EP2729808B1 - Methode amelioree de detection et/ou de quantification d'un analyte present a la surface d'une cellule - Google Patents

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EP2729808B1
EP2729808B1 EP12738559.9A EP12738559A EP2729808B1 EP 2729808 B1 EP2729808 B1 EP 2729808B1 EP 12738559 A EP12738559 A EP 12738559A EP 2729808 B1 EP2729808 B1 EP 2729808B1
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EP
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protein
her2
interest
ligand
antibody
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Gérard Mathis
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Cisbio Bioassays SAS
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Cisbio Bioassays SAS
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    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material

Definitions

  • the invention relates to an improved method for detecting and / or quantifying protein in a sample, in particular a tissue sample.
  • Immunohistochemistry is the name of a method for locating proteins in cells of a tissue section, by the detection of antigens using antibodies. Immunohistochemistry exploits the fact that an antibody specifically binds to antigens in biological tissues.
  • the antibodies may be of polyclonal or monoclonal origin, the monoclonal antibodies being more specific in essence.
  • an antibody-antigen pair can be visualized in several ways.
  • an antibody is conjugated to an enzyme (alkaline phosphatase, horseradish peroxidase in particular) generating highly colored products in the presence of a chromogenic substrate (such as DAB for horseradish peroxidase?) Or a fluorophore ( FITC, TRITC, AMCA etc.).
  • a chromogenic substrate such as DAB for horseradish peroxidase
  • FITC, TRITC, AMCA etc. a fluorophore
  • Densitometric analysis of the signal obtained with the chromogenic or fluorescence methods can provide semi-quantitative or quantitative data respectively, and correlates the level of the measured signal with the level of protein expression or localization. It allows semi-quantitative detection based on microscopic observation by an anatomic pathologist who classifies the cut as "negative” or "positive” (1+, 2+ or 3+).
  • Immunohistochemistry is widely used for the diagnosis and / or monitoring of cancers by detection of abnormal cells such as those found in cancerous tumors.
  • Specific markers are thus known today for various cancers, such as carcinoembryonic antigen (CEA), used in case of colon cancer, CD15 and CD30, used for Hodgkin's disease, Alpha-fetoprotein, used in hepatocellular carcinoma, CD117, gastrointestinal stromal tumor marker and Ki-67, one of the signs of tumor proliferation.
  • CCA carcinoembryonic antigen
  • CD15 and CD30 used for Hodgkin's disease
  • Alpha-fetoprotein used in hepatocellular carcinoma
  • CD117 CD117
  • gastrointestinal stromal tumor marker and Ki-67 Ki-67
  • Immunohistochemistry is also widely used in basic research to understand the distribution and location of biomarkers and proteins expressed in different parts of a biological tissue.
  • the direct method has only one staining step and is based on the use of a labeled antibody that reacts directly with the antigen in the tissue sections. Although this technique is simple and fast, its sensitivity is low due to the lack of amplification of the signal.
  • the indirect method consists in using a non-labeled primary antibody specific for the antigen of interest and a labeled secondary antibody recognizing the IgG of the animal species in which the primary antibody has been prepared. This method is more sensitive than direct detection strategies because of the amplification of the signal due to the binding of several secondary antibodies to each primary antibody.
  • Biol Chem 2011, 86 (13): 11337-11345 discloses a method for evaluating the efficacy of targeted therapy using monoclonal antibodies, wherein: a known number of cells are placed in the wells of a microtiter plate and labeled with fluorescent antibodies; the cells are incubated, labeled and then washed; and a FRET signal is measured directly in the wells.
  • TR-FRET-Basics Datasheets (URL: http: //www.htrf.com/technology/htrftheory/tr_basics) and Homogeneous Time Resolved Fluorescence; Methodological aspects "(URL: http: //www.htrf.com/files/resources/6182008_htrf an01.pdf) succinctly describe the TR-FRET technology.
  • Maurel et al. (Analytical Biochemistry 2004, 329 (2), 253-252 ) describes the use of TR-FRET technology to detect interactions between membrane proteins. Diermeier-Daucher et al. (Ann NY Acad Sci., 2008, 1130: 280-286 ) describes the quantification of homodimerization by the cytometric flow FRET technique, using cyanine labeled antibodies.
  • the invention solves these problems, in particular it drastically reduces the background noise observed when conventional immunohistochemical approaches are implemented, ie when a single antibody is used to detect the protein of interest.
  • the subject of the invention is a method advantageously using a pair of FRET partners to quantify proteins present on the surface of a cell or in a tissue sample.
  • the subject of the invention is also a reagent kit for the implementation of this method, and the application of this method to the HER2 protein as part of a theranostic method for determining whether patients suffering from breast cancer are eligible for treatment with an anti-HER2 antibody.
  • pair of FRET partners is meant a pair consisting of a fluorescent energy-donor compound (hereinafter “fluorescent donor compound”) and an energy accepting compound (hereinafter “acceptor compound”) ; when in proximity to each other and when excited at the excitation wavelength of the donor fluorescent compound, these compounds emit a FRET signal (acronym for "Forster Resonance Energy Transfer ").
  • fluorescent donor compound a fluorescent energy-donor compound
  • acceptor compound an energy accepting compound
  • FRET signal any measurable signal representative of a FRET between a fluorescent donor compound and an acceptor compound.
  • a FRET signal can therefore be a variation of the intensity or of the lifetime luminescence of the donor fluorescent compound or the acceptor compound when the latter is fluorescent.
  • TR-FRET an analog for "time-resolved" FRET.
  • solid tissue sample is meant a sample taken from a patient, and preferably an extract of tumor tissue.
  • quantification method is meant a relative quantification method, i.e. the measured signal will be different from one sample to another, depending on the amount of protein of interest present in the sample. 'sample.
  • This technique differs from conventional immunohistochemistry methods insofar as it uses two ligands (in particular two antibodies) specific for the protein of interest, and not just one as in the methods of the prior art. It also includes a washing step which is generally not implemented when the FRET technique is used since this approach allows measurements in a homogeneous medium.
  • the method according to the invention requires steps of preparation of the solid tissue sample in the form of sections of 20 to 50 microns thick.
  • preparation steps are those which are conventionally carried out in the field of those skilled in the art, namely immunohistochemistry. They can consist in particular of fixing the sample by treatment with formaldehyde, its inclusion in paraffin, in particular in the form of blocks which can then be cut with a microtome (preferably with a thickness of about 20 to 50 ⁇ m).
  • the treatment of these sections with xylene to remove paraffin, their rinsing with ethanol and then with water are also techniques known to those skilled in the art, as well as the regeneration of epitopes by the HIER technique (acronym "heat induced eptitope recovery").
  • cryosections preferably 20 to 50 ⁇ m thick, also prepared according to conventional techniques.
  • the method according to the invention comprises a step for homogenizing the sample in the form of a cell lysate, after the introduction of the fluorescent compounds in the measuring medium (first ligand, second ligand and labeling agent), and prior to the measuring the FRET signal.
  • a treatment may be mechanical, and may be chosen from: the application of ultrasound (sonication), freeze / thaw cycles, the use of mechanical mills, optionally together with the use of hypotonic lysis buffer or lysis buffer containing detergents such as RIPA buffer.
  • the final concentrations of first and second ligand in the measuring medium are optimally higher than 10 nM, preferably between 10 and 150 nM or between 20 and 80 nM, and preferably between 30 and 60 nM.
  • final concentration is meant the concentration of these compounds in the measuring medium once all the reagents have been introduced into this medium.
  • concentration ranges are notably higher than the concentrations usually used in TR-FRET type assays, in which the Final concentrations of fluorescent ligands are of the order of nanomolar, ie less than 10 nM.
  • the method according to the invention provides for standardizing the FRET signal by the amount of biological material (tissue) present in the measuring medium.
  • the method according to the invention thus comprises the incubation of the tissue sample with a fluorescent labeling agent of the DNA (for example Hoechst 33342), before the washing step, and the FRET signal will be normalized. by the signal corresponding to the luminescence of this marking agent.
  • a fluorescent labeling agent of the DNA for example Hoechst 33342
  • the first and the second ligand are antibodies recognizing the protein of interest.
  • the term "antibody” must here be taken broadly and include any protein of the family of immunoglobulins or comprising a domain of an immunoglobulin, as well as a binding site specific to the protein of interest.
  • the antibodies can therefore be Fab, Fab 'fragments, single chain antibodies, immunoglobulin heavy or light chain variable domains.
  • the first ligand is a known ligand (such as an agonist or antagonist) of the protein of interest and is not an antibody, and the second ligand is an antibody. .
  • the binding site of the first ligand is different from the binding site of the antibody.
  • the protein of interest is a G-protein coupled receptor
  • G-protein coupled receptor one skilled in the art can refer to the database published by Okuno et al. (GLIDA: GPCR ligand database for chemical genomics drug discovery database and tools update.) Nucl. Acids Res., 36 (suppl_1), D907-912 ) to find ligands usable in the method according to the invention.
  • the protein of interest can be any protein expressed by the cells present in the measuring medium.
  • the method is particularly adapted to the study of membrane proteins, such as ion channels, receptors, in particular G-protein coupled receptors (GPCRs), receptors with tyrosine kinase (RTK) activity, such as for example: EGFR (HER1), HER2 , HER3, HER4.
  • GPCRs G-protein coupled receptors
  • RTK tyrosine kinase
  • the method is particularly useful for determining the expression of the HER2 protein in tissue samples, particularly tumor samples, to determine whether the affected patients are eligible for anti-HER2 treatment, particularly by an antibody. binding to HER2 protein such as trastuzumab (Herceptin TM). For this, the value obtained representing HER2 expression is compared with a reference threshold value beyond which patients are referred to an anti-HER2 type therapy.
  • the invention therefore relates to a method for selecting patients with cancers eligible for therapeutic treatment with an antibody binding to the HER2 protein, which method comprises the implementation of the quantification method according to the invention. in which protein is HER2.
  • the method according to the invention made it possible to detect the HER2 protein unequivocally in "HercepTest TM negative" patients, ie in patients whose results on this test rendered them ineligible for treatment. by the trastuzumab antibody (patient ranked 0, 1+ or 2+).
