CN111675724B - 一种萤光素酶底物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种萤光素酶底物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种萤光素酶底物及其制备方法和应用，属于萤光素酶底物制备技术领域。所述萤光素酶底物结构式为：
Figure DDA0002594694120000011
其中，R取氢或氘。本发明提供的萤光素酶底物具有选择性好、灵敏性高、检测线低及良好生物相容性等优点；进一步研究证明，在体外、细胞、体内环境中，d2‑cycluc比cycluc的生物发光强度强，生物发光时间长，且两种萤光素酶底物都具有良好的浓度依赖性，同时本发明提供的萤光素酶底物的制备方法简单，可操作性强，成本较低，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种萤光素酶底物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于萤光素酶底物制备技术领域，具体涉及一种萤光素酶底物及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
许多药物都是基于碳的，碳氢键与理解药物分子的重要特性特别相关。氘化是指选择性取代氕氢同位素在小分子药物中的位置，从而实现氘氢同位素药物的过程。一方面，药物的氘化最有可能影响药代动力学特性，例如代谢，而不是药效学作用。因此，氘代时某些药物的代谢可能受到有利影响。可以从氘化作为改变药物药代动力学的策略中获益，在一系列微生物学和生化分析中，氘化似乎并未损害药物的疗效。另一方面，使用氘化时，放置不当会导致明显的主要同位素效应。当与重同位素的键是反应(或代谢转化)中的限速步骤时，就会发生主要的同位素效应，分子与重同位素的反应将进行得更慢，由于轻和重同位素之间的质量差异而产生了标记。
氘表现出独特的理化性质，并且在所有其他元素中具有最强的动力学同位素效应。此外，在经氘处理过的细胞和生物体中已观察到各种各样的形态和生理变化，包括诸如细胞分裂或能量代谢等基本过程的变化。氘化作用改善了代谢谱，同时不影响药物的药理作用，并且降低了药物之间的相互作用，它们在体外显示出明显增强的稳定性。通常，氘最常用于增加药物的稳定性，从而增加其半衰期，并降低其形成反应性代谢产物的倾向，同时增加其安全性或改善药物的分布方式。氘化药物项目的巨大优势是可获得来自其非氘化变体的人类临床试验数据，这使得该过程的财务需求降低了。尽管我们仍未完全了解氘的所有后果，但很显然，在科学应用、生物技术、药理学等领域具有利用这些效应的巨大潜力。此外，动力学同位素效应的表现是其他元素中无与伦比的，此类应用的首选同位素。
生物发光现象是自然界广泛存在的一种发光现象，一些生物可以通过一系列氧化反应将化学能转化为光能。在该过程中，可以在没有外部光激发的情况下有效地产生发光信号。在过去的十年中，生物发光方法作为荧光的替代方法得到了广泛应用，大大推动了生物学相关研究。目前生物发光成像技术已得到广泛的应用，主要应用于食品，肿瘤，重金属，各种离子，酶和有害气体检测等多个领域，然而，发明人发现，基于生物发光现象对动力学同位素效应的研究仍然较少。
发明内容
针对目前现有技术的不足，本发明提供一种合成的环状烷基氨基萤光素，其允许使用修饰的萤光素酶Ultra-Glo发出稳定的红移光，并且发光强度很强，因此它是一种非常有应用价值的生物发光探针。本发明根据环状烷基氨基萤光素发光的优越性，对其进行氘代修饰，将环状烷基氨基萤光素中的部分碳氢键替换为碳氘键，经试验证明其具有更强的生物发光强度和更长的生物发光时间，从而展现出更加良好的生物发光优势，因此具有良好的实际应用之价值。
为了实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种萤光素酶底物，所述萤光素酶底物结构式为：
Figure BDA0002594694100000021
其中，R取氢或氘，优选为氘；
当R取自氢时，所述萤光素酶底物为cycluc，其结构式为：
Figure BDA0002594694100000022
当R取自氘时，所述萤光素酶底物为d2-cycluc，其结构式为：
Figure BDA0002594694100000023
本发明的第二个方面，提供上述萤光素酶底物的制备方法，所述制备方法包括：
Figure BDA0002594694100000031
具体的，所述cycluc的合成步骤为：
(1)以5-硝基吲哚啉为原料和三乙胺反应，同时滴加三氟乙酸酐，将该混合物搅拌反应得到中间体1；
(2)中间体1和SnCl2·2H2O进行反应，得到中间体2；
(3)中间体2、硫氰酸钾的冰醋酸溶液和液溴进行反应，得到中间体3；
(4)中间体3、亚硝酸叔丁酯和氯化亚铜进行反应，得到中间体4；
(5)中间体4和NaBH4进行反应，得到中间体5；
(6)中间体5、氰基三甲基硅烷和四丁基氟化铵进行反应，得到中间体6；
(7)中间体6、无机碱和D-半胱氨酸盐酸盐进行反应，得到cycluc；
所述d2-cycluc的具体合成步骤为：
(8)1H-吲哚和钯碳在氘气条件下进行反应，得到中间体8；
(9)中间体8和乙酰氯进行反应，得到中间体9；
(10)中间体9和Fe(NO3)3·9H2O进行反应，得到中间体10；
(11)中间体10和氯化铵、锌粉进行反应，得到中间体11；
(12)中间体11和硫氰酸钾进行反应，得到中间体12；
(13)中间体12、亚硝基叔丁酯和氯化亚铜进行反应，得到中间体13；
(14)中间体13和LiAlH4进行反应，得到中间体14；
(15)中间体14、氰基三甲基硅烷和四丁基氟化铵进行反应，得到中间体15；
(16)中间体15、碳酸钾和D-半胱氨酸盐酸盐进行反应，得到中间体15；
优选的，上述各反应步骤均在溶剂条件下进行。
优选的，所述步骤(1)中，
所述溶剂可以为二氯甲烷、乙腈、甲醇或乙醇；进一步优选为二氯甲烷；
反应温度为10～30℃，反应时间为1～3h；
所述5-硝基吲哚啉、三乙胺、三氟乙酸酐的摩尔比为1：(1-1.5)：(1-1.5)。
