TW201607960A - 具抗體選擇性之胜肽配體及其應用 - Google Patents

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鄭祥龍
曾偉志
陳文逸
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Abstract

本說明書揭示一種具抗體選擇性之胜肽配體及其應用。上述具抗體選擇性之胜肽配體包含由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體。上述胜肽配體可以是以非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區底部之疏水區域。上述具抗體選擇性之胜肽配體可應用於生物晶片。藉由抗體在上述生物晶片上呈現出的位向性固定，進而提昇對抗原的辨識效率。更好的是，上述生物晶片具有極佳的抗原偵測靈敏度。此外，上述具抗體選擇性之胜肽配體更可應用於抗體純化裝置。依據所欲純化之抗體來選擇相對應之胜肽配體，上述抗體純化裝置可提供佳化的抗體純化效率。

Description

具抗體選擇性之胜肽配體及其應用
本發明係關於一種胜肽配體，特別是關於一種具有抗體選擇性與抗體位向固定功能之胜肽配體及其應用。
人類及其他動物都有天生的免疫防禦機制，所以在治療理論上，如果能有效利用動物體內的自然防禦機制，應該就能充分克服各種難治療的疾病如糖尿病、癌症等。抗體，又稱免疫球蛋白(Immunoglobulin，簡稱Ig)，是一種由B淋巴细胞分泌，在免疫系统中是用來辨識與中和外來物质如病原體等的大型Y形蛋白質。而抗體能辨識特定外來物的一個獨特的物質，此獨特的外來物質被稱為抗原。蛋白上Y形的其中兩個分叉頂端都有一被稱為互補位(抗原結合位)的鎖狀結構，該結構是針對一種特定的抗原。
抗原及免疫原(Immunogen是指外界物質的刺激，誘發後天性免疫反應，但兩者差異在於功能不同。抗原是能夠與 免疫系統進行特異性結合的所有物質(包含淋巴球與抗體)，而免疫原是能夠引發免疫反應的任何物質。
在製造免疫生物檢測晶片或免疫相關的生物器材時，抗體的固定化方式影響了抗體與抗原的辨識效率。所以抗體位向性的固定化在相關技術發展上是一個不可缺少的步驟。而固定化的定義為將生物分子固定於基材表面，使得生物分子失去部分活動力。當抗體被固定於基材表面時，除了失去部分活動力之外，生物活性也會降低。因此，近年來，許多研究團隊致力於開發良好且穩定性高的固定化方式，改善抗體於表面之位向，以利於增加免疫生物晶片之檢測效率。
固定化的方式深深影響著生物晶片之檢測效率。而抗體固定化之方式大致可分成下列三種：(1)共價鍵結(Covalent coupling)、(2)物理吸附(Physical adsorption)、(3)生物親和性(Bio-affinity)。然而，除了如何找到適當方法來固定抗體的研究本身具有極高困難度之外，現有固定化的方式中，普遍具有減弱被固定化之抗體的活性、或是造價昂貴的問題。
有鑑於此，開發可增加有效地將抗體以位向性地固定於基材表面而不影響其抗原辨識性，又可同時具備極佳抗原偵測靈敏度之具抗體選擇性之胜肽配體及其應用，是一項相當值得 產業重視且可有效提升產業競爭力的課題。
鑒於上述之發明背景中，為了符合產業上之要求，本發明提供一種具抗體選擇性之胜肽配體及其應用，上述具抗體選擇性之胜肽配體及其應用，不僅成本便宜，更具有抗體選擇性與位向性固定抗體等優越性能，更好的是，上述具抗體選擇性之胜肽配體可適用於生物檢測晶片與抗體純化等免疫學工具，此外也可將藥物或是基因材料與胜肽配體接合後，利用胜肽與抗體間的高親和力使胜肽配體與抗體進行結合，便可用於藥物或基因傳送。由以上可知利用胜肽配體之方式可發揮低成本、高準確度應用之效果，進而有效提昇產業之競爭力。
本發明之一目的在於提供一種具抗體選擇性之胜肽配體及其應用，藉由使用4至6個胺基酸序列所組成之短鏈胜肽配體，不僅可簡化胜肽配體的合成工序，更大幅降低製作成本。