  • the method according to the invention is carried out on a sample of patient tissue whose results of immunohistochemical analysis of HER2 protein expression. are negative (0.1+ and 2+). This method is particularly valuable for patients who have undergone hormonal chemotherapy, especially when the latter has not improved their condition.
  • the protein of interest is different from a constitutively and exclusively expressed receptor in the form of homodimers.
  • the protein of interest is the EGFR receptor (HER1)
  • one of the ligands labeled by the FRET partners may be an anti-EGFR antibody and the other ligand the EGF or an anti-EGFR antibody (the anti-EGFR antibodies are commercially available).
  • the first and second ligands are preferably antibodies specific for the HER2 protein, in particular antibodies whose epitopes are located in the extracellular domain of this receptor. As indicated above, it is preferable that these epitopes are different.
  • the labeling of a ligand or an antibody by a fluorescent donor or acceptor compound is carried out by conventional conjugation techniques using the use of reactive groups.
  • the fluorescent donor or acceptor compounds are generally marketed in "functionalized” form, that is to say that they carry a reactive group capable of reacting with a functional group present on the compound to be labeled, in this case the ligand. .
  • the reactive group present on the donor or acceptor fluorescent compound is an electrophilic or nucleophilic group that can form a covalent bond when brought into contact with a suitable nucleophilic or electrophilic group, respectively.
  • electrophilic group Nucleophilic group Type of connection acrylamides thiols thioethers acyl halides amines / anilines carboxamides aldehydes amines / anilines imines aldehydes or ketones hydrazines hydrazones aldehydes or ketones hydroxylamines oxime alkyl sulfonates thiols thioethers anhydrides amines / anilines carboxamides aryl halide thiols thioethers aryl halide amines aryl amines aziridines thiols thio
  • donor and acceptor fluorescent compounds generally comprise a maleimide function or an activated ester, most often with an NHS (N-hydroxysuccinimidyl) group, which react with the thiol and amine groups respectively and can therefore be used for labeling.
  • the labeled antibodies are characterized by the final molar ratio (MRF) which represents the average number of ligand-grafted marker molecules.
  • the ligand When the ligand is of protein nature, it may be advantageous to use one of the functional groups naturally present in the proteins: the terminal amino group, the terminal carboxylate group, the carboxylate groups of the aspartic and glutamic acids, the amine groups of the lysines, guanidine groups of arginines, thiol groups of cysteines, phenol groups of tyrosines, indole rings of tryptophans, thioether groups of methionines, imidazole groups of histidines.
  • ligand does not have a functional group in the natural state
  • such groups can be introduced.
  • Methods for introducing functional groups are described in particular in C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd edition, LJ Kricka (1995), Ed. Academic Press Ltd., London, p. 66-72 .
  • Another approach for labeling a ligand with a fluorescent compound is to introduce a reactive group into the ligand, for example an NHS group or a maleimide group, and to bring it into the presence of a fluorophore carrying a functional group which will react with the reactive group to form a covalent bond.
  • a reactive group for example an NHS group or a maleimide group
  • the pairs of FRET partners are preferably constituted by a fluorescent donor compound and a fluorescent energy-accepting compound.
  • FRET is defined as a non-radiative energy transfer resulting from a dipole-dipole interaction between a donor and an energy acceptor. This physical phenomenon requires energy compatibility between these molecules. This means that the donor's emission spectrum must cover, at least partially, the absorption spectrum of the acceptor. According to Förster's theory, FRET is a process that depends on the distance separating the two molecules, donor and acceptor: when these molecules are close to each other, a FRET signal will be emitted.
  • Long-lived fluorescent energy-donor compounds (> 0.1 ms, preferably between 0.5 and 6 ms), in particular rare earth chelates or cryptates, are advantageous since they make it possible to carry out measurements in time resolved, that is to say to measure signals of TR-FRET (in English, "Time Resolved FRET") by overcoming the phenomenon of autofluorescence emitted by the measuring medium. They are for this reason and generally preferred for the implementation of the method according to the invention.
  • Dy3 + dysprosium
  • Sm3 + samarium
  • Nd3 + neodymium
  • Yb3 + ytterbium
  • Er3 + erbium
  • the ruthenium chelates in particular the complexes consisting of a ruthenium ion and several bipyridines such as ruthenium (II) tris (2,2'-bipyridine).
  • DTPA-cs124 Tb sold by the company Life Technologies of formula below (which can be coupled to the compound to be labeled via a reactive group R) and whose synthesis is described in US Pat. US 5,622,821 .
  • the fluorescent donor compound is chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate; a ruthenium chelate; and a quantum dye; europium and terbium chelates and cryptates being particularly preferred.
  • Dy3 + dysprosium
  • Sm3 + samarium
  • Nd3 + neodymium
  • Yb3 + ytterbium
  • Er3 + erbium
  • the fluorescent acceptor compounds may be chosen from the following group: allophycocyanines, in particular those known under the trade name XL665; organic luminescent molecules, such as rhodamines, cyanines (for example Cy5), squaraines, coumarines, proflavines, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives (marketed under the name “Bodipy”), the fluorophores known under the name “Atto”, the fluorophores known under the name "DY”, the compounds known under the name "Alexa”, nitrobenzoxadiazole.
  • organic luminescent molecules such as rhodamines, cyanines (for example Cy5), squaraines, coumarines, proflavines, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives (marketed under the name “Bodipy”)
  • the fluorescent acceptor compounds are chosen from allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavines, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives and nitrobenzoxadiazole.
  • cyanines and “rhodamines” should be understood respectively as “cyanine derivatives” and “rhodamine derivatives”. Those skilled in the art know these different fluorophores, commercially available.
  • the compounds "Alexa” are marketed by the company Invitrogen; the “Atto” compounds are marketed by Atto-tec; the compounds “DY” are marketed by the company Dyomics; the “Cy” compounds are marketed by Amersham Biosciences; the other compounds are marketed by various suppliers of chemical reagents, such as Sigma, Aldrich or Acros.
  • the following fluorescent proteins can also be used as fluorescent acceptor compounds: cyan fluorescent proteins (AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, mTFP1), green fluorescent proteins (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), yellow fluorescent proteins (EYFP, Topaz, Venus, mCitrin, YPet, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana), orange and red fluorescent proteins (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2 , mRFP1, JRed, mCherry, mStrawberry, HcRed1, mRaspberry, HcRed-Tandem, mPlim, AQ143), fluorescent proteins in the far-red (mKate, mKate2, tdKatushka2).
  • cyanine derivatives or fluoroscein are preferred as fluorescent acceptor compounds.
  • NIH / 3T3 cells (mouse fibroblasts not expressing the human EGFR receptor) were stably transfected with a plasmid containing the hEGFR coding sequence, and selected in a medium containing puromycin.
  • the line obtained, expressing the hEGFR receptor, will be named P1 .
  • P1 a line expressing the human HER2 protein was prepared (hereinafter " H2 " line).
  • the tumor obtained by xenografts of P1 cells on a mouse and fixed in formaldehyde according to a conventionally used protocol was then included in paraffin.
  • the blocks thus obtained were cut with a microtome (thickness ⁇ 20 ⁇ m) and the sections FFPE (acronym of "Formaldehyde Fixed Paraffin Embedded") thus obtained were stored in a tube type eppendorff at 4 ° C until use.
  • the section whose epitopes of EGFR were regenerated by heat treatment was resuspended in an incubation buffer consisting of 180 ⁇ l of 50 mM HEPES buffer pH7 containing a cocktail of protease inhibitors, 1% BSA, and a final concentration of 50 nM of an EGFR-specific Ab15 antibody (Thermo Fisher) labeled with Lumi4® Tb cryptate (Ab15-Lumi4Tb®, Cisbio Bioassays) and 50 nM of a REGF01 antibody also specific for EGFR (Cisbio Bioassays) and labeled with the acceptor d2 fluorophore (Cisbio Bioassays), which emit at 665 nm (REGF01-d2).
  • HIER Heat Induced Epitope Recovery
  • a "negative control" sample (not expressing the EGFR receptor) was prepared similarly but from a tumor itself obtained by xenografts of H2 cells on a mouse. 100 ⁇ l of the lysate obtained were pipetted into each of the wells B1 and B2 of the black microplate so as to constitute a negative control.
  • the plate is measured in TRF mode simultaneously at 620 nm (luminescence of the Lumi4Tb® donor) and 665 nm (luminescence of the d2 acceptor).
  • H460c corresponds to the fluorescence at 460 nm of the Hoechst 33342 compound, measured in conventional fluorescence mode.
  • Table 4 H2 cells (no hEGFR) P1 cells (hEGFR) E665 4040 4060 169,700 164,200 E665c 3,875 3,900 169,560 164,060 B665 2,920 2,860 9 940 9 8100 ⁇ 665 960 1,035 159,630 154,250 H460c 32,300 34,100 57,630 60,270 ⁇ 665N 297 303 27,699 25,593 Mean ⁇ 665N 300 26,646
  • E620c emission values obtained were reported in the following table.
  • Table 5 EGF-Lumi 4 Tb (nM) 0.031 0,063 0,125 0.25 0.5 1 E620c 634 930 1,490 3,050 5,500 10,850
  • the E620c f (EGF-Lumi4Tb) graph gave the correspondence between E620c and the nM concentration of EGF-Lumi4Tb (see figure 3 ).
  • the plate was incubated 4 hours at 20 ° C (in the dark) before the addition of 10 .mu.l of Hoechst 33342 (2mg solution / ml in DMSO extemporaneously at prediluted 1/100 in KREBS) in wells A3 at A12 and incubation for an additional 1 hour at 20 ° C. All the wells were then washed with 4 times 100 ⁇ l of KREBS buffer and 100 ⁇ l of the same buffer added to each well. A time resolved fluorescence reading was performed with the same parameters as above.
  • EGF-Lumi4 Tb binding is of the order of 0.096 nM.
  • the specific binding of EGF-Lumi4 Tb on the cells (wells A5 to A8) is of the order of 0.348 nM.
  • the signal-to-noise ratio when a single ligand of the receptor of interest is used (EGF-Lumi4Tb) is 3.6 which is relatively low.
  • the signal-to-noise ratio is 3.78 after normalization of the values by the Hoechst 33342 signal, which is also relatively low.
  • Ab10 binds to an epitope close to the EGFR binding site because this antibody disrupts the binding of EGF to EGFR.
