FR3114160A1 - Rapporteur fluorescent et son utilisation pour la détection de molécules cibles - Google Patents

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Virgile BARRET-VIVIN
Cédric ENGUEHARD
Jérôme Desroches
Akil HUSSEIN
Nicolas VEDRENNE
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Kamax Innovative System
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Dyameo
Kamax Innovative System
Universite de Limoges
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Abstract

RAPPORTEUR FLUORESCENT ET SON UTILISATION POUR LA D É TECTION DE MOL É CULES CIBLES L’invention concerne un rapporteur fluorescent (1) comprenant : un récepteur (11) lié à une protéine de liaison (12) ; deux fluorochromes Fa et Fb ; dans lequel le fluorochrome Fa est lié au récepteur (11) et le fluorochrome Fb est lié à la protéine de liaison (12) ; et les fluorochromes Fa et Fb forment un couple donneur/accepteur FRET. L’invention concerne également un dispositif et une méthode pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible. Figure de l’abrégé : Fig. 1

Description

RAPPORTEUR FLUORESCENT ET SON UTILISATION POUR LA DÉTECTION DE MOLÉCULES CIBLES
DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention concerne un rapporteur fluorescent pour la détection et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible dans un échantillon.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE
La détection de molécules cibles dans un échantillon est devenue essentielle pour la recherche de contaminants dans des produits agroalimentaires, dans les eaux usées ou pour la recherche médicale comme par exemple pour le diagnostic de nombreux états pathologiques, y compris les cancers, les maladies infectieuses, les maladies auto-immunes et les allergies. La détection de molécules cibles en utilisant la technologie FRET, basée sur un transfert d’énergie non radiatif entre deux fluorochromes, nécessite conventionnellement un couple donneur/accepteur FRET dont chaque élément individuel porte une molécule de reconnaissance tel qu’un anticorps. Ce rapporteur fluorescent en deux parties présente certains inconvénients : les deux parties doivent reconnaitre la molécule cible pour générer l’effet FRET et donc la détection de la molécule cible, la détection est longue, et leur sensibilité est fondamentalement limitée par la concentration de la molécule cible et l’affinité des anticorps. Le développement d’un rapporteur fluorescent fonctionnant par FRET intramoléculaire permettrait de s’affranchir d’une partie de ces contraintes.
En parallèle, l’application in vivo de rapporteurs fluorescents reste très limitée. Dans ce contexte, les méthodes utilisées sont généralement basée sur l’injection de traceurs non spécifiques ou d’anticorps couplés à un fluorochrome. La détection se fait alors par mesure de l’intensité du signal présent à la surface des tissus. Ces approches, bien que parfois utilisées présentent de nombreux inconvénients. Notamment, le signal obtenu est fortement affecté par la stabilité du rapporteur in vivo, sa biodistribution ou encore sa spécificité. De plus, l’innocuité de ce produit injectable doit être démontrée de façon systématique. Le développement d’un système rapporteur composé d’une molécule unique réagissant à la présence d’une molécule cible par un changement de propriétés optiques permettrait la détection de marqueurs d’intérêt par simple contact, sans les contraintes liées à l’injection.
Lors d’une utilisation in vivo, par exemple lors d’une chirurgie ou d’une exploration d’une partie du corps humain par endoscopie, il est primordial pour le chirurgien de pouvoir identifier de manière certaine et rapide les cellules tumorales présentes dans les tissus. Ainsi, la chirurgie assistée par fluorescence est aujourd’hui un domaine en plein essor, mais est limitée par les défauts inhérents à l’injection de marqueurs.
Il existe donc un réel besoin concernant des rapporteurs fluorescents pouvant être utilisés lors d’une chirurgie ou par endoscopie, au bout d’une fibre optique par exemple, sans risque de contamination biologique, et permettant de confirmer le diagnostic.
Lors d’une utilisation in vitro, par exemple lors de l’analyse rapide de solutions à des fins de diagnostic médical ou à des fins de détection de molécules cibles dans un échantillon environnemental, il est nécessaire d’éviter la contamination biologique de l’échantillon étudié par le rapporteur fluorescent comme c’est le cas avec les rapporteurs fluorescents développés jusqu’à lors. La présente invention propose une solution à ce problème en fournissant un rapporteur fluorescent dont les différents éléments sont liés fortement les uns aux autres, notamment la partie récepteur afin qu’elle ne se sépare pas des autres éléments constituant le rapporteur fluorescent au profit de la molécule cible à détecter, induisant une contamination biologique de l’échantillon. De plus le rapporteur fluorescent de l’invention a l’avantage de ne nécessiter aucune étape additionnelle de manipulation de type, lavage, marquage secondaire ou autres. Le simple fait de le mettre en contact avec un échantillon à analyser est suffisant, ce qui réduit considérablement le nombre de manipulations de l’échantillon, ainsi que le temps pour l’obtention des résultats.
RÉSUMÉ
L’invention concerne un rapporteur fluorescent comprenant :
  • un récepteur lié à une protéine de liaison ;
  • deux fluorochromes Faet Fb;
dans lequel le fluorochrome Faest lié au récepteur et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison ; et
les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET.
Dans un mode de réalisation, le récepteur est choisi parmi anticorps, fragment d’anticorps, aptamère, protéines, peptides, ou un dérivé de ceux-ci. Dans un mode de réalisation, la protéine de liaison est choisie parmi protéine G, protéine L, protéine A, protéine Z, protéine M, immunoglobuline, une immunoglobuline complète ou partielle, ou un dérivé de celles-ci. Dans un mode de réalisation, les fluorochromes Faet/ou Fbsont choisis parmi des molécules fluorescentes ou des protéines fluorescentes.
L’invention concerne également un dispositif pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible comprenant :
  • un substrat à la surface duquel est accrochée une molécule de greffage de manière covalente ;
  • au moins un rapporteur fluorescent comprenant :
    • un récepteur lié à une protéine de liaison ;
    • deux fluorochromes Faet Fb;
dans lequel le fluorochrome Faest lié au récepteur et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison ; et
les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET ;
dans lequel la protéine de liaison est liée à la molécule de greffage par liaison covalente.
Dans un mode de réalisation, la molécule cible est une molécule pour laquelle le récepteur présente une affinité et une spécificité forte, de préférence un antigène. Dans un mode de réalisation, le substrat est choisi parmi une plaque de culture cellulaire, une plaque à puits, un film, une bandelette, un gel d’agarose, un gel de cellulose, des nanoparticules ou des microparticules, de préférence sphériques, de préférence de silice ou de polymère, une lame de microscope, une lamelle de verre, le pourtour d’une fibre optique ou un substrat configuré à être fixé sur la tête d’une fibre optique. Dans un mode de réalisation, la protéine de liaison comprend un groupement terminal choisi parmi thiol, amine, azide, alcyne, époxyde, acide carboxylique, aldéhyde, aziridine, alcène, ou un dérivé de
ceux-ci. Dans un mode de réalisation, la molécule de greffage comprend au moins deux groupements réactifs choisis parmi maléimide, ester de N-Hydroxysuccinimide (NHS), ester de sulfo N-hydroxysuccinimide, sulfo-NHS, azide, alcyne, époxyde, acide carboxylique, aldéhyde, aziridine, alcène, ou un dérivé de ceux-ci.
L’invention concerne également une méthode pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible comprenant les étapes suivantes :
  • Mettre en contact un échantillon et au moins un rapporteur fluorescent, ledit rapporteur fluorescent comprenant :
    • un récepteur lié à une protéine de liaison ;
    • deux fluorochromes Faet Fb;
dans lequel le fluorochrome Faest lié au récepteur et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison ; et
les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET ; et
le récepteur a une affinité pour ladite molécule cible ;
  • Exciter le rapporteur fluorescent à une longueur d’onde donnée de sorte que le fluorochrome donneur soit excité ;
  • Mesurer le ratio entre l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome donneur et l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome accepteur ; et
  • Déterminer la présence ou l’absence de ladite molécule cible dans l’échantillon et/ou calculer la concentration de ladite molécule cible dans l’échantillon.
DÉFINITIONS
Dans la présente invention, les termes ci-dessous sont définis de la manière suivante :
  • «Anticorps» (également connus sous le nom d’immunoglobulines, en abrégé Ig) concernent les protéines de gamma globuline qui se trouvent dans le sang ou d’autres fluides corporels des vertébrés et sont utilisées par le système immunitaire pour identifier et neutraliser les corps étrangers, tels que les bactéries et les virus. Les anticorps sont constitués de deux paires de chaînes polypeptidiques, appelées chaînes lourdes et chaînes légères disposées en forme de Y. Les deux extrémités du Y sont les régions qui se lient aux antigènes et les désactivent. Le terme « anticorps » (Ab) tel qu’utilisé ici comprend des anticorps monoclonaux, des anticorps polyclonaux, des anticorps multispécifiques (par exemple des anticorps bispécifiques). Le terme « immunoglobuline » (Ig) est utilisé de manière interchangeable avec « anticorps ».