本發明之另一目的在於提供一種具抗體選擇性之胜肽配體及其應用，藉由採用一具有適當鏈長、疏水性、與電性等設計的胜肽配體，以提昇上述胜肽配體與抗體之底部疏水區域的親合力，使得上述胜肽配體可提供極佳的抗體位向性固定之效果。
本發明之又一目的在於提供一種具抗體選擇性之胜 肽配體及其應用，藉由採用具抗體選擇性之胜肽配體來製備抗體位向性固定裝置，進而可達到有效提升抗體位向性固定與抗原辨識性之目標。
本發明之又一目的在於提供一種具抗體選擇性之胜肽配體及其應用，藉由採用具抗體選擇性之胜肽配體來製備抗體純化裝置，進而可達到有效分離目標抗體之效果。
根據以上所述之目的，本發明揭示了一種具抗體選擇性之胜肽配體及其應用。上述具抗體選擇性之胜肽配體包含由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體。上述胜肽配體具有一親水端與一疏水端，其中，上述胜肽配體可以是以非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區(Fragment crystallizable region；Fc)。
在根據本說明書之一較佳範例中，上述具抗體選擇性之胜肽配體可以是選自下列群組中之一者：EGEW、EEGW、EELW、RRGW、EGEGE、EGEGW、EGELW、EEGGW、EELLW、EELWL、EEWLW、EGEGW、EEGGLW、EGEGLW、RRGGLW、RGRGLW。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述胜肽配體可以是藉由疏水作用力與靜電吸引力來結合/嵌合於抗體之底部疏水性區域。
在根據本說明書之一較佳範例中，上述具抗體選擇性之胜肽配體可以是應用於一抗體位向性固定裝置。上述使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體位向性固定裝置包含基材、以及複數個具抗體選擇性之胜肽配體固定於上述基材之表面。根據本範例，藉由上述具抗體選擇性之胜肽配體可將抗體位向性固定於上述基材表面，進而提供優異的抗原辨識效果。
在根據本說明書之一較佳範例中，上述具抗體選擇性之胜肽配體可以是應用於一抗體純化裝置。上述使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化裝置包含複數個介質、以及複數個具抗體選擇性之胜肽配體。其中，上述的每一介質上固定有至少一具抗體選擇性之胜肽配體。根據本範例，藉由針對目標抗體選擇相對應之適當胜肽配體可達到有效分離/純化抗體之效果。
第一A圖係Rabbit IgG與PSA在不同晶片表面吸附之SPR訊號圖，其中(A)表示正電荷表面晶片，(B)表示負電荷表面晶片，(C)表示EGELW表面晶片，(D)表示RRGW表面晶片；第一B圖係第一A圖中Rabbit IgG在不同晶片表面之吸附量示意圖；第二圖係Mouse IgG2a在不同晶片表面之吸附量示意圖； 第三A圖係PSA在帶有Rabbit IgG的不同晶片表面之吸附量的示意圖；第三B圖係PSA在帶有Mouse IgG2a的不同晶片表面之吸附量的示意圖；第四A圖係PSA在帶有Rabbit IgG的不同晶片表面之抗原辨識效率的示意圖；第四B圖係PSA在帶有Mouse IgG2a的不同晶片表面之抗原辨識效率的示意圖；第五A圖係Rabbit IgG與2nd antibody在不同晶片表面吸附之SPR訊號圖，其中(A)表示正電荷表面晶片，(B)表示負電荷表面晶片，(C)表示EGELW表面晶片，(D)表示RRGW表面晶片；第五B圖係二抗在表面帶有Rabbit IgG的不同晶片之吸附量；第五C圖係二抗在表面帶有Mouse IgG2a的不同晶片之吸附量；第六A圖係在帶有Rabbit IgG的不同晶片表面之位向因子的示意圖；第六B圖係在帶有Mouse IgG2a的不同晶片表面之位向因子的示意圖；第七A圖係使用SPR對表面具有Rabbit IgG的晶片進行靈敏度量測的結果圖； 第七B圖係使用SPR對表面具有Mouse IgG2a的晶片進行靈敏度量測的結果圖；以及第八圖係牛血清蛋白質(BSA)、Rabbit IgG與Mouse IgG2a分別吸附在CM-Sepharose、EGELW-CM-Sepharose與RRGW-CM-Sepharose之親合性常數。
