FR3040789A1 - Procede de determination de l'existence d'un risque de recidive d'un cancer base sur la detection d'egfr - Google Patents
Procede de determination de l'existence d'un risque de recidive d'un cancer base sur la detection d'egfr Download PDFInfo
- Publication number
- FR3040789A1 FR3040789A1 FR1558224A FR1558224A FR3040789A1 FR 3040789 A1 FR3040789 A1 FR 3040789A1 FR 1558224 A FR1558224 A FR 1558224A FR 1558224 A FR1558224 A FR 1558224A FR 3040789 A1 FR3040789 A1 FR 3040789A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- tissue sample
- fret
- section
- pair
- egfr protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 51
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 title description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 claims abstract description 65
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 53
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 43
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 35
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 13
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 12
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 11
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 10
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 10
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 9
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 7
- -1 proflavines Chemical class 0.000 claims description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 7
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 6
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 6
- 229910052761 rare earth metal Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 150000002910 rare earth metals Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1,2,3-benzoxadiazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC2=C1N=NO2 UWAUSMGZOHPBJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010606 normalization Methods 0.000 claims description 5
- OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-2',4',5',7'-tetraiodo-3h-spiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3-one Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(I)=C(O)C(I)=C1OC1=C(I)C(O)=C(I)C=C21 OALHHIHQOFIMEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001251 acridines Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 claims description 3
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 2
- 150000004775 coumarins Chemical class 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 43
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 20
- 238000002877 time resolved fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 9
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052747 lanthanoid Inorganic materials 0.000 description 7
- 150000002602 lanthanoids Chemical class 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 6
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011226 adjuvant chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 244000124209 Crocus sativus Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 208000032818 Microsatellite Instability Diseases 0.000 description 3
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015655 Crocus sativus Nutrition 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N Dansyl Chloride Chemical compound C1=CC=C2C(N(C)C)=CC=CC2=C1S(Cl)(=O)=O XPDXVDYUQZHFPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 2
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 125000000332 coumarinyl group Chemical group O1C(=O)C(=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 2
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000013974 saffron Nutrition 0.000 description 2
- 239000004248 saffron Substances 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical class [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- IGVKWAAPMVVTFX-BUHFOSPRSA-N (e)-octadec-5-en-7,9-diynoic acid Chemical compound CCCCCCCCC#CC#C\C=C\CCCC(O)=O IGVKWAAPMVVTFX-BUHFOSPRSA-N 0.000 description 1
- JFJNVIPVOCESGZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dipyridin-2-ylpyridine Chemical compound N1=CC=CC=C1C1=CC=CN=C1C1=CC=CC=N1 JFJNVIPVOCESGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 229910052692 Dysprosium Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 229910052691 Erbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001327 Förster resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 229910052779 Neodymium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical group C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 229910006069 SO3H Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052772 Samarium Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 235000005811 Viola adunca Nutrition 0.000 description 1
- 240000009038 Viola odorata Species 0.000 description 1
- 235000013487 Viola odorata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002254 Viola papilionacea Nutrition 0.000 description 1
- 229910052769 Ytterbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 description 1
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001484 arginines Chemical class 0.000 description 1
- 150000007860 aryl ester derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- VPKDCDLSJZCGKE-UHFFFAOYSA-N carbodiimide group Chemical group N=C=N VPKDCDLSJZCGKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 201000011024 colonic benign neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000011498 curative surgery Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N dysprosium atom Chemical compound [Dy] KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L eosin Y Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C([O-])=C(Br)C=C21 SEACYXSIPDVVMV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N erbium Chemical compound [Er] UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N europium cryptate Chemical compound [Eu+3].N=1C2=CC=CC=1CN(CC=1N=C(C=CC=1)C=1N=C(C3)C=CC=1)CC(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1C(N=1)=CC(C(=O)NCCN)=CC=1CN3CC1=CC=CC2=N1 GWQVMPWSEVRGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N guanidine group Chemical group NC(=N)N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000013388 immunohistochemistry analysis Methods 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002742 methionines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N neodymium atom Chemical compound [Nd] QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical class [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZUNJOHGWZRPMI-UHFFFAOYSA-N samarium atom Chemical compound [Sm] KZUNJOHGWZRPMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 230000001173 tumoral effect Effects 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N ytterbium Chemical compound [Yb] NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/54—Determining the risk of relapse
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un procédé ex vivo de détermination de l'existence d'un risque de récidive chez un patient atteint d'un cancer colorectal de stade II ou III, ce procédé comprenant la détermination par FRET du niveau d'expression de la protéine EGFR présente dans une coupe d'échantillon de tissu tumoral dudit patient.
Description
Procédé de détermination de l'existence d'un risque de récidive d'un cancer basé sur la détection d'EGFR
La présente invention est relative à un procédé de détermination de l'existence d'un risque de récidive, en particulier d'un risque de récidive métastatique, chez des patients souffrant d'un cancer colorectal de stade II ou III.
Etat de la technique
Le cancer colorectal (CRC) représente 10% à 15 % de tous les cancers et est la principale cause de décès par cancer dans le monde occidental. 40 % à 50 % des patients qui subissent une chirurgie potentiellement curative sans autre forme de traitement rechutent et meurent d'une maladie métastatique. L'indicateur de pronostic le plus important pour la survie dans le cancer du côlon est le stade de la tumeur, qui est déterminé par la profondeur de pénétration à travers la paroi intestinale et le nombre de ganglions lymphatiques envahis (système TNM).
Chez les patients dits de stade II, il y a pénétration tumorale à travers la paroi de l'intestin mais pas d'envahissement des ganglions lymphatiques régionaux ou de métastases. Bien que la survie globale dans ce sous-groupe de patients soit d'environ 70% -80% 5 ans après la chirurgie, il a été reconnu qu'il existe un sous-groupe de patients de stade II présentant un pronostic clinique similaire à celui des patients ayant un cancer colorectal de stade III. Actuellement, ces patients à haut risque sont identifiés par la présence de tumeurs qui non seulement pénètrent la paroi intestinale, mais montrent également des signes d'infiltration péri-nerveuses, d'embolie vasculaire, d'adhésion ou d'invasion des structures environnantes, de perforation, d'obstruction ou d'aneuploïdie. Des données récentes utilisant des marqueurs moléculaires tels que la perte d'hétérozygotie (LOH) du chromosome 18q ou la présence de tumeurs sans instabilité de microsatellites, ont permis d'identifier un sous-groupe de patients de stade II de très mauvais pronostic vital et pour lequel un traitement par chimiothérapie pourrait être bénéfique.
