WO2013124544A1 - Procede de normalisation de la luminescence emise par un milieu de mesure. - Google Patents

Procede de normalisation de la luminescence emise par un milieu de mesure. Download PDF

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luminescence
fluorescent
long
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Gérard Mathis
Hervé Bazin
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Cisbio Bioassays
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Definitions

  • the invention relates to an improved method for normalizing the luminescence emitted by a measurement medium with respect to the quantity of cells contained in this medium.
  • the invention also relates to a reagent kit for carrying out this method.
  • Fluorescent compounds are a tool of choice for research in biology as they allow, in combination with equipment capable of detecting their luminescence, to visualize biological processes at the cellular or even the molecular level, by microscopy or simply by measuring their luminescence using a fluorimeter. These compounds can be used as such to stain certain compartments of cells or tissues, or be conjugated to vectors that will transport them to a specific site.
  • vectors may be, for example, antibodies specific for a cellular component (such as a protein) that it is desired to label with a fluorescent compound, or any compound that has a specificity for a compartment or a cellular component.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • This luminescence can be measured by a fluorometer set at the emission wavelengths of the fluorescent compounds, and the FRET signal thus obtained, most often constituted by the ratio of the signal of the acceptor to that of the donor, makes it possible to follow the evolution of the phenomenon observed.
  • the implementation of this technique with rare earth chelates or cryptates, developed in particular by G. Mathis et al. has many advantages that have already allowed several applications in the field of electromagnetic resonance. in vitro diagnostics and in the field of high throughput screening in the pharmaceutical industry.
  • the fluorescent rare earth chelates or cryptates in particular the cryptates or chelates of europium or terbium, have a life of the order of a millisecond which allows the measurement of the FRET signal emitted by the measurement medium after a delay following excitation of the donor compound.
  • This time-resolved FRET measurement technique makes it possible to overcome the parasitic luminescence emitted by the measurement medium immediately after its excitation and is therefore particularly advantageous when the measurement medium includes biological material rich in compounds, in particular proteins, capable of producing this kind of interference.
  • the TR-FRET technique has long been implemented on relatively well-controlled biological systems, such as a given enzyme and its substrate, two proteins interacting with each other, or the assay of an analyte in plasma or blood serum, it has recently been applied to much more complex environments, including cells, cell lysates or tissue explants.
  • One of the problems of in vitro tests performed on this type of material lies in the difficulty of controlling the number of cells present in the measuring medium, making the comparison of the results obtained in different tests all the more difficult. This technical problem is particularly critical when it is desired to apply the TR-FRET technique to the clinical analysis of tissue samples characterized by a large disparity in cellular content.
  • Evaluation or standardization techniques with respect to the quantity of cells present in the measuring medium are available: it is first possible to introduce into the measuring medium a known number of cells by distribution of a homogeneous suspension of cells. Cell counting techniques are also used, but they are relatively tedious and unsuitable for the analysis of a large number of samples (microscopy, FACS). Another approach consists of evaluating the quantity of certain "ubiquitous" proteins, the presence of which indirectly reflects the quantity of cells present in the measurement medium (GAPDH, actin).
  • fluorescent agents that intercalate in the DNA are also used: these agents have the particularity of being luminescent at different wavelengths depending on whether they are complexed with the DNA; calculating the ratio of the signals measured at these two wavelengths makes it possible to evaluate the amount of DNA present in the medium.
  • intercalating agents are Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 or DAPI.
  • the inventors have developed a method for measuring the luminescence emitted by a measurement medium containing cells, in which the luminescence signal is normalized, that is to say that it takes into account the number of cells in the cell. measuring medium.
  • the method of the invention consists in using a cell labeling agent for correcting the luminescence signal to take into account the quantity of cells present in said medium.
  • an intercalating agent capable of labeling the cells at the level of the DNA, or else
  • an agent capable of labeling the cells at the level of structural elements of the cell whose quantity is relatively constant from one cell to another for example: lipid membranes, total proteins, organelles, ubiquitous enzymes, or else
  • an agent capable of labeling the cells at the level of a protein that is artificially expressed by the cell (GAPDH, actin, GST, etc.) and expressed in a similar manner in all the cells of the sample, or else
  • the invention also relates to a kit containing the reagents essential to the implementation of this process.
  • the method of the invention consists of a method for measuring the luminescence of a long-lived fluorescent compound present in a measurement medium, said medium containing a biological sample, characterized in that it comprises the following steps:
  • a) introduction into the measuring medium of a long-lived fluorescent compound b) introduction into the measuring medium of a fluorescent marking agent whose absorption spectrum allows its excitation at the same wavelength than that used to excite the long-lived fluorescent compound, and the emission spectrum makes it possible to measure its luminescence at the same wavelength as that used to measure the luminescence of the long-lived fluorescent compound, ) exciting the measuring medium at a wavelength corresponding to an absorption peak of the long-lived fluorescent compound,
  • step d time-resolved measurement of the luminescence emitted by the measuring medium at the same wavelength as that used in step d), after a delay of 20 to 200 ⁇ s following the excitation of the measurement medium and during a duration of 200 to 1000 ps, this luminescence corresponding mainly to that of the long-lived fluorescent compound,
  • the measured luminescence is that resulting from a TR-FRET phenomenon in the measurement medium, that is to say a transfer of energy between a donor fluorescent compound and an acceptor fluorescent compound.
  • the long-lived fluorescent compound plays the role of the energy donor and the above method then comprises the following steps:
  • step f) optionally, measurement in time resolved of the luminescence emitted by the measuring medium at the same wavelength as that used in step e), after a delay of 20 to 200 ps following the excitation of the measuring medium and for a duration of 200 to 1000 ps,
  • step f) is therefore optional: it is possible to dispense with the measurement of the luminescence of the long-lived fluorescent compound.
  • the luminescence measured is that resulting from a TR-FRET phenomenon in the measuring medium
  • the luminescence of the labeling agent and that of the long-lived fluorescent compound are no longer measured at the same wavelength, and the process is modified as follows:
  • the marking agent is a fluorescent marking agent whose absorption spectrum allows its excitation at the same wavelength as that used to excite the long-lived fluorescent compound, and the emission spectrum makes it possible to measure its luminescence at the same wavelength as that used to measure the luminescence of the acceptor fluorescent compound,
  • step e) the luminescence is measured at a wavelength corresponding to an emission peak of the acceptor fluorescent compound
  • step f) if it is present, the luminescence is measured at a wavelength corresponding to a peak emission of the long-lived fluorescent compound.
  • the method according to the invention further comprises a second step of exciting the measuring medium at a wavelength corresponding to an absorption peak of said long-lived fluorescent compound, said second excitation being carried out immediately before the step of measuring the luminescence time resolved.
  • the method according to the invention further comprises a washing step before the first excitation, ie between steps b) and c) the method or steps c) and d) of its preferred implementation.
  • the method according to the invention is implemented on a measuring medium containing a biological sample.
  • biological sample is meant a tissue sample (in particular a tumor sample) or cells derived from a cell culture.
  • the cells present in the measurement medium may be isolated cells, for example cells obtained by cell culture. They can be in suspension or adhere to the container of the measuring medium. These cells may also be derived from a tissue extract.
  • the biological sample preferably consists of histological sections, in particular frozen histological sections.
  • histological sections are made for example by using a cryotome or an ultramicrotome on paraffin embedded tissue or epoxy resins.
  • a cryotome is used with unfrozen frozen tissues to obtain frozen sections and to avoid denaturing proteins.
  • the method of the invention is particularly advantageous when carried out on a tissue extract because of the variability of the amount of biological material present in this case.
  • the cells may be intact, or have been subjected to a treatment aimed at homogenizing said sample in the form of a cell lysate, and this, before or after the introduction of the fluorescent compounds in the measuring medium.
  • a treatment may be mechanical, leading to a cell lysate.
  • the mechanical treatment in question may be chosen from: the application of ultrasound, freeze / thaw cycles, the use of mechanical mills, optionally together with the use of hypotonic lysis buffer or lysis buffer containing detergents like the RIPA buffer.
  • An example of a gentle mechanical treatment consists in applying ultrasound (sonication) to the measurement medium at a frequency of between 19 800 and 500 kHz, at a power of 80 W and for a duration of 3 to 10 seconds, and preferably during 4 to 6 seconds.
  • the samples are preferably kept in an ice bath during the treatment to limit their heating.
  • This treatment does not significantly disturb the antigen-antibody bonds or the oligomers of proteins, especially the dimers present in the measuring medium.
  • fluorescent metal complex means a compound consisting of a lanthanide or ruthenium and of a polydentate complexing agent, that is to say comprising at least 2, and preferably between 2 and 9 donor heteroatoms. electrons, such as N, O, S, these atoms forming coordination bonds with lanthanide or ruthenium.
  • the fluorescent metal complex comprises one or more chromophores consisting of aromatic structures; preferably these aromatic structures comprise 1, 2 or 3 heteroatoms selected from N and O, which act as coordinating atoms of lanthanide or ruthenium.
  • a suitable fluorescent metal complex for the purposes of the invention must be stable in terms of association / dissociation of the complexing agent and the rare earth, and preferably its formation constant (Kf) must be greater than 10 10 M " 1 .
  • complexing agents have been described and are known to those skilled in the art: the following compounds may be mentioned as examples of complexing agents: EDTA, DTPA, TTHA, DOTA, NTA, HDTA, DTPP, EDTP, H DTP, NTP, DOTP, D03A, DOTAGA. Chelates and crypates of terbium and europium have been described and several are commercially available. Examples of long-lived fluorescent compounds are given in FIG. 1, as well as hereinafter:
  • Lanthanide cryptates with one or more pyridine motifs. Such rare earth cryptates are described, for example, in patents EP 0 180 492 and EP 0 321 353. EP 0 601 113 and in the international application WO 01/96 877.
  • the cryptates of terbium (Tb3 +) and europium (Eu3 +) are particularly suitable for the purposes of the present invention.
  • Cryptates of lanthanides are marketed by the company Cisbio Bioassays.
  • Lanthanide complexes consisting of a chelating agent, such as tetraazacyclododecane, substituted by a chromophore having aromatic rings, such as those described by Poole R. et al. in Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterization of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for use in cellulo", can also be used. We can also use the complexes described in WO 2009/10580.
  • terbium cryptate of formula below (which may be coupled to a compound to be labeled via a reactive group, here for example an NH 2 group):
  • the terbium cryptate Lumi4-Tb from Lumiphore marketed by Cisbio Bioassays.
  • Ruthenium chelates in particular complexes consisting of a ruthenium ion and several bipyridines such as ruthenium (II) tris (2,2'-bipyridine).
  • the long-lived fluorescent compound is a fluorescent metal complex chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate; a ruthenium chelate; and a quantum dye; chelates and cryptates of europium and terbium are particularly preferred.
  • Dy3 + dysprosium
  • Sm3 + samarium
  • Nd3 + neodymium
  • Yb3 + ytterbium
  • Er3 + erbium
  • an energy accepting compound compatible with the long-lived fluorescent compound is introduced into this middle.
  • the selection of the fluorophore donor / acceptor couple to obtain a FRET signal is within the abilities of those skilled in the art.
  • the excitation spectrum of the acceptor must cover at least part of the emission spectrum of the donor compound, and the transition dipoles of the donor and acceptor compounds must be parallel.
  • Donor-acceptor pairs that can be used to study FRET phenomena are described in particular in Joseph R. Lakowicz's book (Principles of fluorescence spectroscopy, 2 nd edition 338), to which a person skilled in the art can refer.
  • the fluorescent acceptor compounds may be chosen from the following group: allophycocyanines, in particular those known under the trade name XL665; organic luminescent molecules, such as rhodamines, cyanines (for example Cy5), squaraines, coumarines, proflavines, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives (marketed under the name “Bodipy”), the fluorophores known under the name “Atto”, the fluorophores known under the name "DY”, the compounds known under the name "Alexa”, nitrobenzoxadiazole.
  • organic luminescent molecules such as rhodamines, cyanines (for example Cy5), squaraines, coumarines, proflavines, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives (marketed under the name “Bodipy”)
  • the fluorescent acceptor compounds are chosen from allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavines, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives and nitrobenzoxadiazole.
  • cyanines and “rhodamines” should be understood respectively as “cyanine derivatives” and “rhodamine derivatives”. Those skilled in the art know these different fluorophores, commercially available.
  • the compounds "Alexa” are marketed by the company Invitrogen; the “Atto” compounds are marketed by Attotec; the compounds “DY” are marketed by the company Dyomics; the “Cy” compounds are marketed by Amersham Biosciences the other compounds are marketed by various suppliers of chemical reagents, such as Sigma, Aldrich or Acros.
  • the following fluorescent proteins may also be used as fluorescent acceptor compounds: cyan fluorescent proteins (AmCyan1, Midori-lshi Cyan, mTFP1), green fluorescent proteins (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), yellow fluorescent proteins (EYFP, Topaz, Venus, mCitrin, YPet, PhiYFP, ZsYellowl, mBanana), orange and red fluorescent proteins (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2 , mRFP1, JRed, mCherry, mStrawberry, HcRedI, mRaspberry, HcRed-Tandem, mPlim, AQ143), fluorescent proteins in the far red (mKate, m ate2, td atushka2).
  • cyanine derivatives are preferred as the acceptor fluorescent compound.
  • the fluorescent donor and / or acceptor compounds are generally each conjugated to a member of a pair of binding partners, depending on the object studied by those skilled in the art, in accordance with the usual application of the TR-technique. FRET to the study of biological phenomena.
  • these compounds may each be coupled to an antibody, an enzyme substrate, a peptide, a membrane receptor ligand, and the like.
  • the nature and the function of these molecules conjugated to the donor and acceptor compounds do not constitute essential technical characteristics of the process according to the invention: they are variable parameters that the person skilled in the art will adapt according to the object of his study, and which will not affect the method of normalizing the FRET signal according to the invention. This is why these aspects, which are largely described elsewhere, are not explained here.
  • the marking agent used in the process according to the invention is a fluorescent intercalating agent.
  • intercalating agent is used here in the broad sense, and refers in particular to an organic compound capable of integrating with the double helix of DNA, either by intercalating between the DNA strands, or by binding to the little furrow or in the big groove of the double helix of DNA.
  • These agents are known and their spectroscopic characteristics, in particular their emission spectra, are different according to whether they are complexed with DNA or not.
  • the concentration of the intercalating agent in the measuring medium must be greater than that of the long-lived fluorescent compound, preferably at least 50 to 150 times.
  • the use of the intercalating agent at a final concentration before complexation of 1 and 10 ⁇ is thus preferred.
  • Table 1 gives a list of these compounds, as well as information relating to their spectroscopic properties.
  • the preferred fluorescent intercalating agents are those which can be used according to the invention with a terbium or europium chelate or cryptate, that is to say which can be excited between 330 and 350 nm, and which emit after binding.
  • DNA at wavelengths corresponding to the emission peaks of these chelates or crypates of terbium or europium, namely in particular around 588 nm and 620 nm (if a chelate or europium cryptate is used) or around 490 nm, 545 nm, 588 nm or 620 nm (if a terbium chelate or cryptate is employed), or at a wavelength corresponding to an emission peak of the acceptor compound, generally between 450 and 650 nm, most often between 480 and 600 nm.
  • a lipophilic intercalating agent will be selected to penetrate the cell nucleus, particularly when working on whole cells and not on a cell crumb. Moreover, some intercalating agents being rejected by living cells, it is appropriate when they are used to introduce them into the measuring medium once the cells have been transformed into a cell lysate, for example by sonication. However, this is not the case for the Hoechst 33342 compound which can be inserted in the DNA of intact living cells.
  • the fluorescent intercalating agent is selected from the following group: Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole).
  • the invention is implemented with the Hoechst 33342 intercalating agent, which is ideal when the long-lived fluorescent compound is a terbium chelate or cryptate, and which is also usable with a chelate or a Europium cryptate.
  • the marking agent is not necessarily an intercalating agent: it is also possible to use a fluorescent compound capable of labeling the cells, the absorption spectrum of which allows its excitation at the same length. wave that used to excite the long-lived fluorescent compound, and the emission spectrum allows the measurement of its luminescence at the same wavelength as that used to measure the luminescence of the long-lived fluorescent compound, or to that of the acceptor when he is present.
  • a sufficiently lipophilic labeling agent will be chosen to penetrate the cells, particularly when working on whole cells and not on a cell crumb.
  • the preferred fluorescent intercalating agents are those which can be used according to the invention.
  • a chelate or a cryptate of terbium or europium that is to say which can be excited between 330 and 350 nm, and which emit after DNA binding either at the wavelengths corresponding to the peaks of emission of these chelates or crypates of terbium or europium, namely in particular around 588 nm and 620 nm (if a chelate or europium cryptate is used) or around 490 nm, 545 nm, 588 nm or 620 nm ( if a terbium chelate or cryptate is employed), or at a wavelength corresponding to a peak emission of the acceptor compound, generally between 450 and 650 nm, most often between 480 and 600 nm.
  • labeling agents are:
  • fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP).
  • GFP green fluorescent protein
  • the cells of the sample will have been previously transfected with an expression vector coding for this fluorescent protein.
  • the step of the invention of introducing the marking agent into the measuring medium will correspond in practice to the step of introducing the biological sample into this medium.
  • Expression plasmids encoding these proteins are commercially available and transfection techniques are known to those skilled in the art. The luminescence of the fluorescent protein will be measured immediately after the excitation of the measuring medium, similarly to the case where the marking agent is an intercalating agent.
  • fluorescent mitochondrial marker compounds such as Mitotracker Orange, Mitotracker Green, or Rhodamine 123. These compounds are commercially available and cell labeling protocols with these compounds are also known. They can be used according to the invention with a similar protocol in the case where the marking agent is an intercalating agent,
  • fluorescent compounds such as dansyl chloride or NBD (nitrobenzoxadiazole): these compounds, also commercially available, bind to amino functions, including proteins.
  • Y. Uratani et al. describe a cell labeling protocol with dansyl chloride (Journal of Bacteriology 1982: 523-528).
  • the invention can be implemented with a similar protocol in the case where the labeling agent is an intercalating agent, fluorescent compounds that accumulate in the lipid membranes, such as Filipin: this compound is commercially available and its use for labeling cells is known. It can be used according to the invention with a protocol similar to that of the case where the marking agent is an intercalating agent.
  • fluorescent compounds capable of labeling a protein which is artificially expressed by the cell in this embodiment, the cells have been previously transfected with a plasmid encoding a fusion protein comprising a suicide enzyme such as the enzymes marketed under the name Snaptag, Cliptag, ACPtag, MCPtag, or Halotag.
  • This fusion protein may also include GST protein, actin, GAPDH or any other protein readily expressed by a cell.
  • a fluorescent substrate of these enzymes such as a benzylguanine-fluorophore derivative, benzylcytosine-fluorophore, or chloroalkane-fluorophore
  • the signal of the fusion protein thus labeled can be measured and used according to the invention with a protocol similar to that used in the case where the labeling agent is an intercalating agent.
  • the invention constitutes an improvement of the known processes using a long-lived fluorescent compound, and optionally also an acceptor fluorescent compound, in that it comprises the use of a fluorescent marking agent and that it proposes to optimize the excitation of these compounds and the measurement of their luminescence.
  • the luminescence emitted by the measuring medium is carried out in a conventional manner using a fluorimeter which allows the excitation of the medium at a given wavelength, and the measurement of the luminescence emitted after excitation in a time window and at a wavelength chosen by the user. Excitation of the long-lived fluorescent compound and the marking agent.
  • One of the novel features of the invention consists in exciting the measurement medium in such a way that not only the donor compound but also the marking agent are excited simultaneously, or in any case at the same wavelength.
  • the invention is based on the use of long-lived fluorescent compounds and fluorescent labeling agents whose absorption spectra allow excitation at the same wavelength.
  • the wavelength of The excitation can be modified by the user depending on the long-lived fluorescent compounds and the labeling agents that he wishes to use. Nevertheless, when these fluorimeters are employed, the excitation wavelength will preferably be chosen between 320 and 360 nm, and preferably between 330 and 350 nm.
  • the measuring medium is excited twice, at the same wavelength: a first time to measure the fluorescence of the labeling agent (continuous fluorescence, measured without delay after the excitation ), and a second time to measure the fluorescence in time resolved. This is particularly advantageous when it is desired to modify the gain of the fluorometer, which may be necessary in particular if the signal of the marking agent saturates the measurement channel.
  • the medium further comprises a FRET partner acceptor fluorescent compound of the long-lived fluorescent compound
  • this acceptor compound will also emit. It is necessary to recall that the measurement of luminescence at a given wavelength is in practice, due to the technical constraints of the fluorimeters, to measure the luminescence in a more or less important range centered around the wavelength d covered issue. Typically, when a fluorometer is set for measurement at a wavelength L, the luminescence emitted at L nm + 1-5, 10 or 20 nm is measured in practice.
  • TR-FRET signal sometimes used is an abuse of language which refers to the luminescence emitted by the measurement medium following the energy transfer from the donor compound to the acceptor compound.
  • This TR-FRET signal may correspond to the luminescence of the donor compound, the intensity and duration of which will decrease following the transfer of energy, or that of the acceptor compound, whose intensity will increase. Most often both signals are measured and the TR-FRET signal is the ratio of the signal from the acceptor to that of the donor.