  • the addition of excess EGF must also disturb the binding of the antibody, which makes it possible to estimate the non-specific binding of this antibody by adding an excess of EGF.
  • Fluorescence measurements were made in fluorescence mode by exciting the acceptor at 640 nm and measuring its emission ("fast fluorescence") at 680 nm (given the bandwidth of the filters it is possible to assimilate the measurements made with a "665 nm” and "680 nm” filter being, in both cases, a measurement corresponding to the "acceptor” channel) No. of flashes per well 100
  • Optical Module FI 640 680 Excitation 640 Emission (nm) 680 Gain 2459
  • E680c after subtraction of the buffer blank measured at 680 nm made it possible to obtain the concentrations of nM antibody bound to the cells using a calibration range of Ab10-d2 (1nM at 0.031 nM).
  • the signal-to-noise ratio when a single ligand of the receptor of interest is used (Ab10-d2) is therefore 1.58, which is relatively low.
  • E665c 0.102 x E620, which makes it possible to obtain the B665 values corresponding to the contribution of the emission of terbium .
  • the signal obtained at 665nm represents the signal emitted by the acceptor (Ab10-d2) excited by FRET with the donor (EGF-Lumi4 Tb).
  • the signal-to-noise ratio when the method according to the invention is implemented, that is to say by using two ligands labeled by FRET partners, is 6.0, which is higher than what is observed. with the labeled ligand alone or the labeled antibody alone.
  • normalization using the Hoechst 33342 signal was performed by dividing the ⁇ 665 signal by the fluorescence value measured at 460nm in "classical" fluorescence mode for the Hoechst / DNA complex. in each well (and multiplying by 100,000 to obtain whole numbers).
  • the signal-to-noise ratio is then 6.29, which is higher than observed with the labeled ligand alone or the labeled antibody alone.
  • KREBS buffer / HEPES mmol / L NaCl 99; KCl 4.69; CaCl 2 1.87; MgSO 4 1.2; K 2 HPO 4 1.03; NaHCO 3 25; Na-HEPES 20 + glucose 11.1 mM + 0.1% BSA pH 7.4].
  • CHO cells Hamster Ovary Chines
  • the wells were washed and the fluorescence measured under the same conditions.
  • the average signal emitted by Cetuximab-Lumi4 Tb alone is 24,033 UAF (arbitrary fluorescence units) for A431 cells and 1,170 UFA for CHO cells, a signal-to-noise ratio of 21.
  • the method according to the invention was used to quantify the expression of EGFR and HER2 proteins, in tumor samples from patients, in particular mammary tumors.
  • the method was carried out in a manner similar to Example 1: the fluorophores Lumi4®Tb and d2 (Cisbio bioassays) were used as FRET partners, respectively donor and acceptor.
  • the antibodies cetuximab (Merck KGaA) and Ab-10 (Thermo Scientific) both recognizing distinct epitopes of EGFR, were used and labeled respectively by the fluorophores Lumi4®Tb and d2.
  • the antibodies trastuzumab (Roche Pharma AG) and FRP5 described by Harwerth IM et al (1992) J. Biol. Chem. 267: 15160-15167 ), both specific for different HER2 epitopes, were also conjugated with Lumi4®Tb and d2, respectively.
  • tumor cryosections of 50 .mu.m were incubated overnight in 180 .mu.l of TR-FRET buffer (1X PBS / 10% BSA) containing 50 nM of each of the two antibodies.
  • DNA staining was then performed by adding 20 ⁇ l of Hoechst 33342 (Invitrogen) 0.1 mg / ml solution and incubating at room temperature for 10 min. After washing and centrifugation, the samples were resuspended in TR-FRET buffer, sonicated, and transferred to a microplate.
  • the fluorescence signals of Lumi4®Tb and d2 were respectively measured at 620 and 665 nm in resolved time mode (60 ⁇ s delay, 400 ⁇ s window) after excitation at 337 nm using a Pherastar ® fluorimeter (BMG Labtech).
  • the signal from Hoechst 33342 was measured in fluorescence mode at 460 nm.
  • F corrected F sample - F background noise , wherein the background noise values were obtained by measuring the fluorescence of the TR-FRET buffer alone.
  • the fluorescence signals measured on solutions obtained by dilution in 1 ⁇ 2 cascade (so as to obtain a concentration range) from a stock solution containing a mixture of 50 nM antibodies-Lumi4 ® -Tb and 50 nM antibody-d2 were measured simultaneously with the samples, and the signal obtained at 665 nm was matched with that measured at 620 nm for each antibody concentration.
  • the curve thus obtained was used to calculate the contribution of fluorescence of Lumi4®-Tb at 665 nm (F 665Tb ) from the signal emitted by the samples at 620 nm.
  • the number of receptors per cell was first evaluated on NIH / 3T3 EGFR, NIH / 3T3 HER2, NIH / 3T3 EGFR / HER2 cell lines. and SKOV-3.
  • cells in culture were analyzed by FACS using an indirect quantitative assay by immunofluorescence (QIFI kit, Dako) as previously described ( Gaborit et al. 2011 J Biol Chem., 286 (13): 11337-45 ).
  • the expression of EGFR and HER2 was measured in mouse xenograft samples derived from the corresponding tumor cells, using the TR-FRET assays.
  • xenograft values were used as standards to convert the TR-FRET signal in number of receptors per cell.
  • the results obtained with the 18 breast tumor specimens are presented in the figure 4 .
  • the median levels of expression observed are 2,800 EGFR / cell (range 220 to 35,500) and 49,800 HER2 / cell (range 11,500 to 584,000).
  • HER2 expression levels were 66-fold higher than those of EGFR.
  • the reproducibility of the results was verified by replicating the experiments three times for each sample.
  • the mean coefficients of variation (CV) were 22% for EGFR and 19% for HER2 quantification analysis. This variability takes into account biological variability as different cryosections were used for each experiment.
  • RNA of each tumor was extracted for RT-qPCR analysis.
  • the expression of HER2 was evaluated using the HercepTest TM as well as by measuring the amplification of the gene coding for HER2 by analyzes. FISH and quantitative PCR.
  • the results of this analysis, presented in the figure 5 showed no overlap in TR-FRET expression levels between HER2-Herceptest TM positive and HER2-Herceptest TM negative tumors. Only five breast tumors with> 150,000 HER2 / cell had a HercepTest TM score of 3+ and were positive for gene amplification tests of HER2.
  • the method according to the invention makes it possible to detect the overexpression of HER2 with a specificity and sensitivity of 100% in tumor samples, which makes it particularly valuable for assessing the susceptibility of patients to respond to certain cancer treatments targeting HER2. (such as treatment with trastuzumab, Herceptin TM).
  • HER2 quantification method that can be used, for example, in the hospital, makes it possible to evaluate the number of HER2 proteins per cell of patient samples. It does not have the disadvantages of immunohistochemical staining and FISH technique.
  • HER2 expression was quantified by the method described in Example 4 on frozen samples of tumors from 100 breast cancer patients. The measurement of normalized fluorescence signals allowed a quantitative measurement of HER2 receptor expression.
  • Disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) were evaluated for each patient.
  • Quantitative measurement of HER2 expression by the method of the invention can predict the outcome of the disease in subjects with IHC-HER2 negative and ER positive breast cancers.
  • This biomarker may be useful for identifying patients whose hormone therapy is not effective enough and who could benefit from adjuvant treatment with Herceptin TM anti-HER therapy. This is one of the major contributions of the invention to be able to improve the selection of patients likely to be able to respond to this type of treatment.

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Description

  • L'invention concerne une méthode améliorée de détection et / ou de quantification protéine dans un échantillon, en particulier un échantillon de tissu
    • Etat de la technique
  • L'immunohistochimie (IHC) est le nom d'une méthode de localisation de protéines dans les cellules d'une coupe de tissu, par la détection d'antigènes au moyen d'anticorps. L'immunohistochimie exploite le fait qu'un anticorps se lie spécifiquement à des antigènes dans les tissus biologiques. Les anticorps peuvent être d'origine polyclonale ou monoclonale, les anticorps monoclonaux étant plus spécifiques par essence.
  • Un couple anticorps-antigène peut être visualisé de plusieurs façons. Dans la plupart des cas, un anticorps est conjugué à une enzyme (phosphatase alcaline, peroxydase de raifort notamment) générant des produits fortement colorés en présence d'un substrat chromogène (comme le DAB pour la peroxydase de raifort ?) ou bien un fluorophore (FITC, TRITC, AMCA etc.). L'analyse densitométrique du signal obtenu avec les méthodes chromogéniques ou de fluorescence peut fournir des données semi-quantitatives ou quantitatives respectivement, et permet de corréler le niveau du signal mesuré avec le niveau d'expression de protéines ou de localisation. Elle permet une détection semi-quantitative basée sur l'observation au microscope par un anatomo-pathologiste qui classe la coupe en « négative » ou « positive » (1+, 2+ ou 3+).
  • L'immunohistochimie est largement utilisée pour le diagnostic et/ou le suivi de cancers par détection de cellules anormales telles que celles trouvées dans les tumeurs cancéreuses. Des marqueurs spécifiques sont ainsi aujourd'hui connus pour divers cancers, tels que l'Antigène carcino-embryonnaire (CEA), utilisé en cas de cancer du côlon, CD15 et CD30, utilisés pour la maladie de Hodgkin, l'Alpha-foetoprotéine, utilisée dans la cadre de carcinomes hépatocellulaires, CD117, marqueur des tumeurs stromales gastro-intestinales et Ki-67, un des indices de prolifération tumorale. Ces marqueurs moléculaires sont caractéristiques de certains évènements cellulaires tels que la prolifération ou la mort cellulaire (apoptose).
  • L'immunohistochimie est aussi largement utilisée en recherche fondamentale pour comprendre la distribution et la localisation de biomarqueurs et de protéines exprimés dans les différentes parties d'un tissu biologique.