本發明在此所探討的方向為一種具抗體選擇性之胜肽配體及其應用。為了能徹底地瞭解本發明，將在下列的描述中提出詳盡的製程步驟或組成結構。顯然地，本發明的施行並未限定於該領域之技藝者所熟習的特殊細節。另一方面，眾所周知的組成或製程步驟並未描述於細節中，以避免造成本發明不必要之限制。本發明的較佳體系會詳細描述如下，然而除了這些詳細描述之外，本發明還可以廣泛地施行在其他的體系中，且本發明的範圍不受限定，以其之後的專利範圍為準。
本發明之一實施例揭露一種具抗體選擇性之胜肽配體。上述具抗體選擇性之胜肽配體包含由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體(Peptide ligand)。根據本實施例，上述胜肽配體具有一親水端與一疏水端，其中，上述胜肽配體可以是以非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區(Fragment crystallizable region；Fc)。
上述胜肽配體可以是選自下列群組中之一者：EGEW、EEGW、EELW、RRGW、EGEGE、EGEGW、EGELW、EEGGW、EELLW、EELWL、EEWLW、EGEGW、EEGGLW、EGEGLW、RRGGLW、RGRGLW。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述胜肽配體可以是藉由疏水作用力與靜電吸引力來結合/嵌合於抗體之底部區域。
本發明之另一實施例揭露一種使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體位向性固定裝置。上述使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體位向性固定裝置包含基材、以及複數個具抗體選擇性之胜肽配體(Peptide ligand)固定於上述基材之表面。上述具抗體選擇性之胜肽配體可以是由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體。上述胜肽配體具有一親水端與一疏水端。其中，上述胜肽配體可以是藉由非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區(Fragment crystallizable region；Fc)，使得上述抗體可以在上述基材上呈現位向式固定。在根據本實施例之一較佳範例中，上述胜肽配體可以是藉由共價鍵來固定於上述基材表面。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述胜肽配體可以是選自下列群組中之一者：EGEW、EEGW、EELW、RRGW、EGEGE、EGEGW、EGELW、EEGGW、EELLW、EELWL、EEWLW、 EGEGW、EEGGLW、EGEGLW、RRGGLW、RGRGLW。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述胜肽配體可以是藉由疏水作用力與靜電吸引力來結合/嵌合於抗體之底部區域。在根據本實施例之一較佳範例中，上述胜肽配體可以是藉由疏水作用力與靜電吸引力來結合/嵌合於抗體之底部疏水區域。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述基材的材質可以是選自下列群組之一者：金(Au)、玻璃(SiO2)、矽晶片(Silicon wafer)、四氧化三鐵(Fe3O4)、氧化鐵(Fe2O3)、或有機高分子。