  • the luminescence of the labeling agent and that of the donor fluorescent compound are measured at the same wavelength. This makes it possible to further reduce the process implementation time since no filter change is necessary to measure the signal of each of these compounds, and moreover to limit the risk of error related to the modification of the conditions of the process. measured. This is again made possible by the choice of a long-lived fluorescent compound and a fluorescent labeling agent whose emission spectra allow the measurement of luminescence at the same wavelength.
  • the luminescence of the labeling agent and that of the acceptor fluorescent compound, when present, are measured at the same wavelength.
  • the long-lived fluorescent compound is a cryptate or a chelate of europium or terbium
  • the fluorescent marking agent is an agent whose absorption spectrum allows excitation at a wavelength between 330 and 350 nm and emitting a wavelength between 450 and 650 nm, in particular between 490 and 600 nm
  • the luminescence of the acceptor fluorescent compound and that of the fluorescent labeling agent are both measured at a length of wave included in these intervals.
  • the marking agent will be selected from those whose absorption spectrum allows excitation at a wavelength. between 330 and 350 nm, and whose emission spectra allow the measurement of luminescence at a wavelength close to that of the maximum of the emission peaks of terbium, namely 490 nm, 545 nm, 588 nm, or 620 nm, especially at wavelengths of 490 +/- 10 nm, 545 +/- 10 nm or 590 +/- 10 nm.
  • the luminescence of the long-lived fluorescent compound (terbium chelate or cryptate) and that of the marking agent will both be measured at these wavelengths.
  • a marking agent is chosen whose emission spectrum allows a luminescence measurement at 490 +/- 10 nm, 545 +/- 10 nm or 590 +/- 10 nm.
  • the labeling agent will be chosen from among those whose spectrum Absorption allows excitation at a wavelength between 330 and 350 nm, and whose emission spectra allow the measurement of luminescence at a wavelength close to that of the maximum emission peaks of the europium, namely 580 nm; 588 nm, 620 nm, 650 nm and 684 nm, especially at wavelengths of 588 nm +/- 10 nm or 620 nm +/- 10 nm; the luminescence of the long-lived fluorescent compound and that of the labeling agent will both be measured preferably at wavelengths of 588 nm +/- 10 nm or 620 nm +/- 10 nm.
  • the invention advantageously takes advantage of the spectroscopic properties of these compounds to discriminate their respective luminescences, even in the case where they are measured at the same wavelength.
  • the luminescence of the long-lived fluorescent compound and that of the labeling agent are indeed measured in different time windows: the inventors have discovered that, unexpectedly, the signal of the fluorescent compound with a duration of long life does not contaminate the signal of the marking agent measured immediately after excitation of the measuring medium.
  • the luminescence of the marking agent is measured immediately after the excitation of the measuring medium, while the signals of the fluorescent compound with a lifetime long and / or acceptor when present are measured after a delay following this excitation, and for a given duration (also called "integration time"), these two parameters being adjustable on commercially available fluorimeters .
  • the term "measurement immediately after the excitation of the measuring medium” an immediate measurement, that is to say without delay or after a very short period of time not exceeding 30 ps.
  • the luminescence of the marking agent is measured immediately after excitation of the measuring medium, and for the shortest time possible on the fluorimeter.
  • the excitation is performed by a laser
  • the signal can be measured in a window from 5 ns to 8 ps. On some lasers, it is advisable to measure in one of the following intervals: 0-8 ps, 2-8 ps, 2-6 ps and 2-4 ps.
  • the excitation is effected by means of a flashlamp, the signal is preferably measured a little longer, namely for a period of 5 ps to 45 ps, preferably 5 ps to 20 ps.
  • the luminescence emitted by the measurement medium and corresponding to the signal of the donor compound is measured after that of the marking agent, after a delay of 20 to 200 ps, and preferably from 40 to 200 ps following the excitation of the medium. measuring time, and for a period of 200 to 1000 ps, preferably 400 to 1000 ps.
  • Time windows The following are individually preferred windows: 50-550 ps, 100-500 ps, 100-300 ps, 200-1200 ps.
  • time window means the period of time which begins when the luminescence is measured after a delay following the light excitation of the measuring medium and ends at the end of the integration time.
  • a "100-500 ps" time window means that the luminescence is measured after a delay of 100 ps after the luminous excitation of the measuring medium for a duration (integration time) of 400 ps.
  • the luminescence of the acceptor compound, when present, is measured at its emission wavelength, either in the same time window as that used for measuring the signal of the long-lived fluorescent compound, or in a different window.
  • the luminescence of the acceptor compound will be measured at its emission wavelength after a delay of 20 to 200 ps, preferably 40 to 200 ps after excitation of the measuring medium and for a period of 200 to 600 ps, preferably 400 to 600 ps.
  • the measuring medium contains an acceptor compound and a TR-FRET signal
  • its evolution will enable the person skilled in the art to better understand the biological system that he is studying since this signal depends on the proximity.
  • fluorescent donor and acceptor compounds introduced into the measuring medium.
  • the invention is not related to the various applications as such of the TR-FRET technique to the study of biological systems that have been described elsewhere, but it nevertheless makes it possible to improve them.
  • the TR-FRET signal representative of an evolution of the biological system observed can be either that of the donor or that of the acceptor. Nevertheless, it is extremely common to measure the two signals and to divide the signal of the acceptor compound by that of the donor compound. Fluorimeters generally include a mode that allows this type of reading.
  • this signal will be further and according to the invention, corrected by that of the agent.
  • this correction to normalize the TR-FRET signal by the DNA content of the measuring medium, and therefore by the amount of cells.
  • this correction is automatic and is performed by the software that analyzes the measured signals. This software can be integrated into the fluorimeter or operate on a separate computer to which the results of the fluorescence measurement are submitted.
  • the method according to the invention can be further refined to take account of the fact that the long-lived compound may contribute, in a minority way, to the signal measured immediately after excitation (signal corresponding mainly to that of the marking agent ). It is possible to calculate this parasitic contribution by establishing a standard range which will make it possible to determine the relationship between the signal of the long-lived compound measured in time resolved and that measured in continuous fluorescence (without delay).
  • the signal emitted by a measuring medium containing the long-lived fluorescent compound, but not the labeling agent will be measured at increasing concentrations of long-lived fluorescent compound, on the one hand in fluorescence continuous and secondly in fluorescence in time resolved.
  • the relationship between the two signals is a linear function which makes it possible to calculate the contribution of the long-lived fluorescent compound to the signal emitted in continuous fluorescence, from the measured value in time resolved.
  • the method according to the invention can be implemented in different ways, in particular according to the nature of the biological material present in the measuring medium.
  • the method according to the invention comprises an additional step of mechanical treatment, such as a step of sonication of the biological material
  • this step can be carried out either before or after the contacting of the sample of biological material with the fluorescent compounds donor, acceptor and the marking agent, and of course always before the measurement of the luminescence emitted by the measuring medium.
  • a first possibility, in the case of working on a tissue extract which is subjected to sonication treatment, is to put the tissue in contact with the fluorescent compounds before the sonication of the sample, according to the following steps:
  • This implementation has the advantage of having a washing step which will limit the background noise and thus increase the sensitivity of the measurement. It is preferred when the biological system studied does not make it possible to measure significant variations of the TR-FRET signal. This protocol has been implemented in Examples 3.2, 5.3 and 6.3.
  • a second possibility, in the case of working on a tissue extract which is subjected to sonication treatment, is to put the tissue in contact with the fluorescent compounds after performing the sonication of the sample, according to the steps following:
  • This implementation does not include a washing step and the luminescence measurements will be less sensitive than that of the first implementation. On the other hand, it is easier to implement since it involves only a limited number of steps. Moreover and as indicated above and in the experimental part, the inventors have verified that a moderate sonication does not disturb the antigen-antibody bonds possibly present in the measuring medium (in particular when the fluorescent compounds donors and / or acceptors are conjugated to antibodies).
  • a third possibility, in the case where one works on isolated cells derived from a cell culture, is the sequence of following steps:
  • This implementation does not require sonication insofar as the cells are homogeneously distributed in the measuring medium, but requires the use of a labeling agent which is not rejected by living cells, such as the Hoechst 33342.
  • a fourth possibility is the following sequence of steps:
  • Kits for carrying out the method according to which the luminescence of the marking agent is measured at the same wavelength as that used to measure the luminescence of the long-lived fluorescent compound comprise a set of reagents, of which :
  • a fluorescent labeling agent whose absorption spectrum allows its excitation at the same wavelength as that used to excite the long-lived fluorescent compound, and the emission spectrum makes it possible to measure its luminescence at the same wavelength as that used to measure the luminescence of the long-lived fluorescent compound;
  • an acceptor fluorescent compound whose absorption spectrum is compatible with the emission spectrum of the long-lived fluorescent compound, the long-lived fluorescent compound and the acceptor fluorescent compound being FRET partners.
  • a preferred reagent kit is a kit in which:
  • the long-lived fluorescent compound is chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate;
  • kits for carrying out the method according to which the luminescence of the marking agent is measured at the same wavelength as that used to measure the luminescence of the acceptor fluorescent compound comprise a set of reagents, including: a fluorescent compound long life;
  • an acceptor fluorescent compound whose absorption spectrum is compatible with the emission spectrum of the long-lived fluorescent compound, the long-lived fluorescent compound and the acceptor fluorescent compound being FRET partners;
  • kits in which:
  • the long-lived fluorescent compound is chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate
  • the fluorescent marking agent has an absorption spectrum allowing its excitation between 330 and 350 nm and an emission spectrum allowing the measurement of its luminescence at the same wavelength as that used to measure the luminescence of the fluorescent acceptor compound .
  • the fluorescent labeling agent is chosen from the following compounds: a fluorescent intercalating agent, a fluorescent protein, a fluorescent marker compound of the mitochondria, a fluorescent compound that binds to the amino functions of the proteins, a fluorescent compound that accumulates in the lipid membranes.
  • marking agents suitable for use according to the invention are: Hoechst compound 33258; Hoechst compound 33342; Hoechst compound 34580; DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole); green fluorescent protein (GFP), Mitotracker Orange, Mitotracker Green, rhodamine 123, dansyl chloride, nitrobenzoxadiazole, filipine.
  • Example 1 Obtaining cryosections of tumor tissue
  • the method according to the invention was implemented on cryosections obtained from mouse tumors, induced by xenografting of NIH-3T3 cells overexpressing either the HER1 receptor (EGFR) or the HER2 receptor (ErbB2), or at the times HER1 and HER2. These cells were obtained by transduction using a retroviral vector carrying the nucleic sequence coding for the proteins in question. This material is a model similar to a biopsy of human tumor tissue.
  • the EGFR sequence was extracted from the pCMV-XL4-EGFR vector (Origene-CliniSciences, Montrouge, France) by cleavage using the NotI restriction enzyme (associated with the enzyme Pvu I to cut the vector into fragments of different size from that of the sequence of interest) (Fermentas, Saint-Rémy-lès-Chevreuse, France).
  • the sequence of interest was treated with T4 DNA polymerase (Roche Diagnostics, Meylan, France) to obtain free ends and then inserted into the MSCV retroviral vector (Clontech-Ozyme) containing the puromycin resistance sequence.
  • the colonies obtained were then placed in liquid LB medium to make mini-preparations of plasmids using the kit Nucleo Spin Plasmid Quick Pure (Machery-Nagel). The direction of insertion of the insert into the vector was verified by restriction analysis using the enzyme Bgl II (Fermentas).
  • the HER2 sequence was extracted from the pCMV-XL4-HER2 vector (Origene-CliniSciences, Montrouge, France) and then inserted into the plasmid of the MSCV retroviral vector. (Clontech - Ozyme) containing the hygromycin resistance sequence (pMSCV-hygro).
  • plasmids pMSCV-puro-HER1 and pMSCV-hygro-HER2 were sent to sequence for verification of the absence of mutations in the HERI or HER2 coding sequence at Millegen (Labege, France).
  • the pMSCV-puro-HER1 or pMSCV-hygro-HER2 vectors were transfected into an AmphoPack-293 packaging line (Clontech) for 24 hours, allowing the multiplication of the modified virus to produce encapsidated virus particles. The supernatant containing the viral particles was collected, centrifuged and filtered on a 0.45 ⁇ m filter.
  • the NIH / 3T3 cells were cultured (2x10 6 cells in a 150-mm dish) for 8 h, then exposed for 16 h in the presence of a quarter of the volume of virus-containing supernatant in DMEM medium containing 10% of serum fetal calf and polybrene (8 ⁇ g ml, Sigma-Aldrich). After 24 hours the cells were washed and then selected by adding the antibiotic (400 ⁇ g / ml of hygromycin or 10 ⁇ g / ml of puromycin as appropriate) and incubation for two days.
  • the antibiotic 400 ⁇ g / ml of hygromycin or 10 ⁇ g / ml of puromycin as appropriate
  • cells (5 x 10 6 ) overexpressing either HER1 or HER2 or both HER1 and HER2 were administered by subcutaneous injection to athymic female mice on their right flank.
  • the lines, as well as the corresponding xenografts, expressing only HER1 will be called R1
  • the lines (and xenografts) expressing only HER2 will be referred to as R2
  • the lines (and xenografts) expressing both HER1 and HER2 will be referred to as R1 R2.
  • Mice bearing tumors were sacrificed when the tumors reached a volume greater than 1500 mm 3 . Preparation of cryosections of xenografts
  • the tumor was excised, the surgical piece thus obtained was frozen immediately by immersing it in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C.
  • the metal sample holder of a cryotome was placed on dry ice for 1 min. A few drops of sterile water were then placed on the support and then, without delay, the surgical piece was removed. By freezing, the water fixed the sample on the support.
  • the sample can be included in an OCT gel (Optimal Cutting Temperature Compound) instead of sterile water. Then the frozen sample was cut to the desired thickness with the microtome contained in the cryostat (-25 ° C) and the sections still frozen (cryosections) were collected in eppendorf tubes previously cooled in dry ice.
  • the thickness of the cryosections was generally between 10 m and 50 pm. For the applications below, a thickness of 50 ⁇ was considered optimum in terms of handling convenience.
  • Example 2 Measurement of the Emitting Signal of an Intercalating Agent for Measuring the Quantity of Cells in a Section of a Tissue of Tumor Cells
  • Hoechst 33342 InVitroGen # H 1399 in solution 2 mg / ml DMSO
  • the pellet formed by the cryosection was finally taken up in 300 ⁇ l of PBS buffer containing 0 ⁇ l. 1% BSA (bovine serum albumin) and a protease inhibitor ("complete mini" Roche # 1, 1 tablet / 10 ml).
  • BSA bovine serum albumin
  • protease inhibitor Complete mini
  • the tube was held in ice and sonicated (5s at 20% power with a Branson 450 sonifier with a micro tip probe). 5 ⁇ , 20 ⁇ and 100 ⁇ of the homogeneous suspension obtained were then deposited in wells of a microplate (Costar # 3694 96 "well half area flat bottom black polystyren"), and supplemented at 100 ⁇ by the same buffer as that used for the sonication step described below.
  • the microplate was then placed in a TECAN Saphir2 fluorometer. After excitation of the wells at 340 nm, the fluorescence of the intercalant Hoechst 33342 was measured at the three wavelengths 490 nm, 545 nm and 590 nm (H490, H545 and H590), corresponding to the main emission peaks of terbium , the 490 nm wavelength also corresponding to one of the emission peaks of europium. Fluorescence was measured here in continuous fluorescence mode, that is to say immediately after excitation, and during the shortest time allowed by the apparatus (20 ⁇ s). The results are shown in Table 2.
  • the FRP5 antibody (supplied by the Jardin Cancer Research Institute, IRCM) (150 ⁇ l at 1.2 mg / ml) was desalted on a NAP5 (G25) column equilibrated in 50 mM phosphate buffer pH8. The excluded fraction was collected as an eluate of 400 ⁇ l to 0.45 mg / ml (ie 1.2 nmol) in pH8 phosphate buffer. To this fraction were added 12 nmol (ie 10 eq.) Of Lumi4Tb-NHS (terbium cryptate, Cisbio Bioassays) in solution in 1, 4 ⁇ l of DMSO.
  • Lumi4Tb-NHS terbium cryptate, Cisbio Bioassays
  • the labeled antibody was purified on a NAP5 (G25) column equilibrated in 100 mM phosphate buffer pH7. The excluded fraction (400 ⁇ l) is collected and the antibody FRP5 labeled at a level of 5.3 cryptates per antibody is thus obtained. The solution was frozen in the presence of 0.1% BSA until use.
  • Example 1 An R1 R2 cryosection prepared in Example 1 was placed in an eppendorf tube in 180 ⁇ l of pH7 PBS buffer containing 4% BSA ("protease free” quality) and a protease inhibitor (Roche 1 tablet / 10 ml).
  • the FRP5-Lumi4Tb antibody prepared in Example 3.1 was added so as to obtain a final antibody concentration of 50 nM in the eppendorf tube.
  • 20 ⁇ l of a solution of Hoechst 33342 InVitroGen # H1399 in solution 2 mg / ml DMSO prediluted 1/100 in pH7 buffer was added.
  • the tube was centrifuged and washed with 3 times 400 ⁇ l of PBS buffer + 0.05% Tween® 20.
  • the pellet formed by the cryosection was taken up in 300 ⁇ l of PBS buffer containing 0.1% BSA and a protease inhibitor ("complete mini" Roche # 1 tablet / 10 ml).
  • the tube was held in ice and sonicated (5s at 20% power with a Branson 450 sonifier with a micro tip probe).
  • the plate was then placed on a TECAN Saphir2 apparatus with flash lamp excitation and a 337 nm excitation filter.
  • TRF Time-resolved fluorescence
  • TRF490 represents the signal measurement of terbium cryptate in time resolved at 490 nm
  • H490 represents the signal measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence at 490 nm
  • normalized TRF490 represents the ratio TRF 490 on H490 assigned a suitable multiplier (in this example x 1000) to have an integer of the same order of magnitude as the raw fluorescence levels measured.
  • TRF490 value increases proportionally to the volume of cell suspension added to the wells whereas the normalized TRF 490 value is globally constant - on average 14 800 ufa (arbitrary fluorescence unit) - and represents a measure of the level of expression.
  • a normalized TRF 490 value is observed here, the average of which is 180 ufa for this negative control, which represents a signal-to-noise ratio of the order of 80.
  • a cryosection R1 R2 prepared in Example 1 was treated as in Example 3.2.
  • the signal was read in continuous fluorescence mode at 545 nm and in 545 nm TRF mode on a TECAN Saphir2 apparatus with flash lamp excitation whose monochromator was set at 340 nm (20 nm bandwidth) at excitation and at 545 nm (bandwidth 10 nm) for emission.
  • the time-resolved measurement was carried out after a delay of 100 ⁇ s following the excitation and during an integration time of 500 ⁇ s; that in continuous fluorescence was performed without delay and during the minimum possible integration time on the device (20 ps).
  • TRF545 represents the measurement of the resolved time terbium signal at 545 nm
  • H545 represents the measurement of the signal of Hoechst 33342 in continuous fluorescence at 545 nm
  • normalized TRF545 represents the ratio TRF 545 on H545 assigned a suitable multiplier (in this example x 10000) to have an integer of the same order of magnitude as the raw fluorescence levels measured.
  • Table 5
  • the H545 value is proportional to the volume of cell suspension added. It is also observed that the TRF545 value increases proportionally to the volume of cell suspension added to the wells whereas the standardized TRF 545 value is globally constant, on average 1250 ufa and represents a measure of the level of expression of the HER2 receptor expressed by the R1 cells R2.
  • This example demonstrates that the method according to the invention makes it possible to normalize the signal emitted by a terbium cryptate by the quantity of cells present in the medium, and this by measuring the fluorescence emitted by this cryptate and the Hoechst 33342 at the same length. wave (545 nm), but in different time windows.
  • Measurement of HER2 expression ErbB2 by measurement of resolved terbium emission time fluorescence at 590 nm and fluorescence normalization of an intercalant measured at 590 nm in continuous fluorescence mode
  • Example 3.3 was reproduced but this time the luminescence of terbium cryptate and Hoechst 33342 was measured at 590 nm. The values obtained are presented in Table 6, in which:
  • TRF590 represents the measurement of the terbium signal in time resolved at 590 nm
  • H590 represents the signal measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence at 590 nm
  • normalized TRF590 represents the ratio TRF 590 on H590 assigned a suitable multiplier (in this example x 1000) to have an integer of the same order of magnitude as the raw fluorescence levels measured.
  • the TRF590 value increases proportionally to the volume of cell suspension added to the wells whereas the normalized TRF 590 value is globally constant, on average 1450 ufa and represents a measurement of the level of expression of the HER2 receptor expressed by the cells.
  • R1 R2. This example demonstrates that the method according to the invention makes it possible to normalize the signal emitted by a terbium cryptate by the quantity of cells present in the medium, and this by measuring the fluorescence emitted by this cryptate and the Hoechst 33342 at the same length. wave (590 nm), but in different time windows.
  • Example 4 Normalization of the europium emission signal allowing the measurement of the expression of a receptor in a section of a tumor cell tissue
  • this solution was purified on a NAP5 (G25) column equilibrated in 100 mM phosphate buffer pH7. The excluded fraction (300 ⁇ l) was collected to obtain a solution containing the antibody FRP5-TBPEu labeled at a level of 3.4 cryptates per antibody. This solution was frozen in the presence of 0.1% BSA until it was used.
  • Example 3.2 was reproduced with the antibody prepared in Example 4.1.
  • the fluorescence is measured at the wavelength of 585 nm using a Rubystar fluorimeter (BMG), provided with excitation at 337 nm by a nitrogen laser.
