-二氟苯甲基)-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1759)
步骤1.(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(JRW-1752)
根据通用程序C，使(Z)-2-((5-溴-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.20g，0.41mmol)与叔丁基(2-氟-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯氧基)二甲基硅烷(0.21g，0.61mmol)反应，得到呈泡沫状的所需产物(0.095g，36％)。ESI MS m/z 638[M+H]+。
步骤2.(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(JRW-1754)
根据通用程序D，使(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸叔丁酯(0.095g，0.15mmol)与三氟乙酸(1mL)反应，得到呈红色泡沫状的粗产物。ESI MS m/z 582[M+H]+。
步骤3.(Z)-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-8-(2,6-二氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(JRW-1757)
根据通用程序E，使(Z)-2-((5-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-3-(2,6-二氟苯甲基)吡嗪-2-基)氨基)-3-(呋喃-2-基)丙烯酸(0.15mmol)与二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.048g，0.30mmol)反应，得到呈红色固体状的粗产物。ESI MS m/z 564[M+H]+。
步骤4. 6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-8-(2,6-二氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1758)
根据通用程序F，使(Z)-6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-8-(2,6-二氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(2H)-酮(0.15mmol)与硼氢化钠(0.017g，0.44mmol)反应，得到呈橙色固体状的粗产物。ESI MS m/z 566[M+H]+。
步骤5. 8-(2,6-二氟苯甲基)-6-(2-氟-3-羟基苯基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(JRW-1759)
根据通用程序G，使6-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-2-氟苯基)-8-(2,6-二氟苯甲基)-2-(呋喃-2-基甲基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(0.15mmol)与HCl(1mL，6M)反应，得到所需产物(0.030g，4步45％)。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ8.21(s,1H),7.44-7.31(m,2H),7.23-7.11(m,1H),7.07-6.93(m,4H),6.34(t,J＝2.5Hz,1H),6.11(d,J＝3.2Hz,1H),4.54(s,2H),4.20(s,2H)；ESI MS m/z 434[M+H]+。
实施例38.发光特性
发光分析程序：使有待筛查的每种化合物溶于DMSO(5mM)中，然后在荧光素酶测定缓冲液中进一步稀释至100μM。针对每种底物，通过用500μl荧光素酶测定缓冲液连续稀释500μl底物溶液来制备两倍稀释系列。然后将每个稀释的底物滴定液等体积地与在非CO2依赖性培养基+10％FBS中稀释的纯化的荧光素酶组合。每种底物的初始光输出是在/>+光度计中在底物加入之后三分钟测量，然后以五分钟时间间隔测量，作为确定信号半衰期的方式。信号半衰期是使用GraphPad Prism单相衰变回归计算，并且Km和Vmax是使用GraphPadPrism使用米凯利斯-麦特回归(Michaelis-Menten regression)计算。
评估合成的腔肠素类似物(式(I)和(II)的化合物)作为荧光素酶底物的适合性。荧光素酶用于筛查，因为它是一种小型(19kDa)、稳定并且尤其明亮的酶。表1证明合成的化合物具有比得上已知的腔肠素类似物8-苯甲基-2-(呋喃-2-基甲基)-6-苯基咪唑并[1,2-a]吡嗪-3(7H)-酮(呋喃马嗪)的相对光单位(RLU)和半衰期数据，已知作为荧光素酶底物，呋喃马嗪优于腔肠素。呋喃马嗪的RLU、半衰期和Km值被设定为1.0。
表1.腔肠素类似物的RLU、半衰期和动力学数据的概述
/>
实施例39.半衰期改良
比较在腔肠素核心的6-位苯基的对位或间位具有羟基的化合物的信号衰变。羟基(或氨基等)从对位移至间位引起信号动力学增加超过10倍，由此使得这些底物能够更广泛地使用。以下比较代表性实施例相对于设定为1的呋喃马嗪的结构和半衰期值。
实施例40.溶解性测试
为了评定溶解性，使测试化合物溶于乙醇/丙二醇(1:1)的混合物中，达43mM。然后将这个5X储备溶液加入羟丙基-β-环糊精/水/PEG400溶液中，得到8.7mM于乙醇/丙二醇/羟丙基-β-环糊精/PEG400/水(10:10:10:35:35)中的制剂混合物。将混合物旋转并离心。对上清液取样并在UV-Vis分光光度计中测量。混合物经0.2微米针式过滤器过滤并且对滤液进行测量并与上清液相比。
图1中示出了制剂中JRW-1040的UV光谱，比较上清液和滤液。将两个UV光谱叠加，显示JRW-1040完全可溶于制剂中。图2中示出用呋喃马嗪进行的相同实验。光谱的差异表明呋喃马嗪不完全溶于制剂中。这是展示与呋喃马嗪相比溶解性得到改良的实施例。