Au cours des 15 dernières années, le développement de la chimiothérapie adjuvante administrée après ablation chirurgicale des tumeurs chez les patients avec une maladie de stade III a permis de réduire le risque de réapparition d'un cancer lié à la présence de cellules tumorales non détectables après chirurgie. Plusieurs milliers de patients atteints de CRC ont été inclus dans les essais cliniques pour évaluer le bénéfice potentiel de diverses combinaisons d'agents chimio thérapeutiques.
Depuis la conférence consensus des National Institutes of Health (NIH, USA) en 1990, l'administration de 5-fluorouracil (FU) en traitement adjuvant pour tous les patients CRC de stade III est devenue un standard de soins et a abouti à 30%-40% de diminution des taux de rechute et de mortalité par rapport à un traitement par chirurgie seule. À l'époque, le panel n'a pas recommandé de traitement adjuvant pour les patients de stade Il en dehors du domaine des essais cliniques, dans la mesure où les données cliniques disponibles à l'époque ne permettaient pas de justifier une telle recommandation. L'un des problèmes des études cliniques impliquant des patients de stade II réside dans la difficulté à travailler avec des cohortes suffisamment importantes en raison du pronostic favorable global de ce sous-groupe de patients. Dans les études portant sur les chimiothérapies adjuvantes, la plupart des essais cliniques ont ainsi inclus des patients à la fois de stades II et III, et la plupart de ces essais comprenaient un nombre trop faible de patients de stade II pour détecter tout bénéfice thérapeutique de traitement adjuvant des patients de stade II. Ainsi et à ce jour, la chimiothérapie adjuvante est seulement recommandée pour les patients ayant un cancer colorectal de stade III et la majorité des patients de stade II sont uniquement traités par chirurgie, et cela en dépit de la connaissance du fait qu'un sous-groupe de mauvais pronostic pourrait probablement bénéficier d'une chimiothérapie adjuvante.
Il existe un besoin pour des biomarqueurs fiables permettant d'identifier les patients de stade II ou III à risque de récidive métastatique, et pour lesquels une chimiothérapie adjuvante serait indiquée.
Description des figures
La Figure 1 représente les caractéristiques de la cohorte de patients.
La Figure 2 représente le protocole de dosage d'EGFR par FRET sur coupes FFPE.
La Figure 3 représente la probabilité de survie sans récidive métastatique (« relapse-free survival ») en fonction du temps pour les patients de la cohorte présentant un taux d'expression d'EGFR faible (« low-EGFR expression ») ou élevé (« high EGFR expression ») sur coupes FFPE.
La Figure 4 représente la corrélation entre le taux de survie sans récidive à 5 ans et le stade du cancer, la quantité d'EGFR évaluée par FRET ou par immunohistochimie.
La Figure 5 représente la corrélation entre le taux de survie sans récidive à 5 ans, la quantité d'EGFR évaluée par FRET ou par immunohistochimie avec différents anticorps.
La Figure 6 représente le protocole de dosage d'EGFR par FRET sur cryosections.
La Figure 7 représente la probabilité de survie sans récidive métastatique en fonction du temps pour les patients de la cohorte présentant un taux d'expression d'EGFR faible ou élevé (mesure sur cryosections).
Description de l'invention
Les inventeurs ont découvert que la détermination quantitative de l'expression de la protéine EGFR par une approche TR-FRET dans un échantillon de tissu d'un patient atteint d'un cancer colorectal de stade II ou III était un facteur indépendant de pronostic du risque de récidive. Par « récidive », on entend : soit le développement d'un nouveau cancer dans un organe qui a déjà été atteint au préalable par une première tumeur maligne, soit la réapparition du premier cancer (rechute) après une période de rémission complète, qu'elle soit locale (au même endroit que le cancer de départ), régionale (métastases dans les ganglions lymphatiques qui drainent l'organe atteint par le cancer de départ) ou à distance, dans un autre organe, soit une récidive métastatique, à savoir le développement d'une colonie secondaire de cellules cancéreuses qui s'installent et se développent à distance du cancer initial.
Au sein d'une cohorte de patients de stade II ou III, les inventeurs ont ainsi déterminé que les taux élevés de protéine EGFR étaient corrélés de manière significative avec un mauvais pronostic, avec un risque de récidive.
Les patients ainsi identifiés comme présentant un risque de récidive peuvent faire l'objet d'un suivi médical plus approfondi et surtout un traitement par chimiothérapie peut leur être proposé. Cela est particulièrement avantageux pour les patients de stade II pour lesquels un traitement par chimiothérapie n'est pas systématiquement mis en place, et pour lesquels l'invention peut potentiellement apporter un bénéfice très significatif.
De manière plus précise, l'invention a pour objet un procédé ex vivo de détermination de l'existence d'un risque de récidive chez un patient atteint d'un cancer colorectal de stade Il ou III, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR présente dans une coupe d'échantillon de tissu tumoral dudit patient, (ii) comparaison du niveau d'expression obtenu a l'étape (i) avec une valeur de référence au dessus de laquelle le patient est considéré comme présentant un risque de récidive, ladite détermination étant effectuée par la mesure de la fluorescence émise en temps résolu par un couple de partenaires de FRET mis en contact avec ladite coupe d'échantillon de tissu, le premier membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un premier ligand capable de se lier à un premier domaine de la protéine EGFR, le second membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un second ligand capable de se lier à un second domaine de la protéine EGFR, lesdits premier et second domaines de la protéine EGFR étant différents, ledit couple de partenaires de FRET étant constitué d'un composé fluorescent donneur et d'un composé fluorescent accepteur.
On entend ici par « domaine » une partie de la séquence protéique constituant l'EGFR cette partie interagissant avec un ligand capable de la reconnaître.