  • «Antigène» fait référence à une molécule qui provoque une réponse immunitaire. Cette réponse immunitaire peut impliquer soit la production d’anticorps, soit l’activation de cellules immunologiquement compétentes spécifiques, ou les deux. L’homme du métier comprendra que toute macromolécule, y compris pratiquement toutes les protéines ou tous les peptides, peut servir d’antigène.
  • «Aptamère» concerne un oligonucléotide synthétique, le plus souvent un ARN qui est capable de fixer un ligand spécifique.
  • «Configuration active» (notée « ON ») se rapporte à la configuration du rapporteur fluorescent en présence de transfert d’énergie (effet FRET) entre les fluorochromes Faet Fb.
  • «Configuration inactive» (notée « OFF ») se rapporte à la configuration du rapporteur fluorescent en abssence de transfert d’énergie (effet FRET) entre les fluorochromes Faet Fb.
  • «Fluorochrome» (ou fluorophore) concerne une substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation.
  • «Fragment d’anticorps» comprend une partie d’un anticorps intact, et inclut notamment la partie variable responsable de la reconnaissance spécifique de l’antigène. Des exemples de fragments d’anticorps comprennent les fragments Fab, Fab’, (Fab’)2et Fv, scFv, scFv-Fc ; fragments d’anticorps dimériques ; des anticorps linéaires (voir le brevet US 5 641 870 ; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 [1995]) ; molécules d’anticorps monocaténaires ; et des anticorps multispécifiques formés à partir de fragments d’anticorps. L’expression « fragment d’un anticorps » (ou fragment fonctionnel) est un composé ayant une activité biologique qualitative en commun avec un anticorps de pleine longueur. La digestion par la papaïne des anticorps produit deux fragments identiques de liaison à l’antigène, appelés fragments « Fab », et un fragment « Fc » résiduel, une désignation reflétant la capacité de cristalliser facilement. Le fragment Fab se compose d’une chaîne L entière avec le domaine de région variable de la chaîne H (VH) et le premier domaine constant d’une chaîne lourde (CH1). Chaque fragment Fab est monovalent en ce qui concerne la liaison à l'antigène, c’est-à-dire qu’il a un seul site de liaison à l’antigène. Le traitement par la pepsine d'un anticorps donne un seul grand fragment (Fab’)2qui correspond approximativement à deux fragments Fab liés par un pont disulfure ayant une activité de liaison à l’antigène divalent et qui est toujours capable de réticuler l’antigène. Les fragments Fab’ diffèrent des fragments Fab en ayant quelques résidus supplémentaires à l'extrémité carboxy du domaine CH1 comprenant une ou plusieurs cystéines de la région charnière de l’anticorps. Fab’-SH est la désignation ici pour Fab’ dans lequel le ou les résidus cystéine des domaines constants portent un groupe thiol libre. Les fragments d’anticorps F(ab’)2ont été initialement produits sous forme de paires de fragments Fab’ qui ont des cystéines charnières entre eux. D'autres couplages chimiques de fragments d'anticorps sont également connus.
  • «Ligand» concerne une molécule cible spécifique capable de se lier de manière réversible avec un récepteur. Le ligand interagit de manière non-covalente et spécifique avec ledit récepteur. La liaison se réalise grâce aux forces entre molécules, telles que les liaisons ioniques, les liaisons d'hydrogène et les forces van der Waals. Un couple anticorps/antigène est un exemple de couple récepteur/ligand. Dans la présente description, les termes « ligand », « antigène » et « molécule cible » sont interchangeables.
  • «Optiquement transparent» concerne un matériau qui absorbe moins de 50%, de préférence moins de 20%, plus préférentiellement moins de 10% de lumière à la longueur d’onde comprise entre 350 nm et 1100 nm.
  • «Protéine» fait référence à une entité fonctionnelle formée d'un ou plusieurs peptides.
  • «Récepteur» concerne une molécule biologique capable de reconnaitre et/ou de se lier de manière réversible à une molécule cible spécifique (ou ligand). Le récepteur interagit de manière non-covalente et spécifique avec ladite molécule cible. La liaison se réalise grâce aux forces entre molécules, telles que les liaisons ioniques, les liaisons hydrogène et les forces van der Waals. Un couple anticorps/antigène est un exemple de couple récepteur/ligand.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE
La présente invention concerne un rapporteur fluorescent comprenant :
  • un récepteur lié à une protéine de liaison ;
  • deux fluorochromes Faet Fb.
Le fluorochrome Faest lié au récepteur et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison. Les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET.
Ainsi le rapporteur fluorescent comprend une partie responsable de la fixation spécifique d’une molécule cible à détecter (récepteur), deux fluorochromes capables de convertir la reconnaissance de la molécule cible en signal fluorescent mesurable (Faet Fb) et un système de support pour un des deux fluorochromes pouvant aussi servir d’accroche permettant une liaison maitrisée sur un substrat (protéine de liaison).
Lors de la reconnaissance d’une molécule cible par le rapporteur fluorescent, un changement de conformation du récepteur a lieu. Ce changement de conformation affecte les positions relatives des fragments variables VH (chaine variable lourde) et VL (chaine variable légère), ainsi que des fragments constants, modifiant la distance entre les deux fluorochromes. Cela conduit à des variations des niveaux d’émission des fluorochromes donneur et accepteur par un transfert d’énergie non radiatif, i.e. effet FRET (Förster Resonance Energy Transfer). Ce transfert d’énergie non radiatif permet une modification de la signature optique du rapporteur fluorescent en cas de modification de la distance entre les deux fluorochromes. Cela conduit à une variation de l’intensité de fluorescence émise par chacun des deux fluorochromes, convertissant ainsi le changement de conformation du récepteur induit par la reconnaissance de la molécule cible en signal fluorescent mesurable.
Pour former un couple donneur/accepteur FRET, les deux fluorochromes Faet Fbdoivent présenter des caractéristiques spectrales compatibles, notamment un chevauchement du spectre d’émission du fluorochrome dit « donneur » avec le spectre d’excitation du fluorochrome dit « accepteur ». Lorsque le fluorochrome donneur est excité, sa fluorescence permettra alors d’exciter le fluorochrome accepteur. L’efficacité de ce transfert d’énergie dépend essentiellement de la distance entre les deux fluorochromes, de leur coefficient d’extinction et leur rendement quantique, ainsi que de l’importance du chevauchement entre leur spectre d’émission et excitation.
Les emplacements spécifiques des fluorochromes sur le récepteur et la protéine de liaison sont optimisés pour favoriser des changements de leur signature optique en fluorescence en cas de reconnaissance et/ou fixation de la molécule cible. De préférence, le fluorochrome Fbest greffé sur une amine libre de la protéine de liaison.
La protéine de liaison a une certaine affinité pour le récepteur, par exemple le récepteur est un anticorps et la protéine de liaison est une protéine G.
Selon un mode de réalisation, le récepteur est lié à la protéine de liaison par interactions entre molécules du type Van der Waals, ou par liaison covalente. De façon avantageuse, une liaison forte (type Van der Waals ou covalente) entre le récepteur et la protéine de liaison, de préférence plus forte que la liaison récepteur -molécule cible, permet d’assurer, qu’une fois la molécule cible reconnue, le récepteur ne se détachera pas de la protéine de liaison. Ainsi la séparation du rapporteur fluorescent en deux parties est évitée. Empêcher la séparation entre le récepteur et la protéine de liaison est particulièrement important lorsque le rapporteur fluorescent est utilisé pour de la détection in vivo de molécules cibles, notamment lorsqu’il est greffé à l’extrémité distale d’une fibre optique en vue d’une exploration intracorporelle, car cela limite le risque de laisser une partie du rapporteur fluorescent (celle avec le récepteur) dans le corps du patient au moment du retrait de la fibre. De plus, sans être lié par aucune théorie, la demanderesse estime qu’une liaison covalente améliore l’efficacité de l’effet FRET.
Selon un mode de réalisation, le récepteur est choisi parmi anticorps, fragment d’anticorps, aptamère, protéines, peptides, ou un dérivé de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation, le récepteur est capable de reconnaitre et/ou de se lier de manière réversible à un ligand, i.e. une molécule cible. Le ligand correspond à toute molécule pour laquelle le récepteur présente une affinité et une spécificité forte, et capable de se lier de manière réversible avec un récepteur donné.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, la molécule cible (ou ligand) est un antigène.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, l’anticorps ou le fragment d’anticorps est choisi parmi Fab, Fab’, (Fab’)2, scFv, ou scFv-Fc.
Selon un mode de réalisation, la protéine de liaison est de préférence une protéine de liaison aux immunoglobulines.
Selon un mode de réalisation, la protéine de liaison est choisie parmi protéine A, protéine G, protéine L, protéine M, protéine Z, immunoglobuline, une immunoglobuline complète ou partielle, ou un dérivé de celles-ci.