应了解上述详细描述和伴随的实施例仅仅是例示性的，并且不应视为限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由随附权利要求书和其等效物界定。
对本领域的技术人员来说，所公开实施方案的多种变化和修改将是显而易见的。在不脱离本发明的精神和范围下，可以进行这类变化和修改，包括不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法有关变化和修改。

Claims (22)

1.一种式(II)化合物，
或其互变异构体或盐，其中：
Y为硝基或-NRy1Ry2；
p为0、1、2、3或4；
q为0、1、2、3、4或5；
p+q为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
R3在每次出现时独立地为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA3或-NRB3RC3；
R4在每次出现时独立地为卤素、CN、硝基、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、-ORA4或-NRB4RC4；
RA3和RA4在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)C3-12环烷基或-C(O)C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；
RB3、RB4、RC3和RC4在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)C3-12环烷基、-C(O)C1-3亚烷基-C3-12环烷基、-SO2C1-10烷基、-SO2C3-12环烷基或-SO2C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；
可替代地，RB3和RC3和/或RB4和RC4连同其附连的氮原子一起形成4至8元饱和或部分不饱和杂环，任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、氧代基、-OH和-OC1-4烷基；
Ry1和Ry2在每次出现时独立地为H、C1-10烷基、C1-10卤代烷基、C3-12环烷基或-C1-3亚烷基-C3-12环烷基，其中每个环烷基任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、C1-4烷基和C1-4卤代烷基；并且
可替代地，Ry1和Ry2连同各自附连的氮原子一起形成4至8元饱和或部分不饱和杂环，任选地经1-4个独立地选自由以下组成的组的取代基取代：C1-4烷基、C1-4卤代烷基、氧代基、-OH和-OC1-4烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中p为1、2、3或4。
3.如权利要求1所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中q为1、2、3、4或5。
4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中q为0。
5.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中Y为NRy1Ry2。
6.如权利要求5所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中Ry1和Ry2为H。
7.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中p+q为1或2。
8.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中p为1并且R3为卤素。
9.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中R3为氟。
10.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中R4在每次出现时为卤素。
11.如权利要求10所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中所述卤素为氟。
12.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中q为1或2并且R4为氟。
13.如权利要求1-3中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐，其中q为1并且R4为C1-10烷基。
14.如权利要求1所述的化合物，或其互变异构体或盐，所述化合物选自由以下组成的组：
15.如权利要求1所述的化合物，或其互变异构体或盐，其具有下式：
16.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-15中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐。
17.如权利要求16所述的试剂盒，所述试剂盒还包含荧光素酶。
18.如权利要求16或17所述的试剂盒，所述试剂盒还包含缓冲试剂。
19.一种用于检测样品中的发光的方法，所述方法包括：
使样品与如权利要求1-15中任一项所述的化合物或其互变异构体或盐接触；
如果利用腔肠素的荧光素酶不存在于所述样品中，则使所述样品与所述利用腔肠素的荧光素酶接触；以及
检测发光。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述样品含有活细胞。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述样品含有利用腔肠素的荧光素酶。
22.一种用于检测转基因动物中的发光的方法，所述方法包括：
向转基因动物施用如权利要求1-15中任一项所述的化合物，或其互变异构体或盐；以及
检测发光；
其中所述转基因动物表达利用腔肠素的荧光素酶。
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