  • BMG Rubystar fluorimeter
  • the time-resolved measurement corresponding to the signal of the Europium cryptate, was carried out after a delay of 100 ⁇ s following the excitation and during an integration time of 400 ⁇ s.
  • the measurement of the Hoechst 33342 signal in continuous fluorescence is carried out without delay after excitation and during the minimum possible integration time on the device (10 ⁇ s).
  • TRF585 represents the measurement of the resolved time europium cryptate signal at 585 nm
  • H585 represents the signal measurement of the Hoechst 33342 in continuous fluorescence at 585 nm
  • the normalized TRF585 represents the ratio TRF 585 over H585 with a multiplying coefficient adequate (in this example x 200) to have an integer of the same order of magnitude as the measured raw fluorescence levels.
  • TRF585 value increases proportionally to the volume of cell suspension added to the wells while the normalized TRF 585 value is globally constant, on average 13 ufa and represents a measure of the level of expression of the HER2 receptor expressed by the R1 cells. R2.
  • An anti-HER1 REGF01 antibody (Cisbio Bioassays) (92 ⁇ at 5.4 mg / ml) was desalted on a NAP5 (G25) column equilibrated in 50 mM phosphate buffer pH8. The excluded fraction was collected as an eluate of 400 ⁇ at 1 mg / ml (ie 3 nmol) in pH8 phosphate buffer. To this fraction were added 20 nmol (ie 7 eq.) Of Lumi4Tb-NHS (terbium cryptate, Cisbio Bioassays) in solution in 2.3 ⁇ l of DMSO.
  • the labeled antibody was purified on a NAP5 (G25) column equilibrated in 100 mM phosphate buffer pH7. The excluded fraction (400 ⁇ l) was collected to obtain the labeled antibody REGF01 at a level of 4.4 cryptates per antibody. The solution was frozen in the presence of 0.1% BSA until use.
  • An anti-HER1 REGF08 antibody (Cisbio Bioassays) (200 ⁇ l at 1, 6 mg / ml) was dialyzed against 50 mM phosphate buffer pH8 (overnight at 4 ° C.). After dialysis the fraction collected in pH8 phosphate buffer contains the antibody at 0.93 mg / ml. To 130 ⁇ l of this fraction (ie 0.8 nmol) were added 4 nmol (ie 5 eq.) Of activated acceptor fluorophore (d2-NHS, Cisbio Bioassays) in solution in 3 ⁇ l of DMSO.
  • d2-NHS activated acceptor fluorophore
  • a cryosecton R1 R2 prepared in Example 1 was placed in an eppendorf tube in 180 ⁇ l of PBS buffer pH7 containing 4% BSA ("protease free” quality) and a protease inhibitor (Roche 1 tablet / 10 ml).
  • the REGF01 -Lumi4Tb and REGF08-d2 antibodies prepared in Examples 5.1 and 5.2 were added so as to obtain a final concentration of 50 nM of each antibody in the tube.
  • 20 ⁇ l of a solution of Hoechst 33342 InVitroGen # H 1399 in 2mg / ml DMSO solution
  • prediluted 1/100 in pH7 buffer was added.
  • the tube was centrifuged and washed with 3 times 400 ⁇ l of PBS buffer + 0.05% Tween® 20.
  • the pellet formed by the cryosection was taken up in 300 ⁇ l of PBS buffer containing 0.1% BSA and a protease inhibitor ("complete mini" Roche # 1, tablet 1 / 10ml).
  • the tube was held in ice and sonicated (5s at 20% power with a Branson 450 sonifier with a micro tip probe).
  • 10 ⁇ , 20 ⁇ , 40 ⁇ and 100 ⁇ of the homogeneous suspension obtained were deposited in wells of a microplate (Costar # 3694 96 "well half area flat bottom black polystyrene") and supplemented to 100 ⁇ by the same buffer than that used for the sonication stage.
  • the plate was then placed on a TECAN Saphir2 apparatus provided with flash lamp excitation and a monochromator set at 340 nm (20 nm bandwidth) on excitation.
  • TRF time resolved measurements
  • TRF490 represents the measurement of the signal of terbium in time resolved at 490 nm
  • H490 represents the signal measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence at 490 nm
  • normalized TRF490 represents the ratio TRF 490 on H490 assigned a suitable multiplier (in this example x 1000) to have an integer of the same order of magnitude as the raw fluorescence levels measured.
  • Table 8
  • the TRF490 value increases proportionally to the volume of cell suspension added to the wells whereas the standardized TRF 490 value is globally constant, on average 11 180 ufa, and represents a measure of the level of expression of the HER1 receptor expressed by the R1 cells R2.
  • TRF490 represents the signal measured in time resolved at 490 nm, essentially corresponding to the emission of terbium cryptate
  • B665 represents the signal measured in time resolved at 665 nm, essentially corresponding to the residual emission of terbium cryptate at this wavelength.
  • the Delta F 665 value increases proportionally to the volume of cell suspension added to the wells whereas the normalized Delta F 665 value is globally constant, on average 3920 ufa and represents a measure of the level of expression of the expressed HER1 receptor. by R1 R2 cells and measured through the TR-FRET process. It should be noted that this measurement of the expression using two antibodies is less subject to parasitic phenomena such as possible non-specific interactions between antibodies and target proteins, the measurement being here based on a dual specificity provided by the fact of using two antibody. 5.3.4. The same plate was placed on an EnVision-type filter apparatus with flash lamp excitation and a monochromator set at 340 nm (20 nm bandwidth) on excitation.
  • TRF time resolved measurements
  • the fluorescence was measured (i) at 490 nm after a delay of 100ps after excitation, and during an integration time of 400 ps; and (ii) at 665 nm after a delay of 60 ⁇ s after excitation, and during an integration time of 400 ⁇ s.
  • fluorescence measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence the fluorescence was measured at 490 nm without delay after excitation, and during the minimum possible integration time on the apparatus (20 ⁇ s).
  • Example 5.3.2 was reproduced, but this time the luminescence of terbium cryptate and Hoechst 33342 was measured on a TECAN Saphir2 apparatus provided with a flash lamp excitation whose monochromator was set at 340 nm (band 20 nm) at excitation and the monochromator at 545 nm (10 nm bandwidth) for emission.
  • the time-resolved fluorescence was measured after a delay of 100 ⁇ s after excitation and for an integration time of 500 ⁇ s, and the fluorescence measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence was carried out without delay after excitation and during the minimum possible integration time on the device (20 ps).
  • the residual emission of terbium cryptate at 665 nm in the FRET absence (B665) was determined as in Example 5.3.2.
  • Table 12 The results obtained are shown in Table 12, in which:
  • TRF545 represents the measurement of the resolved time terbium signal at 545 nm
  • H545 represents the signal measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence at 545 nm.
  • R1 cells R2 ( ⁇ ) 10 20 40 100
  • Delta F665 1 150 3 820 6 600 23 540 TRF665 - B665
  • This example shows that the invention can be implemented by detecting the signals of terbium cryptate and the intercalating agent at 545 nm.
  • EGFR HER1 receptor expression
  • Example 5.5 was reproduced, but this time the luminescence of terbium cryptate and that of Hoechst product 33342 were measured at 590 nm. The results obtained are shown in Table 13, in which:
  • TRF590 represents the measurement of the terbium signal in time resolved at 590 nm
  • H590 represents the signal measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence at 590 nm.
  • the anti-HER2 trastuzumab antibody (trade name, "Herceptin”) was labeled with terbium cryptate Lumi4Tb, as described in Example 5.1.
  • the anti-HER1 cetuximab antibody (trade name "Erbitux”) was labeled with a FRET acceptor, the "d2", as described in Example 5.2. 6.3. Measurement of heterodimerization of HER1-HER2 receptors by TR-FRET measurement of the emission of terbium at 545 nm and the acceptor at 665 nm and fluorescence normalization of an intercalant measured at 545 nm in continuous fluorescence mode
  • the signal emitted at 665 nm results from a transfer of energy between the two labeled antibodies, when they bind to a HER1-HER2 dimer.
  • the pellet formed by the cryosection was taken up in 300 ⁇ l of PBS buffer containing 0.1% BSA and a protease inhibitor ("complete mini" Roche # 1, tablet 1/10 ml). The tube was held in ice and sonicated (5s at 20% power with a Branson 450 sonifier with a micro tip probe). 100 ⁇ l of the homogeneous suspension obtained were deposited (doublet) in wells of a microplate (Costar # 3694 96 "well half area flat bottom black polystyrene").
  • the plate was then placed on a TECAN Infinité F500 apparatus with flash lamp excitation and a 340 nm filter (20 nm bandwidth) on excitation.
  • Continuous fluorescence was read with 544 nm filter (25 nm bandwidth) and 544 nm (25 nm bandwidth) TRF mode (considering bandwidth, equivalent to 545 nm measurement) and 665 nm (bandwidth 5 nm).
  • the time-resolved measurement was carried out after a delay of 100 ss following the excitation and during an integration time of 400 ⁇ , and the fluorescence measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence was carried out without delay after the excitation and during the minimum possible integration time on the device (20 ps).
  • the TRF signal 545 is representative of the binding of the anti-HER2 antibody (trastuzumab-Lumi4Tb), and therefore of the expression of the R2 receptor.
  • the normalization of this signal by the method according to the invention makes it possible to compare the expression levels of HER2 in different samples: thus, the normalized TRF545 signal appears equivalent in the samples R1 R2 and R2, whereas it was 3 times more important in the sample R2 than in the sample R1 R2 before normalization (TRF545).
  • the normalized Delta F665 signal is representative of the presence of heterodimers between HER1 and HER2 receptors: normalized delta F665 values confirm the presence of heterodimers in sample R1 R2 and their absence in samples R1 and R2. 6.4. Measurement of heterodimerization of HER1-HER2 receptors by TR-FRET measurement of the emission of terbium at 490 nm and the acceptor at 665 nm and fluorescence standardization of an intercalant measured at 490 nm in continuous fluorescence mode
  • the fluorescence was measured (i) at 490 nm after a delay of 100ps after excitation, and during an integration time of 400 ps; and (ii) at 665 nm after a delay of 100 ⁇ s following excitation, and during an integration time of 400 ⁇ s.
  • TRF time resolved measurements
  • the fluorescence was measured (i) at 490 nm after a delay of 100ps after excitation, and during an integration time of 400 ps; and (ii) at 665 nm after a delay of 100 ⁇ s following excitation, and during an integration time of 400 ⁇ s.
  • fluorescence measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence the fluorescence was measured at 490 nm without delay after excitation, and during the minimum possible integration time on the apparatus (20 ⁇ s).
  • the protocol used varies from that of the preceding examples: it comprises the following steps: bringing the intercalating agent into contact with cells or a tissue sample, washing, sonication, transfer in microplate, addition to the measurement medium fluorescent compounds (donor, acceptor), Reading the microplate with a fluorimeter (donor signal, acceptor signal, intercalating agent signal).
  • the pellet formed by the cryosection was taken up in 300 ⁇ l of PBS buffer containing 0.1% of BSA and a protease inhibitor ("complete mini" Roche # 1, tablet 1/10 ml).
  • the tube was held in ice and sonicated (5 sec at 20% power with a Branson 450 sonicator equipped with a "micro tip” probe) and the homogenate obtained was diluted three times.
  • 20 ⁇ , 40 ⁇ and 80 ⁇ of this suspension were deposited (in doublet) in wells of a microplate (Costar # 3694 96 "well half-area flat bottom black polystyrene") and supplemented with buffer so as to obtain a total volume of 80 ⁇ per well (named respectively H20, H40 and H80).
  • Wells B20, B40 and B80 were prepared according to the same procedure but omitting Hoechst 33342, to constitute a "white" signal.
  • cetuximab-Lumi4Tb anti-HER1 antibody labeled at a level of 7.5 teritium cryptates Lumi4Tb antibody according to the protocol described in Example 5.1
  • Ab10-d2 antibody Anti-HER1 Ab10 ThermoFisher antibody labeled at a level of 2.1 acceptors of FRET "d2" by antibody according to a protocol described in Example 5.2
  • the fluorescence of the Hoechst 33342 compound was then measured with a 490 nm (10 nm) emission filter and a 337 nm (20 nm) excitation filter on a Pherastar FS apparatus, equipped with a flash lamp, using "Advanced TRF" mode and a 5ps delay.
  • the data are retrieved by calculating the fluorescence intensities measured at 490 nm corresponding to 30-45 ps time windows (signal H490) and by summing the figures obtained in each interval. Elemental 5 ps.
  • the antibody REGF01 (33 ⁇ l at 3 mg / ml in PBS, ie 100, was diluted with 66 ⁇ l of 0.1 M carbonate buffer pH 8.5 and 6 ⁇ l of a solution of Alexa-488 (InVitroGen) 1, 2 mM in DMSO were added After one hour of incubation at room temperature the reaction mixture was purified on a NAP-5 column equilibrated in 100mM phosphate buffer pH 7. A UV spectrum of the excluded fraction (300 ⁇ l) shows that the antibody is labeled at a level of 2 molecules of Alexa-488 per molecule of antibody.
  • Example 1 An R1 R2 cryosection prepared in Example 1 was placed in an eppendorf tube in 360 ⁇ l of PBS buffer pH7 containing 0.1% BSA ("protease free” quality) and a protease inhibitor (Roche 1 tablet / 10 ml ) and 40 ⁇ l of a solution of Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 in 2mg / ml DMSO solution) prediluted to 1/100 in pH7 buffer were added. After 10 min of incubation in the dark, the tube was centrifuged and washed with 3 times 400 ⁇ l of PBS buffer + 0.1% BSA.
  • BSA protease inhibitor
  • the pellet formed by the cryosection was taken up in 300 ⁇ l of PBS buffer containing 0.1% BSA and a protease inhibitor ("complete mini" Roche # 1, tablet 1/10 ml).
  • the tube was held in ice and sonicated (5s at 20% power with a Branson 450 sonifier with a micro tip probe).
  • 10 ⁇ , 20 ⁇ and 40 ⁇ of the homogeneous suspension obtained were deposited in wells of a microplate (Costar # 3694 96 "well half area flat bottom polystyrene") and then supplemented to 80 ⁇ by the same buffer as used for the sonification step and was deposited in several wells 80 ⁇ of the same buffer to form "buffer blanks (BT).
  • BT buffer blanks
  • the antibodies REGF08-Lumi4Tb and REGF01 -Alexa488 prepared according to Examples 5.1 and 8.1 were added so as to obtain a final concentration of 1 nM of the antibody REGF08-Lumi4Tb and 2nM of the antibody REGF01-Alexa488 in the wells, 20 ⁇ l of the antibody mixture was also added to 80 ⁇ l of buffer to obtain a "reagent blank" (BR) (here a single concentration of antibody was used to calculate the contribution to 520 nm of the donor in the well "test").
  • BR "reagent blank"
  • the plate was then placed on a PHERAstar FS apparatus with flash lamp excitation and a monochromator set at 340 nm (20 nm) on excitation.
  • TRF time resolved measurements
  • the fluorescence was measured at 490 nm after a delay of 60 ⁇ following the excitation, and during an integration time of 400 ⁇ ;
  • the fluorescence was measured at 490 nm without delay after excitation using the protocol "Fluorescence" provided in the software of the device.
  • ⁇ of cell suspension 0 10 20 40
  • the fluorescence was measured at 520 nm using the same plate on the same PHERAstar FS device without delay after excitation using the "Fluorescence" protocol provided in the device software. It is observed that the fluorescence intensity measured at 520 nm in continuous mode is also proportional to the amount of cell suspension deposited in the wells.
  • the fluorescence measurement of the Hoechst-DNA complex can be measured indifferently to the wavelength provided for the fluorescence measurement of the donor or the acceptor.
  • EXAMPLE 9 Measurement of HER1 Receptor Expression (EGFR) by Measurement of TR-FRET of Terbium Emission at 490 nm and of a Terbium Compatible FRET Acceptor and Fluorescence Normalization of a Fluorescent Protein (GFP) measured at 490 nm, 545 nm or 590 nm in continuous fluorescence mode
  • HEK cells (HEK ATCC background) were transfected in the presence of Lipofectamine 2000 using a plasmid encoding the HER1 receptor (EGFR), this plasmid comprising also a Geneticin resistance gene. After transfection the cells were screened by adding Geneticin (0.6 mg / ml) to the culture medium to select the resistant cell population that stably integrated the plasmid. The cells (polyclonal population) thus obtained are named HEK-EGFR.
  • HEK-EGFR cells in flask T175 were added to the HEK-EGFR cells in flask T175 (cells at approximately 70% confluency or ⁇ 20 million cells).
  • a mixture consisting of 8 ml of optiMEM medium + 60 ⁇ l Lipofectamine 2000 + 20 ⁇ g of plasmid pmaxGFP (positive control of Amaxa Nucleofection kit) previously incubated for 20 min at room temperature, then 12 ml of complete medium + Geneticin 0.6 mg / ml were added to the cells.
  • PBS Cell Dissociation Buffer
  • Buffer blanks are also made by adding 100 ⁇ of Krebs buffer to adjacent wells.
  • the fluorescence emission spectra (continuous mode) of the wells of a plate comprising series of wells respectively containing 25K, 50K and 200K cells were recorded on a TECAN Saphir 2 apparatus with the following parameters using the preferred wavelength.
  • Wild type GFP wild type: wGFP
  • the spectrum obtained shows a maximum emission towards 500 nm (FIG. 2).
  • the fluorescence emission spectra (continuous mode) of the wells of the same plate were recorded on the TECAN Saphir 2 apparatus with the following parameters using a 340 nm excitation wavelength usually used for excitation. lanthanide complexes without changing the other parameters:
  • the spectrum obtained shows a maximum emission towards 500 nm whose intensity is approximately half that observed while exciting at 395 nm (FIG. 3).
  • the GFP can be excited at the wavelength of 340 nm instead of the wavelength of 395 nm usually used.
  • the fluorescence can be measured preferentially at 490 nm and at 545 nm, it is also possible at 590 nm but it is necessary in this case, and with the cells used in this example, a minimum of 50K cells to have a signal ratio / correct noise.
  • the correlation coefficient corresponding to a linear regression indicates a better linearity for the conditions corresponding to an excitation at 340 nm and more particularly for the measurement using the torque [Ex 340 nm; Em 490 nm] corresponding to the excitation conditions used for intensity measurements on terbium complexes. 9.3.
  • the "reagent blank” makes it possible to calculate the contribution of terbium in the "acceptor" channel 520 nm and to be able to calculate the fluorescence variation at 520 nm from the FRET and thus to be able to measure the expression of the EGFR receptor.
  • the measurement in continuous fluorescence mode gives the following values, the emission variation of the acceptor at 520 nm is calculated as in Example 8 by calculating the contribution of the emission of terbium in the 520 nm channel (B520) in using well calibrators containing only labeled antibodies in buffer.
  • Delta 520 E520 - B520 This value represents the FRET signal corresponding to the measurement of EGFR receptor expression.
  • the value Delta 520N (Delta 520 / F 490) x 10,000 corresponds to the value of the normalized EGFR receptor expression of the F490c fluorescence measurement (GFP signal).
  • the plate was read on a PHERAstar FS apparatus with flash lamp excitation in fluorescence mode with a 340 nm excitation filter and 490 and 520 emission filters. cells 25K 50K 200K
  • the fluorescence of the GFP could therefore be measured either at the wavelength of one of the terbium emission lines (490 nm) or at the emission wavelength of the acceptor (520 nm) ( itself excited by FRET from terbium). In both cases the fluorescence emission is proportional to the number of cells (amount of biological material).
  • Optical module 337, 520, 490
  • the Delta 520 signal measured in time resolved mode increases proportionally to the number of cells contained in each well, but that the Delta 520N represents the expression of the receptor (normalized by the fluorescence measurement measured at 490 nm in continuous fluorescence mode ) is constant, averaging 2,040 ufa.
  • the fluorescence of a protein such as GFP it is possible to use the fluorescence of a protein such as GFP to normalize an TR-FRET signal.
  • Polyclonal cells stably expressing EGFR were used. About 2,000 K cells (2 x 10 6 cells) suspended in 1 ml of Krebs buffer in a 1.5 ml eppendorf were centrifuged for 10 min at a relative centrifugal force (RCF) of 8,000 and then washed 3x300 times. ⁇ of 0.1 M NaHCO 3 buffer pH 9 and then resuspended in 150 ⁇ l of NaHCO 3 buffer. A solution of 5 mM dansyl chloride in a mixture (3/2) of dioxane and 0.1 M NaHCO 3 buffer was prepared, then 3 ⁇ l of this was added. solution to the cell suspension.
  • RCF relative centrifugal force
  • the tube was centrifuged for 10 min at an RCF of 8,000, the supernatant removed, then the pellet was resuspended in 300 ⁇ l of carbonate buffer and then centrifuged for 10 min; this operation was repeated once more with 300 ⁇ l of carbonate buffer and then once with 300 ⁇ l of PBS.
  • the pellet was resuspended in 500 ⁇ l of PBS buffer containing 0.2% BSA and a protease inhibitor (Roche 1 tablet / 10 ml).
  • the tube is cooled in ice and sonicated (5s at 20% power) and the suspension is deposited in the wells of a microplate 10, 20, 40 and 80 ⁇ by completing 80 ⁇ with the same buffer.
  • Fluorescence (continuous mode) was also measured at fixed wavelengths corresponding to emission lines of terbium or europium (490 nm, 545 nm, 590 nm, 620 nm) and at 520 nm corresponding to the emission wavelength of an acceptor such as Alexa-488 or fluorescein using the following parameters:
  • the fluorescence is proportional to the amount of biological material, labeled with dansyl chloride, present in the wells.