  • Deux approches sont utilisées en immunohistochimie : une méthode directe et une méthode indirecte. La méthode directe ne comporte qu'une seule étape de coloration et est basée sur l'utilisation d'un anticorps marqué qui réagit directement avec l'antigène dans les coupes de tissus. Bien que cette technique soit simple et rapide, sa sensibilité est faible en raison de l'absence d'amplification du signal. La méthode indirecte consiste à utiliser un anticorps primaire non marqué, spécifique de l'antigène d'intérêt, et un anticorps secondaire marqué reconnaissant les IgG de l'espèce animale dans laquelle l'anticorps primaire a été préparé. Cette méthode est plus sensible que les stratégies de détection directe en raison de l'amplification du signal due à la liaison de plusieurs anticorps secondaires à chaque anticorps primaire.
  • Les techniques classiques d'immunohistochimie nécessitent plusieurs étapes avant la coloration finale de l'antigène tissulaire, et de nombreux problèmes potentiels peuvent affecter le résultat de la procédure. Les problèmes les plus fréquemment rencontrés sont un bruit de fond trop important, un marquage insuffisant de l'antigène et des problèmes d'autofluorescence. Pour réduire le bruit de fond lié à la fixation non-spécifique de l'anticorps primaire ou secondaire sur des protéines présentes dans l'échantillon, ces derniers sont généralement incubés avec un tampon qui bloque les sites réactifs auxquels l'anticorps primaire ou secondaire peut se lier. Les tampons de blocage les plus fréquemment utilisé sont : le sérum normal, du lait en poudre non gras, de l'albumine sérique bovine (BSA) ou de la gélatine, et d'autres tampons aux formulations particulières sont également disponibles dans le commerce. Gaborit et al. (J. Biol. Chem. 2011, 86(13) : 11337-11345) décrit une méthode pour évaluer l'efficacité d'une thérapie ciblée utilisant des anticorps monoclonaux, méthode dans laquelle : un nombre connu de cellules sont placés dans les puits d'une plaque de microtitration et marqués à l'aide d'anticorps fluorescents ; les cellules sont incubées, marquées puis lavées ; et un signal de FRET est mesuré directement dans les puits. Les fiches techniques « TR-FRET-Basics » (URL :http://www.htrf.com/technology/htrftheory/tr_basics) et « Homogeneous Time Resolved Fluorescence ; Methodological aspects » (URL :http://www.htrf.com/files/resources/6182008_htrf an01.pdf) décrivent de manière succincte la technologie TR-FRET. Maurel et al. (Analytical Biochemistry 2004, 329(2), 253-252) décrit l'utilisation de la technologie TR-FRET pour détecter des interactions entre protéines membranaires. Diermeier-Daucher et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008, 1130: 280-286) décrit la quantification de l'homodimérisation par la technique du FRET en flux cytométrique, en utilisant des anticorps marqués par une cyanine.
  • Il existe un besoin pour une technique d'analyse d'échantillons biologiques, en particulier de tissus, ne présentant pas les inconvénients des techniques classiques en termes de bruit de fond notamment.
  • L'invention permet de résoudre ces problèmes, en particulier elle réduit drastiquement le bruit de fond observé lorsque les approches classiques d'immunohistochimie sont mises en oeuvre, à savoir lorsqu'un seul anticorps est utilisé pour détecter la protéine d'intérêt.
    • Description
  • L'invention a pour objet une méthode utilisant de manière avantageuse un couple de partenaires de FRET pour quantifier des protéines présentes à la surface d'une cellule ou dans un échantillon de tissu. L'invention à également pour objet un nécessaire de réactifs pour la mise en oeuvre de cette méthode, et l'application de cette méthode à la protéine HER2 dans le cadre d'une méthode théranostique pour déterminer si des patients souffrant de cancer du sein sont éligibles à un traitement par un anticorps anti-HER2.
  • Par « couple de partenaires de FRET » on entend un couple constitué d'un composé fluorescent donneur d'énergie (ci-après « composé fluorescent donneur ») et d'un composé accepteur d'énergie (ci-après « composé accepteur »); lorsqu'ils sont à proximité l'un de l'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé fluorescent donneur, ces composés émettent un signal de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Forster Resonnance Energy Transfer »).
  • Par « Signal de FRET » on entend tout signal mesurable représentatif d'un FRET entre un composé fluorescent donneur et un composé accepteur. Un signal de FRET peut donc être une variation de l'intensité ou de la durée de vie de luminescence du composé fluorescent donneur ou du composé accepteur lorsque ce dernier est fluorescent. Lorsque le signal de FRET est mesuré en temps résolu (ce qui est en général le cas lorsque des chélates ou cryptates de terres rares sont utilisés), on parle de TR-FRET (acronyme de « time-resolved » FRET).
  • Un premier aspect de l'invention est relatif à une méthode de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon de tissu solide, comprenant les étapes suivantes :
    1. (i) mise en contact d'un échantillon de tissu solide exprimant ladite protéine avec un premier ligand et un deuxième ligand, chacun de ces ligands étant capables de se lier de manière spécifique à un domaine de ladite protéine, et ces ligands étant respectivement marqués par un composé donneur et un composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de FRET ;
    2. (ii) incubation de l'échantillon de tissu solide avec un agent de marquage fluorescent de l'ADN ;
    3. (iii) lavage de l'échantillon de tissu solide ;
    4. (iv) homogénéisation de l'échantillon de tissu solide sous forme de lysat cellulaire ;
    5. (v) mesure du signal de FRET émis par le milieu de mesure et normalisation de ce signal par le signal correspondant à la luminescence de l'agent de marquage fluorescent de l'ADN.
  • Par «échantillon de tissu solide », on entend un échantillon prélevé sur un patient, et de préférence un extrait de tissu tumoral.
  • Par « méthode de quantification » on entend une méthode de quantification relative, c'est-à-dire que le signal mesuré va être différent d'un échantillon à l'autre, en fonction de la quantité de protéine d'intérêt présente dans l'échantillon. Cette technique se distingue des méthodes classiques d'immunohistochimie dans la mesure où elle met en oeuvre deux ligands (en particulier deux anticorps) spécifiques de la protéine d'intérêt, et non pas un seul comme dans les méthodes de l'art antérieur. Elle comprend également une étape de lavage qui n'est généralement pas mise en oeuvre lorsque la technique de FRET est utilisée puisque cette approche permet des mesures en milieu homogène. Cette méthode, combinée au fait que le signal de FRET ne sera émis que lorsque ces ligands (ou anticorps) sont à proximité l'un de l'autre, résulte en un rapport signal / bruit bien meilleur que celui observé avec les protocoles classiques, à savoir ceux mettant en oeuvre un seul ligand ou anticorps.
  • La méthode selon l'invention nécessite des étapes de préparation de l'échantillon de tissu solide sous forme de sections de 20 à 50 µm d'épaisseur. Ces étapes de préparation sont celles qui sont classiquement mises en oeuvre dans le domaine de l'homme du métier, à savoir l'immunohistochimie. Elles peuvent consister en particulier en la fixation de l'échantillon par un traitement avec du formaldéhyde, son inclusion dans de la paraffine, en particulier sous forme de blocs qui peuvent être ensuite découpés au microtome (de préférence avec une épaisseur d'environ 20 à 50 µm). Le traitement de ces sections au xylène pour enlever la paraffine, leur rinçage à l'éthanol puis à l'eau sont également des techniques connues de l'homme du métier, de même que la régénération des épitopes par la technique HIER (acronyme de l'expression anglaise « heat induced eptitope recovery »).
  • De manière alternative, la méthode selon l'invention peut également être mise en oeuvre sur des cryosections, de préférence de 20 à 50 µm d'épaisseur, également préparées selon les techniques classiques.
  • La méthode selon l'invention comporte une étape visant à homogénéiser l'échantillon sous forme de lysat cellulaire, postérieurement à l'introduction des composés fluorescents dans le milieu de mesure (premier ligand, deuxième ligand et agent de marquage), et préalablement à la mesure du signal de FRET. Un tel traitement peut être mécanique, et peut être choisi parmi : l'application d'ultrasons (sonication), des cycles de congélation / décongélation, l'utilisation de broyeurs mécaniques, éventuellement conjointement à l'utilisation de tampon de lyse hypotonique ou de tampon de lyse contenant des détergents comme le tampon RIPA.
  • Par ailleurs, il a été déterminé que les concentrations finales de premier et deuxième ligand dans le milieu de mesure sont, de manière optimale, supérieures à 10 nM, de préférence comprises entre 10 et 150 nM ou entre 20 et 80 nM, et de préférence entre 30 et 60 nM. Par concentration finale, on entend la concentration de ces composés dans le milieu de mesure une fois que tous les réactifs ont été introduits dans ce milieu. Ces domaines de concentrations sont notablement plus élevés que les concentrations habituellement utilisées dans les dosages de type TR-FRET, dans lesquels les concentrations finales de ligands fluorescents sont de l'ordre du nanomolaire, c'est à dire inférieures à 10 nM.
  • La méthode selon l'invention prévoit de normaliser le signal de FRET par la quantité de matériel biologique (tissu) présent dans le milieu de mesure. La méthode selon l'invention comprend ainsi l'incubation de l'échantillon de tissu avec un agent de marquage fluorescent de l'ADN (par exemple le Hoechst 33342), préalablement à l'étape de lavage, et le signal de FRET sera normalisé par le signal correspondant à la luminescence de cet agent de marquage.
  • Dans une mise en oeuvre préférée, le premier et le deuxième ligand sont des anticorps reconnaissant la protéine d'intérêt. Le terme « anticorps » doit ici être pris au sens large et comprends toute protéine de la famille des Immunoglobulines ou bien comportant un domaine d'une immunoglobuline, ainsi qu'un site de liaison spécifique à la protéine d'intérêt. Les anticorps peuvent donc être des fragments Fab, Fab', des anticorps simple chaîne, des domaines variables de chaînes lourdes ou légères d'immunoglobulines.
  • L'homme du métier est à même de fabriquer des anticorps spécifiques de la protéine dont il souhaite déterminer l'expression en utilisant les techniques classiques. De nombreux anticorps sont également disponibles dans le commerce. L'homme du métier veillera à sélectionner des anticorps reconnaissant des épitopes différents sur la protéine d'intérêt, cela pour permettre leur fixation simultanée à cette protéine.
  • D'autres ligands peuvent être utilisés en lieu et place des anticorps. Ainsi dans une mise en oeuvre particulière de l'invention, le premier ligand est un ligand connu (tel qu'un agoniste ou un antagoniste) de la protéine d'intérêt et n'est pas un anticorps, et le deuxième ligand est un anticorps. Là encore il est préférable que le site de liaison du premier ligand soit différent du site de liaison de l'anticorps.