本發明之又一實施例揭露一種使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料。上述使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料包含複數個介質、以及複數個具抗體選擇性之胜肽配體。其中，上述的每一介質上固定有至少一具抗體選擇性之胜肽配體。根據本實施例，上述的具抗體選擇性之胜肽配體可以是由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體。上述胜肽配體具有一親水端與一疏水端。根據本實施例之設計，上述胜肽配體係以非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區(Fc)。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述胜肽配體可以是選自下列群組中之一者：EGEW、EEGW、EELW、RRGW、EGEGE、EGEGW、EGELW、EEGGW、EELLW、EELWL、EEWLW、EGEGW、EEGGLW、EGEGLW、RRGGLW、RGRGLW。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述胜肽配體可以是藉由疏水作用力與靜電吸引力來結合/嵌合於抗體之底部疏水區域。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述介質的態樣可以是珠粒(bead)、粒子(particle)、薄膜(membrane)、半透膜(semi-permeablemembrane)、毛細管(capillary)、微陣列(microarray)、具複數實驗井的平板(multiple well plate)、玻璃板(Glass plate)、矽晶片(silicon wafer)、或細胞培養盤(Tissue culture plate)。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述介質包含無機材料，上述的無機材料可以是選自下列群組之至少一者：玻璃(glass)、鋁(alumina)、二氧化矽(silica)、矽(silicon)、氧化鋯(zirconia)、磁鐵礦(magnetite)、半導體材質(semiconductors)。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述介質包含有機材料，上述的有機材料可以是選自下列群組之至少一者：多糖(polysaccharides)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、聚丙烯酸酯(polyacrylate)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)。其中上述的多糖可以是選自下列群組之一者：瓊脂糖(agarose)、聚葡萄糖(dextran)、纖維素(cellulose)、幾丁聚醣(chitosan)、瓊脂糖凝膠(Sepharose)。
在根據本實施例之一較佳範例中，上述使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料可以是以物理性或化學性的方式固定於一基材上。上述基材可以是選自下列群組之一者：滲透膜、半滲透膜、玻璃、金、細胞培養盤、矽晶片或高分子。
在根據本實施例之另一較佳範例中，上述使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料可以是堆積於一管柱，並藉由管柱層析來進行抗體純化。
以下將敘明根據本說明書之具抗體選擇性之胜肽配體及其應用的較佳範例。然而，本說明書之範圍應以其後的申請專利範圍為準，而不應以下列實施範例為限。
範例1：製備SPR晶片表面改質
在本範例及以下範例中，我們藉由表面電漿共振儀測(Surface plasmon resonance；SPR)來進行相關檢測。因此，先將SPR檢測之晶片表面改質方式簡述如下。