  • the labeled anti-REGF antibodies REGF08-Lumi4Tb and REGF01-d2 prepared according to Example 5.1 were added. , so as to obtain a final concentration in the wells of 2.7 nM (REGF08-Lumi4Tb) and 7.3 nM (REGF01-d2) respectively.
  • Delta 665 normalized by the fluorescence measurement at 490 nm represents the expression of the receptor. This average value of 750 ufa is independent of the amount of cellular material.
  • the two methods can therefore be used satisfactorily to estimate the amount of biological material present in a sample, but the standardization according to the invention has the additional advantage of not being destructive of the sample, whereas the Quantipro® kit requires the destruction of one third of this sample.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, c) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue, d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, e) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape d), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 ps, cette luminescence correspondant principalement à celle du composé fluorescent à durée de vie longue, f) calcul d'un signal de luminescence normalisé correspondant au ratio : (signal obtenu à l'étape e) / (signal obtenu à l'étape d).

Description

PROCEDE DE NORMALISATION DE LA LUMINESCENCE
EMISE PAR UN MILIEU DE MESURE
Objet de l'invention
L'invention est relative à un procédé amélioré de normalisation de la luminescence émise par un milieu de mesure par rapport à la quantité de cellules contenues dans ce milieu. L'invention concerne également une trousse de réactifs destinée à la mise en œuvre de ce procédé.
Etat de la technique
Les composés fluorescents constituent un outil de choix pour la recherche en biologie dans la mesure où ils permettent, en combinaison avec les équipements capables de détecter leur luminescence, de visualiser les processus biologiques au niveau cellulaire, voire moléculaire, par microscopie ou bien par simple mesure de leur luminescence à l'aide d'un fluorimètre. Ces composés peuvent être utilisés tels quels pour colorer certains compartiments des cellules ou des tissus, ou bien être conjugués à des vecteurs qui vont les transporter vers un site spécifique. De tels vecteurs peuvent être par exemple des anticorps spécifiques d'un composant cellulaire (tel qu'une protéine) que l'on souhaite marquer par un composé fluorescent, ou bien tout composé qui présente une spécificité pour un compartiment ou un composant cellulaire.
Le phénomène de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Fluorescence Résonance Energy transfer ») est largement utilisé en biologie, notamment pour étudier des interactions moléculaires. Il est basé sur l'utilisation d'un composé donneur fluorescent (par exemple un complexe ou un cryptate de terre rare) et d'un composé accepteur éventuellement fluorescent, chacun de ces composés étant couplé à une molécule biologique. Lorsqu'un phénomène biologique provoque le rapprochement de ces molécules, et que le composé donneur est excité, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur et va résulter en une variation de la luminescence émise par le milieu réactionnel, notamment une augmentation du signal émis par le composé accepteur et une diminution de la luminescence du donneur. Cette luminescence peut être mesurée par un fluorimètre réglé aux longueurs d'onde d'émission des composés fluorescents, et le signal de FRET ainsi obtenu, le plus souvent constitué du ratio du signal de l'accepteur sur celui du donneur, permet ainsi de suivre l'évolution du phénomène observé. La mise en œuvre de cette technique avec des chélates ou des cryptâtes de terres rares, développée notamment par G. Mathis et al. (« Homogeneous time resolved fluorescence ernergy transfer using rare earth cryptâtes as a tool for probing molecular interactions in biology », Spectroc imica Acta Part A 57 (2001) 2197-2211) présente de nombreux avantages qui ont déjà permis plusieurs applications dans le domaine du diagnostic in vitro et dans celui du criblage à haut débit dans l'industrie pharmaceutique. Plusieurs sociétés commercialisent des réactifs permettant la mise en œuvre de cette approche pour étudier des processus biologiques ; par exemple la Demanderesse fournit différents réactifs, dont des cryptâtes de terre rare, pour l'étude de phénomènes biologiques particuliers (détection d'activité enzymatique, dosage de seconds messagers etc.).
Les chélates ou cryptâtes de terre rare fluorescents, en particulier les cryptâtes ou chélates d'europium ou de terbium, ont une durée de vie de l'ordre de la milliseconde qui autorise la mesure du signal de FRET émis par le milieu de mesure après un délai suivant l'excitation du composé donneur. Cette technique de mesure de FRET en temps résolu (TR-FRET, pour « Time Resolved FRET ») permet de s'affranchir de la luminescence parasite émise par le milieu de mesure immédiatement après son excitation et est donc particulièrement avantageuse lorsque le milieu de mesure comprend du matériel biologique riche en composés, notamment protéiques, susceptibles de produire ce genre d'interférence.
Si la technique de TR-FRET a longtemps été mise en œuvre sur des systèmes biologiques relativement bien contrôlés, tels qu'une enzyme donnée et son substrat, deux protéines interagissant l'une avec l'autre, ou encore le dosage d'un analyte dans du plasma ou du sérum sanguin, elle a récemment été appliquée à des environnements beaucoup plus complexes, et notamment des cellules, des lysats cellulaires ou des explants tissulaires. Un des problèmes des tests in vitro pratiqués sur ce type de matériel réside dans la difficulté de contrôler le nombre de cellules présentes dans le milieu de mesure, rendant la comparaison des résultats obtenus dans différent tests d'autant plus difficile. Ce problème technique est particulièrement critique lorsque l'on souhaite appliquer la technique de TR-FRET à l'analyse clinique d'échantillons de tissus caractérisés par une grande disparité en contenu cellulaire.
Des techniques d'évaluation ou bien de normalisation par rapport à la quantité de cellules présentes dans le milieu de mesure sont disponibles : il est tout d'abord possible d'introduire dans le milieu de mesure un nombre connu de cellules par distribution d'une suspension homogène de cellules. Des techniques de dénombrement des cellules sont également utilisées, mais elles sont relativement fastidieuses et peu adaptées à l'analyse d'un grand nombre d'échantillon (microscopie, FACS). Une autre approche consiste à évaluer la quantité de certaines protéines « ubiquitaires », dont la présence reflète indirectement la quantité de cellules présentes dans le milieu de mesure (GAPDH, actine). Enfin, des méthodes basées sur l'utilisation d'agents fluorescents s'intercalant dans l'ADN sont également utilisées : ces agents ont la particularité d'être luminescents à des longueurs d'onde différentes selon qu'ils sont complexés ou non avec l'ADN; le calcul du ratio des signaux mesurés à ces deux longueurs d'onde permet d'évaluer la quantité d'ADN présent dans le milieu. Des exemples de tels agents intercalant sont les produits Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 ou DAPI.
Jensen et al (J Biomol Screen. 2010 Oct. 15(9):1071-81) ont par exemple décrit une technique d'étude des potentiels membranaires des mitochondries basée sur l'utilisation de composés fluorescents (DASPEI et TMRM), et incluant une normalisation de la fluorescence de ces composés par celle du produit Hoechst 33258. Les auteurs ont néanmoins dû utiliser pas moins de 6 filtres différents pour exciter et mesurer l'émission des 3 composés fluorescents.
Il n'existe aujourd'hui aucun moyen satisfaisant d'étudier des phénomènes biologiques par !a technique de TR-FRET sur des extraits de tissu, en raison des quantités variables de cellules d'un milieu de mesure à l'autre. Les techniques disponibles sont fastidieuses, introduisent des risques d'erreur et ne sont pas adaptées à l'analyse rapide de plusieurs dizaines ou centaines d'échantillons. II serait donc particulièrement avantageux de pouvoir mesurer par TR-FRET la luminescence émise par un milieu contenant une quantité indéterminée de cellules, et de pouvoir calculer un signal de TR-FRET tenant compte de ce paramètre variable.
Description de l'invention
Les inventeurs ont mis au point un procédé de mesure de la luminescence émise par un milieu de mesure contenant des cellules, dans lequel le signal de luminescence est normalisé, c'est-à- dire qu'il tient compte du nombre de cellules dans le milieu de mesure.
Sous son aspect général, le procédé de l'invention consiste à utiliser un agent de marquage des cellules permettant la correction du signal de luminescence pour tenir compte de la quantité de cellules présentes dans ledit milieu.
L'agent de marquage des cellules peut être
- un agent intercalant capable de marquer les cellules au niveau de l'ADN, ou bien
- un agent capable de marquer les cellules au niveau d'éléments structurels de la cellule dont la quantité est relativement constante d'une cellule à l'autre (par exemple : membranes lipidiques, protéines totales, organites, enzymes ubiquitaires), ou bien
- un agent capable de marquer les cellules au niveau d'une protéine que l'on fait exprimer artificiellement par la cellule (GAPDH, actine, GST...) et exprimée de manière similaire dans toutes les cellules de l'échantillon, ou bien
- une protéine exogène fluorescente exprimée de manière similaire dans toutes les cellules de l'échantillon.
Ce procédé est optimisé pour être mis en œuvre en un nombre réduit d'étapes, ce qui présente l'intérêt de limiter le risque d'erreurs et également d'envisager son utilisation dans une approche de tests de criblage à haut débit. L'invention concerne également une trousse contenant les réactifs essentiels à la mise en œuvre de ce procédé. Le procédé de l'invention consiste en un procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, c) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue,
d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue,
e) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape d), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 ps, cette luminescence correspondant principalement à celle du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) calcul d'un signal de luminescence normalisé correspondant au ratio : (signal obtenu à l'étape e) / (signal obtenu à l'étape d).
Dans une mise en œuvre préférée, la luminescence mesurée est celle consécutive à un phénomène de TR-FRET dans le milieu de mesure, c'est-à-dire un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur. Dans cette mise en œuvre, le composé fluorescent à durée de vie longue joue le rôle du donneur d'énergie et le procédé précédent comprend alors les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET,
c) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, d) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue, e) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) éventuellement, mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape e), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 ps,
g) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure après un délai de 20 à 200 ps après l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de
200 à 600 ps, à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur,
h) détermination d'un signal de TR-FRET normalisé comprenant le calcul du ratio : (signal obtenu à l'étape g) / [(éventuellement signal obtenu à l'étape f) X (signal obtenu à l'étape e)].
Dans cette mise en œuvre, l'étape f) est donc optionnelle : on peut se passer de la mesure de la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue.
Dans une mise en oeuvre préférée selon laquelle la luminescence mesurée est celle consécutive à un phénomène de TR-FRET dans le milieu de mesure, il est possible de mesurer la luminescence de l'agent de marquage et celle du composé fluorescent accepteur à la même longueur d'onde. Dans ce cas bien sûr, la luminescence de l'agent de marquage et celle du composé fluorescent à durée de vie longue ne sont plus mesurées à la même longueur d'onde, et le procédé est modifié de la façon suivante :
- dans l'étape c), l'agent de marquage est un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur,
- dans l'étape e), la luminescence est mesurée à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent accepteur,
- dans l'étape f) si elle est présente, la luminescence est mesurée à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue.
Dans une mise en œuvre particulière, le procédé selon l'invention comprend en outre une deuxième étape d'excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption dudit composé fluorescent à durée de vie longue, cette deuxième excitation étant effectuée immédiatement avant l'étape de mesure de la luminescence en temps résolu. Dans une autre mise en œuvre particulière et lorsque l'échantillon biologique est constitué de tissu ou de cellules intactes, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de lavage avant la première excitation, c'est à dire entre les étapes b) et c) du procédé ou les étapes c) et d) de sa mise en œuvre préférée.
Milieu de mesure, matériel biologique
Le procédé selon l'invention est mis en œuvre sur un milieu de mesure contenant un échantillon biologique. Par « échantillon biologique », on entend un échantillon de tissu (en particulier un échantillon de tumeur) ou bien des cellules issues d'une culture cellulaire. Un des intérêts de ce procédé réside dans le lait qu'il permet de normaliser le signal de TR-FRET par rapport à la quantité de cellules présentes dans ce milieu de mesure.
Les cellules présentes dans le milieu de mesure peuvent être des cellules isolées, par exemple des cellules obtenues par culture cellulaire. Elles peuvent être en suspension ou bien adhérer au contenant du milieu de mesure. Ces cellules peuvent également être issues d'un extrait de tissu. Dans ce cas, l'échantillon biologique est de préférence constitué de coupes histologiques, en particulier de coupes histologiques congelées. La préparation de coupes histologiques relève des connaissances générales de l'homme du métier : elles sont réalisées par exemple en utilisant un cryotome ou un ultramicrotome sur des tissus inclus dans de la paraffine ou des résines époxy. De préférence, on utilise un cryotome avec des tissus congelés non-fixés, afin d'obtenir des coupes congelées et éviter de dénaturer des protéines.
Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux lorsqu'il est mis en œuvre sur un extrait de tissu en raison de la variabilité de la quantité de matériel biologique présent dans ce cas.
Dans tous les cas, les cellules peuvent être intactes, ou encore avoir fait l'objet d'un traitement visant à homogénéiser ledit échantillon sous forme de lysat cellulaire, et cela préalablement ou postérieurement à l'introduction des composés fluorescents dans le milieu de mesure. Un tel traitement peut être mécanique, conduisant à un lysat cellulaire. Cette dernière mise en œuvre est préférée lorsque le procédé est pratiqué sur des extraits de tissu, car elle assure une plus grande fiabilité de la mesure de la luminescence émise, qui doit l'être à partir d'un milieu de mesure le plus homogène possible. Le traitement mécanique en question peut être choisi parmi : l'application d'ultrasons, des cycles de congélation / décongélation, l'utilisation de broyeurs mécaniques, éventuellement conjointement à l'utilisation de tampon de lyse hypotonique ou de tampon de lyse contenant des détergents comme le tampon RIPA. Lorsqu'un tel traitement est pratiqué, et en fonction de l'objet de l'étude de l'homme du métier, ce dernier veillera à utiliser des conditions de traitement ménagées. En particulier, si le procédé est mis en œuvre dans le cadre de l'étude de structures subcellulaires ou encore d'agrégats ou d'oligomères de protéines, un traitement mécanique trop violent pourrait dégrader ces structures ou oligomères.
Un exemple de traitement mécanique ménagé consiste à appliquer au milieu de mesure des ultrasons (sonication) à une fréquence comprise entre 19 800 à 20 500 kHz, à une puissance de 80 W et pendant une durée de 3 à 10 secondes, et de préférence pendant 4 à 6 secondes. Les échantillons sont de préférence maintenus dans un bain de glace pendant le traitement pour limiter leur échauffement. Les inventeurs ont découvert que, de manière surprenante, ce traitement ne perturbe pas significativement les liaisons antigènes-anticorps ou les oligomères de protéines, notamment les dimères présents dans le milieu de mesure.
L'homme du métier peut facilement ajuster ces paramètres de traitement chimique ou mécanique en fonction du matériel étudié.
Composés fluorescents à durée de vie longue
Une des caractéristiques essentielles de l'invention est l'utilisation de composés fluorescents à durée de vie longue. De tels composés sont connus et sont le plus souvent des complexes métalliques fluorescents, ayant une durée de vie supérieure à 1 ps, et de préférence supérieure à 100 ps. De manière générale on entend par complexe métallique fluorescent un composé constitué d'un lanthanide ou de ruthénium et d'un agent complexant polydenté, c'est-à-dire comportant au moins 2, et de préférence entre 2 et 9 hétéroatomes donneurs d'électrons, tels que N, O, S, ces atomes formant des liaisons de coordination avec le lanthanide ou le ruthénium. De manière préférée, le complexe métallique fluorescent comprend un ou plusieurs chromophores constitués de structures aromatiques ; de préférence ces structures aromatiques comprennent 1 , 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N et O, qui jouent le rôle d'atomes de coordination du lanthanide ou du ruthénium.
Un complexe métallique fluorescent approprié aux fins de l'invention doit être stable en termes d'association/dissociation de l'agent complexant et de la terre rare, et de préférence sa constante de formation (Kf) doit être supérieure à 1010 M"1.
De nombreux agents complexants ont été décrits et sont connus de l'homme du métier : on peut citer à titre d'exemples d'agents complexants les composés suivants : EDTA, DTPA, TTHA, DOTA, NTA, HDTA, DTPP, EDTP, H DTP, NTP, DOTP, D03A, DOTAGA. Des chélates et crypates de terbium et d'europium ont été décrits et plusieurs sont disponibles dans le commerce. Des exemples de composés fluorescents à durée de vie longue sont donnés dans la figure 1 , ainsi que ci-après :
• Les cryptâtes de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptâtes de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les cryptâtes de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptâtes de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptâtes d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
Figure imgf000010_0001
TrisBiPy-Eu
Figure imgf000010_0002
Py-BiPy-Eu
Figure imgf000011_0001
TrisBiPy-tetraacide-Eu
Figure imgf000011_0002
Py-BiPy-tetraacide-Eu
Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481 , US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481 , US 4 801 722, US 4 794 191 , US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer.
Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/10580.
Les cryptâtes de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables. le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
Figure imgf000012_0001
et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page.89).
Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays.
Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
Figure imgf000012_0002
Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(ll) tris(2,2'-bipyridine).
Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5,622,821.
Figure imgf000013_0001
Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of Luminescence 75: 149-169) :
Figure imgf000013_0002
Tb-W14016 De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent à durée de vie longue est un complexe métallique fluorescent, choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les cryptâtes d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodymium (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont également des complexes de terres rares appropriés aux fins de l'invention. Composés accepteurs
Dans la mise en œuvre particulière de l'invention selon laquelle la luminescence émise par le milieu de mesure résulte d'un phénomène de TR-FRET, un composé accepteur d'énergie compatible avec le composé fluorescent à durée de vie longue est introduit dans ce milieu. La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. De manière générale, pour que le FRET ait lieu, le spectre d'excitation de l'accepteur doit recouvrir au moins en partie le spectre d'émission du composé donneur, et les dipôles de transition des composés donneurs et accepteurs doivent être parallèles. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd édition 338), auquel l'homme du métier pourra se référer.
Les composés fluorescents accepteurs peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination « Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » sont commercialisés par la société Attotec ; les composés « »DY» » sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
Les protéines fluorescentes suivantes peuvent également être utilisées en tant que composé fluorescent accepteur : les protéines fluorescentes cyans (AmCyanl , Midori-lshi Cyan, mTFP1), les protéines fluorescentes vertes (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), les protéines fluorescentes jaunes (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellowl , mBanana), les protéines fluorescentes oranges et rouges (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2, mRFP1 , JRed, mCherry, mStrawberry, HcRedl , mRaspberry, HcRed-Tandem, mPlim, AQ143), les protéines fluorescentes dans le rouge lointain (mKate, m ate2, td atushka2).
Aux fins de l'invention, les dérivés de cyanines sont préférés comme composé fluorescent accepteur.
Les composés fluorescents donneurs et/ou accepteurs sont généralement chacun conjugués à un membre d'un couple de partenaires de liaison, en fonction de l'objet étudié par l'homme du métier, conformément à l'application usuelle de la technique de TR-FRET à l'étude des phénomènes biologiques. En particulier, ces composés peuvent être chacun couplés à un anticorps, un substrat d'enzyme, un peptide, un ligand de récepteur membranaire etc. La nature et la fonction de ces molécules conjuguées aux composés donneurs et accepteurs ne constituent pas des caractéristiques techniques essentielles du procédé selon l'invention : ce sont des paramètres variables que l'homme du métier adaptera en fonction de l'objet de son étude, et qui n'auront pas d'incidence sur le procédé de normalisation du signal de FRET selon l'invention. C'est la raison pour laquelle ces aspects, largement décrits par ailleurs, ne sont pas explicités ici.
Agents de marquage fluorescents : Agent intercalant
Dans une mise en œuvre préférée, l'agent de marquage utilisé dans le procédé selon l'invention est un agent intercalant fluorescent. L'expression « agent intercalant » est ici utilisée au sens large, et désigne notamment un composé organique capable de s'intégrer à la double hélice d'ADN, soit en s'intercalant entre les brins d'ADN, soit en se liant au petit sillon ou au grand sillon de la double hélice d'ADN. Ces agents sont connus et leurs caractéristiques spectroscopiques, en particulier leur spectres d'émission, sont différentes selon qu'ils sont complexés à l'ADN ou pas. Ces produits, disponibles dans le commerce, constituent ainsi l'une des solutions techniques disponibles pour quantifier la quantité de cellules présentes dans un milieu de mesure.
Il est important de souligner que l'utilisation de tels agents intercalants en combinaison avec d'autres fluorophores, notamment des complexes ou chélates de terre terbium qui émettent à la même longueur d'onde, va à rencontre d'un préjugé technique qui veut que lorsque plusieurs composés fluorescents sont utilisés, il est généralement préférable que ces composés émettent à des longueurs d'onde différentes pour éviter que la luminescence de l'un ne vienne contaminer la luminescence de l'autre.
Les inventeurs ont déterminé les conditions expérimentales permettant d'éviter une contamination du signal de l'agent intercalant par celui du composé fluorescent à durée de vie longue. En particulier la concentration de l'agent intercalant dans le milieu de mesure doit être supérieure à celle du composé fluorescent à durée de vie longue, de préférence d'au moins 50 à 150 fois. De manière générale, l'utilisation de l'agent intercalant à une concentration finale avant complexation de 1 et 10 μΜ est ainsi préférée.