  • Si la protéine d'intérêt est un récepteur couplé aux protéines G, l'homme du métier pourra se référer à la base de données publiée par Okuno et al. (GLIDA: GPCR ligand database for chemical genomics drug discovery database and tools update. Nucl. Acids Res., 36(suppl_1), D907-912) pour trouver des ligands utilisables dans la méthode selon l'invention.
  • La protéine d'intérêt peut être toute protéine exprimée par les cellules présentes dans le milieu de mesure. La méthode est particulièrement adaptée à l'étude de protéines membranaires, telles que les canaux ioniques, les récepteurs, en particulier les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), tels que par exemple : EGFR (HER1), HER2, HER3, HER4.
  • La méthode est particulièrement utile pour déterminer l'expression de la protéine HER2 dans des échantillons de tissus, en particulier des échantillons de tumeurs, pour déterminer si les patients concernés sont éligibles à un traitement de type anti-HER2, en particulier par un anticorps se liant à la protéine HER2 comme le trastuzumab (Herceptin™). Pour cela la valeur obtenue représentant l'expression de HER2 est comparée à une valeur seuil de référence au delà de laquelle les patients sont orientés vers une thérapie de type anti-HER2. Dans un deuxième aspect, l'invention concerne donc une méthode de sélection de patients atteints de cancers éligibles à un traitement thérapeutique par un anticorps se liant à la protéine HER2, méthode qui comprend la mise en oeuvre de la méthode de quantification selon l'invention dans laquelle protéine est HER2.
  • De manière tout à fait surprenante, la méthode selon l'invention a permis de détecter la protéine HER2 de manière non équivoque chez des patients « HercepTest™négatifs », à savoir chez des patients dont les résultats à ce test les rendaient inéligibles à un traitement par l'anticorps trastuzumab (patient classés 0, 1+ ou 2+). Ainsi, dans une mise en oeuvre particulièrement utile d'un point de vue clinique, la méthode selon l'invention est mise en oeuvre sur un échantillon de tissu de patient dont les résultats d'analyse par immunohistochimie de l'expression de la protéine HER2 sont négatifs (0,1+ et 2+). Cette méthode est particulièrement précieuse pour les patients ayant subi une chimiothérapie hormonale, en particulier lorsque cette dernière n'a pas entrainé d'amélioration de leur état.
  • Dans une mise en oeuvre préférée, la protéine d'intérêt est différente d'un récepteur exprimé de manière constitutive et exclusive sous forme d'homodimères.
  • Dans le cas où la protéine d'intérêt est le récepteur EGFR (HER1) l'un des ligands marqués par les partenaires de FRET peut être un anticorps anti-EGFR et l'autre ligand l'EGF ou un anticorps anti-EGFR (les anticorps anti-EGFR étant disponibles dans le commerce).
  • Dans le cas où la structure protéique d'intérêt est la protéine HER2, le premier et le deuxième ligands sont de préférence des anticorps spécifiques de la protéine HER2, en particulier des anticorps dont les épitopes sont situés dans le domaine extracellulaire de ce récepteur. Comme indiqué plus haut, il est préférable que ces épitopes soient différents.
    • Marquages des anticorps par des composés donneurs ou accepteurs d'énergie
  • Le marquage d'un ligand ou d'un anticorps par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation de groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme « fonctionnalisée », c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le composé à marquer, en l'occurrence, le ligand.
  • Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou accepteur est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous :
    Groupe électrophile Groupe nucléophile Type de liaison
    acrylamides thiols thioéthers
    halogénures d'acyle amines/anilines carboxamides
    aldéhydes amines/anilines imines
    aldéhydes ou cétones hydrazines hydrazones
    aldéhydes ou cétones hydroxylamines oximes
    alkyl sulfonates thiols thioéthers
    anhydrides amines/anilines carboxamides
    halogénure d'aryle thiols thioéthers
    halogénure d'aryle amines aryl amines
    aziridines thiols thioéthers
    carbodiimides acides carboxyliques N-acylurées ou anhydrides
    esters activés* amines/anilines carboxamides
    haloacétamides thiols thioéthers
    halotriazines amines/anilines aminotriazines
    imido esters amines/anilines amidines
    isocyanates amines/anilines urées
    isothiocyanates amines/anilines thiourées
    maléimides thiols thioéthers
    sulfonate esters amines/anilines alkyl amines
    halogénures de sulfonyle amines/anilines sulfonamides
    * : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est :
    • un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-OC4H4NO2), sulfo succinimidyloxy (-OC4H3NO2-SO3H) ;
    • un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tel que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ;
    • un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride -OCORa ou -OCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes alkyles en C1-C6, perfluoroalkyles en C1-C6, alkoxy en C1-C6, cyclohexyle ;
    • le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle.
  • Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et amines respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les anticorps marqués sont caractérisés par le rapport molaire final (RMF) qui représente le nombre moyen de molécules de marqueur greffés au ligand.
  • Lorsque le ligand est de nature protéique, il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement présent dans les protéines: le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
  • Si le ligand ne comporte pas de groupe fonctionnel à l'état naturel, de tels groupes peuvent être introduits. Des méthodes d'introduction de groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd edition, L.J. Kricka (1995), Ed. Academic press Ltd., Londres, p. 66-72.
  • Une autre approche pour le marquage d'un ligand par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans le ligand, par exemple un groupe NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore portant un groupe fonctionnel qui réagira avec le groupe réactif pour former une liaison covalente.
  • Il est important de vérifier que le ligand marqué conserve une affinité suffisante pour son récepteur ; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante d'affinité du ligand marqué pour le récepteur.
    • Couples de partenaires de FRET
  • Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie.
  • Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Förster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis.
  • La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition, Kluwer academic/plenum publishers, NY (1999)), auquel l'homme du métier pourra se référer.
  • Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et 6 ms), en particulier les chélates ou cryptates de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET (en langue anglaise, « Time Resolved FRET ») en s'affranchissant du phénomène d'autofluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention.
  • Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de neodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptates d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés.
  • De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays.
  • Des exemples de chélates ou cryptates de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont :
    • Les cryptates de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492 , EP 0 321 353 , EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877 . Les cryptates de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptates de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptates d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
      Figure imgb0001
      Figure imgb0002
      Figure imgb0003
      Figure imgb0004
    • Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481 , US 5 032 677 , US 5 055 578 , US 5 106 957 , US 5 116 989 , US 4 761 481 , US 4 801 722 , US 4 794 191 , US 4 637 988 , US 4 670 572 , US 4 837 169 , US 4 859 777 . Les brevets EP 0 403 593 , US 5 324 825 , US 5 202 423 , US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer.
    • Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/10580 .
    • Les cryptates de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables.
    • Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
      Figure imgb0005
       et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page 89).
    • Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays.
    • Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
      Figure imgb0006
  • Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'-bipyridine).
  • Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821 .
    Figure imgb0007
  • Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of Luminescence 1997, 75: 149-169) :
    Figure imgb0008
  • De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les cryptates d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
  • Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont également des complexes de terres rares appropriés aux fins de l'invention.
  • Les composés fluorescents accepteurs peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination « Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
  • Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
  • Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » sont commercialisés par la société Atto-tec ; les composés « DY» sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
  • Les protéines fluorescentes suivantes peuvent également être utilisées en tant que composé fluorescent accepteur : les protéines fluorescentes cyans (AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, mTFP1), les protéines fluorescentes vertes (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), les protéines fluorescentes jaunes (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana), les protéines fluorescentes oranges et rouges (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2, mRFP1, JRed, mCherry, mStrawberry, HcRed1, mRaspberry, HcRed-Tandem, mPlim, AQ143), les protéines fluorescentes dans le rouge lointain (mKate, mKate2, tdKatushka2).
  • Aux fins de l'invention, les dérivés de cyanines ou de la fluoréscéine sont préférés comme composés fluorescents accepteurs.
    • Exemples Exemple 1
  • Des cellules NIH/3T3 (fibroblastes de souris n'exprimant pas le récepteur EGFR humain) ont été transfectées de manière stable à l'aide d'un plasmide contenant la séquence codant pour hEGFR, et sélectionnées dans un milieu contenant de la puromycine. La lignée obtenue, exprimant le récepteur hEGFR, sera par la suite nommée P1. De manière similaire (à l'exception du milieu de sélection qui contenait de l'hygromycine), une lignée exprimant la protéine HER2 humain a été préparée (ci-après lignée « H2 »).
  • La tumeur obtenue par xenogreffes de cellules P1 sur une souris et fixée dans le formaldéhyde selon un protocole classiquement utilisé a été ensuite incluse dans de la paraffine. Les blocs ainsi obtenus ont été coupée au microtome (épaisseur ∼ 20 µm) et les sections FFPE (acronyme de « Formaldehyde Fixed Paraffin Embedded ») ainsi obtenues ont été conservées dans un tube type eppendorff à 4°C jusqu'à utilisation.
  • A une section contenue dans un tube eppendorf ont été ajoutés 1,2 mL de substitut de Xylène et après 5 min d'incubation, le tube a été centrifugé (16 000 RCF) et le surnageant éliminé par pipetage. Le même processus a été renouvelé une fois, puis 1,2 mL d'Ethanol absolu ont été ajoutés. Après 3 min d'incubation le tube a été centrifugé (16 000 RCF) et le surnageant éliminé par pipetage. Le même processus a été renouvelé une fois, puis 1,2 mL d'Ethanol à 95% ont été ajoutés. Après 3 min d'incubation le tube a été centrifugé (16 000 RCF) et le surnageant éliminé par pipetage. Ensuite, 1,2 mL d'Ethanol à 50% ont été ajoutés, et après 3 min d'incubation le tube a été centrifugé (16 000 RCF) et le surnageant éliminé par pipetage. 0,5 mL de tampon 10 mM TRIS-HCl + EDTA (pH9) ont été ajoutés puis le tube fermé et chauffé au bain marie pendant 20 min. Après refroidissement (10 min) le tube a été centrifugé (16 000 RCF) et le surnageant éliminé par pipetage.