优选的，所述步骤(2)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲醇或乙醇，进一步优选为乙醇；
反应温度为50～70℃，反应时间为3～5h；
所述中间体1、SnCl2·2H2O的摩尔比为1：(1-1.5)。
优选的，所述步骤(3)中，
所述溶剂为冰醋酸或盐酸，进一步优选为冰醋酸；
反应温度为10～30℃，反应时间为15～25h；
所述中间体2、液溴和硫氰酸钾的摩尔比为1：1:(2-3)。
优选的，所述步骤(4)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲醇或乙醇；进一步优选为乙腈；
反应温度为40～70℃，反应时间为1～3h；
所述中间体3、亚硝酸叔丁酯和氯化亚铜的摩尔比为1：2:(1-3)。
优选的，所述步骤(5)中，
所述溶剂为甲醇、二氯甲烷或乙腈；进一步优选为甲醇；
反应温度为10～30℃，反应时间为5～30min；
所述化合物4、NaBH4的摩尔比为1：(3-5)。
优选的，所述步骤(6)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲醇或乙醇；进一步优选为乙腈；
反应温度为50～100℃，反应时间为1～3h；
所述化合物5、氰基三甲基硅烷、四丁基氟化铵的摩尔比为1：(3-5)：(3-5)。
优选的，所述步骤(7)中，
所述溶剂为甲醇、二氯甲烷与水以任意比例互溶的有机溶剂；
所述无机碱为碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠、碳酸氢钠；进一步优选碳酸钾；
反应温度为20～50℃，反应时间为1～5h；
所述中间体6、碳酸钾、D-半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1：(1-3)：(1-3)。
优选的，所述步骤(8)中，
所述溶剂为氘代甲醇、氘代乙腈；进一步优选为氘代甲醇；
反应温度为30～70℃，反应时间为50～80h；
所述1H-吲哚、钯碳的摩尔比为10：1。
优选的，所述步骤(9)中，
所述溶剂为冰醋酸或盐酸；进一步优选为冰醋酸；
反应温度为50～100℃，反应时间为1～3h；
所述中间体8、乙酰氯的摩尔比为1：(4-6)。
优选的，所述步骤(10)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲醇或乙醇；进一步优选为乙腈；
反应温度为40～70℃，反应时间为1～3h；
所述中间体9、Fe(NO3)3·9H2O的摩尔比为2：1。
优选的，所述步骤(11)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈或乙醇；进一步优选为乙醇；
反应温度为10～30℃，反应时间为1～3h；
所述中间体10、氯化铵、锌粉的摩尔比为1：10：20。
优选的，所述步骤(12)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲醇或乙醇；进一步优选为乙腈；
反应温度为10～30℃，反应时间为10～30h；
所述中间体11、硫氰酸钾、液溴的摩尔比为1：3～4：1。
优选的，所述步骤(13)中，
所述溶剂为二氯甲烷、无水乙腈、甲醇或乙醇；进一步优选为无水乙腈；
反应温度为40～70℃，反应时间为1～3h；
所述中间体12、亚硝基叔丁酯、氯化亚铜的摩尔比为1：1～2：1.5。
优选的，所述步骤(14)中，
所述溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、DMF、甲醇或乙醇；进一步优选为四氢呋喃；
反应温度为-40～-100℃，反应时间为1～2h；
所述中间体13、LiAlH4的摩尔比为1～2：1。
优选的，所述步骤(15)中，
所述溶剂为无水乙腈、二氯甲烷、DMF、甲醇或乙醇；进一步优选为无水乙腈；
反应温度为40～100℃，反应时间为1～2h；
所述中间体14、氰基三甲基硅烷、四丁基氟化铵的摩尔比为1～2：1：2.5。
优选的，步骤(16)中，
所述溶剂优选为甲醇、二氯甲烷与水以任意比例互溶的有机溶剂，
所述无机碱为碳酸钾、碳酸铯、碳酸钠或碳酸氢钠；进一步优选为碳酸钾；
反应温度为20～50℃，反应时间为1～5h；
所述中间体15、碳酸钾、D-半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1：1～2：2.5。
本发明的第三个方面，提供上述萤光素酶底物在荧光产品和/或制备荧光产品中的应用。
所述荧光产品包括但不限于荧光探针和荧光检测试剂盒。
本发明的第四个方面，提供一种荧光探针，所述荧光探针包含上述萤光素酶底物。
本发明的第五个方面，提供一种荧光检测试剂盒，所述荧光检测试剂盒包括上述萤光素酶底物或荧光探针。
本发明的第六个方面，提供上述萤光素酶底物、荧光探针和/或荧光检测试剂盒在如下中的应用：
1)环境检测；
2)分析化学；
3)生物分析和检测。
其中，所述生物分析和检测包括但不限于对生物个体水平、器官水平、组织水平和细胞水平的分析与检测；优选为细胞水平。
所述生物包括但不限于鱼、小鼠、大鼠、豚鼠、鸡、兔、狗、猫、猴、猩猩和人等。
进一步的，所述生物分析和检测包括利用上述萤光素酶底物、荧光探针和/或荧光检测试剂盒对细胞进行荧光标记、利用流式细胞仪或荧光显微镜对荧光标记细胞进行分选和利用体内荧光成像装置观察生物体内的荧光标记的细胞。
经试验证明，本申请中萤光素酶底物细胞毒性较低，具有良好的生物相容性，且在细胞水平上都呈现出浓度依赖性，同时d2-cycluc相较于cycluc在低浓度时对萤光素酶有着较高的灵敏度，同时在细胞中有更强的生物发光强度；因此两者均可用于活体成像，并且由于d2-cycluc具有更强的生物发光强度和更长的生物发光时间，在活体成像时会有更佳的成像效果。
上述技术方案的有益技术效果：