Le procédé selon l'invention est particulièrement avantageux pour les patients de stade II. Par « couple de partenaires de FRET » on entend un couple constitué d'un composé fluorescent donneur d'énergie (ci-après «composé fluorescent donneur») et d'un composé accepteur d'énergie (ci-après « composé accepteur »); lorsqu'ils sont à proximité l'un de l'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé fluorescent donneur, ces composés émettent un signal de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Forster Résonance Energy Transfer ») qui correspond à la mesure de la fluorescence émise par le couple de partenaires de FRET. L'échantillon de tissu tumoral est un échantillon de tissu prélevé sur un patient (tissu dit «natif»), comme par exemple un échantillon prélevé dans le cadre d'une biopsie, y compris par une biopsie d'aspiration à l'aiguille fine, ou encore une pièce d'exérèse. Avant la mise en œuvre du procédé selon l'invention, le prélèvement est préparé sous forme de coupes, en particulier sous forme de coupes FFPE (acronyme de l'expression anglaise « formalin fixed paraffin embedded », c'est-à-dire enrobées dans de la paraffine et fixées par formaldéhyde), ou encore de cryosections.
Les techniques de préparation de tissu sous forme de coupes FFPE sont connues de l'homme du métier : elles peuvent consister en particulier en la fixation de l'échantillon par un traitement avec du formaldéhyde, son inclusion dans de la paraffine, en particulier sous forme de blocs qui peuvent être ensuite découpés au microtome (de préférence avec une épaisseur d'environ 1 à 50 pm). Le traitement de ces sections au xylène pour enlever la paraffine, leur rinçage à l'éthanol puis à l'eau sont également des techniques connues de l'homme du métier, de même que la régénération des épitopes par la technique HIER (acronyme de l'expression anglaise « heat induced eptitope recovery », décrite notamment dans le brevet US 8 067 241). De manière alternative, le procédé selon l'invention peut également être mis en œuvre sur des cryosections, de préférence de 1 à 50 μιτι d'épaisseur, également préparées selon les techniques classiques.
Le procédé selon l'invention comprend avantageusement une étape d'homogénéisation ou de lyse de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire. Cette étape peut être mise en œuvre postérieurement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon (conjugués au donneur et à l'accepteur), et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET, ou bien préalablement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET. L'homogénéisation de l'échantillon de tissu peut être effectuée par un traitement mécanique connu de l'homme du métier, qui peut être choisi parmi : l'application d'ultrasons (sonication), des cycles de congélation / décongélation, l'utilisation de broyeurs mécaniques, éventuellement conjointement à l'utilisation de tampon de lyse hypotonique ou de tampon de lyse contenant des détergents comme le tampon RIPA. Un exemple de traitement mécanique ménagé consiste à appliquer a l'échantillon des ultrasons (sonication) à une fréquence > 16 000 Hz (de préférence 20 000Hz), à une puissance de 80 W et pendant une durée de 3 à 15 secondes, et de préférence pendant 4 à 15 secondes. Les échantillons sont de préférence maintenus dans un bain de glace pendant le traitement pour limiter leur échauffement.
Lorsque l'échantillon biologique est préparé sous forme d'homogénat, il peut être dilué selon un facteur de dilution qui dépend de plusieurs facteurs et en particulier de l'affinité des ligands fluorescents avec la protéine EGFR. Ces dilutions relèvent de mise au point de routine pour l'homme du métier spécialiste de la détection de protéines dans des milieux biologiques. L'échantillon est dilué de préférence après son homogénéisation sous forme de lysat cellulaire et avant sa distribution dans un ou plusieurs contenants.
Du fait de la variabilité de la quantité de matériel biologique d'une coupe d'échantillon à l'autre, il est recommandé de normaliser le signal obtenu par une référence interne à l'échantillon. Ainsi, le procédé selon l'invention peut comprendre une étape de normalisation du signal de FRET par une valeur représentative de la quantité de matériel biologique présent dans la coupe d'échantillon. Dans une première variante de cette mise en oeuvre, le procédé selon l'invention comprend une étape d'incubation de la coupe d'échantillon de tissu avec un agent de marquage émettant un signal proportionnel à la quantité de matériel biologique présent dans l'échantillon, cette étape étant préalable à toute éventuelle étape de lavage, ainsi qu'une étape de normalisation du signal de FRET par le signal correspondant à cet agent de marquage. De préférence, l'agent de marquage est un agent de marquage fluorescent de l'ADN (tel qu'un agent intercalant comme le compose Hoechst 33342, ou encore un colorant de l'ADN comme le SYBR Green), et le signal de FRET correspondant à la protéine EGFR est normalisé par le signal correspondant à la fluorescence de cet agent de marquage. Cette approche est décrite par exemple dans la demande de brevet WO 2013/124544 au nom de Cisbio Bioassays.
La normalisation peut également être effectuée en utilisant d'autres types d'agents de marquage, en particulier des composés fluorescents, tels que le chlorure de dansyle ou le NBD (nitrobenzoxadiazole) : ces composés, disponibles dans le commerce, se lient aux fonctions amines, notamment des protéines. Y.Uratani et al. décrivent un protocole de marquage de cellules avec le chlorure de dansyle (Journal of Bacteriology 1982 p. 523-528). Une fois les cellules marquées, l'invention peut être mise en oeuvre avec un protocole similaire au cas où l'agent de marquage est un agent intercalant.
Dans une seconde variante de cette mise en œuvre comprenant la normalisation du signal de FRET correspondant à la protéine EGFR, la référence interne est une caractéristique mesurée sur une coupe de tissu adjacente à la coupe d'échantillon sur laquelle le FRET est mesuré, telle que le nombre de noyaux, le nombre de cellules, la surface des noyaux, avantageusement la référence interne est constituée par la surface des noyaux de cellules présentes dans l'échantillon.
Dans cette variante, l'étape de normalisation comprend ainsi : - la mise en œuvre de moyens informatiques pour l'acquisition de l'image d'une deuxième coupe de l'échantillon de tissu, cette deuxième coupe étant adjacente à la coupe d'échantillon de tissu destinée à être mise en contact avec le couple de partenaires de FRET, et - l'analyse de cette image pour déterminer une valeur représentative d'un paramètre choisi parmi : le nombre de noyaux de cellules présents dans ladite deuxième coupe; le nombre de cellules présentes dans ladite deuxième coupe ; la surface des noyaux des cellules présentes dans ladite deuxième coupe.
De préférence, l'analyse de ladite image est effectuée par un logiciel mesurant la surface des noyaux des cellules présents dans ladite deuxième coupe (tel que le logiciel Histolab de la société Microvision Instruments), la valeur obtenue étant utilisé pour normaliser le signal de FRET.