Selon un mode de réalisation, le fluorochrome Faest le donneur et le fluorochrome Fbest l’accepteur du couple donneur/accepteur FRET.
Selon un autre mode de réalisation, le fluorochrome Faest l’accepteur et le fluorochrome Fbest le donneur du couple donneur/accepteur FRET.
Selon un mode de réalisation, les fluorochromes Faet/ou Fbprésentent un pic d’émission de fluorescence compris entre 350 nm et 399 nm (dans la gamme UV), entre 400 nm et 499 nm (dans la gamme bleue du spectre visible), entre 500 nm et 599 nm (dans la gamme verte du spectre visible) ou entre 600 nm et 719 nm (dans la gamme rouge du spectre visible), entre 720 nm et 850 nm (dans la gamme du proche infrarouge).
Selon un mode de réalisation, les pics d’émission de fluorescence des fluorochromes Faet Fbprésentent une zone de chevauchement. De façon avantageuse, ce chevauchement permet un transfert non radiatif d’énergie entre les deux fluorochromes.
Selon un mode de réalisation, les fluorochromes Faet/ou Fbsont choisis parmi des molécules fluorescentes ou des protéines fluorescentes.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, une molécule fluorescente est choisie parmi rhodamine, coumarine, EVOblue®, oxazine, carbopyronine, naphthalène, biphényle, anthracène, phenanthrène, pyrène, carbazole, xanthène, cyanine, fluoresceine, squaraine, squaraine rotaxane, oxadiazole, acridine, arylméthine, tétrapyrrole, dipyrrométhène, ou tout autre dérivé fluorescent de celles-ci.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, une protéine fluorescente est choisie parmi la protéine fluorescente verte (GFP, « Green Fluorescent Protein »), 22G, aceGFP, amFP486 (« GFP-like fluorescent chromoprotein amFP486 », « Anemonia manjano FP486 »), amm2CP, avGFP, AvicFP1, cFP484 (« GFP-like fluorescent chromoprotein cFP484 », « Clavularia cFP484 »), dendFP, dfGFP (« Green fluorescent protein »), DrCBD, DsRed, EosFP (« Green to red photoconvertible GFP-like protein EosFP »), eqFP578 (« Red fluorescent protein eqFP578 », « Entacmaea quadricolor FP578 »), eqFP611 (« Red fluorescent protein eqFP611 », « Entacmaea quadricolor FP611 »), HcRed (« GFP-like non-fluorescent chromoprotein », « Heteractis crispa Red »), KikG, KO, LanYFPn, Montipora sp20 (« Cytochrome c oxidase subunit 1 »), mRed7 (« Rod shape-determining protein MreD », « mine drainage metagenome 7 »), NpR3784g, RpBphP1 (« Rhodopseudomonas palustris BphP1 »), RpBphP2 (« Rhodopseudomonas palustris BphP2 »), RpBphP6 (« Rhodopseudomonas palustris BphP6 »), TeAPCalpha, zFP538 (« GFP-like fluorescent chromoprotein FP538 », « Zoanthus FP538 »), AausFP1, vsfGFP-0, LanYFP, bfloGFPa1, RRvT, dLanYFP, dVFP, ccalYFP1, efasGFP, pcDronpa (Green), aeurGFP, Skylan-S (On), mVenus-Q69M, tdTomato, PlamGFP, eechGFP1, mNeonGreen, Kaede (Green), mClover3, Clover, VFP, pcDronpa2 (Green), moxNeonGreen, tdimer2(12), Dronpa (On), YPet, Skylan-NS (On), ffDronpa (On), eechGFP2, gfasGFP, Gamillus (On), sarcGFP, vsfGFP-9, mEos3.1 (Green), pmeaGFP1, mVFP, pmimGFP1, pmimGFP2, mEos4a (Green), pcDronpa2 (Red), pdae1GFP, pmeaGFP2, mScarlet, mCitrine, ccalGFP3, phiYFP, SYFP2, Citrine2, mVFP1, Gamillus0.4, SHardonnay, aacuGFP2, mVenus, mEos4b (Green), mKOκ, fabdGFP, mGeos-C (On), rsKame (On), TurboRFP, afraGFP, stylGFP, phiYFPv, FoldingReporterGFP, Citrine, dendFP (Green), PSmOrange (Orange), anobGFP, mRuby3, RFP611, Topaz, SEYFP, mScarlet-I, mWasabi, iq-mVenus, meffRFP, d2EosFP (Green), eqFP578, EYFP-Q69K, mTFP1, ccalRFP1, eechGFP3, cgreGFP, SuperfolderGFP, meffGFP, mEos3.2 (Green), pporGFP, muGFP, Venus, mGeos-E (On), Gamillus0.2, mEosFP-M159A (Green), pporRFP, pcDronpa (Red), d1EosFP (Green), moxGFP, oxGFP, EosFP (Green), amilFP513, KO, mGeos-S (On), tdKatushka2, mOrange, mEYFP, anm1GFP1, meffCFP, AzamiGreen, obeGFP, TagRFP, dimer2, dTomato, mEos2 (Green), usGFP, M355NA, cgfTagRFP, mGeos-F (On), EYFP, Gamillus0.3, Kohinoor (On), amilFP593, ccalOFP1, obeYFP, mGeos-M (On), moxVenus, oxVenus, WasCFP, mEos4a (Red), mUkG, NowGFP, mEosFP (Green), mRuby2, ppluGFP2, mAvicFP1, dTFP0.2, AvicFP1, scubRFP, mKO2, UnaG, mEos4b (Red), GFPmut2, mRuby, Emerald, mEmerald, ppluGFP1, meleRFP, mGeos-L (On), OFP, mmilCFP, KikGR1 (Green), TurboGFP, mApple, CyRFP1 (CyRFP1), E2-Red/Green, ccalGFP1, mPapaya, moxCerulean3, GFP(S65T), eqFP611, meleCFP, GFPmut3, SGFP2(E222Q), mCerulean3, mOrange2, G3, Dreiklang (On), TagGFP2, mAzamiGreen, mKikGR (Green), iq-mEmerald, cfSGFP2, Dendra2-M159A (Orange), mEGFP, EGFP, TagRFP-T, TagGFP, anobCFP2, KCY, td-RFP611, TagBFP, smURFP, mTagBFP2, mLumin, SGFP2, SGFP2(T65G), PSmOrange2 (Orange), eqFP611V124T, efasCFP, TagYFP, mKO, TDsmURFP, CyOFP1, mEos2 (Red), SGFP2(206A), LanFP1, rsFastLime (On), mTFP0.7 (On), cerFP505, psamCFP, Katushka2S, DsRed.T3, E2-Crimson, FR-1, DsRed2, mCerulean2, Dendra2-M159A (Green), PATagRFP1314 (On), mTurquoise2, Padron (On), aceGFP, AcGFP1, NijiFP (Orange), SPOON (on), Cerulean, amilFP490, dTFP0.1, PATagRFP1297 (On), mT-Sapphire, T-Sapphire, NijiFP (Green), mAmetrine, mNectarine, mStrawberry, SGFP1, cgfmKate2, BrUSLEE, rsGreen1 (Bright), mIrisFP (Green), G2, mTurquoise, moxDendra2 (Green), iq-mCerulean3, PATagRFP (On), mKate2, d1EosFP (Red), Turquoise-GL, MiCy, mBlueberry2, FusionRed-M, dendFP (Red), Dendra2-T69A (Green), anobCFP1, αGFP, mCerulean2.N, LSSmOrange, mCerulean2.D3, cpT-Sapphire174-173, Aquamarine, oxCerulean, mEosFP (Red), mEosFP-F173S (Green), KikGR1 (Red), mNeptune2.5, EBFP1.5, Dendra2-T69A (Orange), EosFP (Red), aacuGFP1, bsDronpa (On), Dendra2 (Green), mKateS158A, IrisFP (Green), ZsGreen, mCerulean.B24, obeCFP, Katushka, Padron0.9 (On), mNeptune2, AausGFP, TagCFP, mCerulean.B, LanFP2, mKateS158C, mEos3.1 (Red), Dronpa-2 (On), D10, shBFP-N158S/L173I, Kaede (Red), sg25, d2EosFP (Red), mCerulean2.N(T65S), avGFP, E2-Orange, BDFP1.6, DsRed-Max, mCerulean.B2, mIrisFP (Red), CGFP, Dendra2 (Red), Dronpa-3 (On), Sapphire, EBFP1.2, rsEGFP2 (On), FusionRed, EBFP2, CyPet, eforCP, mEos3.2 (Red), mKikGR (Red), mBeRFP, mCyRFP1, mKillerOrange, RFP630, mCherry2, moxBFP, oxBFP, KillerOrange, moxDendra2 (Red), mClavGR2 (Red), cFP484, rsEGFP (On), KCY-G4219, Gamillus0.1, mMaple (Red), SCFP3A, IrisFP (Orange), RFP637, mCardinal, mRFP1-Q66T, mKalama1, mCerulean, mKateM41GS158C, SBFP2, KCY-R1, mPapaya0.7, mCherry, iq-EBFP2, eqFP650, G1, sg12, mMiCy, mEos2-A69T (Green), SCFP3B, DsRed-Express2, mKate, mScarlet-H, Dendra (Green), mClavGR2 (Green), td-RFP639, Azurite, Dendra (Red), miRFP670-2, PA-GFP (On), iRFP713/V256C, miRFP680, mECFP, SuperNovaRed, mNeptune, DsRed.T4, BFP.A5, mCRISPRed, ECFP, ZsYellow1, Neptune, mRaspberry, rsFolder (Green), PAmCherry2 (On), DsRed-Express, moxMaple3 (Red), iRFP670, mRFP1, mMaple3 (Red), RFP639, iq-mApple, emiRFP670, miRFP670, shBFP, SiriusGFP, AvicFP4, W7, H9, SCFP2, mRFP1-Q66S, mTangerine, IrisFP-M159A (Green), KillerRed, mMaple (Green), dsFP483, GZnP3, PS-CFP2 (Green), sg11, mRFP1-Q66C, miRFP670nano, mEosFP-F173S (Red), miRFP682, LSSmCherry1, rsFolder2 (Green), iRFP682, R3-2+PCB, amFP486, PSmOrange (Far-red), mGarnet2, miRFP, Jred, mMaroon1, PS-CFP2 (Cyan), mGarnet, zFP538, PAmCherry1 (On), miRFP670v1, W1C, dTG, rsFusionRed1 (On), P4-1, emiRFP703, miRFP703, mKelly2, mStable, dKeima, mEos2-A69T (Orange), iRFP702, deGFP2, PSmOrange2 (Far-red), miRFP702, lanRFP-ΔS83l, laRFP, W2, mKelly1, SCFP1, miRFP713, iFP2.0, pHuji, mIFP, iFP1.4, SuperNovaGreen, HcRed-Tandem, EBFP, iRFP713, SOPP3, SOPP2, miniSOG, HcRed7, miRFP720, RDSmCherry0.1, P4-3E, mTFP0.3, mMaple3 (Green), mCarmine, iRFP720, SOPP, Maroon0.1, moxMaple3 (Green), PS-CFP (Cyan), BFP, mBlueberry1, eechRFP, PS-CFP (Green), deGFP3, PAmCherry3 (On), RDSmCherry1, deGFP1, PAmKate (On), LSS-mKate2, Wi-Phy, rsFusionRed2 (On), miRFP709, eqFP670, mBanana, KFP1 (On), sg50, mPlum, rsTagRFP (ON), deGFP4, iq-mKate2, sg42, Pp2FbFPL30M, TagRFP675, mRojoB, AQ143, Sirius, mKeima, TagRFP657, ECGFP, SNIFP, tKeima, Pp2FbFP, rsFusionRed3 (On), AsRed2, LSS-mKate1, AvicFP2 (pre-conversion), ECFPH148D, dKeima570, mHoneydew, cpCitrine, rsCherry (On), mNeptune681, mGrape1, mGinger2, mGrape3, mNeptune684, mGinger1, RDSmCherry0.2, mGrape2, mRojoA, SBFP1, mRouge, P4, RDSmCherry0.5, GZnP3 (GZnP3(apostate)), rsCherryRev (On), Sandercyanin, HcRed, mRtms5, anm2CP, mTFP1-Y67W, Ultramarine, 10B, 11, 22G, (3-F)Tyr-EGFP, 5B, 6C, A1a, A44-KR, aacuCP, AausFP2, AausFP3, AausFP4 (On), acanFP, aceGFP-G222E-Y220L, aceGFP-h, Achilles, AdRed, AdRed-C148S, ahyaCP, alajGFP1, alajGFP2, alajGFP3, amCyan1, amFP495, amFP506, amFP515, amilCP, amilCP580, amilCP586, amilCP604, amilFP484, amilFP497, amilFP504, amilFP512, amilFP597, anm1GFP2, apulCP584, apulFP483, AQ14, asCP562, asFP499, asulCP, atenFP, avGFP454, avGFP480, avGFP509, avGFP510, avGFP514, avGFP523, AvicFP3 (pre-conversion), bfloGFPc1, BFP5, BFPsol, Blue102, BR1, cEGFP, CFP, CFP4, cgigCP, cgigGFP, CheGFP1, CheGFP2, CheGFP3, CheGFP4, Clomeleon, Clover1.5, cpasCP, cp-mKate, Cy11.5, dClavGR1.6, dClover2, dClover2A206K, dfGFP, dhorGFP, dhorRFP, dimer1, dis2RFP, dis3GFP, dPapaya0.1, DrCBD, d-RFP618, Dronpa-C62S, DspR1, DsRed.M1, DsRed-Timer, DstC1, EaGFP, echFP, echiFP, eGFP203C, eGFP205C, EnhancedCyan-EmittingGFP, EYFP-F46L, fcFP, fcomFP, Flamindo2, FP586, Fpaagar, Fpag_frag, Fpcondchrom, FPmann, FPmcavgr7.7, FPrfl2.3, Gamillus0.5, GCaMP2, GCaMP6f (in presence of Ca2+), gdjiCP, gfasCP, GFP-151pyTyrCu, GFPhal, GFP-Tyr151pyz, GFPxm16, GFPxm161, GFPxm162, GFPxm163, GFPxm18, GFPxm181uv, GFPxm18uv, GFPxm19, GFPxm191uv, GFPxm19uv, gtenCP, HcRed1-Blue, hcriCP, hcriGFP, hfriFP, hmGFP, HriCFP, HriGFP, iLov, jRGECO1a (in absence of Ca2+), jRGECO1a (in presence of Ca2+), Katushka-9-5, KCY-G4219-38L, KCY-R1-158A, KCY-R1-38H, KCY-R1-38L, KikG, KOFP-7 (KOFP-7), laesGFP, laGFP, LEA, mc1, mc2, mc3, mc4, mc5, mc6, McaG1, McaG1ea, McaG2, mcavFP, mcavGFP, mcavRFP, mcCFP, mcFP497, mcFP503, mcFP506, mCherry1.5, mClavGR1, mClavGR1.1, mClavGR1.8, mClover1.5, mcRFP, meffCP, mEos2-NA, meruFP, MfaG1, miniSOG2, miniSOGQ103V, mKate2.5, mKG, mK-GO (Late), mK-GO (Early), mMaple2 (Green), mMaple2 (Red), mmGFP, mOFP.T.12, mOFP.T.8, montFP, Montiporasp.#20-9115, moxEos3.2, mPA-GFP, mPapaya0.3, mPapaya0.6, mPlum-E16P, mRed7, mRed7Q1, mRed7Q1S1, mRed7Q1S1BM, mRFP1.1, mRFP1.2, mRFP1.3, mRFP1.4, mRFP1.5, mTFP*, mTFP0.4, mTFP0.5, mTFP0.6, mTFP0.8, mTFP0.9, mTFP1-Y67H, mTurquoise-146G, mTurquoise-146S, mTurquoise2-G, mTurquoise-DR, mTurquoise-GL, mTurquoise-GV, mTurquoise-RA, NpR3784g, OFPxm, P11, P9, Padron(star) (On), PdaC1, PDM1-4, pHluorin2 (acidic), pHluorin2 (alkaline), pHluorin, psupFP, ptilGFP, Q80R, RCaMP, R-FlincA, rfloGFP, rfloGFP2, rfloRFP, RFP618, roGFP1, roGFP1-R1, roGFP1-R8, roGFP2, RpBphP1, RpBphP2, RpBphP6, rrenGFP, rrGFP, rsCherryRev1.4 (On), RSGFP1, RSGFP2, RSGFP3, RSGFP4, RSGFP6, RSGFP7, Rtms5, SAASoti (Red), SAASoti (Green), scleFP1, scleFP2, scubGFP1, scubGFP2, secBFP2, sfCherry, sfCherry2, sfCherry3C, SH3, ShG24, spisCP, stylCP, SuperfoldermTurquoise2, SuperfoldermTurquoise2ox, sympFP, TeAPCα, tPapaya0.01, Trp-lessGFP, TurboGFP-V197L, V127TSAASoti (Red), V127TSAASoti (Green), vsGFP, Xpa, yEGFP, YFP3, zGFP, zoan2RFP, zRFP, ou tout autre dérivé fluorescent de celles-ci. Les protéines fluorescentes sont encodées génétiquement.
Selon un mode de réalisation, le lien entre le fluorochrome Faet le récepteur est une liaison covalente. Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, cette liaison est de type NHS-NH2, maléimide-SH ou leurs dérivés, le groupement NHS ou maléimide étant porté sur le fluorochrome Faet l'amine ou thiol étant sur le récepteur.
Selon un mode de réalisation dans lequel le fluorochrome Faest une protéine fluorescente, le récepteur et Fasont liés sous forme de protéine de fusion. Dans ce mode de réalisation, le récepteur et Fasont codés par le même gène.