上述技术方案提供的萤光素酶底物具有选择性好、灵敏性高、检测线低及良好生物相容性等优点；进一步研究证明，在体外、细胞、体内环境中，d2-cycluc比cycluc的生物发光强度强，生物发光时间长，且两种萤光素酶底物都具有良好的浓度依赖性，同时上述技术方案提供的制备方法简单，可操作性强，成本较低，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1所制备的萤光素酶底物cycluc的核磁共振氢谱；
图2为实施例1所制备的萤光素酶底物cycluc的核磁共振碳谱；
图3为实施例1所制备的萤光素酶底物cycluc的高分辨质谱；
图4为实施例1所制备的萤光素酶底物cycluc的HPLC；
图5为实施例2所制备的萤光素酶底物d2-cycluc的核磁共振氢谱；
图6为实施例2所制备的萤光素酶底物d2-cycluc的核磁共振碳谱；
图7为实施例2所制备的萤光素酶底物d2-cycluc的高分辨质谱；
图8为实施例2所制备的萤光素酶底物d2-cycluc的HPLC；
图9为实施例3萤光素酶底物d2-cycluc、cycluc的体外代谢研究；其中，A为0～120min 内萤光素酶底物d2-cycluc、cycluc在体外的生物发光强度变化图，B为0～30min内萤光素酶底物d2-cycluc、cycluc在体外的生物发光强度变化图，C为30～60min内萤光素酶底物d2-cycluc、cycluc在体外的生物发光强度变化图，D为60～120min内萤光素酶底物 d2-cycluc、cycluc在体外的生物发光强度变化图，E为化合物cycluc和d2-cycluc在30min、时的生物发光强度差异，F为化合物cycluc和d2-cycluc在60min时的生物发光强度差异，G为化合物cycluc和d2-cycluc在120min时的生物发光强度差异，H为化合物 d2-cycluc与cycluc生物发光强度比值在30min、60min、120min内的变化曲线；
图10为实施例5萤光素酶底物d2-cycluc、cycluc的体外浓度依赖性研究；其中，A为不同浓度d2-cycluc、cycluc的体外成像图，B为不同浓度d2-cycluc与生物发光强度的关系，C为不同浓度cycluc与生物发光强度的关系；
图11为实施例6萤光素酶底物d2-cycluc、cycluc的细胞毒性研究；其中，A为不同浓度d2-cycluc对ES-2-Fluc细胞的存活率，B为不同浓度cycluc对ES-2-Fluc细胞的存活率；
图12为实施例7萤光素酶底物d2-cycluc、cycluc的细胞浓度依赖性研究；其中，A为不同浓度d2-cycluc、cycluc的细胞成像，B为不同浓度d2-cycluc与生物发光强度的关系，C为不同浓度cycluc与生物发光强度的关系，D为两种化合物浓度为5μM时，在 1-60min的生物发光强度，E为两种化合物浓度为0-100μM时，d2-cycluc与cycluc生物发光强度相对比值；
图13为实施例8萤光素酶底物d2-cycluc的FVB-luc+小鼠体内浓度依赖性研究；其中， A为不同浓度d2-cycluc与生物发光强度的关系，B为不同浓度d2-cycluc的小鼠成像结果；
图14为实施例9萤光素酶底物d2-cycluc、cycluc的FVB-luc+小鼠体内对比研究，其中， A为FVB-luc+小鼠腹腔注射cybluc和d2-cycluc(100μM，100μL)在60min，B为FVB-luc+小鼠腹腔注射cybluc和d2-cycluc(100μM，100μL)在120min，C为FVB-luc+小鼠腹腔注射cybluc和d2-cycluc(100μM，100μL)在240min时体内光子数，D为FVB-luc+小鼠腹腔注射cybluc和d2-cycluc(100μM，100μL)在480min时体内光子数，E为 FVB-luc+小鼠腹腔注射cycluc和d2-cycluc(100μM，100μL)在1min、5min、10min、 15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、60min、120min、240min、480min时体内光子数总和，F为在FVB-luc+小鼠腹腔注射1min、30min、 60min、120min、240min、480min时，化合物d2-cycluc与cycluc(100μM，100μL) 在FVB-luc+小鼠体内的光子数比值随时间的变化趋势，G为FVB-luc+小鼠腹腔注射化合物cycluc和d2-cycluc(100μM，100μL)在1min、60min、120min、240min、480 min时成像结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：制备化合物cycluc
Figure BDA0002594694100000091
2,2,2-trifluoro-1-(5-nitroindolin-1-yl)ethan-1-one(中间体1)
在5-硝基吲哚啉(4g，24.3mmol)和三乙胺(2.6g，26.8mmol)中加入二氯甲烷(20mL)进行搅拌，同时滴加三氟乙酸酐(5.6g，26.8mmol)。将该混合物搅拌45分钟，然后加入水(50mL)，搅拌10分钟后，将混合物用5M HCl酸化，有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩得到中间体1，为黄色固体6g，产率为94％，mp：136-138℃。1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ8.23(d,J＝10.9Hz,3H),4.40(t,J＝8.3Hz,2H),3.36(d,J＝8.2 Hz,2H)。
1-(5-aminoindolin-1-yl)-2,2,2-trifluoroethan-1-one(中间体2)