Dans une troisième variante de cette mise en œuvre comprenant la normalisation du signal de FRET correspondant à la protéine EGFR, la référence interne est une deuxième protéine, différente de l'EGFR, dont la quantité est mesurée parTR-FRET. Cette deuxième protéine peut être notamment une protéine de ménage ou encore une protéine caractéristique d'un état physiopathologique donné. Cette approche est décrite dans la demande de brevet FR15 51191 déposée le 13 février 2015 au nom de Cisbio Bioassays.
Protocoles préférés
Dans un premier protocole préféré, le procédé selon l'invention est mis en œuvre sur une cryosection dudit échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : a) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, b) Incubation, c) Lavage, d) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, e) Transfert en microplaques, f) Lecture du FRET.
Dans un second protocole préféré, le procédé selon l'invention est mis en œuvre sur une coupe dudit échantillon de tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, b) Régénération des épitopes, c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lavage, f) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, g) Transfert en microplaques, h) Lecture du FRET.
Dans un troisième protocole préféré, le procédé selon l'invention est mis en œuvre sur une cryosection dudit échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : a) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, b) Transfert en microplaque, c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lecture du FRET.
Dans un quatrième protocole préféré, le procédé selon l'invention est mis en œuvre sur une coupe dudit échantillon de tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, b) Régénération des épitopes, c) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, d) Transfert en microplaque, e) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, f) Incubation, g) Lecture du FRET.
Valeur de référence
La valeur de référence au dessus de laquelle le patient est considéré comme présentant un risque de récidive peut varier en fonction des caractéristiques techniques du dosage, notamment les caractéristiques spectroscopiques du couple de partenaires de FRET, et l'affinité des premiers et seconds ligands spécifiques de la protéine EGFR. Néanmoins, pour un dosage donné, c'est-à-dire une fois le couple de partenaires de FRET et les ligands capables de se lier à l'EGFR choisis, cette valeur de référence peut être établie une seule fois comme étant par exemple la valeur médiane observée dans une population de patients souffrant d'un cancer colorectal de stade II ou III. L'homme du métier du domaine de l'analyse statistique est à même de déterminer une autre valeur de référence, à partir des mesures observées dans cette population, pour une discrimination optimale des patients présentant un risque de récidive.
Les ligands spécifiques de la protéine EGFR
Dans une mise en œuvre préférée, le premier ligand et le second ligand sont des anticorps spécifiques de la protéine EGFR, et dans une mise en œuvre particulière, ils se lient à des domaines localisés dans la partie intracellulaire de cette protéine. Le terme « anticorps » doit ici être pris au sens large et comprend toute protéine de la famille des immunoglobulines ou bien comportant un domaine d'une immunoglobuline, ainsi qu'un site de liaison spécifique à la protéine d'intérêt. Les anticorps peuvent donc être des fragments Fab, Fab', des anticorps simple chaîne ou simple domaine, des domaines variables de chaînes lourdes ou légères d'immunoglobulines. L'homme du métier est à même de fabriquer des anticorps spécifiques de la protéine EGFR en utilisant les techniques classiques. Des anticorps sont également disponibles dans le commerce. L'homme du métier veillera à sélectionner des anticorps reconnaissant des épitopes différents sur la protéine EGFR, cela pour permettre la fixation simultanée de l'anticorps marqué par le donneur et de celui marqué par l'accepteur.
Dans une mise en œuvre préférée, lesdits premier et second ligands sont des anticorps capables d'inhiber la liaison des anticorps de lapin D38B1 et C74B9 à la protéine EGFR de plus de 75 % (« D38B1 » et « C74B9 » désignent les références de deux clones d'anticorps monoclonaux de lapin). Ces deux anticorps sont préférés.
Les ligands spécifiques peuvent également être des aptamères ou autres bioprobes. Dans le cas ou la coupe d'échantillon est sous forme de cryosection, les ligands naturels de la protéine EGFR, tel que les amphirégulines ou l'EGF, peuvent être utilisés.
Marquage des ligands par des composés donneurs ou accepteurs d'énergie
Les ligands peuvent être marqués par les fluorophores de manière directe (covalente) ou indirecte. De manière préférée, au moins un des partenaires de FRET est lié de manière covalente au premier ou au second ligand, et de manière encore plus préférée, les deux partenaires de FRET sont respectivement liés de manière covalente au premier et au second ligand.
Le marquage direct d'un ligand par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation de groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme « fonctionnalisée », c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le composé à marquer, en l'occurrence, le ligand ou l'anticorps.
Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou accepteur est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié, respectivement. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous :
* : par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est : • un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-OC4H4NO2), sulfo-succinimidyloxy (-OC4H3NO2-SO3H) ; • un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tel que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ; • un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride -OCORa ou -OCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes alkyle en CrC6, perfluoroalkyle en Cr C6, alkoxy en Ci-C6, cyclohexyle ; • le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle.
Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et amines respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les anticorps marqués sont caractérisés par le rapport molaire final (RMF) qui représente le nombre moyen de molécules de marqueur greffés au ligand.
Lorsque le ligand est de nature protéique, il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement présent dans les protéines : le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
Si le ligand ne comporte pas de groupe fonctionnel à l'état naturel, de tels groupes peuvent être introduits. Des méthodes d'introduction de groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd édition, LJ. Kricka (1995), Ed. Academie press Ltd., Londres, p. 66-72.
Une autre approche pour le marquage d'un ligand par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans le ligand, par exemple un groupe NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore portant un groupe fonctionnel qui réagira avec le groupe réactif pour former une liaison covalente.
Il est important de vérifier que le ligand marqué conserve une affinité suffisante pour son récepteur; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante d'affinité du ligand marqué pour le récepteur.
Le ligand peut également être marqué par un composé fluorescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu d'incubation un anticorps dit « secondaire », lui-même lié de manière covalente à un composé fluorescent, cet anticorps reconnaissant de manière spécifique le ligand ou bien un haptène présent sur ce ligand (tel qu'un groupe dinitrophényle, dogoxigénine, la fluorescéine, les étiquettes FLAG, c-myc, 6-HIS). Lorsque le ligand est un anticorps, l'anticorps secondaire peut être un anticorps antiespèce.
Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur le ligand à marquer, puis d'incuber ce ligand biotinylé en présence de streptavidine marquée par un fluorophore. Le marquage de ligand par la biotine relève des connaissances générales de l'homme du métier, et la société Cisbio Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec le fluorophore dont la dénomination commerciale est « d2 » (réf 610SADLA).
Couples de partenaires de FRET
Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie.
Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, et que le composé donneur est excité à une longueur d'onde correspondant à un de ses pics d'absorption, un transfert d'énergie aura lieu, provoquant une diminution de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission du donneur, et une augmentation de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur.
La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd édition, Kluwer academic/plenum publishers, NY (1999)), auquel l'homme du métier pourra se référer.
Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise dans la gamme 0,5-6 ms), en particulier les chélates ou cryptâtes de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET en s'affranchissant du phénomène d'auto-fluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptâtes d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés.
De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays.
Des exemples de chélates ou cryptâtes de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont : • Les cryptâtes de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptâtes de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les cryptâtes de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptâtes de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptâtes d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
TrisBiPy-Eu Py-BiPy-Eu
TrisBiPy-tetraacide-Eu Py-BiPy-tetraacide-Eu • Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer. • Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/010580. • Les cryptâtes de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables. • Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page 89). • Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays. • Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
• Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(ll) tris(2,2'-bipyridine). • Le chélate de terbium DTPA-csl24 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821.
• Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of Luminescence 1997, 75:149-169) :
Tb-W14016
De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les cryptâtes d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
Le composé fluorescent accepteur doit posséder un spectre d'absorption qui recouvre le spectre d'émission du donneur (Mathis G, Clin. Chem. 1993, 39(9):1953-1959) et peut être choisi dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination «Bodipy»), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
Les expressions «les cyanines» et «les rhodamines» doivent être respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés «Atto» sont commercialisés par la société Atto-tec; les composés « DY» sont commercialisés par la société Dyomics; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
Aux fins de l'invention, les dérivés de cyanines ou de la fluoréscéine sont préférés comme composés fluorescents accepteurs.
Mesure du signal de TR-FRET
La mesure du signal de TR-FRET est effectuée après excitation du milieu de mesure par une source pulsée dans une bande d'excitation du composé donneur, de préférence après un délai de 1 à 500 microsecondes (ps) et pendant une durée de 10 à 2000 ps. De manière encore plus préférée, le délai est de 50 ps (temps résolu).
Le signal de TR-FRET peut être constitué par l'intensité de la luminescence mesurée, soit par sa durée de vie.
EXEMPLES
Exemple 1 : analyse sur coupes FFPE
Cohorte de patients L'étude a été conduite avec des échantillons de tissus provenant de 63 patients souffrant d'un cancer colorectal de stade II ou III. Les données de suivi (notamment rechute métastatique) ont été collectées pour l'ensemble de la cohorte et les caractérisations moléculaires en termes de statut mutationnel KRAS, BRAF et d'instabilité des microsatellites (MSI) ont été réalisées (voir figure 1). Méthodologies d'analyse sur coupes en paraffine L'analyse de l'expression d'EGFR par TR-FRET en homogène sur coupes en paraffine a été réalisée avec les anticorps monoclonaux de lapin D38B1 et C74B9 (commercialisés par la société Cell Signaling Technology), conjugués avec les composés fluorescent accepteur d2 et donneur cryptate Tris-Bipyridine (Eu3+) (commercialisés par la société Cisbio Bioassays) après régénération des épitopes, selon le protocole suivant (protocole schématisé figure 2): • Coupe de l'échantillon FFPE au microtome pour évaluation de la densité en cellules tumorales et analyse de la surface des noyaux : une première coupe de 4pm d'épaisseur a été effectuée au microtome ; cette coupe a été collectée sur une lame porte-objet puis la lame a été traitée afin d'effectuer une coloration HES (voir ci-dessous). Cette lame est destinée à l'observation microscopique permettant 1) l'acquisition d'une image (scan) utilisée pour mesurer la surface des noyaux (logiciel Histolab de la société Microvision Instruments) et 2) la sélection de la zone tumorale à macro-disséquer si besoin afin d'enrichir l'échantillon en cellules tumorales et dans laquelle le pourcentage de cellules tumorales est évalué. Les coupes qui succèdent immédiatement cette première coupe sont destinées à être collectées dans des tubes Eppendorf pour les analyses de FRET proprement dites. • Coloration HES (Hématoxyline Eosine Safran) : après réhydratation dans des bains successifs de xylène et d'alcool à concentration décroissante, les coupes ont été successivement colorées par l'hématoxyline, puis par l'éosine et enfin par le safran. Les lames ont ensuite été rapidement déshydratées (bains d'alcools à concentration croissante puis bains de xylène) avant d'être recouvertes d'une lamelle permettant leur conservation et leur visualisation. L'hématoxyline colore en bleu-violet le noyau et les substances basophiles; l'éosine colore en rouge-rosé le cytoplasme et le safran colore les fibres conjonctives en jaune-orangé. • Sélection de la zone d'intérêt et analyse de la surface des noyaux : la zone tumorale localisée sur la lame colorée par HES a été identifiée au microscope et cerclée avec un marqueur directement sur