De nombreux agents intercalants fluorescents ont été décrits. Le tableau 1 ci-après donne une liste de ces composés, ainsi que des informations relatives à leurs propriétés spectroscopiques. Tableau 1
Excitation / émission
Homodimère d'acridine 431/498
500/526 (DNA)
Acridine orange
460/650 (RNA)
7-AAD (7-amino-actinomycin
546/647
D)
ACMA 419/483
DAPI 358/461
Dihydroéthidium 518/605
Bromure d'éthidium 518/605
homodimère-1 d'éthidium
528/617
(EthD-1)
Homodimère-2 d'éthidium
535/624
(EthD-2)
lodure d'hexidium 518/600
Hoechst 33258 (bis-
352/461
benzimide)
Hoechst 33342 350/461
Hoechst 34580 392/498
Hoechst S769121 355/495
385/emission varies with
Hydroxystilbamidine
nucleic acid
543/712 (DNA)
LDS 751 590/607 (RNA)
Jaune nucléaire 355/495 lodure de propidium (PI) 530/625
OliGreen 485/535
PicoGreen 485/535
RiboGreen 485/535
SybrGreen 1 485/535
YO-YO-1 450/550
YO-PRO-1 450/550
Les agents intercalants fluorescents préférés sont ceux qui peuvent être utilisés selon l'invention avec un chélate ou un cryptate de terbium ou d'europium, c'est-à-dire qui peuvent être excités entre 330 et 350 nm, et qui émettent après liaison à l'ADN soit aux longueurs d'ondes correspondant aux pics d'émission de ces chélates ou crypates de terbium ou d'europium, à savoir notamment autour de 588 nm et 620 nm (si un chélate ou cryptate d'europium est utilisé) ou autour de 490 nm, 545 nm, 588 nm ou 620 nm (si un chélate ou cryptate de terbium est employé), soit à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé accepteur, généralement située entre 450 et 650 nm, le plus souvent entre 480 et 600 nm. De préférence, on choisira un agent intercalant suffisamment lipophile pour pénétrer dans le noyau cellulaire, en particulier lorsque l'on travaille sur des cellules entières et non pas sur un broyât cellulaire. Par ailleurs, certains agents intercalants étant rejetés par les cellules vivantes, il convient lorsqu'ils sont utilisés de les introduire dans le milieu de mesure une fois que les cellules ont été transformées en un lysat cellulaire, par exemple par sonication. Cela n'est néanmoins pas le cas du composé Hoechst 33342 qui peut s'intercaler dans l'ADN de cellules vivantes intactes.
De préférence l'agent intercalant fluorescent est choisi dans le groupe suivant : Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole).
Figure imgf000017_0001
Cette liste n'est pas limitative et l'homme du métier, sur la base des éléments fournis par les inventeurs, sera capable de choisir d'autres agents adaptés à l'invention.
De manière encore plus préférée, l'invention est mise en œuvre avec l'agent intercalant Hoechst 33342, qui est idéal lorsque le composé fluorescent à durée de vie longue est un chélate ou un cryptate de terbium, et qui est également utilisable avec un chélate ou un cryptate d'Europium.
Autres agents de marquage :
Dans le procédé de l'invention, l'agent de marquage n'est pas forcément un agent intercalant : on peut également utiliser un composé fluorescent capable de marquer les cellules, dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, ou encore à celle de l'accepteur lorsqu'il est présent. De préférence, on choisira un agent de marquage suffisamment lipophile pour pénétrer dans les cellules, en particulier lorsque l'on travaille sur des cellules entières et non pas sur un broyât cellulaire Les agents intercalants fluorescents préférés sont ceux qui peuvent être utilisés selon l'invention avec un chélate ou un cryptate de terbium ou d'europium, c'est-à-dire qui peuvent être excités entre 330 et 350 nm, et qui émettent après liaison à l'ADN soit aux longueurs d'ondes correspondant aux pics d'émission de ces chélates ou crypates de terbium ou d'europium, à savoir notamment autour de 588 nm et 620 nm (si un chélate ou cryptate d'europium est utilisé) ou autour de 490 nm, 545 nm, 588 nm ou 620 nm (si un chélate ou cryptate de terbium est employé), soit à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé accepteur, généralement située entre 450 et 650 nm, le plus souvent entre 480 et 600 nm. Des exemples de tels agents de marquage sont :
des protéines fluorescentes comme la protéine verte fluorescente (GFP ou « green fluorescent protein »). Lorsqu'une protéine fluorescente est utilisée comme agent de marquage, les cellules de l'échantillon auront été préalablement transfectées avec un vecteur d'expression codant pour cette protéine fluorescente. Dans ce cas, l'étape de l'invention consistant à introduire l'agent de marquage dans le milieu de mesure correspondra en pratique à l'étape d'introduction de l'échantillon biologique dans ce milieu. Des plasmides d'expression codant pour ces protéines sont disponibles dans le commerce et les techniques de transfection sont connues de l'homme du métier. La luminescence de la protéine fluorescente sera mesurée immédiatement après l'excitation du milieu de mesure, de manière similaire au cas où l'agent de marquage est un agent intercalant.
des composés fluorescents marqueurs des mitochondries, tels que le Mitotracker Orange, le Mitotracker Green, ou encore la rhodamine 123. Ces composés sont disponibles dans le commerce et les protocoles de marquage de cellules avec ces composés sont également connus. Ils peuvent être utilisés selon l'invention avec un protocole similaire au cas où l'agent de marquage est un agent intercalant,
des composés fluorescents, tels que le chlorure de dansyle ou le NBD (nitrobenzoxadiazole) : ces composés, également disponibles dans le commerce, se lient aux fonctions aminés, notamment des protéines. Y.Uratani et al. décrivent un protocole de marquage de cellules avec le chlorure de dansyle (Journal of Bacteriology 1982 p. 523-528). Une fois les cellules marquées, l'invention peut être mise en œuvre avec un protocole similaire au cas où l'agent de marquage est un agent intercalant, des composés fluorescents qui s'accumulent dans les membranes lipidiques, tels que le Filipin : ce composé est disponible dans le commerce et son utilisation pour marquer des cellules est connue. Il peut être utilisé selon l'invention avec un protocole similaire à celui du cas ou l'agent de marquage est un agent intercalant.
des composés fluorescents capables de marquer une protéine que l'on fait artificiellement exprimer par la cellule : dans cette mise en œuvre, les cellules ont été préalablement transfectées avec un plasmide codant pour une protéine de fusion comprenant une enzyme suicide telle que les enzymes commercialisées sous la dénomination Snaptag, Cliptag, ACPtag, MCPtag, ou Halotag. Cette protéine de fusion peut également comprendre la protéine GST, l'actine, la GAPDH ou toute autre protéine facilement exprimée par une cellule. La mise en contact de ces cellules avec un substrat fluorescent de ces enzymes (tel qu'un dérivé benzylguanine-fluorophore, benzylcytosine-fluorophore, ou chloroalcane-fluorophore) va provoquer le marquage de la protéine de fusion. Le signal de la protéine de fusion ainsi marquée peut être mesuré et utilisé selon l'invention avec un protocole similaire à celui utilisé dans le cas où l'agent de marquage est un agent intercalant.
Excitation et mesure de la luminescence
L'invention constitue une amélioration des procédés connus mettant en œuvre un composé fluorescent à durée de vie longue, et de manière optionnelle également un composé fluorescent accepteur, en ce qu'elle comprend l'utilisation d'un agent de marquage fluorescent et qu'elle propose d'optimiser l'excitation de ces composés et la mesure de leur luminescence. La luminescence émise par le milieu de mesure est effectuée de manière classique à l'aide d'un fluorimètre qui permet l'excitation du milieu à une longueur d'onde donnée, et la mesure de la luminescence émise après excitation dans une fenêtre temporelle et à une longueur d'onde choisies par l'utilisateur. Excitation du composé fluorescent à durée de vie longue et de l'agent de marquage.
Une des originalités de l'invention consiste à exciter le milieu de mesure de telle façon que non seulement le composé donneur mais également l'agent de marquage soient excités simultanément, où en tout cas à la même longueur d'onde. Pour cela, l'invention est basée sur l'utilisation de composés fluorescents à durée de vie longue et d'agents de marquage fluorescents dont les spectres d'absorption autorisent une excitation à la même longueur d'onde.
Dans la mesure où les fluorimètres à excitation laser à azote ne permettent qu'une excitation à 337 nm, les composés fluorescents donneurs à durée de vie longue et les agents de marquage dont les spectres d'absorption autorisent une excitation à cette longueur d'onde sont préférés. Cette condition est remplie notamment par les chélates et cryptâtes d'europium ou de terbium, ainsi que par un certain nombre d'agents intercalants fluorescents listés dans le tableau 1. Lorsque des fluorimètres à lampe flash sont utilisés, la longueur d'onde d'excitation peut être modifiée par l'utilisateur en fonction des composés fluorescents à durée de vie longue et des agents de marquage qu'il souhaite utiliser. Néanmoins, lorsque ces fluorimètres sont employés, la longueur d'onde d'excitation sera de préférence choisie entre 320 et 360 nm, et de préférence entre 330 et 350 nm.
Enfin, dans une mise en œuvre particulière, le milieu de mesure est excité deux fois, à la même longueur d'onde : une première fois pour mesurer la fluorescence de l'agent de marquage (fluorescence continue, mesurée sans délai après l'excitation), et une deuxième fois pour mesurer la fluorescence en temps résolu. Cela est particulièrement avantageux lorsque l'on souhaite modifier le gain du fluorimètre, ce qui peut être nécessaire en particulier si le signal de l'agent de marquage sature le canal de mesure.
Mesure de la luminescence émise
A la suite de l'excitation du milieu de mesure, ce dernier va émettre de la luminescence correspondant à l'excitation du composé fluorescent à durée de vie longue et de l'agent de marquage fluorescent. Dans la mise en œuvre selon laquelle le milieu comporte en outre un composé fluorescent accepteur partenaire de FRET du composé fluorescent à durée de vie longue, ce composé accepteur va également émettre. Il est nécessaire de rappeler que la mesure de la luminescence à une longueur d'onde donnée revient en pratique, en raison des contraintes techniques des fluorimètres, à mesurer la luminescence dans une fourchette plus ou moins importante centrée autour de la longueur d'onde d'émission visée. Typiquement, lorsque l'on règle un fluorimètre pour une mesure à une longueur d'onde L, on mesure en pratique la luminescence émise à L nm +1-5, 10 ou 20 nm. L'expression « signal de TR-FRET » parfois utilisée est un abus de langage qui désigne en fait la luminescence émise par le milieu de mesure suite au transfert d'énergie du composé donneur vers le composé accepteur. Ce signal de TR-FRET peut correspondre à la luminescence du composé donneur, dont l'intensité et la durée de vie vont diminuer suite au transfert d'énergie, ou bien à celle du composé accepteur, dont l'intensité va augmenter. Le plus souvent les deux signaux sont mesurés et le signal de TR-FRET est constitué du ratio du signal de l'accepteur sur celui du donneur.
Selon l'une des mises en œuvre de l'invention, la luminescence de l'agent de marquage et celle du composé fluorescent donneur sont mesurées à la même longueur d'onde. Cela permet de réduire encore le temps de mise en œuvre du procédé puisqu'aucun changement de filtre n'est nécessaire pour mesurer le signal de chacun de ces composés, et par ailleurs de limiter le risque d'erreur lié à la modification des conditions de mesure. Cela est encore une fois rendu possible par le choix d'un composé fluorescent à durée de vie longue et d'un agent de marquage fluorescent dont les spectres d'émission autorisent la mesure de luminescence à la même longueur d'onde.
Dans une autre mise en œuvre, la luminescence de l'agent de marquage et celle du composé fluorescent accepteur, lorsqu'il est présent, sont mesurées à la même longueur d'onde. De préférence, le composé fluorescent à durée de vie longue est un cryptate ou un chélate d'europium ou de terbium, l'agent de marquage fluorescent est un agent dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm et émettant une longueur d'onde comprise entre 450 et 650 nm, en particulier entre 490 et 600 nm, et la luminescence du composé fluorescent accepteur et celle de l'agent de marquage fluorescent sont toutes deux mesurées à une longueur d'onde comprise dans ces intervalles.
Dans le mode de réalisation consistant à utiliser des chélates ou des cryptâtes de terbium en tant que composé fluorescent à durée de vie longue, l'agent de marquage sera choisi parmi ceux dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm, et dont les spectres d'émission autorisent la mesure de luminescence à une longueur d'onde proche de celle des maximum des pics d'émission du terbium, à savoir 490 nm, 545 nm, 588 nm, ou 620 nm, notamment aux longueurs d'onde de 490 +/-10 nm, 545 +/-10 nm ou 590 +/-10 nm. Selon cette mise en œuvre, la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue (chélate ou cryptate de terbium) et celle de l'agent de marquage seront ainsi toutes deux mesurée à ces longueurs d'onde. De manière préférée on choisit un agent de marquage dont le spectre d'émission autorise une mesure de luminescence à 490 +/-10 nm, 545 +/-10 nm ou 590 +/-10 nm.
De la même façon, si le composé fluorescent à durée de vie longue est un chélate ou un cryptate d'europium, alors l'agent de marquage sera choisi parmi ceux dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm, et dont les spectres d'émission autorisent la mesure de luminescence à une longueur d'onde proche de celle des maximum des pics d'émission de l'europium, à savoir 580 nm ; 588 nm, 620 nm, 650 nm et 684 nm, notamment aux longueurs d'onde de 588 nm +/- 10 nm ou 620 nm +/- 10 nm ; la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue et celle de l'agent de marquage seront toutes deux mesurées de préférence aux longueurs d'onde de 588 nm +/- 10 nm ou 620 nm +/- 10 nm.
L'invention tire avantageusement partie des propriétés spectroscopiques de ces composés pour discriminer leurs luminescences respectives, et ce même dans le cas où elles sont mesurées à la même longueur d'onde. Selon l'invention, la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue et celle de l'agent de marquage sont en effet mesurées dans des fenêtres temporelles différentes : les inventeurs ont découvert que de manière inattendue, le signal du composé fluorescent à durée de vie longue ne contamine pas le signal de l'agent de marquage mesuré immédiatement après l'excitation du milieu de mesure.
Ainsi, et c'est l'une des caractéristiques les plus importantes de l'invention, la luminescence de l'agent de marquage est mesurée immédiatement après l'excitation du milieu de mesure, alors que les signaux du composé fluorescent à durée de vie longue et/ou de l'accepteur lorsqu'il est présent sont mesurés après un délai suivant cette excitation, et pendant une durée donnée (également appelée « temps d'intégration »), ces deux paramètres étant réglables sur les fluorimètres disponibles dans le commerce.
Selon la présente invention, on entend par « mesure immédiatement après l'excitation du milieu de mesure » une mesure immédiate, c'est-à-dire sans délai ou après un laps de temps très court ne dépassant pas 30 ps.
En particulier, la luminescence de l'agent de marquage est mesurée immédiatement après l'excitation du milieu de mesure, et pendant la durée la plus faible possible sur le fluorimètre. Lorsque l'excitation est effectuée par un laser, le signal peut être mesuré dans une fenêtre de 5 ns à 8 ps. Sur certains appareils à excitation laser, il est conseillé d'effectuer la mesure dans un des intervalles suivants : 0-8 ps, 2-8 ps, 2-6 ps et 2-4 ps. Lorsque l'excitation est effectuée à l'aide d'une lampe flash, le signal est de préférence mesuré un peu plus longtemps, à savoir pendant une durée de 5 ps à 45 ps, de préférence de 5 ps à 20 ps.
La luminescence émise par le milieu de mesure et correspondant au signal du composé donneur est mesurée postérieurement à celle de l'agent de marquage, après un délai de 20 à 200 ps, et de préférence de 40 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure, et pendant une durée de 200 à 1000 ps, de préférence de 400 à 1000 ps. Les fenêtres temporelles suivantes, individuellement, sont des fenêtres préférées : 50-550 ps, 100-500 ps, 100-300 ps, 200-1200 ps.
On entend par « fenêtre temporelle » la période de temps qui commence lorsque la luminescence est mesurée après un délai suivant l'excitation lumineuse du milieu de mesure et se termine à la fin du temps d'intégration. Par exemple, une fenêtre temporelle « 100-500 ps » signifie que la luminescence est mesurée au bout d'un délai de 100 ps après l'excitation lumineuse du milieu de mesure, pendant une durée (temps d'intégration) de 400 ps. Enfin, la luminescence du composé accepteur, lorsqu'il est présent, est mesurée à sa longueur d'onde d'émission, soit dans la même fenêtre temporelle que celle utilisée pour la mesure du signal du composé fluorescent à durée de vie longue, soit dans une fenêtre différente. Dans ce dernier cas, la luminescence du composé accepteur sera mesurée à sa longueur d'onde d'émission après un délai de 20 à 200 ps, de préférence de 40 à 200 ps après excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 600 ps, de préférence de 400 à 600 ps.
Dans le cas où le milieu de mesure contient un composé accepteur et qu'un signal de TR-FRET est mesuré, son évolution permettra à l'homme du métier de mieux comprendre le système biologique qu'il étudie puisque ce signal dépend de la proximité des composés fluorescents donneur et accepteur qu'il a introduit dans le milieu de mesure. L'invention n'est pas relative aux différentes applications en tant que telle de la technique de TR-FRET à l'étude des systèmes biologiques qui ont été décrites par ailleurs, mais elle permet néanmoins de les améliorer. Comme indiqué plus haut, lorsqu'un transfert d'énergie a lieu entre un composé donneur et un composé accepteur, la luminescence du donneur va diminuer lorsque le transfert d'énergie va augmenter, et celle de l'accepteur augmenter. Ainsi, le signal de TR-FRET représentatif d'une évolution du système biologique observé peut être soit celui du donneur, soit celui de l'accepteur. Il est néanmoins extrêmement courant de mesurer les deux signaux et de diviser le signal du composé accepteur par celui du composé donneur. Les fluorimètres incluent généralement un mode permettant ce type de lecture.
Dans tous les cas, que le signal de TR-FRET soit celui du donneur, de l'accepteur ou bien encore un ratio des signaux accepteurs/donneur, ce signal sera en outre et selon l'invention, corrigé par celui de l'agent de marquage fluorescent, cette correction permettant de normaliser le signal de TR-FRET par le contenu en ADN du milieu de mesure, et donc par la quantité de cellules. De manière préférée, cette correction est automatique et est opérée par le logiciel qui analyse les signaux mesurés. Ce logiciel peut être intégré au fluorimètre ou bien opérer sur un ordinateur qui en est séparé et auquel sont soumis les résultats de la mesure de fluorescence.
Dans le cas où l'on est dans un format TR-FRET, il est recommandé de déterminer la contribution du composé fluorescent à durée de vie longue à la luminescence émise en temps résolu à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur, en établissant une gamme étalon qui va permettre de déterminer la relation entre d'une part le signal du composé à durée de vie longue émis, en temps résolu, à la longueur d'onde d'émission de ce composé, et d'autre part le signal émis par ce même composé en temps résolu mais à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur, et cela en l'absence de FRET - ou en l'absence d'accepteur. Cette gamme étalon permet de déterminer les coefficients de la fonction linéaire qui relie ces deux signaux, et qui permet de calculer la contribution parasite. Cette méthode est illustrée dans l'exemple 5.3.2. Enfin, la méthode selon l'invention peut être encore affinée pour tenir compte du fait que le composé à durée de vie longue peut contribuer, de façon minoritaire, au signal mesuré immédiatement après excitation (signal correspondant majoritairement à celui de l'agent de marquage). Il est possible de calculer cette contribution parasite en établissant une gamme étalon qui va permettre de déterminer la relation entre le signal du composé à durée de vie longue mesuré en temps résolu et celui mesuré en fluorescence continue (sans délai). Pour cela, on va mesurer le signal émis par un milieu de mesure contenant le composé fluorescent à durée de vie longue mais pas d'agent de marquage, à des concentrations croissantes de composé fluorescent à durée de vie longue, d'une part en fluorescence continue et d'autre part en fluorescence en temps résolu. La relation entre les deux signaux est une fonction linéaire qui permet de calculer la contribution du composé fluorescent à durée de vie longue au signal émis en fluorescence continue, à partir de la valeur mesurée en temps résolu.
Séquence de mise en contact des composés fluorescent avec le milieu de mesure, lavage et transfert de ce milieu d'un contenant à l'autre.
Le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre de différentes façons, notamment en fonction de la nature du matériel biologique présent dans le milieu de mesure. Lorsque le procédé selon l'invention comprend une étape additionnelle de traitement mécanique, telle qu'une étape de sonication du matériel biologique, cette étape peut être effectuée soit avant soit après la mise en contact de l'échantillon de matériel biologique avec les composés fluorescents donneur, accepteur et l'agent de marquage, et bien sûr toujours de manière préalable à la mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure.
Une première possibilité, dans le cas où l'on travaille sur un extrait de tissu auquel on fait subir un traitement par sonication, consiste à mettre le tissu en contact avec les composés fluorescents avant la sonication de l'échantillon, selon les étapes suivantes :
a) Mise en contact des composés fluorescents (donneur, accepteur, agent de marquage) avec un échantillon de tissu,
b) Lavage,
c) Sonication, d) Transfert dans une microplaque (si le tissu ne se trouvait pas déjà dans une micropiaque),
e) Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent de marquage).
Cette mise en œuvre offre l'avantage de comporter une étape de lavage qui va limiter le bruit de fond et ainsi augmenter la sensibilité de la mesure. Elle est préférée lorsque le système biologique étudié ne permet pas de mesurer des variations importantes de signal de TR-FRET. Ce protocole a été mis en œuvre dans les exemples 3.2, 5.3 et 6.3.