  • La section dont les épitopes d'EGFR ont été régénérés par traitement thermique (en Anglais : HIER pour Heat Induced Epitope Recovery) a été remise en suspension dans un tampon d'incubation constitué de 180 µL de tampon HEPES 50 mM pH7 contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases, 1 % de BSA, et une concentration finale de 50 nM d'un anticorps Ab15 spécifique d'EGFR (Thermo Fisher) marqué à l'aide de cryptate Lumi4® Tb (Ab15-Lumi4Tb®, Cisbio Bioassays) et de 50 nM d'un anticorps REGF01 également spécifique de EGFR (Cisbio Bioassays) et marqué à l'aide du fluorophore accepteur d2 (Cisbio Bioassays), qui émets à 665 nm (REGF01-d2).
  • Après 16h d'incubation à 20°C, 20 µL d'une solution de Hoechst 33342 à 20 µg/ mL dans du tampon ont été ajoutés, puis après 15 min d'incubation, le tube a été centrifugé (16 000 RCF), le surnageant éliminé par pipetage. Le culot a été remis en suspension dans 300 µL de tampon HEPES 50 mM contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéases et 0,1 % de BSA, et le tube a été centrifugé (16 000 RCF). Le cycle de lavage/centrifugation dans le même tampon a été répété deux fois, et les surnageant éliminés. Après sonication (5s à 20% d'intensité sur sonicateur Branson) permettant une homogénéisation, 100 µL du lysat obtenu ont été pipetés dans les puits B3 et B4 d'une microplaque noire (96 puits).
  • Un échantillon de « contrôle négatif » (n'exprimant pas le récepteur EGFR) a été préparé de manière similaire mais à partir d'une tumeur elle-même obtenue par xenogreffes de cellules H2 sur une souris. 100 µL du lysat obtenu ont été pipetés dans chacun des puits B1 et B2 de la microplaque noire de façon à constituer un témoin négatif.
  • Dans les puits adjacents ont été déposés également du tampon seul (BT : blanc tampon) et 100 µL de solutions diluées du mélange d'anticorps REGF01-d2 Ab15-Lumi4Tb® (tampon d'incubation) obtenus par dilution en cascade au ½ (dans le tampon HEPES 0,1% BSA) de façon à obtenir une gamme de concentration finale en anticorps marqués allant de 0,16 nM à 5 nM (puits A3 à A12). On a ensuite mesuré successivement en mode fluorescence (« prompt fluorescence » délai = 0 ; durée de mesure après délai = 20 µs) sur un appareil TECAN Saphir 2 en excitant l'accepteur (d2) à 640 nm et en lisant la fluorescence émise à 665 nm, puis la fluorescence en mode temps résolu simultanément à 620 nm (Lumi4Tb®) et 665 nm (délai = 60 µs ; durée de la mesure après délai = 400 µs) sur un appareil Pherastar (excitation par lampe flash) après excitation à 340 nm.
  • Les mesures en mode fluorescence à 665 nm (F665) des puits de la gamme (0,16 nM à 5 nM) permettent d'obtenir une droite étalon reliant la fluorescence corrigée pour chaque puits par soustraction de la fluorescence du tampon seul (B665) :
    • F665c = F665-B665 (voir figure 1).
  • Par interpolation on obtient la concentration en anticorps liés au matériel biologique. Tableau 1
    Cellules H2 (pas d'hEGFR) Cellules P1 (hEGFR)
    F665c 28 070 28 080 45 370 45 200
    Ac-d2 (nM) 2,8 2,8 4,6 4,6
  • Le rapport du signal spécifique (fixation REGF01-d2 sur EGFR) sur le signal du contrôle négatif est de 4,6 / 2,8 = 1,64, ce qui est un rapport signal/bruit relativement faible.
  • De la même façon les mesures en mode TRF à 620 nm des puits de la gamme (0,16 nM à 5 nM) permettent d'obtenir une droite étalon reliant la fluorescence corrigée pour chaque puits par soustraction de la fluorescence du tampon seul (B620) :
    • E620c = E620-B620 (voir figure 2).
    Tableau 2
    Cellules H2 (pas d'hEGFR) Cellules P1 (hEGFR)
    E620c 33 930 33 300 115 500 114 100
    AcLumi4 Tb (nM) 0,80 0,79 2,73 2,70
  • Le rapport du signal spécifique (fixation Ab15-Lumi4Tb® sur EGFR) sur le signal du contrôle négatif est de 2,72 / 0,8 = 3,4, ce qui est également relativement mauvais.
  • On mesure la plaque en mode TRF simultanément à 620 nm (luminescence du donneur Lumi4Tb®) et 665 nm (luminescence de l'accepteur d2).
  • Pour la gamme de calibration on obtient les valeurs suivantes, reportées dans le tableau3. Tableau 3
    Ac Lumi4 Tb (nM) 0,16 0,31 0,63 1,25 2,5 5
    E620 6 650 13 200 27 270 53 600 106 450 210 700
    E665 609 1 150 2 360 4 630 9 260 18 250
  • On trace le graphe représentant E665 = f(E620), et on obtient une droite dont la pente permet de calculer la contribution de l'émission résiduelle du terbium à 665 nm à partir du signal mesuré à 620 nm pour les échantillons H2 et P1 qui est nommé B665 dans le tableau suivant.
  • On calcule le signal de FRET restitué à 665 nm en calculant la différence entre le signal à 665 nm (E665c) et l'émission résiduelle du terbium dans le canal 665 nm : Δ665 = E665c - B665.
  • Dans le tableau ci-dessous H460c correspond à la fluorescence à 460nm du composé Hoechst 33342, mesurée en mode fluorescence classique. Tableau 4
    Cellules H2 (pas d'hEGFR) Cellules P1 (hEGFR)
    E665 4040 4060 169 700 164 200
    E665c 3 875 3 900 169 560 164 060
    B665 2 920 2 860 9 940 9 8100
    Δ665 960 1 035 159 630 154 250
    H460c 32 300 34 100 57 630 60 270
    Δ665N 297 303 27 699 25 593
    Δ665N moyen 300 26 646
  • Le rapport du signal spécifique obtenu selon l'invention (fixation REGF01-d2 et Ab15-Lumi4Tb® sur EGFR) sur le signal du contrôle négatif est de 26646 / 300 = 89, ce qui est excellent.
  • Cet exemple montre que la méthode selon l'invention permet d'obtenir un excellent rapport signal / bruit (facteur 89) alors que l'utilisation d'un seul anticorps marqué ne permets d'obtenir qu'un facteur de 3,42, au mieux, entre le signal spécifique et le bruit de fond.
    • Exemple 2
  • Dans les puits d'une plaque de microtitration (plaque noire 96 puits fond plat) des cellules de la lignée A431 (ATCC/CRL-1555 exprimant environ 2.106 récepteurs EGFR par cellule (Shinobu, 1984 Molecular and Cellular Endocrinology 37, 205) ont été distribuées à une densité de 25 000 cellules par puits et incubées une nuit à 37 °C en milieu DMEM de façon à obtenir un tapis de cellules adhérentes.
  • Après deux lavages par 100 µL de PBS, 50 µL de tampon KREBS ont été ajoutés par puits.
  • [Tampon Krebs/HEPES mmol/L: NaCl 99 ; KCI 4,69 ; CaCl2 1,87 ; MgSO4 1,2 ; K2HPO4 1,03 ; NaHCO3 25 ; Na-HEPES 20 + glucose 11,1 mM + 0,1% BSA pH 7,4].
  • Dans les puits A1 à A4 aucun autre réactif n'a été ajouté (blanc tampon). Dans les puits A9 à A12 ont été ajoutés 10 µL d'EGF 1µM dans du KREBS (pour saturer les sites de liaison à l'EGF), puis dans les puits A5 à A12 un mélange d'anticorps Ab10-d2 (anti-EGFR Ab10 Thermo Fisher Scientific marqué par du d2-NHS Cisbio Bioassays à un RMF = 1,8) et d'EGF-Lumi4 Tb (Cisbio Bioassays). Le volume de chaque puits a été complété à 100 µL par du tampon KREBS de façon à obtenir une concentration finale dans les puits de 5 nM en Ab10-d2 et 5 nM en EGF-Lumi4 Tb.
  • Dans des puits de la même plaque de microtitration, une gamme étalon a été constituée par dilution dans du tampon KREBS d'une solution mère contenant EGF-Lumi4 Tb et Ab10-d2 (dilution en cascade au ½ de façon à obtenir des concentrations finales en Ac de 1 nM à 0,031 nM). Une lecture en mode temps résolu a été effectuée sur un appareil Pherastar FS (BMG) en utilisant les paramètres suivants :
    Nombre de flashes par puits 300
    Module optique: HTRF
    Excitation (nm) 337
    Emission A (nm) 665
    Emission B (nm) 620
    Début de l'Intégration [µs]: 60
    Durée de l'Intégration [µs]: 400
    Hauteur de focalisation [mm]: 3.9
    Ratio multiplicateur: 10 000
    Source Lumineuse: lampe flash
  • Les valeurs d'émission E620c obtenues (après soustraction de la valeur du blanc B620 mesuré sur les puits A1 et A2 contenant uniquement du tampon) ont été reportées dans le tableau suivant. Tableau 5
    EGF-Lumi 4 Tb (nM) 0,031 0,063 0,125 0,25 0,5 1
    E620c 634 930 1 490 3 050 5 500 10 850
  • Le graphe E620c = f (EGF-Lumi4Tb) a permis d'obtenir la correspondance entre E620c et la concentration en nM de l'EGF-Lumi4Tb (voir figure 3).