la lamelle. Les échantillons colorés par HES ont ensuite été scannés par un scanner haute résolution (par exemple Scanner Hamamatsu). La zone d'intérêt, cerclée, a ensuite été analysée avec un logiciel (Histolab®, société Microvision Instruments) permettant de discriminer les noyaux par seuillage colorimétrique. La surface des noyaux dans la zone d'intérêt est donnée en pm2. • Réalisation des coupes pour les analyses FRET proprement dites et distribution en tubes Eppendorf : des coupes de 5pm d'épaisseur ont été effectuées au microtome et soumises à une macro dissection visant à éliminer, si besoin, les tissus visiblement non-tumoraux repérés sur les lames soumises à la coloration HES. Les échantillons résultants ont été collectés dans un tube Eppendorf (2 à 3 coupes selon la surface de la section de tissus tumoral de façon à obtenir au total en moyenne environ 300 mm2). • Déparaffinage : les coupes ont été soumises à un traitement par un substitut de xylène (1,2 ml, 5 min sous agitation sur agitateur à plateau), les tubes ont été centrifugés (2 min, 10 000g) et le surnageant a été éliminé par pipetage. Le culot obtenu a été soumis au traitement par le substitut de xylène une seconde fois (1,2 ml, 5 min) et après centrifugation (2 min, 10 000g) le surnageant a été éliminé par pipetage. Le culot a ensuite été traité par l'éthanol pur (1,2 ml, 3 min), centrifugé (2 min, 10 000g) et le surnageant éliminé par pipetage. Puis le processus a été répété une fois avec de l'éthanol pur puis avec de l'éthanol à 95%. Le culot a ensuite été mis à réhydrater dans du tampon de régénération (DAKO lOmM tris-EDTA pH9) pendant 30 min puis centrifugé (2 min, 10 000g) et le surnageant éliminé par pipetage. Régénération des épitopes : le culot a ensuite été remis en suspension dans 500μΙ de tampon de régénération (DAKO lOmM tris-EDTA pH9) puis porté à 97°C pendant 40 min sous agitation (Thermomix). Les tubes ont ensuite été laissés à température ambiante pour refroidissement pendant 15-20 min puis centrifugés (3 min, 10 000 -12000g) et le surnageant éliminé par pipetage. • Ajout de tampon de lyse : du tampon de lyse IX (Cisbio Bioassays réf 64KL4FDF) a été ajouté (250μΙ) et ensuite les tubes ont été mis à refroidir dans de la glace. • Lyse par sonication : les tubes refroidis dans la glace ont été soumis à une sonication (2 x 5s à 20% d'intensité avec un sonicateur Branson 450 équipé d'une Sonotrode de 3,2 mm). • Stockage des lysats : les lysats ont été congelés puis stockés à -80°C jusqu'à leur utilisation. • Transfert du lysat en microplaques : les lysats ont été distribués en doublets à raison de 16μΙ par puits, dans des puits de plaque de microtitration (Plaques 384w F-bottom, SV ,Hibase, White, GREINER réf #784075). • Ajout des deux ligands (anticorps) conjugués avec les donneur et accepteur : chacun des deux anticorps marqués préalablement dilués dans un tampon (HEPES 200 mM pH7, 0,5M KF, 0,1% ASB) ont été ajoutés sous un volume de 2μΙ de façon à obtenir une concentration finale de 0,5 nM en anticorps-TPB(Eu) et de 5nM en anticorps-d2. Des puits « négatifs » ont été constitués par 16μΙ de tampon de lyse IX (Cisbio Bioassays réf 64KL4FDF) auxquels ont été ajoutés 2μΙ de solution de chacun des anticorps. • Incubation: La plaque de microtitration a ensuite été incubée à température ambiante pendant environ 16h.
Mesure du FRET : La lecture de la fluorescence a été effectuée en mode TRF sur un lecteur Pherastar (BMG) en utilisant les paramètres suivants :
Module optique: HTRF
Excitation: 337
Emission A: 665 nm
Emission B: 620 nm
Hauteur focale: 12 mm
Source de lumière: lampe Flash
Les valeurs d'intensité de fluorescence désignées E665 et E620 ont été respectivement mesurées pour chaque puits d'échantillon ainsi que pour les puits « négatifs ». Pour chaque puits d'échantillon le ratio des intensités a été calculé: ratio (échantillon) = (E665/E620) x 10000. De même pour les puits « négatifs » : ratio (négatif) = (E665/E620) x 10000. La variation de fluorescence (DF) entre les valeurs de ratio obtenues pour chaque échantillon et le ratio moyen obtenu pour les puits « négatifs » a ensuite été calculé : DF = 100 x [ratio(échantillon) - ratio(négatif)] / ratio(négatif).
Les valeurs de DF obtenues sont proportionnelles à la concentration d'EGFR présente dans chaque puits. Cette valeur de DF est ensuite normalisée par la surface des noyaux (Sn) obtenue par l'analyse d'image effectuée sur la lame colorée HES. Le DF normalisé (DFN) a été obtenu selon la formule suivante : DFN= (DFxl08)xSn ; où Sn est exprimée en ,._2 pm . Résultats
Sur cette cohorte rétrospective de tumeurs coliques de stade ll/lll (n= 58), les tumeurs présentant des niveaux d'expression de l'EGFR élevés (>médiane) mesurés par TR-FRET étaient associées à un mauvais pronostic (figure 3). En particulier dans cette série, le seul paramètre corrélé de manière significative (p=0,031) avec le risque de récidive métastatique était l'expression de l'EGFR mesurée par TR-FRET (figure 4).
Cette étude a montré que la quantification de l'EGFR par TR-FRET est un donc facteur pronostique pour les cancers colorectaux de stade ll/lll qui permettrait de prédire les patients à risque de récidive.
Exemple 2 : analyse sur crvosections
Les échantillons des 63 patients de l'exemple 1 étant initialement conservés sous forme de tumeurs congelées, ils ont également été analysés avec les mêmes réactifs après préparation de cryosections de 50 pm d'épaisseur (protocole schématisé figure 6). La même technique de normalisation par analyse de la surface des noyaux que celle présentés dans l'exemple 1 a été utilisée.
Les cryosections ont été incubées une nuit dans 180 pl de tampon TR-FRET (IX PBS / 10% ASB + cocktail inhibiteur de protéase, Roche, réf. 1836153) contenant 50 nM de chacun des deux conjugués fluorescents (dans ce cas un conjugué anticorps-Lumi4(Tb) est utilisé comme donneur). Après lavage et centrifugation, les échantillons ont été remis en suspension dans le tampon TR-FRET, soumis à une sonication et transférés dans une microplaque et mesure du signal de TR-FRET.
Les résultats sont similaires à ceux obtenus dans l'exemple précédent, et sont présentés dans la figure 7.
Exemple 3 : analyse par immunohistochimie
Les échantillons de tissus ont également été analysés par immunohistochimie (IHC) selon le protocole suivant.
Des coupes de 3pm d'épaisseur, consécutives à celles réalisées pour l'analyse par FRET, ont été effectuées sur un microtome, étalées sur des lames de verre et séchées pendant une nuit à 56°C dans une étuve ventilée.