將OEG[(11-Mercaptoundecyl)tetra(ethyleneglycol)]與OEG-COOH[HS(CH2)11(EG)6OCH2COOH]以10：1混合，藉由硫金的強烈鍵結將OEG與OEG-COOH改質於SPR晶片上形成mixed SAM(self-assembly monolayer)。利用mixed SAM後的表面 帶有負電荷之羧基及親水性之羥基；接著，利用EDC/20% DMSO活化負電荷表面的羧基，將乙二胺(EDA)的一級胺與表面的羧基形成醯胺鍵，讓晶片表面形成正電荷表面；再利用相同反應條件將設計好的胜肽配體接枝於表面上形成胜肽配體表面。
負電荷SPR晶片之表面改質(Mixed SAM)：
1.以無塵布沾少許丙酮擦拭SPR金片背面之銅膠。
2.將金片以95%乙醇、超純水來回沖洗三次。
3.利用UV臭氧清潔機，清潔金片表面20分鐘。
4.將金片以95%乙醇、超純水來回沖洗三次。
5.配製莫耳濃度比OEG-OH：OEG-COOH=10：1，總濃度為1mM的硫醇溶液在4mL的95%乙醇中。
6.將金片及上述之溶液放入鐵氟龍(Teflon)盒中，於40℃反應16小時。
7.取出金片並以10%NH4OH及乙醇沖洗金片表面。
8.以超純水洗去殘留之乙醇後，金片保存於4℃超純水中。
正電荷SPR晶片之表面改質：
1.配製5mM EDA、200mM EDC與20% DMSO於0.1M pH=6.0MES緩衝溶液中。
2.將上述之溶液加到金片表面上，在4℃下反應4小時。
3.取出金片，以超純水沖洗金片表面。
4.配製10mM之乙醇胺溶液於0.1M pH=6.0MES緩衝溶液中。
5.將乙醇胺溶液加到金片表面上，在25℃下反應2小時。
6.以超純水沖洗之後，金片保存於4℃超純水中。
胜肽配體SPR晶片之表面改質：
1.配製5mM胜肽配體、200mM EDC與20% DMSO於0.1M pH=6.0MES緩衝溶液中。
2.將上述之溶液加到金片表面上，在4℃下反應4小時。
3.取出金片，以超純水沖洗金片表面。
4.配製10mM之乙醇胺於0.1M pH=6.0MES緩衝溶液中。
5.將乙醇胺溶液加到金片表面上，在25℃下反應2小時。
6.以超純水沖洗之後，金片保存於4℃超純水中。
範例2：抗原辨識效率分析
在本範例中，我們使用SPR來測量目標抗體[兔子免疫球蛋白IgG(Rabbit IgG)]及目標抗原[人類前列腺特異抗原(Prostate specific antigen；PSA)]，在不同電荷表面以及不同胜肽配體表面上之吸附量。在上述之不同晶片表面上吸附Rabbit IgG，再來以緩衝液(PB buffer)沖洗，接著直接吸附PSA。最後，利用PB buffer將未被Rabbit IgG辨識的PSA沖洗掉，以測量抗體與抗原之吸附量。實驗步驟大致如下：
1.配製Rabbit IgG 10μg/mL於0.01M pH=7.4PB緩衝溶液中。
2.配製PSA 5μg/mL於0.01M pH=7.4PB緩衝溶液中。
3.將負電荷、正電荷及胜肽配體改質之晶片放置SPR上。
4.設定流速為20μL/min。
5.在流道上依序流過Rabbit IgG、PB、PSA、PB，吸附時間約為60分鐘，脫附時間約為50分鐘。
範例3：抗體於表面上位向性之分析：
在本範例中，我們使用SPR進行Rabbit IgG表面位向性之分析，並以二抗(Secondary antibody，2nd antibody；2nd Ab)取代範例2中的PSA，以測定Rabbit IgG及二抗之吸附量。實驗步驟大致如下：
1.配製Rabbit IgG 10μg/mL於0.01M pH=7.4PB緩衝溶液中。
2.配製Goat anti-Rabbit IgG 10μg/mL(2nd Ab)於0.01M pH=7.4PB緩衝溶液中。
3.將負電荷、正電荷及胜肽配體改質之晶片放置於SPR上。
4.設定流速為20μL/min。
5.在流道上依序流過Rabbit IgG、PB、2nd Ab、PB，吸附時間約為60分鐘，脫附時間約為50分鐘。
範例4：以胜肽配體共價接枝於CM-Sepharose上之法進行抗體純化：