Selon un mode de réalisation, le lien entre le fluorochrome Fbet la protéine de liaison est une liaison covalente. Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, cette liaison est de type NHS-NH2, maléimide-SH ou leurs dérivés, le groupement NHS ou maléimide étant porté sur le fluorochrome Fbet l'amine ou thiol étant sur la protéine de liaison.
Selon un mode de réalisation, en configuration inactive du rapporteur fluorescent (configuration OFF), la distance entre les fluorochromes Fa et Fb ne permet pas l’effet FRET, i.e. la distance entre les fluorochromes Fa et Fb est supérieure ou inférieure à la distance permettant l’effet FRET ; alors qu’en configuration active (configuration ON), la distance entre les fluorochromes Fa et Fb permet l’effet FRET. En d’autres termes, la distance entre les fluorochromes Fa et Fb en configuration inactive (i.e. rapporteur fluorescent au repos, configuration OFF) est supérieure ou inférieure à la distance entre les fluorophores Fa et Fb en configuration active (configuration ON). Le rapporteur fluorescent est au repos lorsque le récepteur n’est pas lié à une molécule cible ; dans le cas où le récepteur est un anticorps, le rapporteur fluorescent est au repos lorsque le site de reconnaissance de l’anticorps est libre. Le rapporteur fluorescent est en configuration active lorsque le récepteur est lié à une molécule cible ; dans le cas où le récepteur est un anticorps, le rapporteur fluorescent est en configuration active lorsque le site de reconnaissance de l’anticorps n’est pas libre, i.e. un antigène est reconnu et lié à l’anticorps. Il existe aussi une configuration où la configuration ON a lieu lorsque l’anticorps ne détecte pas sa molécule cible et qui passe en configuration OFF lorsque le récepteur est lié à la molécule cible (FRET sans molécule cible et arrêt du FRET avec).
La présente invention concerne également un dispositif pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible.
Le dispositif comprend :
  • un substrat à la surface duquel est accrochée une molécule de greffage de manière covalente ;
  • au moins un rapporteur fluorescent comprenant :
    • un récepteur lié à une protéine de liaison ;
    • deux fluorochromes Faet Fb;
dans lequel le fluorochrome Faest lié au récepteur et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison ; et
les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET.
La protéine de liaison est liée à la molécule de greffage par liaison covalente.
Une liaison forte (type Van der Waals ou covalente) entre le récepteur et la protéine de liaison, plus forte que la liaison récepteur-molécule cible, et une liaison covalente entre la protéine de liaison et la molécule de greffage permet d’assurer, qu’une fois la molécule cible reconnue, le récepteur ne se détachera pas de la protéine de liaison. Ainsi la séparation du rapporteur fluorescent en deux parties est évitée.
Lors d’une détection de molécule cible in vitro, éviter la séparation entre le récepteur et la protéine de liaison est particulièrement important afin de ne pas induire une contamination de l’échantillon.
Lors d’une détection de molécule cible in vivo, éviter la séparation entre le récepteur et la protéine de liaison est particulièrement important lorsque le rapporteur fluorescent est utilisé pour de la détection in vivo de molécules cibles, notamment lorsqu’il est greffé à l’extrémité distale d’une fibre optique en vue d’une exploration intracorporelle, car cela limite le risque de laisser une partie du rapporteur fluorescent (celle avec le récepteur) dans le corps du patient au moment du retrait de la fibre. Une telle contamination biologique peut avoir divers effets indésirables, semblables à ceux observés lors de l’injection directe d’anticorps, comme par exemple des manifestations d’inconfort telles que céphalées, nausées ou sensation d'asthénie, des réactions telles que fièvre ou frissons, des symptômes d’allure allergique, à tropisme cutané (prurit, éruption, urticaire), respiratoires (bronchospasmes, toux, dyspnée) ou cardiovasculaires (hypotension), ou encore des syndromes de lyse tumorale (en cas de forte masse tumorale). Ces effets indésirables sont dûs à la fois à la nature du ligand et celle du récepteur.
La molécule de greffage a pour rôle de garantir la bonne orientation du récepteur pour que ses sites de reconnaissance soient accessibles à la molécule cible.
Les modes de réalisation concernant le rapporteur fluorescent ou les différents éléments dudit rapporteur (récepteur, protéine de liaison, fluorochromes) s’appliquent au dispositif de l’invention.
Selon un mode de réalisation, la molécule cible (ou ligand) est une molécule pour laquelle le récepteur présente une affinité et une spécificité forte. Préférentiellement, la molécule cible (ou ligand) est un antigène.
Selon un mode de réalisation, le substrat est choisi parmi une plaque de culture cellulaire, une plaque à puits, un film, une bandelette, un gel d’agarose, un gel de cellulose, des nanoparticules ou des microparticules, de préférence sphériques, de préférence de silice ou de polymère, une lame de microscope, ou une lamelle de verre. Un dispositif selon ce mode de réalisation a pour but la détection et/ou la mesure de concentration en molécules cibles in vitro, i.e. en solution ou sur substrat.
Selon un mode de réalisation, le dispositif comprend en outre une fibre optique et une tête d’exploration. La tête étant fixée de manière amovible ou solidaire à la fibre optique (par l’intermédiaire d’une férule). De manière connue, une fibre optique comprend une gaine enveloppant un ou plusieurs cœurs de fibre, et son extrémité distale destinée à l’exploration se présente sous la forme d’une férule rigide rendue solidaire fermement de l’extrémité de la gaine de la fibre et dont la face externe transversale à l’axe de la fibre est transparente. Un dispositif selon ce mode de réalisation a pour but la détection et/ou la mesure de concentration en molécule cible in vivo, i.e. dans le corps du patient par exemple par endoscopie ou lors d’une chirurgie.
La « tête d’exploration » est la partie de la fibre jouant le rôle de sonde ou d’une manière générale de toute fonction technique utilisant la lumière émise en extrémité de la fibre optique pour coopérer ou interagir avec le milieu dans lequel l’extrémité de la fibre est introduite. Elle peut être amovible ou solidaire de la fibre optique. La férule de la fibre optique n’a qu’une fonction de moyen de fixation mécanique pour la tête d’exploration.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, le substrat est choisi parmi le pourtour d’une fibre optique ou un substrat configuré à être fixé sur la tête d’une fibre optique, de préférence un substrat optiquement transparent et configuré pour être fixé à l’extrémité distale d’une fibre optique (i.e. l’extrémité d’exploration), plus précisément, à l’extrémité distale de la tête d’exploration. De préférence, le rapporteur fluorescent est greffé sur un film, de préférence un film organique tel qu’un film polymère, à l’extrémité distale de la tête d’exploration.
Dans le cas d’une tête d’exploration amovible, la férule et la tête d’exploration sont rendues solidaires par assemblage mécanique (sertissage, chaussage, vissage, clipsage, verrouillage quart-de-tour), ou comprennent respectivement des moyens de fixation par coopération mutuelle (moyens mâles-femelles de coopération). La fixation de la tête à la férule est conçue de sorte que la tête et la férule ne puissent se désolidariser en cours d’utilisation, en particulier lorsque la fibre a été introduite dans le corps du patient.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, la tête d’exploration présente un corps et une face externe, dite face d’émission, dont une partie au moins est transparente formant un hublot, et destinée à être en regard du ou des cœurs de la fibre optique pour le passage de la lumière. De préférence, un film polymère est utilisé comme partie transparente de sorte qu’il soit fonctionnalisé avec le rapporteur fluorescent. De préférence, le corps est en matériau polymérique, en verre, en céramique, en acier inoxydable, en matériau composite, ou combinaison de ces matériaux, et la face externe d’émission est en polymère, verre, céramique, silice, matériau composite ou hybride.
Selon un mode de réalisation dans lequel la fibre optique comprend un cœur recouvert partiellement par une gaine métallique, une portion du cœur n’étant pas recouvert par la gaine, le rapporteur fluorescent est greffé à la surface de la portion du cœur non recouverte. Ce mode de réalisation permet l’obtention d’une onde de surface sur la partie longitudinale de la fibre optique.
Selon un mode de réalisation, la protéine de liaison comprend un groupement terminal choisi parmi thiol, amine, azide, alcyne, epoxyde, acide carboxylique, aldéhyde, aziridine, alcène, ou un dérivé de ceux-ci.
Selon un mode de réalisation, la molécule de greffage comprend au moins deux groupements réactifs choisis parmi maléimide, ester de N-Hydroxysuccinimide (NHS), ester de sulfo N-hydroxysuccinimide, sulfo-NHS, azide, alcyne, époxyde, acide carboxylique, aldéhyde, aziridine, alcène, ou un dérivé de ceux-ci. La molécule de greffage permet le lien covalent entre le substrat et le rapporteur fluorescent. De préférence, les deux groupements réactifs se situent à chacune de ses extrémités.