Une seconde possibilité, dans le cas où l'on travaille sur un extrait de tissu auquel on fait subir un traitement par sonication, consiste à mettre le tissu en contact avec les composés fluorescent après avoir réalisé la sonication de l'échantillon, selon les étapes suivantes :
a) Sonication de l'échantillon de tissu,
b) Transfert dans une microplaque (si le tissu ne se trouvait pas déjà dans une microplaque),
c) Ajout au milieu de mesure des composés fluorescents (donneur, accepteur, agent de marquage),
d) Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent de marquage).
Cette mise en œuvre ne comporte pas d'étape de lavage et les mesures de luminescence seront donc moins sensibles que celle de la première mise en œuvre. En revanche, elle est plus facile à mettre en œuvre puisqu'elle ne comporte qu'un nombre limité d'étapes. Par ailleurs et comme indiqué plus haut et dans la partie expérimentale, les inventeurs ont vérifié qu'une sonication modérée ne perturbait pas les liaisons antigènes-anticorps éventuellement présents dans le milieu de mesure (en particulier lorsque les composés fluorescents donneurs et / ou accepteurs sont conjugués à des anticorps).
Une troisième possibilité, dans le cas où l'on travaille sur des cellules isolées issues d'une culture cellulaire, est la séquence d'étapes suivantes :
a) Distribution des cellules dans la microplaque,
b) Ajout au milieu de mesure des composés fluorescents (donneur, accepteur, agent de marquage),
c) Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent de marquage).
Cette mise en œuvre ne requiert pas de sonication dans la mesure où les cellules sont réparties de manière homogène dans le milieu de mesure, mais nécessite l'utilisation d'un agent de marquage qui n'est pas rejeté par les cellules vivantes, tel que le Hoechst 33342. Une quatrième possibilité, est la séquence d'étapes suivantes :
a) Mise en contact de l'agent de marquage avec des cellules ou un échantillon de tissu, b) Lavage,
c) Sonication,
d) Transfert dans microplaque (si le tissu ou les cellules ne se trouvaient pas déjà dans une microplaque),
e) Ajout au milieu de mesure des composés fluorescents (donneur, accepteur), f) Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent de marquage).
Ce protocole est préféré lorsque l'on travaille avec des cellules adhérentes, par exemple dans le contexte de tests destinés à découvrir de nouveaux médicaments. Ce protocole a été utilisé dans l'exemple 7. Trousses de réactifs
L'invention concerne enfin des trousses de réactifs adaptées à la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Les trousses pour la mise en œuvre du procédé selon laquelle la luminescence de l'agent de marquage est mesurée à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue comportent un ensemble de réactifs, dont :
un composé fluorescent à durée de vie longue ;
un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue ;
optionnellement, un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET.
Une trousse de réactifs préférée est une trousse dans laquelle :
le composé fluorescent à durée de vie longue est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ;
- l'agent de marquage fluorescent a un spectre d'absorption permettant son excitation entre 330 et 350 nm et un spectre d'émission autorisant la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue. Les trousses pour la mise en œuvre du procédé selon laquelle la luminescence de l'agent de marquage est mesurée à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur comportent un ensemble de réactifs, dont : un composé fluorescent à durée de vie longue ;
- un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET ;
un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur. Une autre trousse de réactifs préférée est ainsi une trousse dans laquelle :
le composé fluorescent à durée de vie longue est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium
l'agent de marquage fluorescent a un spectre d'absorption permettant son excitation entre 330 et 350 nm et un spectre d'émission autorisant la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur.
Selon une mise en œuvre de l'invention, l'agent de marquage fluorescent est choisi parmi les composés suivants : un agent intercalant fluorescent, une protéine fluorescente, un composé fluorescent marqueur des mitochondries, un composé fluorescent se liant aux fonctions aminés des protéines, un composé fluorescent qui s'accumule dans les membranes lipidiques. Des exemples de tels agents de marquage adaptés à une utilisation selon l'invention sont : le composé Hoechst 33258 ; le composé Hoechst 33342; le composé Hoechst 34580 ; DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole) ; la protéine fluorescente verte (GFP), le Mitotracker Orange, le Mitotracker Green, la rhodamine 123, le chlorure de dansyle, le nitrobenzoxadiazole, le filipin.
L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre purement indicatif.
Exemple 1. Obtention de cryosections de tissus tumoral
La méthode selon l'invention a été mise en œuvre sur des cryosections obtenues à partir de tumeurs de souris, induites par xenogreffe de cellules NIH-3T3 surexprimant soit le récepteur HER1 (EGFR), soit le récepteur HER2 (ErbB2), soit à la fois HER1 et HER2. Ces cellules ont été obtenues par transduction à l'aide d'un vecteur rétroviral portant la séquence nucléique codant pour les protéines en question. Ce matériel constitue un modèle proche d'une biopsie de tissu tumoral humain. Pour obtenir la construction rétrovirale portant le gène HER1 , la séquence de l'EGFR a été extraite du vecteur pCMV-XL4-EGFR (Origene - CliniSciences, Montrouge, France) par coupure à l'aide de l'enzyme de restriction Not I (associée à l'enzyme Pvu I pour découper le vecteur en fragments de taille différente de celle de la séquence d'intérêt) (Fermentas, Saint- Rémy-lès-Chevreuse, France). La séquence d'intérêt a été traitée à la T4 DNA polymérase (Roche Diagnostics, Meylan, France) afin d'obtenir des bout francs et être ensuite insérée dans le vecteur rétroviral MSCV (Clontech - Ozyme) contenant la séquence de résistance à la puromycine (p SCV-puro) et préalablement digéré par l'enzyme de restriction Hpa I puis déphosphorylé à la CIAP "calf intestinal alcaline phosphatase" (Fermentas). Avant d'être liguées avec de la T4 DNA ligase (Roche), les séquences (insert et plasmide digéré) ont été déposées sur gel d'agarose 1%, et après électrophorèse, récupérées d'après leur taille et purifiées à l'aide du kit Nucleo Spin Extract II (Machery-Nagel, Hoerdt). Des bactéries compétentes de type E.coli DH5a ont ensuite été transformées avec le produit de ligation puis étalées sur boîte de Pétri en milieu LB agar. Les colonies obtenues ont alors été placées en milieu LB liquide pour faire des mini-préparations de plasmides à l'aide du kit Nucleo Spin Plasmid Quick Pure (Machery-Nagel). Le sens d'insertion de l'insert dans le vecteur a été vérifié par analyse de restriction utilisant l'enzyme Bgl II (Fermentas). De la même façon pour obtenir la construction rétrovirale portant le gène HER2, la séquence de l'HER2 a été extraite à partir du vecteur pCMV-XL4-HER2 (Origene - CliniSciences, Montrouge, France) puis insérée dans le plasmide du vecteur rétroviral MSCV (Clontech - Ozyme) contenant la séquence de résistance à l'hygromycine (pMSCV-hygro). Dans ce cas, le sens d'insertion de l'insert dans le vecteur a été vérifié par analyse de restriction utilisant les enzymes Xho I et Bel I (Fermentas). Finalement, les plasmides pMSCV-puro-HER1 et pMSCV-hygro-HER2 ont été envoyés à séquencer pour vérification de l'absence de mutations dans la séquence codante d'HERI ou HER2 à la société Millegen (Labege, France). Les vecteurs pMSCV-puro-HER1 ou pMSCV- hygro-HER2 ont été transfectés dans une lignée d'empaquetage AmphoPack-293 (Clontech) pendant 24h, permettant la multiplication du virus modifié de façon à produire des particules virales encapsidées. Le surnageant contenant les particules virales a été collecté, centrifugé et filtré sur un filtre 0,45μηη.
Les cellules NIH/3T3 ont été cultivées (2x106 cellules dans une boite de 150-mm) pendant 8h, puis exposées pendant 16h en présence d'un quart du volume de surnageant contenant les virus dans du milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau fétal et du polybrene (8 μg ml, Sigma-AIdrich). Après 24h les cellules ont été lavées puis sélectionnées par ajout de l'antibiotique (400 μg/ml d'hygromycine ou 10 μg/ml de puromycine suivant le cas) et incubation pendant deux jours. Après sélection et multiplication, les cellules (5 x 106) surexprimant soit HER1 soit HER2 soit à la fois HER1 et HER2 ont été administrées par injection sous cutanée à des souris femelles athymiques sur leur flanc droit. Dans ce qui suit, les lignées, ainsi que les xénogreffes correspondantes, n'exprimant que HER1 seront dénommées R1 , les lignées (et xénogreffes) n'exprimant que HER2 seront dénommées R2 et les lignées (et xénogreffes) exprimant à la fois HER1 et HER2 seront dénommées R1 R2. Les souris portant des tumeurs ont été sacrifiées quand les tumeurs atteignaient un volume supérieur à 1500 mm3. Préparation des cryosections de xénogreffes
Après sacrifice de l'animal, la tumeur a été excisée, la pièce chirurgicale ainsi obtenue a été congelée immédiatement en la plongeant dans de l'azote liquide, puis conservée à -80°C.
Pour la réalisation des cryosections, le support métallique porte-échantillon d'un cryotome a été placé sur de la carboglace pendant 1 min. On a ensuite déposé quelques gouttes d'eau stérile sur le support, puis, sans attendre, déposé la pièce chirurgicale. En se congelant, l'eau a fixé l'échantillon sur le support. Alternativement l'échantillon peut être inclus dans un gel de type OCT (Optimal Cutting Température compound) à la place de l'eau stérile. Ensuite l'échantillon congelé a été coupé à l'épaisseur désirée avec le microtome contenu dans le cryostat (-25°C) et les sections encore congelées (cryosections) ont été collectées dans des tubes eppendorf préalablement refroidis dans de la carboglace. L'épaisseur des cryosections était généralement comprise entre 10 m et 50 pm. Pour les applications ci-dessous, une épaisseur de 50 μητι a été considérée comme optimum en termes de praticité de manipulation. Exemple 2. Mesure du signal d'émission d'un agent intercalant permettant la mesure de la quantité de cellules dans une section d'un tissu de cellules tumorales
Une cryosection issue de tumeur de souris ayant subi une xénogreffe de cellules R1 R2, préparée selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 , et dénommée cryosection R1 R2, a été placée dans un tube eppendorf dans 180μΙ de tampon PBS, auxquels ont été ajoutés 20 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H 1399 en solution 2mg/ml DMSO) prédiluée au 1/100 dans du tampon PBS pH 7 (soit une concentration de Hoechst 33342 de 3,25μΜ). Après 10 min d'incubation à l'obscurité on a centrifugé et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,05 % Tween® 20. On a finalement repris le culot formé par la cryosection dans 300μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA (albumine sérique bovine) et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10 ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 5 μΙ, 20 μΙ et 100 μΙ de la suspension homogène obtenue ont été alors déposés dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyren »), et complétés à 100 μΙ par le même tampon que celui utilisé pour l'étape de sonification décrite plus loin.
La microplaque a ensuite été placée dans un fluorimètre TECAN Saphir2. Après excitation des puits à 340 nm, la fluorescence de l'intercalant Hoechst 33342 a été mesurée aux trois longueurs d'onde 490 nm, 545 nm et 590 nm (H490, H545 et H590), correspondant aux principaux pics d'émission du terbium, la longueur d'onde 490 nm correspondant également à un des pics d'émission de l'europium. La fluorescence a été ici mesurée en mode fluorescence continue, c'est-à-dire immédiatement après l'excitation, et pendant le temps le plus court autorisé par l'appareil (20 ps). Les résultats sont présentés dans le tableau 2.
Tableau 2
Figure imgf000030_0001
Ces résultats montrent que l'intensité de fluorescence en fonction des volumes de suspension de cellules évolue de manière linéaire, et est donc proportionnelle à la quantité de cellules présentes dans le puits. Cet exemple démontre que la fluorescence émise par le complexe Hoechst 33342 - ADN peut être mesurée à 490, 545 ou 590 nm, en plus de l'être aux longueurs d'onde classiquement utilisées (excitation à 330-380 nm et mesure de l'émission à 430-530 nm).
Exemple 3. Normalisation du signal d'émission du terbium permettant la mesure de l'expression d'un récepteur dans une section d'un tissu de cellules tumorales
3.1. Marquage d'un anticorps anti-HER2 par un cryptate de terbium
L'anticorps FRP5 (fournit par l'Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, IRCM) (150 μΙ à 1 ,2 mg/ml) a été dessalé sur une colonne NAP5 (G25) équilibrée dans un tampon phosphate 50 mM pH8. La fraction exclue a été recueillie sous forme d'un éluat de 400 pl à 0,45 mg/ml (soit 1 ,2 nmol) en tampon phosphate pH8. A cette fraction ont été ajoutées 12 nmol (soit 10 eq.) de Lumi4Tb-NHS (cryptate de terbium, Cisbio Bioassays) en solution dans 1 ,4 μΙ de DMSO. Après 1 h d'incubation à 20°C l'anticorps marqué a été purifié sur colonne NAP5 (G25) équilibrée dans du tampon phosphate 100 mM pH7. On collecte la fraction exclue (400 μΙ) et on obtient ainsi l'anticorps FRP5 marqué à un taux de 5,3 cryptâtes par anticorps. La solution a été congelée en présence de 0,1% de BSA jusqu'à son utilisation.
3.2. Mesure de l'expression de HER2 (ErbB2) par mesure de fluorescence en temps résolu de l'émission du terbium à 490 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée également à 490nm en mode fluorescence continue
Une cryosection R1 R2 préparée dans l'exemple 1 a été placée dans un tube eppendorf dans 180 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 4% de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml). L'anticorps FRP5-Lumi4Tb préparé à l'exemple 3.1 a été ajouté de façon à obtenir une concentration finale en anticorps de 50 nM dans le tube eppendorf. Après incubation pendant une nuit à 30°C, 20 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 en solution 2 mg/ml DMSO) prédiluée au 1/100 dans du tampon pH7 ont été ajoutés. Après 10 min d'incubation à l'obscurité, le tube a été centrifugé et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,05 % Tween® 20. Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300 μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10 ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 5 μΙ, 20 μΙ et 100 μΙ de la suspension homogène obtenue ont été déposés dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyrène ») et complétés à 100 μΙ par le même tampon que celui utilisé pour l'étape de sonification.
La plaque a ensuite été placée sur un appareil TECAN Saphir2 pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un filtre 337 nm à l'excitation.
La fluorescence en mode continu, correspondant à celle du Hoechst 33342 a été mesurée à 490 nm, sans délai après excitation, et pendant un temps d'intégration de 20 ps. La fluorescence en mode temps-résolu (TRF pour « time-resolved fluorescence » en langue anglaise), correspondant au signal émis par le cryptate de terbium, l'a été également à 490 nm mais après un délai de 100 ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps.
Après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul on obtient les valeurs présentées dans le tableau 3, dans lequel :
TRF490 représente la mesure du signal du cryptate de terbium en temps résolu à 490 nm,
H490 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 490 nm, et TRF490 normalisé représente le rapport TRF 490 sur H490 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 1000) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés.
Tableau 3
Figure imgf000031_0001
On observe que la valeur TRF490 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 490 normalisée est globalement constante -en moyenne 14 800 ufa (unité de fluorescence arbitraire)- et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER2 exprimé par les cellules R1 R2.
La même expérience réalisée sur des coupes obtenues à partir de la lignée cellulaire R1 surexprimant HER1 seul (témoin négatif) et ne surexprimant pas HER2 permet d'estimer la spécificité et le bruit de fond de la détection de cette surexpression par la technique décrite ci- dessus. Après dépôt dans des puits sur la même plaque et lecture dans les mêmes conditions on observe les valeurs suivantes, reportées dans le tableau 4. Tableau 4
Figure imgf000032_0001
On observe ici une valeur de TRF 490 normalisée dont la moyenne est de 180 ufa pour ce témoin négatif ce qui représente un rapport signal / bruit de l'ordre de 80.
Cet exemple démontre que la méthode selon l'invention permet de normaliser le signal émis par un cryptate de terbium par la quantité de cellules présentes dans le milieu, et cela en mesurant la fluorescence émise par ce cryptate et le Hoechst 33342 à la même longueur d'onde (490 nm), mais dans des fenêtres temporelles différentes.
3.3. Mesure de l'expression de HER2 (ErbB2) par mesure de fluorescence en temps résolu de l'émission du terbium à 545 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée à 545 nm en mode fluorescence continue
Une cryosection R1 R2 préparée dans l'exemple 1 a été traitée comme dans l'exemple 3.2.
La lecture du signal a été effectuée en mode fluorescence continue à 545 nm et en mode TRF à 545 nm sur un appareil TECAN Saphir2 pourvu d'une excitation par lampe flash dont le monochromateur a été réglé à 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation et à 545 nm (bande passante 10 nm) pour l'émission. La mesure en temps résolu a été effectuée après un délai de 100 ps suivant l'excitation et pendant un temps d'intégration de 500 ps ; celle en fluorescence continue a été effectuée sans délai et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps). Après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul on obtient les valeurs présentées dans le tableau 5, dans lequel :
TRF545 représente la mesure du signal du terbium en temps résolu à 545 nm,
H545 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 545 nm, et TRF545 normalisé représente le rapport TRF 545 sur H545 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 10000) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés. Tableau 5
Figure imgf000033_0001
On observe que la valeur H545 est proportionnelle au volume de suspension cellulaire ajoutée. On observe également que la valeur TRF545 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 545 normalisée est globalement constante, en moyenne 1 250 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER2 exprimé par les cellules R1 R2. Cet exemple démontre que la méthode selon l'invention permet de normaliser le signal émis par un cryptate de terbium par la quantité de cellules présentes dans le milieu, et cela en mesurant la fluorescence émise par ce cryptate et le Hoechst 33342 à la même longueur d'onde (545 nm), mais dans des fenêtres temporelles différentes. 3.4. Mesure de l'expression de HER2 (ErbB2) par mesure de fluorescence en temps résolu de émission du terbium à 590 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée à 590 nm en mode fluorescence continue
L'exemple 3.3 a été reproduit mais cette fois la luminescence du cryptate de terbium et de l'Hoechst 33342 a été mesurée à 590 nm. Les valeurs obtenues sont présentées dans le tableau 6, dans laquelle:
TRF590 représente la mesure du signal du terbium en temps résolu à 590 nm,
H590 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 590 nm, et TRF590 normalisé représente le rapport TRF 590 sur H590 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 1000) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés.
Tableau 6
Figure imgf000033_0002
Là encore, la valeur TRF590 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 590 normalisée est globalement constante, en moyenne 1 450 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER2 exprimé par les cellules R1 R2. Cet exemple démontre que la méthode selon l'invention permet de normaliser le signal émis par un cryptate de terbium par la quantité de cellules présentes dans le milieu, et cela en mesurant la fluorescence émise par ce cryptate et le Hoechst 33342 à la même longueur d'onde (590 nm), mais dans des fenêtres temporelles différentes.
Exemple 4. Normalisation du signal d'émission de l'europium permettant la mesure de l'expression d'un récepteur dans une section d'un tissu de cellules tumorales
4.1. Marquage d'un anticorps anti-HER2 par un cryptate d'europium
A un anticorps FRP5 (IRCM / Montpellier) (150 μΙ à 1 ,2 mg/ml dans PBS pH 7), ont été ajoutés 10 μΙ d'une solution de NaHP04 à 0,1 M (pH9) puis 40 μΙ d'une solution de P04 à 0,1 M (pH8), pour obtenir une solution contenant 1 ,3 nmol de FRP5 dans 200 μΙ soit une concentration finale de 6,5 μΜ dans un tampon pH8. 13,5 nmol de EuTBP-NHS (soit 10 eq. de cryptate d'europium, Cisbio Bioassays) ont été ajoutés à cette solution. Après 1 h d'incubation à 20°C, cette solution a été purifiée sur colonne NAP5 (G25) équilibrée dans du tampon phosphate 100 mM pH7. La fraction exclue (300 μΙ) a été collectée pour obtenir une solution contenant l'anticorps FRP5- TBPEu marqué à un taux de 3,4 cryptâtes par anticorps. Cette solution a été congelée en présence de 0,1% de BSA jusqu'à son utilisation.
4.2. Mesure de l'expression de HER2 par mesure de fluorescence en temps résolu de l'émission de l'europium à 585 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée également à 585 nm en mode fluorescence continue
L'exemple 3.2 a été reproduit avec l'anticorps préparé dans l'exemple 4.1. La fluorescence est mesurée à la longueur d'onde de 585 nm à l'aide d'un fluorimètre Rubystar (BMG), pourvu d'une excitation à 337 nm par un laser à azote.
La mesure en temps résolu, correspondant au signal du cryptate d'Europium a été effectuée après un délai de 100 ps suivant l'excitation et pendant un temps d'intégration de 400 ps. La mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue est effectuée sans délai après excitation et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (10 ps).
Après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul on obtient les valeurs présentées dans le tableau 7, dans lequel :
TRF585 représente la mesure du signal du cryptate d'europium en temps résolu à 585 nm, H585 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 585 nm, et TRF585 normalisé représente le rapport TRF 585 sur H585 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 200) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés. Tableau 7
Figure imgf000035_0001
On observe que la valeur TRF585 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 585 normalisée est globalement constante, en moyenne 13 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER2 exprimé par les cellules R1 R2.
Cet exemple démontre que la méthode selon l'invention permet de normaliser le signal émis par un cryptate d'europium par la quantité de cellules présentes dans le milieu, et cela en mesurant la fluorescence émise par ce cryptate et le Hoechst 33342 à la même longueur d'onde (585 nm), mais dans des fenêtres temporelles différentes.