將10mL CM-Sepharose(COOH配體之濃度為130mM)先以100mL去離子水沖洗，再以3000rpm將CM-Sepharose離心。移除上清液的去離子水後，再加入10mL溶於PBS溶液中的EDC/NHS(26mM：52mM)，於37℃下搖晃反應30分鐘。將上述含有CM-Sepharose、EDC和NHS的溶液以3000rpm離心，去除上清液後，加入10mL含有13mM的EGELW peptide或13mM的RRGW peptide之PBS溶液於CM-Sepharose中。反應1天後，即可得EGELW-CM-Sepharose或RRGW-CM-Sepharose。
取5mL的EGELW-CM-Sepharose或RRGW-CM-Sepharose填充於層析管柱後，將混合BSA(牛血清蛋白質)與抗體(mouse IgG2a或rabbit IgG)，以高效能液相層析系統(HPLC)進行純化分離，其中移動相A為10mM pH 7.4磷酸緩衝液，B為pH 7.4PBS緩衝液。沖堤方法為等梯度沖提A溶液15分鐘後，再從A溶液到B溶液以梯度沖提之法進行30分鐘。沖提流速為0.5mL/min。
以EGELW-CM-Sepharose為填充管柱，BSA之滯留 時間為7.2分鐘、mouse IgG2a為14.8分鐘、而rabbit IgG為28.5分鐘。
以RRGW-CM-Sepharose為填充管柱，BSA之滯留時間為9.2分鐘、mouse IgG2a為16.8分鐘、而rabbit IgG為20分鐘。
BSA與抗體(mouse IgG2a或rabbit IgG)和三種樹酯間(CM-Sepharose、EGELW-CM-Sepharose、RRGW-CM-Sepharose)之吸附親合力常數表列於第八圖。
在上述的實驗中，我們藉由利用表面電漿共振儀去測量抗體在不同改質的晶片下辨識抗原的能力，比較在兩種不同電荷表面和不同胜肽配體表面上的Rabbit IgG與PSA的辨識效率。第一A圖為四種不同表面上的Rabbit IgG與PSA吸附之訊號對時間做圖。我們進一步將第一A圖中的訊號下列公式轉換成蛋白質吸附量後，可以得到第一B圖。
其中，△1表示蛋白質吸脫附之訊號差，△2表示PB之溶劑背景值，M.W.表示蛋白質分子量。
由第一B圖可以發現，Rabbit IgG在四種不同表面 的晶片上都有很高的吸附量，尤其是在負電荷表面的晶片上之吸附量為8.52mol/cm2。因為我們在分析Rabbit IgG的Fc區域之理想結合位置時，發現在理想結合位置周圍幾乎為正電荷，所以負電荷表面的吸附量會比較高。我們同時也發現，正電荷上的吸附量為6.55mol/cm2，兩種不同的電荷表面之吸附量相差不多。因此，我們可以推論Rabbit IgG表面電荷分布均勻，造成此兩種不同電荷表面都具有高吸附量。另一方面，由第一B圖也可發現，在以不同胜肽配體EGELW與RRGW表面改質的晶片，從Rabbit IgG的吸附量也看不出來差異。所以我們將Mouse IgG2a在不同表面下的吸附量來比較，如第二圖所示。
比照第一B圖與第二圖可以發現，RRGW對於兩種不同的抗體均有高吸附量。由此可知RRGW對於抗體沒有專一性。但是，從EGELW對於Rabbit IgG具有高吸附量，而對於Mouse IgG2a只有些微的吸附量，可知EGELW對於抗體具有專一性。
我們將帶有Rabbit IgG和Mouse IgG2a進行PSA的吸附實驗，並且利用上述的公式換算成蛋白質吸附量，如第三A圖與第三B圖所示。
由第三A圖與第三B圖可以得知，Rabbit IgG在負電荷表面上有8.52mol/cm2的高吸附量，但是PSA在負電荷表面上只有0.538mol/cm2的吸附量。藉此，我們可以推論，在負電荷 表面上的Rabbit IgG的位向性是不好的。另一方面，Rabbit IgG在胜肽配體EGELW和RRGW的表面上之吸附量雖然差不多，但是PSA在此兩種不同的胜肽配體表面確有明顯的差異性。Rabbit IgG在EGELW上有2.82mol/cm2的吸附量，但是在RRGW的表面上只有0.2mol/cm2的吸附量。藉此可以推知，在EGELW的表面上，Rabbit IgG具有較好的位向性。從第三A圖與第三B圖也可看出，Mouse IgG2a在胜肽配體EGELW和RRGW的表面上之吸附量就有著明顯的差異，RRGW的表面具有較高的吸附量。同樣地，對於PSA而言，也是具有高的吸附量。因此，推斷在胜肽配體RRGW的表面上，Mouse IgG2a具有較好的位向性。