Trois anticorps monoclonaux [clone 31G7 (monoclonal de souris, InVitroGen, épitope localisé dans le domaine extra-cellulaire), D38B1 et C74B9 (monoclonaux de lapin, Cell Signalling Technology, épitopes localisés dans le domaine cytoplasmique)] ont été utilisés en parallèle avec des protocoles de réhydratation et de démasquage antigénique différents (cf. tableau 1). La liaison antigène/anticorps a été objectivée par l'utilisation d'un kit de révélation EnVision Flex (DAKO) et de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) comme substrat de la peroxydase de raifort. Les lames ont ensuite été contre-colorées avec l'hématoxyline avant d'être déshydratées et recouvertes d'une lamelle. L'observation microscopique a permis d'évaluer l'expression de l'EGFR. Pour chaque cas, le pourcentage de cellules positives ainsi que l'intensité du signal (0 : absent, 1 : faible, 2 : marqué, 3 : modéré) a été reporté et un score global, obtenu en multipliant le pourcentage de cellules positives par l'intensité, a été calculé, représentant l'expression globale de l'EGFR par la tumeur.
Les résultats présentés dans la figure 5 montrent que l'analyse de l'expression d'EGFR par IHC n'est pas un facteur de pronostic (p non significatif), et cela quel que soit l'anticorps testé (31G7, D38B1 ou C74B9).
Tableau 1: anticorps anti-EGRF utilisés en IHC
Claims (24)
- REVENDICATIONS1. Procédé ex vivo de détermination de l'existence d'un risque de récidive chez un patient atteint d'un cancer colorectal de stade II ou III, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (i) détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR présente dans une coupe d'échantillon de tissu tumoral dudit patient, (ii) comparaison du niveau d'expression obtenu a l'étape (i) avec une valeur de référence au dessus de laquelle le patient est considéré comme présentant un risque de récidive, ladite quantification étant effectuée par la mesure de la fluorescence émise en temps résolu par un couple de partenaires de FRET mis en contact avec ladite coupe d'échantillon de tissu, le premier membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un premier ligand capable de se lier à un premier domaine de la protéine EGFR, le second membre de ce couple étant lié de manière directe ou indirecte à un second ligand capable de se lier à un second domaine de la protéine EGFR, lesdits premier et second domaines de la protéine EGFR étant différents, ledit couple de partenaires de FRET étant constitué d'un composé fluorescent donneur et d'un composé fluorescent accepteur.
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier ligand et le second ligand sont des anticorps spécifiques de la protéine EGFR.
- 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le premier ligand et le second ligand sont des anticorps spécifiques de la protéine EGFR, et en ce que les dits premier et second domaines de la protéine EGFR sont localisés dans la partie intracellulaire de cette protéine.
- 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'un au moins des partenaires de FRET est lié de manière covalente au premier ou au second ligand.
- 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les partenaires de FRET sont respectivement liés de manière covalente au premier et au second ligand.
- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'elle comprend une étape d'homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire.
- 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'homogénéisation de l'échantillon de tissu est mise en oeuvre postérieurement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon de tissu, et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET.
- 8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'étape d'homogénéisation de l'échantillon de tissu est mise en oeuvre préalablement à la mise en contact du couple de partenaires de FRET avec la coupe d'échantillon de tissu, et préalablement à la mesure de la fluorescence émise par ledit couple de partenaires de FRET.
- 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la coupe d'échantillon de tissu est sous forme de cryosection ou bien d'une coupe enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde (coupe FFPE).
- 10. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR est mise en œuvre sur une cryosection de la coupe d'échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : a) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, b) Incubation, c) Lavage, d) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, e) Transfert en microplaques, f) Lecture du signal de FRET.
- 11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR est mise en œuvre sur une coupe de l'échantillon de tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, b) Régénération des épitopes, c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lavage, f) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, g) Transfert en microplaques, h) Lecture du signal de FRET.
- 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR est mise en œuvre sur une coupe de l'échantillon de tissu, enrobée dans de la paraffine et fixée au formaldéhyde, et comprend les étapes suivantes : a) Déparaffinage, b) Régénération des épitopes, c) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, d) Transfert en microplaque, e) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, f) Incubation, g) Lecture du signal de FRET.
- 13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la détermination du niveau d'expression de la protéine EGFR est mise en oeuvre sur une cryosection de l'échantillon de tissu, et comprend les étapes suivantes : a) Homogénéisation de la coupe d'échantillon de tissu sous forme de lysat cellulaire, b) Transfert en microplaque, c) Mise en contact de la coupe d'échantillon de tissu avec le couple de partenaires de FRET, d) Incubation, e) Lecture du signal de FRET.
- 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de normalisation du signal de FRET par une valeur représentative de la quantité de matériel biologique présent dans la coupe d'échantillon de tissu.
- 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incubation de la coupe d'échantillon de tissu avec un agent de marquage émettant un signal proportionnel à la quantité de matériel biologique présent dans l'échantillon, et en ce que le signal de FRET est normalisé par le signal correspondant à cet agent de marquage.
- 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'agent de marquage est un agent de marquage fluorescent de l'ADN, et en ce que le signal de FRET est normalisé par le signal correspondant à la fluorescence de cet agent de marquage.
- 17. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'étape de normalisation comprend : - la mise en oeuvre de moyens informatiques pour l'acquisition de l'image d'une deuxième coupe de l'échantillon de tissu, cette deuxième coupe étant adjacente à la coupe d'échantillon de tissu destinée à être mise en contact avec le couple de partenaires de FRET, et - l'analyse de cette image pour déterminer une valeur représentative d'un paramètre choisi parmi : le nombre de noyaux de cellules présents dans ladite deuxième coupe; le nombre de cellules présentes dans ladite deuxième coupe ; la surface des noyaux des cellules présentes dans ladite deuxième coupe.
- 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que l'analyse de ladite image est effectuée par un logiciel mesurant la surface des noyaux des cellules présents dans ladite deuxième coupe, la valeur obtenue étant utilisé pour normaliser le signal de FRET.
- 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé fluorescent donneur est un chélate ou un cryptate de terre rare.
- 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en que le composé fluorescent donneur est un chélate ou un cryptate d'europium ou de terbium.
- 21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé fluorescent accepteur est choisi parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa » et le nitrobenzoxadiazole.
- 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits premiers et second ligands sont des anticorps capable d'inhiber la liaison des anticorps de lapin D38B1 et C74B9 à la protéine EGFR de plus de 75 %.