将SnCl2·2H2O(14.2g，63.1mmol)添加到中间体1(5.5g，21.5mmol)的乙醇(20 mL)溶液中，并将反应混合物60℃加热回流4小时。冷却至室温后，减压浓缩溶剂。将得到的残余物溶于饱和NaHCO3并用乙酸乙酯(2×100mL)萃取，然后用盐水洗涤，减压浓缩有机溶剂，并通过快速色谱法纯化(10％乙酸乙酯：石油醚)，得到中间体2，为白色固体3g，产率为61％。mp：175-176℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(d, J＝8.6Hz,1H),6.54(d,J＝1.6Hz,1H),6.44(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),5.18(s,2H),4.19(t, J＝7.7Hz,2H),3.11(t,J＝8.1Hz,2H)。
1-(2-amino-6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indol-5-yl)-2,2,2-trifluoroethan-1-one(中间体3)
中间体2(2g，8.695mmol)和硫氰酸钾(3.37g，34.78mmol)的冰醋酸溶液(20mL) 中在20℃下搅拌10分钟。在20分钟内将液溴(1.3g，8.695mmol)缓慢滴加到上述溶液中，反应混合物在室温下进一步搅拌21小时，将反应混合物倒在碎冰上，并使用 NH4OH把pH调节至8。所得沉淀物真空过滤并干燥，得到中间体3其无需进一步纯化即可用于下一步骤，为黄色固体2.3g，产率为92％，mp：179-181℃。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ8.33(s,1H),7.54(s,2H),7.29(s,1H),4.28(t,J＝7.9Hz,2H),3.24(t,J＝8.0 Hz,2H)。
1-(2-chloro-6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indol-5-yl)-2,2,2-trifluoroethan-1-one(中间体4)
在1小时内向亚硝酸叔丁酯(1.45g，14.1mmol)，氯化亚铜(1.16g，11.28mmol) 和乙腈(10mL)的混合物中分批加入中间体3(2.2g，7.66mmol)。在室温下搅拌2h，然后移至到65℃加热回流反应1h。将混合物过滤并将滤液倒入6M HCl中，并用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。浓缩后，将粗产物通过快速色谱法纯化(15％乙酸乙酯：石油醚)，得到中间体4，为粉红色固体粉末1.6g，产率为68％，mp：231-233℃。1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ8.76(s,1H),8.03–7.77(m,1H),4.38(t,J＝8.0Hz,2H),3.39(t,J＝8.2Hz,2H)。
2-chloro-6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indole(中间体5)
将化合物4(1.5g，4.9mmol)在甲醇(5mL)中搅拌，5分钟内分批添加NaBH4(0.725g，19.6mmol)。将混合物搅拌15分钟，用水(50mL)稀释，并用乙酸乙酯(2×50 mL)萃取。有机层用盐水洗涤并减压浓缩，得到中间体5，为白色固体粉末500mg，产率为48％，mp：207-209℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.56(d,J＝10.0Hz,1H), 6.96(s,1H),6.04(s,1H),3.51(t,J＝8.4Hz,2H),3.09–2.97(m,2H)。
6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indole-2-carbonitrile(中间体6)
将化合物5(0.5g，1.0mmol)溶于无水乙腈中，加入氰基三甲基硅烷(1.18g，5.0mmol)和四丁基氟化铵(3.11g，5.0mmol)于90℃条件下加热回流反应，用TLC进行实时监测，反应不完全进行后处理，旋干反应液后加入适量的水用乙酸乙酯进行萃取，过滤，旋干，进行色谱柱分离纯化，选择层析液为石油醚：乙酸乙酯＝5：1，浓缩液体得中间体6，为黄色固体粉末250mg，产率为52.4％，mp：195-196℃。1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ7.76(s,1H),7.05(s,1H),6.69(s,1H),3.61(t,J＝8.1Hz,2H),3.11(t,J＝8.2 Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ155.01,144.90,137.95,134.26,127.44,120.06, 115.00,96.85,47.06,28.58。
(S)-2-(6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indol-2-yl)-4,5-dihydrothiazole-4-carboxylic acid(终产物cycluc)
将中间体6(40mg，0.199mmol)溶于10mL二氯甲烷、10mL无水甲醇中，在氮气保护下，滴加用2mL无水甲醇、2mL蒸馏水溶解的碳酸钾(70mg)、D-半胱氨酸盐酸盐(41mg，0.238mmol)，在室温条件下反应，反应时间为1h，旋干，用1mol 盐酸调pH至7析出固体，过滤，滤液为终产物，粗产物用二氯甲烷和乙酸乙酯进行打浆，过滤得到固体粉末终产物7为50mg，产率为48％，mp：145-147℃。1H NMR(400 MHz,MeOD-d4)δ7.68(s,1H),6.99(s,1H),5.17(t,J＝9.1Hz,1H),3.79–3.55(m,4H), 3.35(s,1H),3.13(t,J＝8.1Hz,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ152.43,152.19, 145.03,142.89,135.96,131.19,118.44,98.76,47.16,29.17,25.78.HRMS(AP-ESI)m/z Cacld for C13H11N3O2S2[M+H]+306.0365Found:306.0368。