為了比較抗原辨識效率，我們進一步將抗原辨識效率定義為：
我們依據上述公式將第三A圖與第三B圖的抗原辨識效率加以計算後得到第四A圖與第四B圖。
由第四A圖與第四B圖可以得知，胜肽配體EGELW使得Rabbit IgG在晶片上具有良好的抗原辨識效率，RRGW則沒有。相對地，胜肽配體RRGW使得Mouse IgG2a在晶片上具有良好的抗原辨識效率，EGELW則沒有。因此，我們可以推論，胜肽配體RRGW可以使得Mouse IgG2a有良好的位向性來辨識PSA， 另外，胜肽配體EGELW則可以使得Rabbit IgG有良好的位向性來辨識PSA。
另一方面，為了分析Rabbit IgG在表面的位向性，我們利用可以辨識Rabbit IgG之Fc區域的二抗來做為分析。若固定在晶片表面上的Rabbit IgG之Fc區域暴露於溶液之中，就會被二抗辨識，藉此得知Rabbit IgG是以錯誤的位向性固定於晶片表面上。
在實驗方面，我們使用表面電漿共振儀測量二抗在不同的晶片下的吸附量，比較在Rabbit IgG與二抗在不同晶片表面的位向性。第五A圖為四種不同表面上的Rabbit IgG與二抗吸附的訊號對時間做圖。
同樣地，我們可以利用前述公式將吸附訊號換算成蛋白質吸附量，如第五B圖所示。另外，我們也將Mouse IgG2a與二抗的吸附量做圖，如第五C圖所示。
由第五B圖可以得知，二抗在帶有Rabbit IgG的不同晶片表面上，都有很高的吸附量，尤其是帶有胜肽配體的表面上。我們推論這四種表面上的Rabbit IgG還是有部分以錯誤的位向性固定於表面上，所以不能夠只看二抗的吸附量，還要利用PSA和二抗的比例看其位向性的差別。因此，我們定義位向因子 (Orientation factor)為：
位向因子越大，表示抗體在晶片表面上可辨識的PSA越多，且被二抗辨識的越少，所以我們利用位向因子來比較不同表面下抗體的位向性。如第六A圖與第六B圖所示。
由第六A圖中可以發現，帶有Rabbit IgG的胜肽配體EGELW晶片具有高位向因子。藉此可以推知，EGELW能夠使得Rabbit IgG呈現出較好的位向性。也就是說Rabbit IgG在胜肽配體EGELW晶片表面上可辨識的PSA越多，且被二抗辨識的越少。另外，我們也發現，正電荷表面的位向因子也很好。我們推測這是因為PSA在正電荷表面上的吸附量多，位向因子也因此而上升。另一方面，由第六B圖可以發現，在帶有Mouse IgG2a的胜肽配體RRGW晶片，具有高位向因子，藉此也可以推論RRGW能夠使得Mouse IgG2a有較好的位向性。
因此，我們根據胜肽配體的設計以及篩選的策略，所設計出來的胜肽配體EGELW和RRGW是可以分別有助於Rabbit IgG和Mouse IgG2a在晶片上的位向性固定化以利於增加抗原的辨識效率。
我們進一步分別使用可以辨識Rabbit IgG和Mouse IgG2a的胜肽配體晶片，利用微量抗原PSA濃度來量測該些胜肽配體晶片抗原偵測的靈敏度，其結果如第七A圖和第七B圖所示。
我們先將Rabbit IgG和Mouse IgG2a吸附在GGEGELW和GGRRGW的表面。接著，流經低抗原濃度後，將Rabbit IgG和Mouse IgG2a流經晶片表面以增強訊號。其結果可以發現，兩個不同胜肽配體的晶片都可以在低抗原濃度下，在SPR儀器測得到訊號。根據第七A圖和第七B圖的實驗結果，在GGRRGW表面的晶片，Mouse IgG2a可以測到2ng/mL的PSA濃度；在GGEGELW表面的晶片，Rabbit IgG可以測到1ng/mL的PSA濃度。因此，我們所設計出的胜肽配體確實可以有效地提升抗原偵測的靈敏度。