Selon un mode de réalisation, le substrat est couvert d’une couche de matériau organique ou inorganique choisi parmi zircone, dioxyde de titane, epoxy, organosilane tel que par exemple organosilane aminé, organosilane thiolé, organosilane azidé, organosilane alcyné, organosilane carbonylé, ou organosilane présentant une double liaison carbone-carbone.
La présente invention concerne également une méthode pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible.
La méthode comprend les étapes suivantes :
  • Mettre en contact un échantillon et au moins un rapporteur fluorescent, ledit rapporteur fluorescent comprenant :
    • un récepteur lié à une protéine de liaison ;
    • deux fluorochromes Faet Fb;
dans lequel le fluorochrome Faest lié au récepteur et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison ; et
les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET ; et
le récepteur a une affinité pour ladite molécule cible ;
  • Exciter le rapporteur fluorescent à une longueur d’onde donnée de sorte que le fluorochrome donneur soit excité ;
  • Mesurer le ratio entre l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome donneur et l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome accepteur ;
  • Déterminer la présence ou l’absence de ladite molécule cible dans l’échantillon et/ou calculer la concentration de ladite molécule cible dans l’échantillon.
Lors de la reconnaissance d’une molécule cible par le récepteur, un changement de conformation dudit récepteur a lieu, induisant une variation de la distance entre les fluorochromes Faet Fb, conduisant à un transfert non radiatif du fluorochrome donneur vers le fluorochrome accepteur (effet FRET). Les variations de l’intensité des pics de fluorescence des fluorochromes donneur et accepteur sont ainsi la conséquence directe de la concentration en molécule cible dans l’échantillon. Une augmentation ou une diminution de l’intensité de fluorescence émise par le fluorochrome donneur est donc attendue si la molécule cible est présente dans l’échantillon, cela résulte en une augmentation ou une diminution du ratio entre l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome donneur et l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome accepteur (appelé ci-après indice FRET). Si l’intensité des pics de fluorescence reste inchangée (indice FRET nul), cela indique l’absence de molécule cible dans l’échantillon. Ainsi, la détermination de la présence ou l’absence de ladite molécule cible dans l’échantillon et/ou calculer la concentration de ladite molécule cible dans l’échantillon découle de l’interprétation de la variation de l’indice FRET. L’inverse est aussi possible.
La détection de la molécule cible est avantageusement rapide.
Les modes de réalisation concernant le rapporteur fluorescent, les différents éléments dudit rapporteur (récepteur, protéine de liaison, fluorochromes), le dispositif ou les différents éléments dudit dispositif s’appliquent à la mise en œuvre de la méthode selon l’invention. En particulier, la méthode selon l’invention est mise en œuvre par le dispositif de l’invention.
Selon un mode de réalisation, la mise en contact du rapport fluorescent avec l’échantillon est réalisée par n’importe quel moyen de mise en contact. De préférence la mise en contact a lieu en solution ou par toucher direct.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, la mise en contact par toucher direct dure quelques secondes. Dans une autre configuration spécifique de ce mode de réalisation, par exemple en solution, la mise en contact en solution dure moins d’une heure, de préférence moins de 30 minutes, plus préférentiellement moins de 5 minutes. Plus la durée de mise en contact est élevée, plus le signal optique est net.
Selon un mode de réalisation, la mesure du ratio entre l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome donneur et l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome accepteur est faite par spectrométrie.
Selon un mode de réalisation, la méthode comprend également une étape préalable de calibration selon laquelle le dispositif est mis au contact d’un échantillon sain. De façon avantageuse, cette étape permet de déterminer une mesure de référence d’indice FRET pour le couple Fa/Fbchoisi. Par la suite, la comparaison entre cette mesure de référence et l’indice FRET mesuré au contact de l’échantillon suspecté de porter la molécule cible permettra de conclure sur la présence ou non de la molécule cible ainsi que de sa concentration dans l’échantillon testé.
La présence, l’absence, ou la détection d’une quantité de molécule cible au-delà ou en deçà d’un certain seuil permettra de caractériser l’échantillon, et de le considérer ou non comme sain.
Selon un mode de réalisation, l’échantillon peut être n'importe quel échantillon ayant la possibilité de contenir une molécule cible comme objet de détection ou de mesure et peut être un échantillon liquide ou un échantillon solide.
Selon un mode de réalisation, l’échantillon est choisi parmi une solution, une culture cellulaire (par exemple eukaryote ou prokaryote), du sang total, du plasma, du sérum sanguin, de la sueur, ou n’importe quel liquide ou fluide biologique, un tissu organique, ou un organe.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, un échantillon liquide peut être directement utilisé comme objet de détection ou de mesure ou peut être dilué avec, par exemple, une solution tampon, une solution saline, puis peut être utilisé comme objet de détection ou de mesure. Des exemples de l'échantillon liquide comprennent mais ne sont pas limités à une culture cellulaire (par exemple eukaryote ou prokaryote), les surnageants de culture, les extraits cellulaires, les extraits bactériens, les fluides corporels tels que, par exemple, le sérum, le plasma, la salive, la sueur, le liquide céphalo-rachidien ou l'urine, les eaux usées industrielles, ou un liquide agroalimentaire tel que, par exemple, le lait.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, un échantillon solide est choisi parmi un tissu organique, un organe. L’échantillon solide peut être dissous, mis en suspension ou immergé dans un liquide, tel qu'une solution tampon ou une solution saline, dans un état capable d'être en contact avec le rapporteur fluorescent libre et est ensuite utilisé comme échantillon. De préférence, l’échantillon solide ne subit aucun traitement avant la mise en contact avec le rapporteur fluorescent.
Selon un mode de réalisation, le seuil de détection de la molécule cible est dépendant de l’affinité du récepteur avec la molécule cible, le seuil de détection est de l’ordre de quelques pmol.L-1(picomolaire), de préférence de l’ordre de quelques fmol.L-1(femto molaire).
Selon un mode de réalisation, la méthode peut être mise en œuvre :
  • In vitro, par exemple en suspension, en solution, ou sur un substrat (e.g. plaque multipluits, lame de microscope ou bandelette) ; ou
  • In vivo, par exemple par endoscopie, ou pendant une chirurgie.
Selon un mode de réalisation, le dispositif comprend également un moyen d’excitation configuré pour exciter l’échantillon et/ou le rapporteur fluorescent, et/ou un moyen de collecte de données optiques configuré pour collecter les données issues de la fluorescence des fluorochromes Faet Fb.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, le moyen d’excitation est une source de lumière pouvant effectuer une irradiation avec une longueur d'onde donnée telle que, par exemple une lampe au mercure, une lampe au xénon, une LED, une lampe UV ou une source de lumière laser.
Dans une configuration spécifique de ce mode de réalisation, le moyen de collecte de données optiques est un microscope, un fluorimètre, un cytomètre, ou un spectrophotomètre.
La présente invention concerne également l’utilisation du rapporteur fluorescent selon l’invention et/ou du dispositif selon l’invention pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible dans un échantillon.
Selon un mode de réalisation, rapporteur fluorescent selon l’invention et/ou du dispositif selon l’invention sont utilisés pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible dans un échantillon in vitro.
Selon un mode de réalisation, le rapporteur fluorescent selon l’invention et/ou le dispositif selon l’invention sont utilisés pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible dans un échantillon in vivo.
Dans une configuration spécifique du mode de réalisation in vivo, le rapporteur fluorescent selon l’invention et/ou le dispositif selon l’invention sont utilisés pour la détection de cellules tumorales, la recherche d’infection, ou la détection de marqueurs susceptibles d’aider au diagnostic ou au suivi de l’évolution d’une pathologie. Dans une configuration spécifique du mode de réalisation in vivo, le dispositif est une fibre optique comprenant une tête à laquelle est greffé le rapporteur fluorescent, ou un cathéter à l’extrémité distale duquel est greffé le rapporteur fluorescent. De manière préférentielle, le rapporteur fluorescent selon l’invention et/ou le dispositif selon l’invention sont utilisés en endoscopie. L’endoscopie permet d’examiner l’intérieur d’une cavité par une technique de détection de lumière rétrodiffusée grâce à une fibre optique. Un endoscope comprend une enveloppe flexible logeant une ou plusieurs fibres optiques dont l’extrémité distale est destinée à être introduite dans la cavité à examiner, et l’extrémité proximale opposée est destinée à être reliée à une source de lumière alignée avec la ou les fibres optiques pour transmettre de la lumière jusqu’à l’extrémité distale et dans la cavité, des détecteurs de lumière disposés également en alignement avec les fibres optiques et à l’extrémité proximale étant destinés à recevoir la lumière émise par le rapporteur fluorescent et transmise en retour via les fibres.