  • La plaque a été incubée 4 heures à 20°C (à l'obscurité), avant l'ajout de 10 µL de Hoechst 33342 (solution 2mg/ml en DMSO prédiluée extemporanément au 1/100ème dans du KREBS) dans les puits A3 à A12 et incubation pendant 1 heure supplémentaire à 20°C. Tous les puits ont alors été lavés par 4 fois 100 µL de tampon KREBS et 100 µL du même tampon ajouté dans chaque puits. Une lecture de fluorescence en temps résolu a été effectuée avec les mêmes paramètres que ci-dessus. Tableau 6
    Puits 5 6 7 8 9 10 11 12
    Pas d'EGF ajouté + EGF (100nM final)
    E620c 3 870 4 710 3 390 3 280 1 180 1 340 770 910
    E620c moyen 3810 1 050
    EGF-Lumi4Tb (nM) 0,348 0,096
  • Les puits dans lesquels de l'EGF (100 nM final) a été ajouté pour saturer les sites de liaison des récepteurs EGFR exprimés par les cellules (puits A9 à A12), ont permis d'obtenir une valeur de fluorescence E620c (moyenne = 1050 UFA) qui représente le bruit de fond correspondant à la fixation non spécifique de l'EGF marqué au Lumi4 Tb sur les cellules. Grâce à la droite d'étalonnage il a pu être évalué que la fixation d'EGF-Lumi4 Tb est de l'ordre de 0,096 nM. La fixation spécifique d'EGF-Lumi4 Tb sur les cellules (puits A5 à A8) est de l'ordre de 0,348 nM. Le rapport signal/bruit lorsque un seul ligand du récepteur d'intérêt est utilisé (EGF-Lumi4Tb) est donc de 3,6 ce qui est relativement faible.
  • Pour tenir compte de la variabilité du nombre de cellules dans les puits (due notamment au décollement des cellules suite aux lavages) une normalisation utilisant le signal du Hoechst 33342 a été effectuée en divisant le signal E620c par la valeur de fluorescence à 460nm mesurée en mode fluorescence « classique » pour le complexe Hoechst/ADN dans chaque puits (et en multipliant par 100 000 pour obtenir des nombres entiers). Tableau 7
    H460c 67 380 99 330 79 590 106 300 82 990 109 800 74 400 88 000
    E620N 5 750 4 740 4 250 3 090 1 420 1 220 1 040 1 040
    E620N moyen 4 460 1 180
  • Le rapport signal/bruit est de 3,78 après normalisation des valeurs par le signal du Hoechst 33342, ce qui est également relativement faible.
    • Mesure de la fixation de l'Anticorps marqué (Ab10-d2):
  • D'après la fiche technique du fabriquant, l'Ab10 se fixe sur un épitope proche du site de liaison de l'EGFR car cet anticorps perturbe la liaison de l'EGF sur l'EGFR. L'ajout d'EGF en excès doit également perturber la fixation de l'anticorps ce qui permet d'estimer la liaison non spécifique de cet anticorps en ajoutant un excès d'EGF.
  • Des mesure de fluorescence ont été effectuées en mode fluorescence en excitant l'accepteur à 640 nm et en mesurant son émission (« prompt fluorescence ») à 680 nm (compte-tenu de la largeur de bande des filtres on est en droit d'assimiler les mesures faites avec un filtre « 665 nm » et « 680 nm » comme étant, dans les deux cas, une mesure correspondant au canal « accepteur »)
    No. de flashes par puits 100
    Module Optique: FI 640 680
    Excitation (nm) 640
    Emission (nm) 680
    Gain 2459
  • Les mesures E680c après soustraction du blanc tampon mesuré à 680 nm ont permis d'obtenir les concentrations en nM d'anticorps fixé sur les cellules en utilisant une gamme de calibration d'Ab10-d2 (1nM à 0,031 nM). Tableau 8
    3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
    pas d'EGF ajouté +EGF (100nM final)
    E680c 102 800 105 900 71 500 91 500 53 800 65 350 54 750 62 800
    E680c moyen 92 950 59 180
    Ab10-d2 (nM) 6,74 4,29
  • Le rapport signal/bruit lorsque un seul ligand du récepteur d'intérêt est utilisé (Ab10-d2) est donc de 1,58, ce qui est relativement faible
    • Mesure de la fixation des sondes fluorescentes par TR-FRET :
  • De façon analogue, les signaux à 620 nm et à 665nm ont été mesurés en mode temps résolu dans les puits contenant des dilutions d'EGF-Lumi4 Tb et d'Ab10-d2 (1nM à 0,031 nM). Tableau 9
    E620c 634 930 1 490 3 050 5 500 10 850
    E665c 13 43 106 220 466 1 210
  • La droite de corrélation entre E665c et E620c permet d'obtenir la contribution de l'émission du terbium dans le canal 665nm : E665 = 0.102 x E620, ce qui permet d'obtenir les valeurs B665 correspondant à la contribution de l'émission du terbium.
  • Les résultats des mesures à 665nm en temps résolu (paramètres ci dessus) ont été rassemblés dans le tableau suivant, dans lequel Δ665 = E665c - B665. Tableau 10
    Pas d'EGF ajouté + EGF (100nM final)
    Puits 5 6 7 8 9 10 11 12
    E665c 2060 2 390 1 600 1 860 390 480 290 320
    B665 395 480 345 335 120 137 79 93
    Δ665 1 660 1 910 1 260 1 520 270 340 215 223
    Δ665 moyen 1 588 262
  • Dans ce cas le signal obtenu à 665nm représente le signal émis par l'accepteur (Ab10-d2) excité par FRET avec le donneur (EGF-Lumi4 Tb).
  • Le rapport signal/bruit lorsque la méthode selon l'invention est mise en oeuvre, c'est-à-dire en utilisant deux ligands marqués par des partenaires de FRET, est de 6,0, ce qui plus élevé que ce qui est observé avec le ligand marqué seul ou l'anticorps marqué seul.
  • Pour tenir compte de la variabilité du nombre de cellules dans les puits, une normalisation utilisant le signal du Hoechst 33342 a été effectuée en divisant le signal Δ665 par la valeur de fluorescence mesurée à 460nm en mode fluorescence « classique » pour le complexe Hoechst/ADN dans chaque puits (et en multipliant par 100 000 pour obtenir des nombres entiers). Tableau 11
    Pas d'EGF ajouté + EGF (100nM final)
    Puits 5 6 7 8 9 10 11 12
    Δ665 1 660 1 910 1 260 1 520 270 340 215 223
    H460c 67 380 99 330 79 590 106 300 82 990 109 800 74 400 88 000
    Δ665N 2463 1923 1583 1430 325 309 289 253
    Δ665N moyen 1 849 294
  • Le rapport signal/bruit est alors de 6,29, donc plus élevé que ce qui est observé avec le ligand marqué seul ou l'anticorps marqué seul.
    • Exemple 3
  • Dans les puits d'une plaque de microtitration (plaque noire 96 puits fond plat) des cellules de la lignée A431 (ATCC/CRL-1555 exprimant environ 2.106 récepteurs EGFR par cellule (Shinobu, 1984 Molecular and Cellular Endocrinology 37, 205) ont été distribuées à une densité de 25 000 cellules par puits et incubées une nuit à 37 °C en milieu DMEM de façon à obtenir un tapis de cellules adhérentes.
  • On a lavé par 2x 100 µL PBS puis ajouté 50 µL de tampon KREBS par puits. [Tampon Krebs/HEPES mmol/L: NaCl 99 ; KCI 4,69 ; CaCl2 1,87 ; MgSO4 1,2 ; K2HPO4 1,03 ; NaHCO3 25 ; Na-HEPES 20 + glucose 11,1 mM + 0,1% BSA pH 7,4].
  • Dans les puits B1 à B4 aucun autre réactif n'a été ajouté (blanc tampon). Dans les puits B5 à B8 a été ajouté un mélange d'anticorps Ab10-d2 (anti-EGFR Ab10 Thermo Fisher Scientific marqué par du d2-NHS Cisbio Bioassays) et du Cetuximab-Lumi4 Tb (anti-EGFR) et le volume complété à 100 µL par du tampon KREBS de façon à obtenir une concentration finale dans les puits de 5 nM en Ab10-d2 et 5 nM en Cetuximab-Lumi4 Tb.
  • Dans des puits de la même plaque de microtitration, une gamme étalon a été constituée par dilution dans du tampon KREBS d'une solution mère contenant EGF-Lumi4 Tb et Ab10-d2 (dilution en cascade au ½ de façon à obtenir des concentrations finales en Ac de 1 nM à 0,031 nM). Une lecture en mode temps résolu a été effectuée sur un appareil Pherastar FS (BMG) en utilisant les paramètres suivants :
    Nombre de flashes par puits 300
    Module optique: HTRF
    Excitation (nm) 337
    Emission A (nm) 665
    Emission B (nm) 620
    Début de l'Intégration [µs]: 60
    Durée de l'Intégration [µs]: 400
    Hauteur de focalisation [mm]: 3,9
    Ratio multiplicateur: 10 000
    Source Lumineuse: lampe flash
  • Pour évaluer la fixation non spécifique des anticorps à la surface des cellules, des cellules CHO (Chines Hamster Ovary) ont été incubées avec la même solution d'anticorps marqués, les puits ont été lavés et la fluorescence mesurée dans les mêmes conditions.
  • Après lavage, le signal moyen émis par Cetuximab-Lumi4 Tb seul est de 24 033 UAF (unités arbitraires de fluorescence) pour les cellules A431 et de 1 170 UFA pour les cellules CHO, soit un rapport signal/bruit de 21.
  • Lorsque la méthode selon l'invention est mise en oeuvre et que l'on mesure le signal de FRET, on obtient un rapport signal/bruit bien meilleur, d'environ 520.
    • Exemple 4
  • Dans cet exemple, la méthode selon l'invention a été utilisée pour quantifier l'expression des protéines EGFR et HER2, dans des échantillons de tumeurs issues de patients, en particulier des tumeurs mammaires.
  • La méthode a été mise en oeuvre de manière similaire à l'exemple 1 : les fluorophores Lumi4®Tb et d2 (Cisbio bioassays) ont été utilisés comme partenaires de FRET, respectivement donneur et accepteur. Pour la mesure de l'expression de EGFR, les anticorps cetuximab (Merck KGaA) et Ab-10 (Thermo Scientific), tous deux reconnaissant des épitopes distincts de EGFR, ont été utilisés et marqués respectivement par les fluorophores Lumi4®Tb et d2. Pour la quantification de HER2, les anticorps trastuzumab (Roche Pharma AG) et FRP5 (décrit par Harwerth IM et al (1992) J. Biol. Chem. 267: 15160-15167), tous deux spécifiques d'épitopes différents de HER2, ont été également conjugués avec Lumi4®Tb et d2 respectivement.