Exemple 5. Normalisation du signal d'émission du terbium permettant la mesure de l'expression d'un récepteur par TR-FRET dans une section d'un tissu de cellules tumorales
5.1. Marquage d'un anticorps anti-HER1 par un cryptate de terbium
Un anticorps anti-HER1 REGF01 (Cisbio Bioassays) (92 μΙ à 5,4 mg/ml) a été dessalé sur une colonne NAP5 (G25) équilibrée dans un tampon phosphate 50 mM pH8. La fraction exclue a été recueillie sous forme d'un éluat de 400μΙ à 1 mg/ml (soit 3 nmol) en tampon phosphate pH8. A cette fraction ont été ajoutées 20 nmol (soit 7 eq.) de Lumi4Tb-NHS (cryptate de terbium, Cisbio Bioassays) en solution dans 2,3 μΙ de DMSO. Après 1 h d'incubation à 20°C l'anticorps marqué a été purifié sur colonne NAP5 (G25) équilibrée dans du tampon phosphate 100 mM pH7. La fraction exclue (400 μΙ) a été collectée pour obtenir ainsi l'anticorps REGF01 marqué à un taux de 4,4 cryptâtes par anticorps. La solution a été congelée en présence de 0,1% de BSA jusqu'à son utilisation.
5.2. Marquage d'un anticorps anti-HER1 par un accepteur de FRET
Un anticorps anti-HER1 REGF08 (Cisbio Bioassays) (200 μΙ à 1 ,6 mg/ml) a été dialysé contre un tampon phosphate 50 m M pH8 (une nuit à 4°C). Après dialyse la fraction recueillie en tampon phosphate pH8 contient l'anticorps à 0,93 mg/ml. A 130 μΙ de cette fraction (soit 0,8 nmol) ont été ajoutées 4 nmol (soit 5 eq.) de fluorophore accepteur activé (d2-NHS ; Cisbio Bioassays) en solution dans 3 μΙ de DMSO. Après 1 h d'incubation à 20°C cette solution a été purifiée sur colonne NAP5 (G25) équilibrée dans du tampon phosphate 100 mM pH7. La fraction exclue (400 μΙ) a été collectée pour obtenir ainsi l'anticorps REGF08 marqué à un taux de 3,3 fluorophores par anticorps. La solution a été congelée en présence de 0,1% de BSA jusqu'à son utilisation. 5.3. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de l'émission du terbium à 490 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée également à 490 nm en mode fluorescence continue
5.3.1. Une cryosectïon R1 R2 préparée dans l'exemple 1 a été placée dans un tube eppendorf dans 180 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 4% de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10ml). Les anticorps REGF01 -Lumi4Tb et REGF08- d2 préparés dans les exemples 5.1 et 5.2 ont été ajoutés de façon à obtenir une concentration finale de 50 nM de chaque anticorps dans le tube. Après incubation pendant une nuit à 30°C, 20 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H 1399 en solution 2mg/ml DMSO) prédiluée 1/100 dans du tampon pH7 ont été ajoutés. Après 10 min d'incubation à l'obscurité, le tube a été centrifugé et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,05 % Tween® 20. Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 10 μΙ, 20 μΙ, 40 μΙ et 100 μΙ de la suspension homogène obtenue ont été déposés dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyrène ») et complétés à 100 μΙ par le même tampon que celui utilisé pour l'étape de sonification. La plaque a ensuite été placée sur un appareil TECAN Saphir2 pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un monochromateur réglé à 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation. Pour les mesures en temps résolu (TRF), la fluorescence a été mesurée à 490 nm après un délai de 100ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400ps ; pour la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue, la fluorescence a été mesurée à 490 nm sans délai après excitation, et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 με).
Après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul on obtient les valeurs présentées dans le tableau 8, dans lequel :
TRF490 représente la mesure du signai du terbium en temps résolu à 490 nm,
H490 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 490 nm, et TRF490 normalisé représente le rapport TRF 490 sur H490 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 1000) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés. Tableau 8
Figure imgf000037_0001
On observe que la valeur TRF490 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 490 normalisée est globalement constante, en moyenne 11 180 ufa, et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER1 exprimé par les cellules R1 R2.
5.3.2. Evaluation de la contribution du cryptate de terbium au signal mesuré à 665 nm : détermination du « blanc réactif » B665
Pour mesurer l'expression du récepteur HER1 par TR-FRET on peut mesurer l'augmentation d'émission de l'accepteur à 665 nm. Néanmoins la fluorescence mesurée à 665 nm ne correspond pas seulement à la luminescence de l'accepteur puisque le cryptate de terbium est encore faiblement fluorescent à cette longueur d'onde. Ainsi, il est nécessaire de corriger le signal mesuré à 665 nm. Pour cela, on met en présence différentes concentrations d'anticorps REGF08-d2 et d'anticorps REGF0-Lumi4Tb (0,2 nM, 1 nM, 5 nM), en l'absence de Hoechst 33342 et de cellules (mélange ci-après nommé « blanc réactif »), et l'on mesure en temps résolu les signaux émis à 490 et à 665 nm. On obtient les résultats présentés dans le tableau 9, dans lequel :
TRF490 représente le signal mesuré en temps résolu à 490 nm, correspondant essentiellement à l'émission du cryptate de terbium, et
B665 représente le signal mesuré en temps résolu à 665 nm, correspondant essentiellement à l'émission résiduelle du cryptate de terbium à cette longueur d'onde.
Tableau 9
Figure imgf000037_0002
Ces résultats permettent de déterminer la relation entre la luminescence du cryptate de terbium à 490 nm et celle à 665 nm. Cette relation est une fonction linéaire qui permet de calculer, dans les expériences ci-après, et à partir de la valeur de TRF490 mesurée sur l'échantillon, celle de B665 dans cet échantillon. 5.3.3. On reproduit l'exemple 5.3.1 , mais cette fois en mesurant en plus le signal en temps résolu à 665 nm (TRF665), correspondant essentiellement à l'émission du composé accepteur d2 suite au transfert d'énergie entre l'anticorps anti-HER1-Lumi4Tb et l'anticorps anti-HER1-d2. Les résultats sont présentés dans le tableau 10.
Tableau 10
Figure imgf000038_0001
On observe que la valeur Delta F 665 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de Delta F 665 normalisée est globalement constante, en moyenne 3 920 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER1 exprimé par les cellules R1 R2 et mesurée au travers du processus de TR- FRET. On notera que cette mesure de l'expression utilisant deux anticorps est moins sujette à des phénomènes parasites tels que des interactions non-spécifiques éventuelles entre anticorps et protéines cibles, la mesure étant ici basée sur une double spécificité apportée par le fait d'utiliser deux anticorps. 5.3.4. La même plaque a été placée sur un appareil à filtre de type EnVision pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un monochromateur réglé à 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation. Pour les mesures en temps résolu (TRF), la fluorescence a été mesurée (i) à 490 nm après un délai de 100ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps ; et (ii) à 665 nm après un délai de 60 ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps. Pour la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue, la fluorescence a été mesurée à 490 nm sans délai après excitation, et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps).
Les résultats sont présentés dans le tableau 11. Tableau 11
Figure imgf000039_0001
Ces résultats sont similaires à ceux obtenus avec le fluorimètre TECAN saphir2 dans l'exemple 5.3.3, et cela bien que la limite de sensibilité puisse être très différente entre un appareil à monochromateur comme le TECAN saphir2 et un appareil à filtres comme l'EnVision.
5.5. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de l'émission du terbium à 545 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée également à 545 nm en mode fluorescence continue
L'exemple 5.3.2 a été reproduit, mais cette fois la luminescence du cryptate de terbium et du Hoechst 33342 a été mesurée sur un appareil TECAN Saphir2 pourvu d'une excitation par lampe flash dont le monochromateur a été réglé à 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation et le monochromateur à 545 nm (bande passante 10 nm) pour l'émission. La fluorescence en temps résolu a été mesurée après un délai de 100 ps suivant l'excitation et pendant un temps d'intégration de 500 ps, et la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue a été effectuée sans délai après l'excitation et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps). L'émission résiduelle du cryptate de terbium à 665 nm en l'absence FRET (B665) a été déterminée comme dans l'exemple 5.3.2. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 12, dans laquelle :
TRF545 représente la mesure du signal du terbium en temps résolu à 545 nm, et
H545 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 545 nm.
Tableau 12
Cellules R1 R2 (μΙ) 10 20 40 100
TRF545 3 250 9 330 16 350 51 240
B665 227 355 500 1 240
TRF665 1 380 4 180 7 100 24 780
Delta F665 = 1 150 3 820 6 600 23 540 TRF665 - B665
H545 3 420 9 920 18 500 51 150
Delta F665 3 370 3 850 3 570 4 600 normalisé On observe des résultats similaires à ceux obtenus précédemment, à savoir une augmentation de la valeur TRF665 proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 665 normalisée est globalement constante, en moyenne de 3 850 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER1 exprimé par les cellules R1 R2.
Cet exemple montre que l'invention peut être mise en œuvre en détectant les signaux du cryptate de terbium et de l'agent intercalant à 545 nm. 5.6. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de l'émission du terbium à 590 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée à 590 nm en mode fluorescence continue
L'exemple 5.5 a été reproduit, mais cette fois la luminescence du cryptate de terbium et celle du produit Hoechst 33342 ont été mesurées à 590 nm. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 13, dans lequel :
TRF590 représente la mesure du signal du terbium en temps résolu à 590 nm, et
H590 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 590 nm.
Tableau 13
Figure imgf000040_0001
Ces résultats sont similaires à ceux obtenus précédemment et montrent que l'invention peut être mise en œuvre en mesurant la luminescence du cryptate de terbium et de l'Hoechst 33342 à 590 nm. Exemple 6. Normalisation du signal d'émission TR-FRET permettant la mesure de la dimérisation d'un récepteur dans une section d'un tissu de cellules tumorales
6.1. Marquage d'un anticorps anti-HER2 par un cryptate de terbium
L'anticorps anti-HER2 trastuzumab (nom commercial, « Herceptine ») a été marqué par le cryptate de terbium Lumi4Tb, comme décrit dans l'exemple 5.1.
6.2. Marquage d'un anticorps anti-HER1 par un accepteur de FRET
L'anticorps anti-HER1 cetuximab (nom commercial « Erbitux ») a été marqué par un accepteur de FRET, le « d2 », comme décrit dans l'exemple 5.2. 6.3. Mesure de l'hétérodimérisation de récepteurs HER1-HER2 par mesure TR-FRET de l'émission du terbium à 545 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par la fluorescence d'un intercalant mesurée à 545 nm en mode fluorescence continue
Dans cet exempte, le signal émis à 665 nm résulte d'un transfert d'énergie entre les deux anticorps marqués, lorsqu'ils se lient à un dimère HER1 -HER2.
Deux cryosections R1 , ou bien R2, ou bien R1 R2, préparées dans l'exemple 1 et de 50 μιη d'épaisseur ont été placées dans un tube eppendorf dans 180 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 10% de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml). Les anticorps trastuzumab-Lumi4Tb et cetuximab-d2 préparés dans les exemples 6.1 et 6.2 ont été ajoutés de façon à obtenir une concentration finale de 50 nM de chaque anticorps. Après incubation pendant une nuit à 37°C, 20 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 en solution 2 m g/ml DMSO) prédiluée au 1/100 dans du tampon pH7 ont été ajoutés. Après 5 min d'incubation à l'obscurité le tube a été centrifugé 2 min à 12 000 tr/min et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,1 % de BSA.
Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300 μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10 ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 100 μΙ de la suspension homogène obtenu ont été déposés (en doublet) dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyrène »).
La plaque a ensuite été placée sur un appareil TECAN Infinité F500 pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un filtre 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation. On effectue la lecture en mode fluorescence continue avec un filtre 544 nm (bande passante 25 nm) et en mode TRF à 544 nm (bande passante 25 nm) (compte-tenu de la largeur de bande, équivalent à une mesure à 545 nm) et 665 nm (bande passante 5 nm). La mesure en temps résolu a été effectuée après un délai de 100 ss suivant l'excitation et pendant un temps d'intégration de 400 μβ, et la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue a été effectuée sans délai après l'excitation et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps).
La contribution du cryptate de terbium à 665 nm a été calculée pour chaque mesure comme dans l'exemple 5.3.2. Les résultats obtenus après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul sont présentés dans le tableau 14. Tableau 14
Figure imgf000042_0001
Le signal TRF 545 est représentatif de la fixation de l'anticorps anti-HER2 (trastuzumab- Lumi4Tb), et donc de l'expression du récepteur R2. La normalisation de ce signal par la méthode selon l'invention permet de comparer les niveaux d'expression de HER2 dans différents échantillons : ainsi, le signal TRF545 normalisé apparaît équivalent dans les échantillons R1 R2 et R2, alors qu'il était 3 fois plus important dans l'échantillon R2 que dans l'échantillon R1 R2 avant normalisation (TRF545).
Le signal Delta F665 Normalisé est représentatif de la présence d'hétérodimères entre récepteurs HER1 et HER2 : les valeurs de delta F665 normalisés confirme la présence d'hétérodimères dans l'échantillon R1 R2 et leur absence dans les échantillons R1 et R2. 6.4. Mesure de l'hétérodimérisation de récepteurs HER1-HER2 par mesure TR-FRET de l'émission du terbium à 490 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par la fluorescence d'un intercalant mesurée à 490 nm en mode fluorescence continue
La même plaque a été placée sur un appareil à filtre de type Pherastar FS pourvu d'une excitation par lampe flash et de filtres disponibles sous forme de modules optiques ; pour obtenir les valeurs de fluorescence à 665 nm il faut faire une mesure indépendante en changeant le module optique. Pour les mesures en temps résolu (TRF), la fluorescence a été mesurée (i) à 490 nm après un délai de 100ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps ; et (ii) à 665 nm après un délai de 100 ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps. Pour la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue, la fluorescence a été mesurée à 490 nm sans délai après excitation, et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps).
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 5. Tableau 15
Figure imgf000043_0001
Ces résultats sont similaires à ceux de l'exemple 6.3.
Exemple 7. Immunodosage TR-FRET subséquent au marquage normalisateur
Dans cet exemple, le protocole utilisé varie de celui des exemples précédents : il comprend les étapes suivantes : Mise en contact de l'agent intercalant avec des cellules ou un échantillon de tissu, Lavage, Sonication, Transfert dans microplaque, Ajout au milieu de mesure des composés fluorescents (donneur, accepteur), Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent intercalant).
Une cryosection R1 R2 de 50 μιη d'épaisseur, préparée dans l'exemple 1 , a été placée dans un tube eppendorf dans 270 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 0,1 % de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml). 30 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 en solution 2 mg/ml DMSO) prédiluée au 1/100 dans du tampon pH7 ont ensuite été ajoutés. Après 10 min d'incubation à l'obscurité le tube a été centrifugé pendant 2 min à 12 000 tr/min et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,1 % de BSA. Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300 μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip ») et l'homogénat obtenu a été dilué trois fois. 20 μΙ, 40 μΙ et 80 μΙ de cette suspension ont été déposés (en doublet) dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyrène ») et complétés avec du tampon de façon à obtenir un volume total de 80 μΙ par puits (nommés respectivement H20, H40 et H80). Des puits B20, B40 et B80 ont été préparés selon la même procédure mais en omettant l'Hoechst 33342, pour constituer un signal « blanc ».
On a ajouté dans tous les puits une solution d'un mélange de deux anticorps marqués, le cetuximab-Lumi4Tb (anticorps anti-HER1 marqué à un taux de 7,5 cryptâtes de terbium Lumi4Tb par anticorps selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1) et l'anticorps Ab10-d2 (anticorps anti-HER1 Ab10 ThermoFisher marqué à un taux de 2,1 accepteurs de FRET « d2 »par anticorps selon un protocole décrit dans l'exemple 5.2) de façon à obtenir une concentration finale dans les puits de 1 nM en cetuximab-Lumi4Tb et 2 nM en Ab10-d2. La fluorescence du composé Hoechst 33342 a été ensuite mesurée avec un filtre 490 nm (10 nm) à l'émission et un filtre 337 nm (20nm) à l'excitation sur un appareil Pherastar FS, équipé d'une lampe flash, en utilisant le mode « TRF avancé » et un découpage en délais de 5ps.
Après exportation des données dans un logiciel de type « tableur » on retraite les données en calculant les intensités de fluorescence mesurées à 490 nm correspondant à des fenêtre temporelles 30-45 ps (signal H490) et en faisant la somme des chiffres obtenus dans chaque intervalle élémentaire de 5 ps.
Ces mesures ont en effet montré que sur cet appareil particulier, il est nécessaire de mesurer la fluorescence du Hoechst 33342 sur la fenêtre temporelle 30-45 ps, et d'éviter de mesurer le signal immédiat (0-30 ps) qui provoque une saturation du lecteur. Il aurait également été possible de mesurer directement la fluorescence du Hoechst 33342 avec un délai de 30 ps et un temps d'intégration de 15 ps. La fluorescence en temps résolu à 490 nm (TRF490, correspondant essentiellement au signal du cryptate de terbium) et celle à 665 nm (TRF665, fluorescence de l'accepteur) ont été mesurées comme dans l'exemple 6.3 mais avec un délai de 60 ps et un temps d'intégration de 340 ps. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 16.
Tableau 16
Figure imgf000044_0001
On observe une augmentation à la fois du signal de Hoechst (H490) et du signal de FRET et ces signaux sont proportionnels à la quantité de lysat ajouté, comme observé dans les exemples précédents. Le signal de TR-FRET à 665 nm normalisé par le signal H490 donne une valeur moyenne d'environ 11 000 ufa représentant la quantité de récepteur HER1 exprimée par les cellules de type R1 R2. Exemple 8. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de émission du terbium à 490 nm et d'un accepteur de FRET, compatible avec le terbium et émettant vers 520 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée à 490 nm ou 520 nm en mode fluorescence continue
8.1. Marquage d'un anticorps par de l'Alexa-488 comme accepteur de FRET
L'anticorps REGF01 (33 pl à 3 mg/ml dans du PBS soit 100 a été dilué par 66 μΙ de tampon carbonate 0,1 M pH 8.5 et 6 μΙ d'une solution d'Alexa-488 (InVitroGen) 1 ,2 mM dans le DMSO ont été ajoutés. Après une heure d'incubation à température ambiante le mélange réactionnel a été purifié sur une colonne NAP-5 équilibrée dans du tampon phosphate 100mM pH7. Un spectre UV de la fraction exclue (300 μΙ) montre que l'anticorps est marqué à un taux de 2 molécules d'Alexa-488 par molécule d'anticorps.
8.2.1. Une cryosection R1 R2 préparée dans l'exemple 1 a été placée dans un tube eppendorf dans 360 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 0,1 % de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml) et 40 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 en solution 2mg/ml DMSO) prédiluée à 1/100 dans du tampon pH7 ont été ajoutés. Après 10 min d'incubation à l'obscurité, le tube a été centrifugé et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,1 % BSA. Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300 μΐ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10 ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 10 μΙ, 20 μΙ et 40 μΙ de la suspension homogène obtenue ont été déposés dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyren ») puis complétés à 80 μΙ par le même tampon que celui utilisé pour l'étape de sonification et on a déposé dans plusieurs puits 80 μΙ du même tampon pour constituer des « blancs tampon » (BT).
Les anticorps REGF08-Lumi4Tb et REGF01 -Alexa488 préparés en suivant les exemples 5.1 et 8.1 ont été ajoutés de façon à obtenir une concentration finale de 1 nM de l'anticorps REGF08- Lumi4Tb et 2nM de l'anticorps REGF01-Alexa488 dans les puits, on a également ajouté 20 μΙ du mélange d'anticorps à 80 μΙ de tampon de façon a obtenir un « blanc réactif » (BR) (ici on a utilisé une seule concentration d'anticorps pour calculer la contribution à 520 nm du donneur dans les puits « essai »).
8.2.2. La plaque a ensuite été placée sur un appareil PHERAstar FS pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un monochromateur réglé à 340 nm (20 nm) à l'excitation. Pour les mesures en temps résolu (TRF), la fluorescence a été mesurée à 490 nm après un délai de 60 μβ suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 με ; pour la mesure de fluorescence du Hoechst en fluorescence continue, la fluorescence a été mesurée à 490 nm sans délai après excitation en utilisant le protocole « Fluorescence » prévu dans le logiciel de l'appareil. μΙ de suspension cellulaire 0 10 20 40
H490 (Fluorescence 490 nm après ajout Ac) 8 880 21 200 31 500 49230
On observe que l'intensité de fluorescence mesurée à 490 nm en mode continu est proportionnelle à la quantité de suspension cellulaire déposée dans les puits. μΙ de suspension cellulaire 0 10 20 40
H520 (Fluorescence 520 nm après ajout Ac) 1 115 12 418 22 840 40 120
La fluorescence a été mesurée à 520 nm en utilisant la même plaque sur le même appareil PHERAstar FS sans délai après excitation en utilisant le protocole « Fluorescence » prévu dans le logiciel de l'appareil. On observe que l'intensité de fluorescence mesurée à 520 nm en mode continu est aussi proportionnelle à la quantité de suspension cellulaire déposée dans les puits. La mesure de fluorescence du complexe Hoechst-DNA peut être mesurée indifféremment à la longueur d'onde prévue pour la mesure de fluorescence du donneur ou de l'accepteur.