- 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits premiers et second ligands capables de se lier à la protéine EGFR sont les anticorps de lapin D38B1 et C74B9.
- 24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le risque de récidive est un risque de récidive métastatique.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1558224A FR3040789B1 (fr) | 2015-09-04 | 2015-09-04 | Procede de determination de l'existence d'un risque de recidive d'un cancer base sur la detection d'egfr |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1558224A FR3040789B1 (fr) | 2015-09-04 | 2015-09-04 | Procede de determination de l'existence d'un risque de recidive d'un cancer base sur la detection d'egfr |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR3040789A1 true FR3040789A1 (fr) | 2017-03-10 |
| FR3040789B1 FR3040789B1 (fr) | 2017-09-29 |
Family
ID=54783776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR1558224A Active FR3040789B1 (fr) | 2015-09-04 | 2015-09-04 | Procede de determination de l'existence d'un risque de recidive d'un cancer base sur la detection d'egfr |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR3040789B1 (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022053769A2 (fr) | 2020-09-11 | 2022-03-17 | Dyameo | Rapporteur fluorescent et son utilisation pour la détection de molécules cibles |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013124544A1 (fr) * | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Cisbio Bioassays | Procede de normalisation de la luminescence emise par un milieu de mesure. |
-
2015
- 2015-09-04 FR FR1558224A patent/FR3040789B1/fr active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013124544A1 (fr) * | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Cisbio Bioassays | Procede de normalisation de la luminescence emise par un milieu de mesure. |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ALEXANDRE HO-PUN-CHEUNG ET AL: "Quantification of HER Expression and Dimerization in Patients' Tumor Samples Using Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer", PLOS ONE, vol. 7, no. 7, 19 July 2012 (2012-07-19), pages e37065, XP055061400, DOI: 10.1371/journal.pone.0037065 * |
| GENNARO GALIZIA ET AL: "Prognostic Significance of Epidermal Growth Factor Receptor Expression in Colon Cancer Patients Undergoing Curative Surgery", ANNALS OF SURGICAL ONCOLOGY, SPRINGER-VERLAG, NE, vol. 13, no. 6, 18 April 2006 (2006-04-18), pages 823 - 835, XP019389612, ISSN: 1534-4681, DOI: 10.1245/ASO.2006.05.052 * |
| JERRY ZHOU ET AL: "Surface profiles of live colorectal cancer cells and tumor infiltrating lymphocytes from surgical samples correspond to prognostic categories", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS., vol. 416, 1 January 2015 (2015-01-01), NL, pages 59 - 68, XP055279909, ISSN: 0022-1759, DOI: 10.1016/j.jim.2014.11.001 * |
| RESNICK MURRAY B ET AL: "Epidermal growth factor receptor, c-MET, beta-catenin, and p53 expression as prognostic indicators in stage II colon cancer: a tissue microarray study", CLINICAL CANCER RESEARCH, THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, US, vol. 10, no. 9, 1 May 2004 (2004-05-01), pages 3069 - 3075, XP002511853, ISSN: 1078-0432, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-03-0462 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022053769A2 (fr) | 2020-09-11 | 2022-03-17 | Dyameo | Rapporteur fluorescent et son utilisation pour la détection de molécules cibles |
| FR3114160A1 (fr) * | 2020-09-11 | 2022-03-18 | Dyameo | Rapporteur fluorescent et son utilisation pour la détection de molécules cibles |
| WO2022053769A3 (fr) * | 2020-09-11 | 2022-05-05 | Dyameo | Rapporteur fluorescent et son utilisation pour la détection de molécules cibles |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR3040789B1 (fr) | 2017-09-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11906523B2 (en) | Signaling conjugates and methods of use | |
| EP2729808B1 (fr) | Methode amelioree de detection et/ou de quantification d'un analyte present a la surface d'une cellule | |
| JP6691092B2 (ja) | ハプテン、ハプテンコンジュゲート、その組成物ならびにそれらの製造および使用の方法 | |
| US11070750B2 (en) | Digitally enhanced microscopy for multiplexed histology | |
| Yezhelyev et al. | In situ molecular profiling of breast cancer biomarkers with multicolor quantum dots | |
| Chen et al. | The biocompatibility of quantum dot probes used for the targeted imaging of hepatocellular carcinoma metastasis | |
| ES2434491T3 (es) | An�lisis inmunohistoqu�mico multiplex in situ | |
| Won et al. | Visible to mid IR: A library of multispectral diagnostic imaging | |
| WO2013124544A1 (fr) | Procede de normalisation de la luminescence emise par un milieu de mesure. | |
| Wang et al. | iSERS microscopy guided by wide field immunofluorescence: analysis of HER2 expression on normal and breast cancer FFPE tissue sections | |
| FR3040789A1 (fr) | Procede de determination de l'existence d'un risque de recidive d'un cancer base sur la detection d'egfr | |
| WO2016128689A1 (fr) | Procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique | |
| EP2875357B1 (fr) | Methode theranostique basee sur la detection de dimeres her2-her2 | |
| Efimova et al. | Synthesis and optical characteristics of 4-styrylpyridinium dyes and their conjugates with antibody | |
| EP3384290A1 (fr) | Methode de detection de cellules souches cancereuses | |
| JPWO2016013541A1 (ja) | 分子標的薬を含有する標識剤 | |
| WO2020021213A1 (fr) | Anticorps a domaine unique qui se lient a la proteine g alpha | |
| Wegner | Förster Resonance Energy Transfer from Terbium Complexes to Quantum Dots for Multiplexed Homogeneous Immunoassays and Molecular Rulers | |
| Espinar Barranco | Estudio fotofísico de nuevas sondas fluorescentes y su aplicación en sistemas biológicos de interés biomédico | |
| EP3131930B1 (fr) | Anticorps reconnaissant le domaine central de l'adn polymerase pol theta et leurs utilisations pour le diagnostic du cancer | |
| Singh | Selection and high-throughput immunofluorescence detection of cell lines with a hybrid epithelial/mesenchymal phenotype: towards improved characterization of Circulating Tumor Cells | |
| FR3038985A1 (fr) | Methode de quantification des proteines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 2 |
|
| PLSC | Publication of the preliminary search report |
Effective date: 20170310 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 3 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 4 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 5 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 6 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 7 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 8 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 9 |
|
| PLFP | Fee payment |
Year of fee payment: 10 |