实施例2：制备化合物d2-cycluc：
Figure BDA0002594694100000111
indoline-2,3-d2(中间体8)
1H-吲哚(20.0g，170.7mmol)加入到圆底烧瓶中，用氘代甲醇进行溶解，加入钯碳(2.0g，18.7mmol)，并且鼓入氘气在40℃下加热回流反应，并用高压反应釜施加八个大气压的压力，用TLC进行监测，大约反应72小时，仍反应不完全。进行过滤除去钯碳，旋干反应液，加入水用乙酸乙酯萃取，得黄色液体11g，产率为50％，旋干直接投下一步。
1-(indolin-1-yl-2,3-d2)ethan-1-one(中间体9)
将中间体8(5g，41.3mmol)溶于冰醋酸中，在室温下将乙酰氯(19.5mL，247.6mmol)一滴滴加入到溶液中，然后将反应液移至90℃进行加热回流反应，搅拌1.5小时，TLC进行监测，反应完全。旋干反应液，加入水用乙酸乙酯萃取，拌样过柱子，得到固体粉末4g，产率为60％，mp：167-169℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20(d, J＝8.0Hz,1H),7.20–7.14(m,2H),7.02–6.97(m,1H),4.00(d,J＝7.0Hz,1H),3.16(d,J＝8.0Hz,1H),2.19(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.76,142.92,131.08,127.52, 124.57,123.58,116.93,48.68,27.87,24.22。
1-(5-nitroindolin-1-yl-2,3-d2)ethan-1-one(中间体10)
将中间体9(1.4g，8.58mmol)溶于无水乙腈中，加入Fe(NO3)3·9H2O(1.7g，4.29mmol)，在50℃进行加热回流反应，TLC进行监测，反应完全。减压浓缩反应液，用乙酸乙酯溶解，加入水进行萃取，加入硅胶旋干溶剂过柱子，得到白色固体粉末0.5g，产率为30％，mp：143-145℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝8.9Hz,1H),8.10 (dt,J＝10.8,5.4Hz,1H),8.03(s,1H),4.19(dd,J＝10.2,3.3Hz,1H),3.44–3.15(m,1H), 2.27(d,J＝9.7Hz,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ169.61,148.37,143.50,132.41, 124.70,120.31,116.14,49.37,27.25,24.30。
1-(5-aminoindolin-1-yl-2,3-d2)ethan-1-one(中间体11)
将中间体10(1.0g，4.8mmol)溶于无水乙醇中，加入用水溶解的氯化铵(2.6g，48mmol)，再加入活化的锌粉(6.3g，96mmol)，室温搅拌反应，反应很快，大概1 小时反应完全。过滤除掉锌粉，旋干反应液，用乙酸乙酯打浆，过滤，干燥，得黄色固体产物0.9g，产率为70％，mp：156-156℃。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.00(d,J＝8.4 Hz,1H),6.55–6.49(m,2H),3.97(t,J＝6.5Hz,1H),3.08(t,J＝6.8Hz,1H),2.17(s, 3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.65,142.80,117.74,113.84,111.68,48.72,28.02, 23.92。
1-(2-amino-6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indol-5-yl-6,7-d2)ethan-1-one(中间体12)
将中间体11(0.9g，5.05mmol)和硫氰酸钾(2.6g，20.1mmol)溶于冰醋酸中，搅拌10分钟，滴加用冰醋酸稀释的液溴(1.1g，5.05mmol)，缓慢滴加10分钟，室温搅拌反应15小时。旋干反应液，加水溶解，用氢氧化钠溶液调pH＝8，过滤，干燥，得红色固体粉末0.9g，产率为80.1％，mp：185-187℃。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29 (s,1H),7.29(s,2H),7.19(s,1H),4.09(q,J＝7.0Hz,1H),3.15(t,J＝7.0Hz,1H),2.14(s, 3H)。
1-(2-chloro-6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indol-5-yl-6,7-d2)ethan-1-one(中间体13)
将亚硝基叔丁酯(0.92g，8.97mmol)和氯化亚铜(0.7g，7.01mmol)用无水乙腈进行溶解，分批次加入中间体12(1.1g，4.67mmol)，5分钟加完，于室温反应2小时，再移至65℃继续加热回流反应1小时。将反应液过滤，滤液倒入6M HCl中，用乙酸乙酯进行萃取，干燥，浓缩，用柱色谱进行分离纯化，层析液选择石油醚：乙酸乙酯＝5：1，浓缩干燥得黄色固体粉末780.6mg，产率为76.3％，mp：156-158℃。1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H),7.78(s,1H),4.20–4.15(m,1H),3.31–3.25(m,1H), 2.20(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.55,150.71,146.86,141.81,135.16, 133.46,118.90,108.39,49.19,35.29,24.50。