Selon un mode de réalisation, rapporteur fluorescent selon l’invention et/ou du dispositif selon l’invention sont utilisés pour la détection d’une molécule cible et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible dans des eaux industrielles, eaux usées ou un liquide agroalimentaire tel que le lait par exemple. Dans une configuration particulière de ce mode de réalisation, rapporteur fluorescent selon l’invention et/ou du dispositif selon l’invention sont utilisés pour la détection de résidu de médicaments ou pesticides, ou la détection de pathogènes.
DESCRIPTION DES FIGURES
est un schéma représentant le passage du rapporteur fluorescent d’une configuration inactive (off) à une configuration active (on) lors de la reconnaissance d’une molécule cible.
représente un dispositif de détection selon un mode de réalisation particulier.
est une illustration des spectres optiques obtenus par analyse au fluorimètre de la réponse du rapporteur fluorescent à différentes concentrations d’antigène.
est une illustration de la courbe dose réponse obtenue avec le rapporteur fluorescent, en mesurant les indices de FRET à partir des courbes présentées en .
est une illustration de la réponse FRET obtenue lors de l’ajout d’un antigène au rapporteur fluorescent (ici TrkB) et d’une molécule non relevante, la BSA où le changement de conformation n’a pas lieu.
est une illustration des spectres optiques mesurés après exposition du rapporteur fluorescent par un laser 488nm en présence de lignées cellulaires exprimant ou non l’antigène cible.
est une illustration des indices de FRET obtenus à partir des spectres présentés en .
MODES DE RÉALISATION ILLUSTRATIFS DE L'INVENTION
La reconnaissance d’une molécule cible 2 par le rapporteur fluorescent 1 est illustrée dans la , le rapporteur fluorescent 1 comprend :
  • un récepteur 11 lié à une protéine de liaison 12 ; et
  • deux fluorochromes Faet Fb;
Le fluorochrome Faest lié au récepteur 11 et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison 12. Les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET. Le récepteur 11 est lié à la protéine de liaison 12 une liaison de force supérieure à celle pouvant lier le récepteur 11 à une molécule de reconnaissance 2.
Avant la reconnaissance de la molécule cible 2 par le rapporteur fluorescent 1, ce dernier est dans une configuration dite inactive (« OFF »), i.e. il n’y a pas d’effet FRET entre les deux fluorochromes Faet Fb. Dans cette configuration, le fluorochrome donneur émet de la lumière par fluorescence car excité alors que le fluorochrome accepteur n’en émet pas. Lors de la reconnaissance de la molécule cible 2 par le rapporteur fluorescent 1, ce dernier prend alors une configuration active (« ON »), un changement de conformation du récepteur 11 s’opère, modifiant la distance qui sépare les deux fluorochromes Faet Fb, induisant ainsi un transfert d’énergie non radiatif (effet FRET) entre les deux fluorochromes. Ce transfert d’énergie s’opère du fluorochrome donneur vers le fluorochrome accepteur : l’intensité de fluorescence du fluorochrome donneur diminue, et celle du fluorochrome accepteur augmente ; dans cette configuration les fluorochromes sont notés F’aet F’b. La variation de leur spectre d’émission due à l’effet FRET peut être mesurée pour détecter et/ou mesurer la concentration en molécule cible 2.
Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux car il permet une détection rapide de la molécule cible 2 tout en évitant la dégradation du rapporteur fluorescent 1 car la liaison récepteur 11-protéine de liaison 12 prévaut sur la liaison récepteur 11-molécule cible 2.
Dans un mode de réalisation illustré en , le dispositif de détection de molécule cible comprend :
  • une fibre optique 4 comprenant :
    • une gaine 46 ;
    • au moins un cœur 45 d’axe longitudinal XX’ ;
    • une férule 44
    • une tête d’exploration comprenant un corps 43 et une face externe 42, dite face d’émission, dont une partie au moins est transparente formant un hublot 41, et destinée à être en regard du ou des cœurs 45 de la fibre optique 4 pour le passage de la lumière ; et
  • un rapporteur fluorescent 1 comprenant :
    • un récepteur lié à une protéine de liaison ; et
    • deux fluorochromes Faet Fb; le fluorochrome Fa est lié au récepteur 11 et le fluorochrome Fb est lié à la protéine de liaison 12, les fluorochromes Fa et Fb forment un couple donneur/accepteur FRET.
La fibre optique 4 présente une extrémité proximale, ici non illustrée, qui est destinée à être connectée de manière connue à une source de lumière, et une extrémité opposée distale, constituant l’extrémité d’exploration de la fibre optique 4 depuis laquelle sera émise la lumière nécessaire à l’illumination du rapporteur fluorescent. Cette même fibre optique est également utilisée pour la collection de la réponse lumineuse du rapporteur et conduit le faisceau lumineux retour jusqu’à un boitier à l’extrémité proximale de la fibre.
L’extrémité d’exploration de la fibre optique 4 est dotée de manière connue d’une férule 44 formant un embout rigide percé en son centre et dans lequel est fixée la gaine 46 de la fibre optique 4.
Le hublot 41 à la face externe 42 de la tête d’exploration est fonctionnalisé par le rapporteur fluorescent 1 par l’intermédiaire d’une molécule de greffage 3. Le rapporteur fluorescent 1 peut ainsi reconnaitre une molécule cible présente dans la cavité explorée par la fibre optique 4, notamment une molécule cible que rencontrerait la tête d’exploration lors de son utilisation, telle que logée dans une cavité du corps humain, i.e. sur un tissu humain, pour détecter des cellules cancéreuses par observation et/ou mesure des variations des spectres d’émission des fluorochromes Faet Fb.
De façon préférentielle illustrée en , la tête d’exploration comprend un corps 43 cylindrique creux de même axe médian longitudinal XX’ en position assemblée de la tête sur le corps de la fibre optique 4, et une face externe d’extrémité distale 42 qui est transversale à l’axe du corps cylindrique et depuis laquelle est destinée à être émise la lumière sortant du cœur 45 de la fibre optique 4.
Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux car il permet une détection rapide de la molécule cible dans une cavité du corps humain (par exemple par endoscopie ou pendant une chirurgie) tout en évitant la dégradation du rapporteur fluorescent 1 lors de la reconnaissance de la molécule cible. Cela évite notamment de laisser des portions dudit rapporteur fluorescent 1 dans la cavité à explorer, ce qui amènerait une contamination dans le corps humain exploré.
EXEMPLES
La présente invention se comprendra mieux à la lecture des exemples suivants qui illustrent non-limitativement l’invention.
Ex e mple 1 a : Détection de molécule cible in vitro - Cas de la détection d’un antigène en solution
Préparation du rapporteur fluorescent
Une solution de l’anticorps est incubée avec la protéine de liaison. Cette dernière peut être présente en solution ou immobilisée sur un substrat. L’incubation doit être suffisamment longue pour s’assurer de la liaison optimale entre protéine de liaison et anticorps. Une fixation chimique peut ou non être réalisée au cours de cette étape pour lier la protéine de support et l’anticorps de façon covalente.
Détection de molécule cible
La solution contenant l’antigène est mélangée à une solution contenant le rapporteur. En parallèle, des solutions de concentrations connues de l’antigène sont diluées dans la même solution de rapporteur, permettant de réaliser une gamme étalon. Après incubation, les propriétés spectrales sont mesurées par fluorimètre, ou tout autre appareil permettant ces mesures. Les FRET index sont calculés pour la gamme étalons et l’échantillon, permettant ainsi de calculer la concentration de ce dernier. Les résultats obtenus pour la courbe étalon sont présentés en figure 1a et 1b.
Les résultats présentés en figures 4, 5A et 5B l’ont été en déposant des cellules exprimant ou non la cible de l’anticorps sur une lame de microscope sur laquelle a été préalablement fixé le rapporteur fluorescent. L’excitation par le laser et la collecte du signal sont réalisées à l’aide d’une fibre optique et d’un spectrophotomètre. Les résultats permettent de déterminer la quantité de molécule cible présente à la surface des cellules (faible à nulle dans les cellules HEK, modérée dans les cellules A549, forte dans les cellules A431).
Ex e mple 1b : Détection de molécule cible in vitro
L’exemple 1a a été reproduit mais le rapporteur fluorescent a été modifié selon le tableau I.
Récepteur Fa Protéine de liaison Fb Ligand Détection du ligand
Anticorps anti TrkB Alexa 488 Protéine G Alexa 546 TrkB recombinant oui
Anticorps anti TrkB Alexa 488 Protéine G Alexa 594 TrkB recombinant oui
Anticorps anti EGFR (clone AY3) Alexa 488 Protéine G Alexa 546 EGFR recombinant oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) Alexa 488 Protéine G Alexa 546 EGFR recombinant oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) CF Dye 503R Protéine G CF Dye 555 Cellules de la lignée A431 oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) CF Dye 503R Protéine G CF Dye 594 Cellules de la lignée A431 oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) CF Dye 503R Protéine G CF Dye 555 Cellules de la lignée A549 oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) CF Dye 503R Protéine G CF Dye 594 Cellules de la lignée A549 oui
Tableau I : Compositions de rapporteur fluorescent
Ex e mple 2 : Détection de molécule cible in vitro
Greffage sur substrat
Un sol organosilice (silice thiolée) / zircone est déposé sur un substrat, typiquement le puits d’une plaque, et est traité thermiquement à 80°C pendant 12 heures. Une première molécule de liaison contenant un groupement maléimide et un groupement amine est dissoute dans du DMSO puis cette solution est ajoutée dans le puits pendant 1 heure sous agitation. Après rinçages et lavages, une deuxième solution contenant une autre molécule de liaison, contenant un groupement NHS et un groupement maléimide dans du DMSO est ajoutée dans le puits pendant 1h sous agitation. Après rinçages et lavages, le substrat est préparé pour fixer la première protéine de liaison fluorescente (classiquement une protéine G se terminant par une cystéine).