La même plaque a ensuite été mesurée en mode TRF (délai de 60 ps suivant l'excitation, et temps d'intégration de 400 ps). Dans ce cas du fait du fort transfert on observe que la normalisation met en évidence un effet crochet. Dans ce cas la variation de fluorescence à 520 nm a tendance à diminuer avec la quantité de suspension cellulaire ajoutée, alors que la fluorescence H490 augmente bien avec la quantité de suspension cellulaire ajoutée. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 17.
Tableau 17
Figure imgf000046_0001
Exemple 9. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de l'émission du terbium à 490 nm et d'un accepteur de FRET compatible avec le terbium et normalisation par la fluorescence d'une protéine fluorescente (GFP) mesurée à 490 nm, 545 nm ou 590 nm en mode fluorescence continue
9.1. Obtention d'une lignée cellulaire polyclonale exprimant de façon stable des récepteurs HER1 (EGFR) et transfection transitoire d'une protéine fluorescente (GFP):
Des cellules HEK (fond HEK ATCC) ont été transfectées en présence de Lipofectamine 2000 en utilisant un plasmide codant pour le récepteur HER1 (EGFR), ce plasmide comportant également un gène de résistance à la Généticine. Apres transfection les cellules ont été soumises à une sélection par ajout de Généticine (0,6 mg/ml) dans le milieu de culture de façon à sélectionner la population de cellules résistantes ayant intégrées le plasmide de façon stable. Les cellules (population polyclonale) ainsi obtenues sont nommées HEK-EGFR.
Transfection transitoire de la lignée polyclonale HEK-EGFR avec GFP (Cellules HEK-EGFR- GFP) :
Aux cellules HEK-EGFR en flasque T175 (cellules à environ 70% de confluence soit ~ 20 millions de cellules) a été ajouté un mélange composé de 8 ml de milieu optiMEM + 60 μΙ Lipofectamine 2000 + 20 pg de plasmide pmaxGFP (contrôle positif du kit Amaxa Nucléofection) préalablement incubé pendant 20 min à température ambiante, puis on a ajouté sur les cellules 12 ml de milieu complet + Généticine 0,6 mg/ml.
Après 24h d'incubation dans l'incubateur (37°C + C02) les cellules sont lavées (PBS), décollées avec 5 ml de « Cell Dissociation Buffer » (Sigma) ; la suspension de cellules a été ensuite centrifugée et le culot repris dans du tampon KREBS. Après comptage des cellules sur le compteur ViaCell la suspension a été diluée par du tampon KREBS de façon à ajuster la concentration, puis les suspensions diluées ont été distribuées dans les puits d'une plaque de microtitration noire Cellstar 96 puits (prétraitées à la Poly-Ornithine) de façon à avoir une densité cellulaire connue par exemple de 25K (= 25 000 cellules), 50K et 200K cellules HEK- EGFR-GFP dans un volume de 100 μΙ par puits.
On constitue également des « blancs tampon» en ajoutant 100 μΙ de tampon Krebs dans des puits adjacents.
9.2. Mesures de fluorescence en mode « fluorescence continue » sur des cellules HEK-EGFR- GFP :
Les spectres d'émission de fluorescence (mode continu) des puits d'une plaque comportant des séries de puits contenants respectivement 25K, 50Ket 200K cellules ont été enregistrés sur un appareil TECAN Saphir 2 avec les paramètres suivants en utilisant la longueur d'onde préférée pour l'excitation de la GFP située dans le proche ultra-violet. La GFP sauvage (wild type : wGFP) a deux maxima d'excitation, à 395 nm (lumière UV) et à 475 nm (lumière bleue) (extinction coefficient respectifs de 30,000 M"1 cm"1 et 7,000 M"1 cm"1) :
Excitation 395 nm (20 nm)
Emission (5 nm)
Délai 0 ps
Intégration 20 ps
Gain 171
Le spectre obtenu montre un maximum d'émission vers 500 nm (Figure 2). Les spectres d'émission de fluorescence (mode continu) des puits de la même plaque ont été enregistrés sur l'appareil TECAN Saphir 2 avec les paramètres suivants en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 340 nm habituellement utilisée pour l'excitation des complexes de lanthanides sans changer les autres paramètres :
Excitation 340 nm (20 nm)
Emission (5 nm)
Délai 0 ps
Intégration 20 ps
Gain 171
Le spectre obtenu montre un maximum d'émission vers 500 nm dont l'intensité est environ moitié de celle observé en excitant à 395 nm (Figure 3).
Les intensités de fluorescence des puits de la même plaque ont été mesurées sur l'appareil TECAN Saphir 2 :
a) Soit en utilisant la longueur d'onde habituellement préférée pour mesurer la fluorescence de la GFP :
Excitation 395 nm (20 nm)
Emission 509 (10 nm)
Délai 0 ps
Intégration 20 ps
Gain 150
b) Soit une longueur d'onde d'excitation de 340 nm habituellement utilisée pour l'excitation des complexes de lanthanides :
Excitation 340 nm (20 nm)
Et en mesurant les intensités de fluorescence aux longueurs d'onde correspondant aux principales lignes d'émission du terbium (490 nm et 545 nm) ainsi qu'à 509 nm la longueur d'onde habituellement utilisée pour mesurer la fluorescence de la GFP. Emission 490 (10 nm), Emission 509 (10nm), Emission 545 (10 nm)
Délai 0 ps
Intégration 20 ps
Gain 150
Les résultats (moyenne de 10 mesures) ont été regroupés dans le tableau 18. Tableau 18
Figure imgf000049_0001
Cet exemple montre que la GFP peut être excitée à la longueur d'onde de 340 nm à la place de la longueur d'onde de 395 nm habituellement utilisée. De même la fluorescence peut être mesurée préférentiellement à 490 nm et à 545 nm, c'est aussi possible à 590 nm mais il faut dans ce cas, et avec les cellules utilisées dans cet exemple, un minimum de 50K cellules pour avoir un rapport signal/bruit correct.
Il a été observé que de façon inattendue le coefficient de corrélation correspondant à une régression linéaire indique une meilleure linéarité pour les conditions correspondant à une excitation à 340 nm et plus particulièrement pour la mesure utilisant le couple [Ex 340 nm ; Em 490 nm] correspondant aux conditions d'excitation utilisées pour les mesures d'intensités sur des complexes de terbium. 9.3. Mesures de l'expression du récepteur EGFR par TR-FRET et normalisation par mesure en en mode « fluorescence continue » de l'émission de la GFP sur des cellules HEK-EGFR-GFP : A la plaque précédente on a ajouté 10 μΙ d'une solution contenant de l'anticorps REGF-08- Lumi4 Tb (25nM) et de l'anticorps REGF01 -Alexa488 (25nM) dans du tampon (PBS + 0,1 % BSA) dans les puits contenant des quantités connues de cellules HEK-EGFR-GFP ainsi que dans un des puits contenant du tampon Krebs de façon à constituer un « blanc réactif » (BR). Le « blanc réactif » permet de calculer la contribution du terbium dans le canal « accepteur » 520 nm et de pouvoir calculer la variation de fluorescence à 520 nm provenant du FRET et ainsi de pouvoir doser l'expression du récepteur EGFR.
La mesure en mode fluorescence continue donne les valeurs suivantes, la variation d'émission de l'accepteur à 520 nm est calculé comme dans l'exemple 8 en calculant la contribution de l'émission du terbium dans le canal 520 nm (B520) en se servant comme calibrateurs de puits ne contenant que des anticorps marqués dans du tampon. Delta 520 = E520 - B520 cette valeur représente le signal de FRET correspondant à la mesure de l'expression du récepteur EGFR. La valeur Delta 520N = (Delta 520 / F 490) x 10 000 correspond à la valeur de l'expression du récepteur EGFR normalisé de la mesure de fluorescence F490c (signal de la GFP).
La plaque a été lue sur un appareil PHERAstar FS avec excitation par lampe flash en mode fluorescence avec un filtre 340 nm à l'excitation et des filtres 490 et 520 à l'émission. cellules 25K 50K 200K
E490 15 880 23 900 49 780 cellules 25K 50K 200K
F520 54 000 62 190 88 170
La fluorescence de la GFP a pu donc être mesurée soit à la longueur d'onde d'une des raies d'émission du terbium (490 nm) soit à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur (520 nm) (lui-même excité par FRET à partir du terbium). Dans les deux cas l'émission de fluorescence est proportionnelle au nombre de cellules (quantité de matière biologique).
Les mesures en mode TRF a été effectuée avec les paramètres suivants :
Module optique : 337, 520, 490
Excitation : 337 nm
Délai : 60 με
Intégration : 400 ps Les résultats sont regroupés dans le tableau 19.
Tableau 19
Figure imgf000050_0001
On a observé que le signal Delta 520 mesuré en mode temps résolu augmente proportionnellement au nombre de cellules contenu dans chaque puits, mais que le Delta 520N représentant l'expression du récepteur (normalisée par la mesure de fluorescence mesurée à 490 nm en mode fluorescence continu) est constante, en moyenne 2 040 ufa. Ainsi il est possible d'utiliser la fluorescence d'une protéine comme la GFP pour normaliser un signal de TR-FRET.
Exemple 10. Marquage des cellules au chlorure de dansyle
Des cellules polyclonales exprimant de façon stable l'EGFR (voir exemple 9) ont été utilisées. Environ 2 000 K cellules (2 x 106 cellules) en suspension dans 1 ml de tampon Krebs dans un eppendorf de 1 ,5 ml ont été centrifugées 10 min à une force centrifuge relative (RCF) de 8 000 puis lavées par 3 fois 300 μΙ de tampon NaHC03 0,1 M pH 9 et ensuite remise en suspension dans 150 pl de tampon NaHC03. On a préparé une solution de chlorure de dansyle 5 mM dans un mélange (3/2) de dioxane et de tampon NaHC03 0,1 M, puis on a ajouté 3 μΙ de cette solution à la suspension de cellules. Après 30 min d'incubation sous agitation mécanique le tube a été centrifugé 10 min à une RCF de 8 000, le surnageant éliminé, puis le culot a été remis en suspension dans 300 μΙ de tampon carbonate, puis centrifugé 10 min ; cette opération a été répétée encore une fois avec 300 μΙ de tampon carbonate puis une fois avec 300 μΙ de PBS.
Le culot a été remis en suspension dans 500μΙ de tampon PBS contenant 0,2% de BSA et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml). Le tube est refroidi dans la glace et soumis à une sonication (5 s à 20% de la puissance) puis la suspension est déposée dans les puits d'une microplaque 10, 20, 40 et 80 μΙ en complétant à 80 μΙ avec le même tampon.
La préparation des cellules marquées par le groupe dansyle a été inspirée de la publication d'Y.Uratani Journal of Bacteriology 1982 (p. 523-528).
Un spectre d'émission enregistré sur un appareil TECAN Saphir II avec les paramètres suivants a montré (Figure 4) un maximum d'émission de fluorescence vers 500 nm correspondant aux données de fluorescence connus pour les dérivés de dansyle (Excitation 330 nm, Emission 510 nm).
Excitation 340 nm (20 nm)
Bande passante d'émission : 5 nm
Gain : 158
Intégration : 20 ps
Délai : 0 ps
La fluorescence (mode continu) a été également mesurée à des longueurs d'ondes fixes correspondant à des lignes d'émission du terbium ou de l'europium (490 nm, 545 nm, 590 nm, 620 nm) ainsi qu'à 520 nm correspondant à la longueur d'onde d'émission d'un accepteur tel que l'Alexa-488 ou la fluorescéine en utilisant les paramètres suivants :
Excitation : 340 nm (bande passante : 20 nm)
Bande passante d'émission : 10 nm
Délai : 0 ps
Intégration : 20 ps
Les résultats sont regroupés dans le tableau 20. Tableau 20
Figure imgf000052_0001
On a observé qu'aux diverses longueurs d'onde d'émission testées, la fluorescence est proportionnelle à la quantité de matériel biologique, marqué par du chlorure de dansyle, présent dans les puits.
Mesure de l'expression des récepteurs REGF par HTRF sur lysat cellulaire après marquage au chlorure de dansyle
Dans les puits d'une microplaque contenant 10 μΙ, 20 μΙ et 40 μΙ de lysat cellulaire obtenu après marquage au chlorure de dansyle ont été ajoutés les anticorps anti-REGF marqués, REGF08- Lumi4Tb et REGF01 -d2 préparés en suivant l'exemple 5.1 , de façon à obtenir une concentration finale dans les puits respectivement de 2,7 nM (REGF08-Lumi4Tb) et 7,3 nM (REGF01-d2). Un puits ne contenant que les anticorps marqués (« Blanc Réactif ») a été utilisé pour mesurer la contribution du cryptate de terbium à 665 nm (B 665) qui a servi pour le calcul de la variation du signal TRF 665 (Delta 665) dû au FRET. Une lecture de fluorescence a été effectuée sur un appareil PHERAStar FS avec excitation par lampe flash et en utilisant les paramètres suivants :
Mode fluorescence (continue):
Excitation 337 nm
Emission 490 nm
Mode TRF :
Excitation 337 nm
Emission A 665 nm
Emission B 490 nm
Intégration 60 με
Intégration 400 ps
Lampe flash
Les résultats sont regroupés dans le tableau 21. Tableau 21
Figure imgf000053_0001
On a observé que variation de fluorescence en mode temps résolu (Delta 665) augmente avec la quantité de matériel biologique introduit dans les puits. Le Delta 665 normalisé par la mesure de fluorescence à 490 nm (delta 665N) représente l'expression du récepteur cette valeur en moyenne 750 ufa est indépendante de la quantité de matériel cellulaire.
Exemple 11. Comparaison entre le signal du Hoechst 33342 mesuré selon l'invention et celui obtenu par une méthode de référence de quantification des protéines (kit Quantipro™ Sigma)
Des cryosections de tissus (tumeur) de 50μητι d'épaisseur dans 200μί de tampon PBS (sans ajout de BSA) contenant un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10ml) ont été marquées au Hoechst 33342 (20μί d'une solution 100 μg/mL PBS). Après 10 min d'incubation le tube a été centrifugé (3 min à 2 000 tr/min) et le culot lavé par 2 fois 200 μΙ de tampon PBS (sans ajout de BSA) contenant un inhibiteur de protéase; le culot repris par 300μί de même tampon a été refroidi dans la glace puis soumis à une sonification, dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 7. Un volume de 90 μΙ de chaque homogénat a été dilué de moitié dans du tampon PBS puis la concentration en protéines totales a été mesurée à l'aide du kit Quantipro™ BCA Sigma, au format microplaque 96 puits en suivant le protocole du kit. Les valeurs d'absorbance ont été converties en concentration de protéines totales exprimées en μg/ml en utilisant une droite de calibration obtenue à l'aide d'une gamme de concentration en BSA. Les concentrations en protéines totales mesurées sont reportées dans le tableau 22.
En parallèle, 50μί de chaque homogénat ont été déposés (doublets) dans les puits d'une plaque de microtitration (Corning® « black 96 well half-area ») et la lecture de fluorescence a été effectuée sur un appareil à de type Pherastar FS pourvu d'une excitation par lampe flash, d'un filtre d'excitation à 337 nm et d'un filtre d'émission à 490nm (modules optiques HTRF). Les mesures en temps résolu (TRF) ont été effectuées en mode « decay curve » permettant l'acquisition de la fluorescence par « pas » de 2 με. Pour la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 la fluorescence a été mesurée à 490 nm dans un intervalle de 38 à 42 μβ par sommation de la fluorescence des pas 38 à 42 (Raw Data 490 B obtenues sous forme de tableau Excel par le logiciel MARS permettant l'exportation des données obtenues sur l'appareil Pherastar). Ces mesures de fluorescence (F490 {38-42} sont reportées dans le tableau 22.
Tableau 22
Figure imgf000054_0001
Le signal du Hoechst mesuré dans les conditions de l'invention est bien corrélé avec celui obtenu par une méthode classique de quantification des protéines (R2 = 0.847). Les deux méthodes peuvent donc être utilisées de manière satisfaisante pour estimer la quantité de matériel biologique présent dans un échantillon, mais la normalisation selon l'invention présente l'intérêt supplémentaire de ne pas être destructive de l'échantillon, alors que le kit Quantipro® nécessite la destruction d'un tiers de cet échantillon.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, c) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue,
d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue,
e) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape d), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 ps, cette luminescence correspondant principalement à celle du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) calcul d'un signal de luminescence normalisé correspondant au ratio : (signal obtenu à l'étape e) / (signal obtenu à l'étape d).
2. Procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET,
c) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, d) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue,
e) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) optionnellement, mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape e), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 g) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure après un délai de 20 à 200 ps après l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 600 ps, à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur,
h) détermination d'un signal de TR-FRET normalisé comprenant le calcul du ratio : (signal obtenu à l'étape g) / [(optionnellement signal obtenu à l'étape f)) X (signal obtenu à l'étape e)].
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que :
- le composé fluorescent à durée de vie longue est un cryptate ou un chélate d'europium ; - l'agent de marquage fluorescent est un agent dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm et émettant notamment aux longueurs d'onde de 588 nm +/-10 nm ou 620 nm +/-10 nm ;
- la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue et celle de l'agent de marquage fluorescent sont toutes deux mesurées à la longueur d'onde de 588 nm +/-10 nm ou 620 nm +/-10 nm.
4. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que :
- le composé fluorescent à durée de vie longue est un cryptate ou un chélate de terbium ;
- l'agent de marquage fluorescent est un agent dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm et émettant notamment aux longueurs d'onde de 490 nm +/-10 nm, 545 nm +/-10 nm ou 590 +/-10 nm ;
- la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue et celle l'agent de marquage fluorescent sont toutes deux mesurées à la longueur d'onde de 490 nm +/-10 nm, 545 nm +/-10 nm ou 590 +/-10 nm.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que :
- dans l'étape c), l'agent de marquage est un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur,
- dans l'étape e), la luminescence est mesurée à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent accepteur
- dans l'étape f) si elle est présente, la luminescence est mesurée à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que :
- le composé fluorescent à durée de vie longue est un cryptate ou un chélate d'europium ou de terbium,
- l'agent de marquage fluorescent est un agent dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm et émettant une longueur d'onde comprise entre 450 et 650 nm, en particulier entre 490 et 600 nm, et
-la luminescence du composé fluorescent accepteur et celle de l'agent de marquage fluorescent sont toutes deux mesurées à une longueur d'onde comprise dans ces intervalles.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une deuxième étape d'excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption dudit composé fluorescent à durée de vie longue, cette deuxième excitation étant effectuée immédiatement avant la première étape de mesure de la luminescence en temps résolu.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi : un extrait de tissu, en particulier une coupe histologique ; un échantillon de tumeur ; des cellules issues d'une culture cellulaire.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'échantillon biologique a fait l'objet d'un traitement visant à homogénéiser ledit échantillon sous forme de lysat cellulaire, et cela préalablement à l'introduction des composés fluorescents dans le milieu de mesure.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'échantillon biologique a fait l'objet d'un traitement visant à homogénéiser ledit échantillon sous forme de lysat cellulaire, et cela postérieurement à l'introduction des composés fluorescents dans le milieu de mesure.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le composé fluorescent à durée de vie longue est un complexe métallique fluorescent, choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; un quantum dye.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que l'agent de marquage est choisi parmi : un agent intercalant fluorescent, une protéine fluorescente, un composé fluorescent marqueur des mitochondries, un composé fluorescent se liant aux fonctions aminés des protéines, un composé fluorescent qui s'accumule dans les membranes lipidiques.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que l'agent de marquage est un agent intercalant fluorescent.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'agent intercalant fluorescent est choisi parmi les composé suivants : Hoechst 33258 ; Hoechst 33342; Hoechst 34580 ; DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole).
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le composé fluorescent accepteur, lorsqu'il est présent, est choisi parmi : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (en particulier ceux connus sous la dénomination « Bodipy ») ; les fluorophores connus sous la dénomination « Atto » ;, les fluorophores connus sous la dénomination «DY» ; les composés connus sous la dénomination « Alexa » ; le nitrobenzoxadiazole ; les protéines fluorescentes.
16. Trousse de réactifs comprenant :
un composé fluorescent à durée de vie longue ;
un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue ;
optionnellement, un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET.
17. Trousse de réactifs selon la revendication 16, caractérisée en ce que :
le composé fluorescent à durée de vie longue est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; l'agent de marquage fluorescent a un spectre d'absorption permettant son excitation entre 330 et 350 nm et spectre d'émission autorisant la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue.
18. Trousse de réactifs comprenant :
un composé fluorescent à durée de vie longue ;
un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET ;
un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur.
19. Trousse de réactifs selon la revendication 18, caractérisée en ce que :
le composé fluorescent à durée de vie longue est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ;
l'agent de marquage fluorescent a un spectre d'absorption permettant son excitation entre 330 et 350 nm et une spectre d'émission autorisant la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur.
20. Trousse selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que l'agent de marquage est choisi parmi : un agent intercalant fluorescent, une protéine fluorescente, un composé fluorescent marqueur des mitochondries, un composé fluorescent se liant aux fonctions aminés des protéines, un composé fluorescent qui s'accumule dans les membranes lipidiques.
21. Trousse selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que l'agent de marquage est un agent intercalant fluorescent.
22. Trousse selon la revendication 21 , caractérisée en ce que l'agent intercalant fluorescent est choisi parmi les composés suivants : Hoechst 33258 ; Hoechst 33342; Hoechst 34580 ; DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole).
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