2-chloro-6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indole-6,7-d2(中间体14)
用干燥的THF溶解中间体13(300mg，712.2mmol)，在-70℃条件下，滴加用THF 稀释的1M的LiAlH4(27mg，712.2mmol)混悬液，搅拌反应，反应很快。用TLC进行监测，30min反应完全。(LiAlH4的后处理过程：X g的LiAlH4，加入X mL的水，再加入X mL 15％NaOH溶液，最后加入3X mL水，搅拌30min，加硅藻土进行过滤)，旋干，用薄层色谱板进行层析，层析液选择石油醚：乙酸乙酯＝7：1，浓缩干燥得粉红色固体粉末200mg，产率为71％，mp：207-209℃。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.60(s, 1H),6.86(s,1H),3.65(t,J＝7.2Hz,1H),3.22–3.12(m,1H).13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ152.17,145.05,142.90,135.96,131.10,118.45,98.75,47.17,29.07。
6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indole-2-carbonitrile-6,7-d2(中间体15)
将中间体14(300mg，423.9mmol)溶于无水乙腈中，加入氰基三甲基硅烷(2.13mol，211.8mg)和四丁基氟化铵(2.13mol，558.6mg)，于90℃条件下加热回流反应，用TLC进行实时监测，反应不完全，进行后处理，旋干反应液，加入适量的水用乙酸乙酯进行萃取，过滤，旋干，进行色谱柱分离纯化，选择层析液为石油醚：乙酸乙酯＝5： 1，浓缩液体，得黄色固体粉末即为产物200mg，产率为64.7％，mp：195-196℃。1H NMR (400MHz,DMSO-d6)δ7.64(s,1H),7.11(s,1H),6.69(s,1H),3.67(t,J＝8.1Hz,1H),3.14 (t,J＝8.2Hz,1H)。
(4R)-2-(6,7-dihydro-5H-thiazolo[4,5-f]indol-2-yl-6,7-d2)-4,5-dihydrothiazole-4-carboxylic acid(终产物d2-cycluc)
将中间体15(500mg，1.0mmol)溶于10mL二氯甲烷、10mL无水甲醇中，在氮气保护下，滴加用2mL无水甲醇、2mL蒸馏水溶解的碳酸钾(370mg)、D-半胱氨酸盐酸盐(450mg，2.0mmol)，在室温条件下反应，反应时间为1h，旋干，用1mol 盐酸调pH至7析出固体，过滤，滤液为终产物。粗产物用二氯甲烷和乙酸乙酯进行打浆，过滤得到目标产物黄色固体粉末544.4mg，产率为78.1％，mp：145-147℃。1H NMR (400MHz,MeOD-d4)δ7.68(s,1H),6.99(s,1H),5.17(t,J＝9.1Hz,1H),4.00–3.95(m, 1H),3.67(m,2H),3.35(s,1H),3.13(t,J＝8.1Hz,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ 152.46,149.17,143.94,142.58,135.82,132.77,118.39,98.43,47.44,29.17,24.30.HRMS (AP-ESI)m/z Cacld for C13H9D2N3O2S2[M+H]+308.0491Found:308.0495。
实施例3：萤光素酶底物cycluc、d2-cycluc的体外代谢实验研究
在全黑色96孔板中加入化合物cycluc和d2-cycluc(20μM，50μL)，再加入50μL 含2mM ATP的萤光素酶溶液，立即开始拍摄，每隔5min拍摄一次，记录光子数至120 min结束，用多功能荧光酶标仪(
Figure BDA0002594694100000141
)测量生物发光强度，每组实验重复三次，并用Graphpad进行统计学计算。
由图9可知，萤火虫萤光素酶底物cycluc和d2-cycluc在体外的生物发光强度随着时间的延长而减弱，并且由图9A-D可知d2-cycluc的生物发光强度远远大于cycluc。在120min内，d2-cycluc与cycluc的生物发光强度比值最小达到10.4倍，最大达到158.1 倍，可见d2-cycluc的生物发光强度远远大于cycluc，并且生物发光时间也有很大的改善。由图9E-H可知，在30min、60min和120min时的生物发光强度具有极显著性差异，由30min内的14.9倍增加到120min内的18.5倍，这预示着d2-cycluc比cycluc 的生物发光强度更强，时间更长，更有利于用于活体成像实验。
实施例4：萤火虫萤光素酶底物cycluc和d2-cycluc的体外动力学研究
将50μL不同浓度的化合物溶液(0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM) 加入全黑色96孔板中，再加入50μL含2mM ATP的萤光素酶溶液，立即用小动物活体成像仪测生物发光强度，并用Graphpad中的Linewearver-Burk公式计算Vmax和Km。
由表1可见，d2-cycluc与cycluc相比反应速度增加，亲和力明显增加，这预示着d2-cycluc可能会在低浓度时对萤光素酶有着较高的灵敏度，更适合进行细胞和活体实验研究。
表1生物发光性质
Figure BDA0002594694100000151
实施例5：萤火虫萤光素酶底物cycluc和d2-cycluc的体外浓度依赖性研究