Préparation du rapporteur fluorescent
Une solution de l’anticorps est incubée avec la protéine de liaison immobilisée sur un substrat. L’incubation doit être suffisamment longue pour s’assurer de la liaison optimale entre protéine de liaison et anticorps. Une fixation chimique peut ou non être réalisée au cours de cette étape pour lier la protéine de support et l’anticorps de façon covalente. Puis l’excédent d’anticorps est lavé.
Détection de molécule cible
Une solution contenant l’antigène cible est ajouté dans le puits et sera détecter de la même manière que lors du test en solution de l’exemple 1.
Ex e mple 3 a : Détection de molécule cible in vivo
Greffage sur une capsule ou sur une fibre optique
Une fois le rapporteur fluorescent prêt, selon la méthode définie auparavant, il est greffé soit directement sur l’extrémité distale de la fibre optique, soit sur un hublot transparent positionné dans une capsule en vue d’être assemblé à une fibre optique. Le hublot est typiquement constitué d’un film polymère de PET (polyethylène terephtalate ou de FEP (poly ethylène – co- propylène fluoré). Le greffage s’effectue de la même façon que lors de l’exemple 2. C’est-à-dire d’abord via une étape de dépôt de couche mince silice / zircone sur le hublot ou sur l’extrémité de la cible puis via une étape de fonctionnalisation de la surface par des molécules de liaison contenant des groupements maléimides / NHS.
La méthode de greffage du rapporteur fluorescent sur l’extrémité de la fibre ou sur le hublot est comparable à la méthode de greffage sur le substrat de l’exemple 2.
Détection de molécule cible
Le hublot ou la fibre optique sont mis en contact avec un tissus ou toute autres interfaces à la surface à laquelle la molécule cible est susceptible de se trouver et dans le même temps une illumination par faisceau laser est acheminé par la fibre optique jusqu’au rapporteur fluorescent. Le faisceau réfléchi est collecté par la même fibre optique vers un spectrophotomètre pour analyse.
Le FRET index est calculé afin de savoir si l’interaction entre la fibre (ou le hublot) et le tissu est positive (présence de la molécule cible) ou négative (absence de la molécule cible). Cette détection est faite dans un laps de temps de quelques secondes
Ex e mple 3b : Détection de molécule cible
L’exemple 3a a été reproduit mais le rapporteur fluorescent a été modifié selon le tableau II.
Récepteur Fa Protéine de liaison Fb Ligand Détection du ligand
Anticorps anti TrkB Alexa 488 Protéine G Alexa 546 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti TrkB Alexa 488 Protéine G Alexa 594 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti TrkB Alexa 488 Protéine A Alexa 546 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431 Oui
Anticorps anti TrkB Alexa 488 Protéine A Alexa 594 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431 Oui
Anticorps anti TrkB Alexa 488 Protéine G Alexa 546 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti TrkB Alexa 488 Protéine G Alexa 594 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti EGFR (clone AY3) Alexa 488 Protéine G Alexa 546 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) Alexa 488 Protéine G Alexa 546 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) CF Dye 503R Protéine G CF Dye 555 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) CF Dye 503R Protéine G CF Dye 594 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) CF Dye 503R Protéine G CF Dye 555 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Anticorps anti EGFR (clone MA-12693) CF Dye 503R Protéine G CF Dye 594 Cellules HEK ou HCT 116 ou A 431, ou tumeur patient humains Oui
Tableau II : Compositions de rapporteur fluorescent
REFERENCES NUMERIQUES
1 – Rapporteur fluorescent
11 – Récepteur
12 – Protéine de liaison
2 – Molécule cible
3 – Molécule de greffage
4 – Fibre optique
41 – Hublot
42 – Face externe d’émission
43 – Corps
44 – Férule
45 – Cœur
46 – Gaine
5 – Dispositif
Fa– Fluorochrome lié au récepteur (configuration inactive)
F’a – Fluorochrome lié au récepteur (configuration active)
Fb– Fluorochrome lié à la protéine de liaison (configuration inactive)
F’b– Fluorochrome lié à la protéine de liaison (configuration active)
XX’ – Axe longitudinal de la fibre optique

Claims (10)

  1. Rapporteur fluorescent (1) comprenant :
    • un récepteur (11) lié à une protéine de liaison (12) ;
    • deux fluorochromes Faet Fb;
    dans lequel le fluorochrome Faest lié au récepteur (11) et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison (12) ; et
    les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET.
  2. Rapporteur fluorescent (1) selon la revendication1, dans lequel le récepteur (11) est choisi parmi anticorps, fragment d’anticorps, aptamère, protéines, peptides, ou un dérivé de ceux-ci.
  3. Rapporteur fluorescent (1) selon la revendication1ou la revendication2, dans lequel la protéine de liaison (12) est choisie parmi protéine G, protéine L, protéine A, protéine Z, protéine M, immunoglobuline, une immunoglobuline complète ou partielle, ou un dérivé de celles-ci.
  4. Rapporteur fluorescent (1) selon l’une quelconque des revendications1à3, dans lequel les fluorochromes Faet/ou Fbsont choisis parmi des molécules fluorescentes ou des protéines fluorescentes.
  5. Dispositif (5) pour la détection d’une molécule cible (2) et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible (2) comprenant :
    • un substrat à la surface duquel est accrochée une molécule de greffage (3) de manière covalente ;
    • au moins un rapporteur fluorescent (1) comprenant :
      • un récepteur (11) lié à une protéine de liaison (12) ;
      • deux fluorochromes Faet Fb;
    dans lequel le fluorochrome Faest lié au récepteur (11) et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison (12) ; et
    les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET ;
    dans lequel la protéine de liaison (12) est liée à la molécule de greffage (3) par liaison covalente.
  6. Dispositif selon la revendication5, dans lequel la molécule cible (2) est une molécule pour laquelle le récepteur présente une affinité et une spécificité forte, de préférence un antigène.
  7. Dispositif selon la revendication5ou la revendication6, dans lequel le substrat est choisi parmi une plaque de culture cellulaire, une plaque à puits, un film, une bandelette, un gel d’agarose, un gel de cellulose, des nanoparticules ou des microparticules, de préférence sphériques, de préférence de silice ou de polymère, une lame de microscope, une lamelle de verre, le pourtour d’une fibre optique ou un substrat configuré à être fixé sur la tête d’une fibre optique.
  8. Dispositif selon l’une quelconque des revendications5à7, dans lequel la protéine de liaison (12) comprend un groupement terminal choisi parmi thiol, amine, azide, alcyne, époxyde, acide carboxylique, aldéhyde, aziridine, alcène, ou un dérivé de ceux-ci.
  9. Dispositif selon l’une quelconque des revendications5à8, dans lequel la molécule de greffage (3) comprend au moins deux groupements réactifs choisis parmi maléimide, ester de N-Hydroxysuccinimide (NHS), ester de sulfo N-hydroxysuccinimide, sulfo-NHS, azide, alcyne, époxyde, acide carboxylique, aldéhyde, aziridine, alcène, ou un dérivé de ceux-ci.
  10. Méthode pour la détection d’une molécule cible (2) et/ou la mesure de la concentration d’une molécule cible (2) comprenant les étapes suivantes :
    • Mettre en contact un échantillon et au moins un rapporteur fluorescent (1), ledit rapporteur fluorescent (1) comprenant :
      • un récepteur (11) lié à une protéine de liaison (12) ;
      • deux fluorochromes Faet Fb;
    dans lequel le fluorochrome Faest lié au récepteur (11) et le fluorochrome Fbest lié à la protéine de liaison (12) ; et
    les fluorochromes Faet Fbforment un couple donneur/accepteur FRET ; et
    le récepteur (11) a une affinité pour ladite molécule cible (12) ;
    • Exciter le rapporteur fluorescent (1) à une longueur d’onde donnée de sorte que le fluorochrome donneur soit excité ;
    • Mesurer le ratio entre l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome donneur et l’intensité de la fluorescence émise par le fluorochrome accepteur ; et
    • Déterminer la présence ou l’absence de ladite molécule cible (2) dans l’échantillon et/ou calculer la concentration de ladite molécule cible (2) dans l’échantillon.
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