  • Pour chaque dosage, des cryosections de tumeur de 50 µm ont été incubées une nuit dans 180 µl de tampon TR-FRET (1X PBS / 10% BSA) contenant 50 nM de chacun des deux anticorps. Une coloration de l'ADN a ensuite été effectuée par ajout de 20 µl d'une solution de Hoechst 33342 (Invitrogen) à 0,1 mg/mL et incubation à température ambiante pendant 10 min. Après lavage et centrifugation, les échantillons ont été remis en suspension dans le tampon TR-FRET, soumis à une sonication et transférés dans une microplaque. Les signaux de fluorescence de Lumi4®Tb et d2 ont été mesurés respectivement à 620 et 665 nm en mode temps résolu (délai 60 µs ; fenêtre 400µs) après excitation à 337 nm en utilisant un fluorimètre Pherastar ® (BMG Labtech). Le signal du Hoechst 33342 a été mesuré en mode fluorescence à 460 nm. Ces signaux ont été corrigés par le bruit de fond selon la formule : F corrigé = F échantillon − F bruitdefond ,
    Figure imgb0009
     dans laquelle les valeurs de Fbruitdefond ont été obtenues en mesurant la fluorescence du tampon de TR-FRET seul.
  • Par ailleurs pour chaque dosage, les signaux de fluorescence mesurés sur des solutions obtenues par dilution en cascade au ½ (de façon à obtenir une gamme de concentration) à partir d'une solution mère contenant un mélange de 50 nM d'anticorps-Lumi4 ®-Tb et 50 nM d'anticorps - d2 ont été mesurés simultanément avec les échantillons, et le signal obtenu à 665 nm a été mis en relation avec celui mesuré à 620 nm pour chaque concentration d'anticorps. La courbe ainsi obtenue a été utilisée pour calculer la contribution de la fluorescence de Lumi4®-Tb à 665 nm (F665Tb) à partir du signal émis par les échantillons à 620 nm . Le signal de TR-FRET a été exprimé de la manière suivante : Δ F 665 = F 665 échantillon − F 665 Tb
    Figure imgb0010
  • Le signal du complexe ADN-Hoechst 33342 à 460 nm (F460) a été utilisé pour normaliser le signal de TR-FRET pour tenir compte de la variabilité de la quantité de matériel biologique présent dans chaque milieu de mesure et en normalisant à une valeur moyenne de 100 000 unités de fluorescence (FU):
    • TR-FRETnormalisé = (ΔF665 X 100 000)/ (F460). Le signal de TR-FRET normalisé a été exprimé en FU.
  • Afin de convertir le signal de TR-FRET normalisé en nombre de récepteurs par cellule, le nombre de récepteurs par cellule a été tout d'abord évalué sur des lignées cellulaires NIH/3T3 EGFR, NIH/3T3 HER2, NIH/3T3 EGFR/HER2 et SKOV-3. Pour cela, des cellules en culture ont été analysées par FACS en utilisant un dosage quantitatif indirect par immunofluorescence (QIFI kit, Dako) comme décrit précédemment (Gaborit et al. 2011 J Biol Chem., 286(13):11337-45). En parallèle, l'expression de EGFR et HER2 a été mesurée dans des échantillons de xénogreffes de souris dérivées des cellules tumorales correspondantes, en utilisant les essais TR-FRET. Ainsi, sur la base de l'hypothèse selon laquelle l'EGFR et HER2 sont exprimés à des niveaux comparables dans les cultures cellulaires et dans les xénogreffes de tumeurs dérivées de ces cellules, les valeurs obtenues dans les xénogreffes ont été utilisées comme étalons pour convertir le signal de TR-FRET en nombre de récepteurs par cellule.
    • Résultats : Expression de EGFR et HER2
  • Les résultats obtenus avec les 18 échantillons de tumeurs mammaires sont présentés dans la figure 4. Les niveaux médians d'expression observés sont de 2 800 EGFR / cellule (plage de 220 à 35 500) et de 49 800 HER2/cellule (plage de 11 500 à 584 000). Cinq des 18 tumeurs (soit 27,8%) exprimaient des niveaux très élevés de HER2 (216 800, 234 300, 391 000, 491 500 et 584 000 HER2/cellule). En moyenne, les niveaux d'expression de HER2 étaient 66 fois plus élevés que ceux d'EGFR. La reproductibilité des résultats a été vérifiée en reproduisant les expériences trois fois pour chaque échantillon. Les coefficients moyens de variation (CV) étaient de 22% pour EGFR et 19% pour l'analyse de quantification de HER2. Cette variabilité tient compte de la variabilité biologique, car des cryosections différentes ont été utilisées pour chaque expérience.
  • Pour confirmer la quantification de EGFR, l'ARN total de chaque tumeur a été extrait pour analyse RT-qPCR. Une corrélation linéaire positive (Rho= 0,84, P < 0,001) a été observée entre les niveaux d'expression de protéines EGFR déterminées par TR-FRET et les niveaux d'ARNm EGFR mesurés par RT-qPCR.
  • Pour valider les résultats de l'analyse de quantification de HER2 par la méthode selon l'invention, l'expression de HER2 a été évaluée en utilisant l'HercepTest™ ainsi qu'en mesurant l'amplification du gène codant pour HER2 par des analyses FISH et PCR quantitative. Les résultats de cette analyse, présentés dans la figure 5, n'ont montré aucun chevauchement dans les niveaux d'expression déterminés par TR-FRET entre les tumeurs HER2-Herceptest™ positives et HER2-Herceptest™ négatives. Seules les cinq tumeurs du sein avec > 150 000 HER2/cellule avaient un score HercepTest™ de 3+ et étaient positives pour les tests d'amplification génique de HER2. Cela indique que la méthode selon l'invention permet de détecter la surexpression de HER2 avec une spécificité et une sensibilité de 100% dans des échantillons tumoraux, ce qui la rend particulièrement précieuse pour évaluer la susceptibilité de patients à répondre à certains traitements anticancéreux visant HER2 (tels que le traitement par trastuzumab, Herceptin™).
  • Pour la première fois, une méthode fiable de quantification de HER2 pouvant être mise en oeuvre par exemple à l'hôpital, permet d'évaluer le nombre de protéines HER2 par cellule d'échantillons de patients. Elle ne présente pas les inconvénients de la coloration par immunohistochimie et de la technique FISH.
    • Exemple 5
  • L'expression de HER2 a été quantifiée par la méthode décrite dans l'exemple 4 sur des échantillons congelés de tumeurs de 100 patients atteints d'un cancer du sein. La mesure de signaux de fluorescence normalisée a permis une mesure quantitative de l'expression des récepteurs HER2. La survie des patients sans maladie (« DFS » pour disease-free survival) et la survie globale (« OS » pour overall survival) ont été évaluées pour chaque patient. Résultats: Parmi les 100 patients, 82 étaient IHC-HER2 négatifs (HercepTest™ négatifs), dont 60 sujets qui étaient ER (récepteur de l'oestrogène) positifs et traités avec une thérapie hormonale. En utilisant des analyses de risques proportionnels de Cox, il a été montré que chez les sujets IHC-HER2 négatifs et ER positifs la présence de HER2 était significativement associée à la fois à une DFS (p = 0,0005) et une OS (p = 0,003) réduite.
  • La mesure quantitative de l'expression de HER2 par la méthode de l'invention peut permettre de prévoir l'issue de la maladie chez des sujets atteints de cancers du sein IHC-HER2 négatifs et ER positifs. Ce biomarqueur peut être utile pour identifier les patients dont le traitement hormonal n'est pas suffisamment efficace et qui pourraient bénéficier d'un traitement adjuvant par thérapie anti-HER de type Herceptin™. C'est là un des apports majeur de l'invention que de pouvoir améliorer la sélection des patients susceptibles de pouvoir répondre à ce type de traitement.

Claims (16)

  1. Méthode de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon de tissu solide, comprenant les étapes suivantes :
    (i) mise en contact d'un échantillon de tissu solide exprimant ladite protéine avec un premier ligand et un deuxième ligand, chacun de ces ligands étant capable de se lier de manière spécifique à un domaine de ladite protéine, et ces ligands étant respectivement marqués par un composé donneur et un composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de FRET ;
    (ii) incubation de l'échantillon de tissu solide avec un agent de marquage fluorescent de l'ADN ;
    (iii) lavage de l'échantillon de tissu solide ;
    (iv) homogénéisation de l'échantillon de tissu solide sous forme de lysat cellulaire ;
    (v) mesure du signal de FRET émis par le milieu de mesure et normalisation de ce signal par le signal correspondant à la luminescence de l'agent de marquage fluorescent de l'ADN.
  2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits premier et deuxième ligands sont des anticorps.
  3. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le premier ligand est un ligand connu de la protéine d'intérêt et n'est pas un anticorps, et en ce que le deuxième ligand est un anticorps.
  4. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est une protéine membranaire.
  5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est choisie parmi un récepteur membranaire couplé aux protéines G et un récepteur à activité tyrosine kinase.
  6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est choisie parmi EGFR, HER2, HER3 et HER4.
  7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le composé donneur est un chélate ou un cryptate de terre rare.
  8. Méthode selon la revendication 7, caractérisée en que le composé donneur est un chélate ou un cryptate d'europium ou de terbium.
  9. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le composé accepteur est choisi parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa » et le nitrobenzoxadiazole.
  10. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que lesdits premier et second ligands sont introduits dans le milieu de mesure à une concentration finale supérieure à 10 nM.
  11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que lesdits premier et second ligands sont introduits dans le milieu de mesure à une concentration finale comprise entre 20 et 80 nM.
  12. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre sur un échantillon de tissu tumoral.
  13. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que lorsque le premier ou le deuxième ligand est un anticorps, l'épitope dudit anticorps est localisé sur un domaine de la protéine d'intérêt exposé au milieu extracellulaire.
  14. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que la protéine d'intérêt est la protéine HER2, et en ce que le premier ligand et le deuxième ligand sont des anticorps spécifiques de cette protéine.
  15. Méthode ex vivo pour déterminer si un patient est éligible à un traitement thérapeutique par un anticorps se liant à la protéine HER2, caractérisée en ce qu'elle comprend la mise en oeuvre d'une méthode de quantification selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans laquelle la protéine d'intérêt est la protéine HER2.
  16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'elle est mise en oeuvre sur un échantillon de tissu de patient dont les résultats d'analyse par immunohistochimie de l'expression de la protéine HER2 sont négatifs.
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