将50μL不同浓度的化合物溶液(0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.25μM、0.5μM) 加入全黑色96孔板中，再加入50μL含2mM ATP的萤光素酶溶液，立即用小动物活体成像仪测生物发光强度，测定90min中内生物发光强度，并用Graphpad进行数据处理。
由图10可见，cycluc和d2-cycluc的体外生物发光强度呈现浓度依赖性，随着萤光素酶底物浓度的增加生物发光强度越来越强，并且相同浓度的d2-cycluc比cycluc在体外的生物发光强度强很多，说明d2-cycluc更适合用于细胞和活体实验。
实施例6：萤火虫萤光素酶底物对细胞的毒性测定
将对数期的ES-2-Fluc细胞消化离心后，用含l0％胎牛血清的RPMI 1640培养基打散吹匀后，经过细胞计数，将细胞密度调整为4×104个/mL，将细胞用排枪种于透明96 孔板中间的60个孔的区域中(100μL/孔)，其中96孔板周围一圈以普通培养基填充，放置在细胞培养箱中孵育。
孵育过夜，待细胞贴壁，将萤光素酶底物的浓储液用无血清RPMI 1640培养基稀释成不同的浓度梯度(0、8μM、16μM、31μM、62μM、125μM、250μM、500μM、 1000μM、2000μM)加入96孔板中，每个浓度设置三个复孔，将萤光素酶底物和细胞于细胞培养箱中孵育。
24h后，加入MTT(5mg/mL)20μL/孔，(MTT需现配现用：取MTT 50mg，溶于10mL的磷酸缓冲液(PBS)中，0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌)。
4h后，将96孔板中的液体用注射器吸掉，每孔入DMSO 150μL，并置于摇床上振荡5min，使形成的结晶充分溶解，于酶标仪下扫描490nm处的吸收值。
由图11可见，为了检测萤光素酶底物对细胞的生物毒性较小，可以进行后续细胞实验研究，我们进行了细胞MTT实验。实验结果表明，两个萤光素酶底物对细胞的毒性作用均很小，cycluc的IC50＝855.4μM，d2-cycluc的IC50＞5*105μM，远大于细胞实验时所采用的萤光素酶底物浓度，因此可以用于生物水平的检测。
实施例7：细胞生物发光强度对底物浓度依赖性的测定
(1)培养ES-2-FLuc细胞至长满细胞培养瓶底约90％后，用含EDTA的0.25％胰酶消化离心，再用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基将细胞吹打均匀，取少量混合均匀的细胞悬液，用细胞计数板进行计数，细胞计数后将细胞密度调整为4×106个/mL，用排枪在全黑色96孔板中种入细胞，每孔加100μL细胞液(4万/孔)，于细胞培养箱中孵育过夜。(96孔板最外层一圈的孔，每孔加入100μL培养基；第二排孔，每孔加入100μL培养基；第3-8排孔，每孔加入100μL细胞液)
(2)次日早晨用排枪吸去培养基(除最外层一圈的孔)，每孔分别加入100μL不同浓度(0μM、5μM、10μM、20μM、50μM、100μM)的萤光素酶底物cycluc、d2-cycluc，用小动物活体成像仪进行生物发光成像。
由图12可见，为证明我们设计的萤光素酶底物可以用于活体检测，我们对化合物进行了细胞水平活性检测。由图12A、B、C可知，两种化合物在细胞水平上都呈现出浓度依赖性；由图D可知，在两种化合物浓度为5μM时，在1-60min内d2-cycluc相较于cycluc在细胞中有更强的生物发光强度；由图E可知，在0-100μM范围内d2-cycluc 相较于cycluc在细胞中有更强的生物发光强度最低可达1.98倍，最高可达4.60倍。因此两者均可用于活体成像并且d2-cycluc具有更强的生物发光强度和更长的生物发光时间，在活体成像时可能会有更好的成像效果。
实施例8：萤火虫萤光素酶底物d2-cycluc对FVB-luc+小鼠不同浓度腹腔注射实验
将化合物d2-cycluc用生理盐水和DMSO配置成终浓度为10mM、5mM、1mM、 100μM、10μM的溶液，每只FVB-luc+小鼠(转录萤光素酶)(约20g)腹腔注射200μL 水合氯醛溶液(40mg/mL)麻醉，麻醉后腹腔注射100μL化合物d2-cycluc，立即用小动物活体成像仪进行成像，时间记为1min。在1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min时用小动物活体成像仪拍摄生物发光强度。取FVB-luc+小鼠除尾部以外的其他部分计算ROI值，并用 Graphpad进行统计学计算。
由图13可见，在FVB-luc+小鼠体内腹腔注射不同浓度的化合物d2-cycluc，FVB-luc+小鼠体内生物发光强度随着d2-cycluc浓度的升高而增强。
实施例9：萤火虫萤光素酶底物cycluc和d2-cycluc对FVB-luc+小鼠腹腔注射实验
将cycluc和d2-cycluc用生理盐水和DMSO按照9：1的比例配置成最终浓度为100 μM的溶液，取6只成年雌性FVB-luc+小鼠(转录萤光素酶)并分成2组，每只FVB-luc+小鼠(转录萤光素酶)(约20g)腹腔注射200μL水合氯醛溶液(40mg/mL)麻醉，两组小鼠分别腹腔注射100μL cycluc和d2-cycluc，立即用小动物活体成像仪进行成像，时间记为1min。在1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、120min、240min、480min用小动物活体成像仪拍摄生物发光强度。取FVB-luc+小鼠除尾部以外的其他部分计算ROI值，并用 Graphpad进行统计学计算。
由图14可见，从图A-D中我们可以看出，FVB-luc+小鼠体内腹腔注射化合物cycluc和d2-cycluc在1min-480min内的发光情况，除了120min时没有显著性差异，其他时间都具有一定的差异性，并且在60min和480min时都具有极显著性差异，在240min 时具有显著性差异；从图E中我们可以看出，在1min-480min内的光子数总和具有极显著性差异(P＜0.01)；从图F中我们可以看出，随着时间的延长，化合物d2-cycluc 与cycluc在FVB-luc+小鼠体内的光子数比值具有下降的趋势，由腹腔注射后1min时的 5.4倍降低到腹腔注射后480min时的1.8倍，我们可以看出腹腔注射cycluc和d2-cycluc 后，1-480min内d2-cycluc组生物发光强度始终大于cycluc组，可见d2-cycluc更适合活体内成像研究。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (17)

1.一种萤光素酶底物，所述萤光素酶底物结构式为：
Figure FDA0003138047490000011
其中，R取氘。
2.权利要求1所述萤光素酶底物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
Figure FDA0003138047490000012
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述d2-cycluc的具体合成步骤为：
(1)1H-吲哚和钯碳在氘气条件下进行反应，得到中间体8；
(2)中间体8和乙酰氯进行反应，得到中间体9；
(3)中间体9和Fe(NO3)3·9H2O进行反应，得到中间体10；
(4)中间体10和氯化铵、锌粉进行反应，得到中间体11；
(5)中间体11和硫氰酸钾进行反应，得到中间体12；
(6)中间体12、亚硝基叔丁酯和氯化亚铜进行反应，得到中间体13；
(7)中间体13和LiAlH4进行反应，得到中间体14；
(8)中间体14、氰基三甲基硅烷和四丁基氟化铵进行反应，得到中间体15；
(9)中间体15、碳酸钾和D-半胱氨酸盐酸盐进行反应，得到d2-cycluc。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，各反应步骤均在溶剂条件下进行。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1)中，
所述溶剂为氘代甲醇、氘代乙腈；
反应温度为30～70℃，反应时间为50～80h；
所述1H-吲哚、钯碳的摩尔比为10：1；
所述步骤(2)中，
所述溶剂为冰醋酸或盐酸；
反应温度为50～100℃，反应时间为1～3h；
所述中间体8、乙酰氯的摩尔比为1：(4-6)；
所述步骤(3)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲醇或乙醇；
反应温度为40～70℃，反应时间为1～3h；
所述中间体9、Fe(NO3)3·9H2O的摩尔比为2：1；
所述步骤(4)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈或乙醇；
反应温度为10～30℃，反应时间为1～3h；
所述中间体10、氯化铵、锌粉的摩尔比为1：10：20；
所述步骤(5)中，
所述溶剂为二氯甲烷、乙腈、甲醇或乙醇；
反应温度为10～30℃，反应时间为10～30h；
所述中间体11、硫氰酸钾、液溴的摩尔比为1：3～4：1；
所述步骤(6)中，
所述溶剂为二氯甲烷、无水乙腈、甲醇或乙醇；
反应温度为40～70℃，反应时间为1～3h；
所述中间体12、亚硝基叔丁酯、氯化亚铜的摩尔比为1：1～2：1.5；
所述步骤(7)中，
所述溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、DMF、甲醇或乙醇；
反应温度为-40～-100℃，反应时间为1～2h；
所述中间体13、LiAlH4的摩尔比为1～2：1；
所述步骤(8)中，
所述溶剂为无水乙腈、二氯甲烷、DMF、甲醇或乙醇；
反应温度为40～100℃，反应时间为1～2h；
所述中间体14、氰基三甲基硅烷、四丁基氟化铵的摩尔比为1～2：1：2.5；
步骤(9)中，
所述溶剂甲醇、二氯甲烷与水以任意比例互溶的有机溶剂，
反应温度为20～50℃，反应时间为1～5h；
所述中间体15、碳酸钾、D-半胱氨酸盐酸盐的摩尔比为1：1～2：2.5。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(1)中，
所述溶剂为氘代甲醇。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(2)中，
所述溶剂为冰醋酸。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(3)中，
所述溶剂为乙腈。
9.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(4)中，
所述溶剂为乙醇。
10.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(5)中，
所述溶剂为乙腈。
11.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(6)中，
所述溶剂为无水乙腈。
12.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(7)中，
所述溶剂为四氢呋喃。
13.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤(8)中，
所述溶剂为无水乙腈。
14.权利要求1所述萤光素酶底物制备荧光产品中的应用。
15.如权利要求14所述应用，其特征在于，所述荧光产品为荧光探针和荧光检测试剂盒。
16.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针包含权利要求1所述萤光素酶底物。
17.一种荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光检测试剂盒包含权利要求1所述萤光素酶底物或权利要求16所述荧光探针。
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