在利用胜肽配體進行抗體純化方面，上述範例4係以胜肽配體共價接枝於樹酯上後，再將樹酯填充於層析管柱內，進行抗體的純化分離。由範例4之結果可看出，使用具抗體選擇性之胜肽配體共價接枝的樹酯，在管柱層析的試驗中，確實有相當理想的抗體分離效果。換言之，根據本說明書的具抗體選擇性之胜肽配體確實可應用於抗體純化材料。需說明的是，根據本說明書的設計，除了接枝於樹酯之外，其他習知該項技藝者所熟悉的基材，例如薄膜(membrane)、半透膜(semi-permeablemembrane)、毛細管(capillary)、微陣列(microarray)、或具複數實驗井的平板(multiple well plate)、玻璃 板(Glass plate)、矽晶片(silicon wafer)、或細胞培養盤(Tissue culture plate)等，亦能接枝上述具抗體選擇性之胜肽配體，以達到抗體純化之效果。
綜上所述，本說明書揭露一種具抗體選擇性之胜肽配體及其應用。上述具抗體選擇性之胜肽配體包含由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體。上述胜肽配體可以是以非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區(Fc)之底部疏水區域。根據本說明書，上述具抗體選擇性之胜肽配體可應用於抗體位向性固定裝置。上述使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體位向性固定裝置包含基材、以及複數個具抗體選擇性之胜肽配體固定於上述基材之表面。藉由上述具抗體選擇性之胜肽配體，上述抗體位向性固定裝置可有效地將抗體位向性固定於基材表面，進而達到提供優秀抗原辨識性之效果。更好的是，上述具抗體選擇性之胜肽配體可應用於抗體純化材料。上述使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料包含複數個介質、以及複數個具抗體選擇性之胜肽配體。其中，上述的每一介質上固定有至少一具抗體選擇性之胜肽配體。藉由先讓具抗體選擇性之胜肽配體與抗體結合，再以適當方式讓抗體由抗體純化材料上脫離，以達到純化抗體之效果。更好的是，根據本說明書之設計，可以依據所需要純化的抗體來選擇相對應的具抗體選擇性之胜肽配體。根據本說明書之具抗體選擇性之胜肽配體及其應用不僅可有效達到抗體位向性固定之效 果，更可達到抗體純化之效果。因此，根據本說明書之具抗體選擇性之胜肽配體及其應用確實可有效地改善免疫學研究方式，更可實際在免疫科學的臨床應用上提供更優異的工具。
顯然地，依照上面體系中的描述，本發明可能有許多的修正與差異。因此需要在其附加的權利要求項之範圍內加以理解，除了上述詳細的描述外，本發明還可以廣泛地在其他的體系中施行。上述僅為本發明之較佳體系而已，並非用以限定本發明之申請專利範圍；凡其它未脫離本發明所揭示之精神下所完成的等效改變或修飾，均應包含在下述申請專利範圍內。

Claims (13)

  1. 一種具抗體選擇性之胜肽配體，其包含：由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體，該胜肽配體具有一親水端與一疏水端，其中該胜肽配體係以非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區(Fragment crystallizable region；Fc)。
  2. 根據申請專利範圍第1項之具抗體選擇性之胜肽配體，其中該胜肽配體係選自下列群組中之一者：EGEW、EEGW、EELW、RRGW、EGEGE、EGEGW、EGELW、EEGGW、EELLW、EELWL、EEWLW、EGEGW、EEGGLW、EGEGLW、RRGGLW、RGRGLW。
  3. 根據申請專利範圍第1項之具抗體選擇性之胜肽配體，其中該胜肽配體係藉由疏水作用力與靜電吸引力結合於該抗體之底部區域。
  4. 一種使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體位向性固定裝置，其包含：一基材；以及複數個具抗體選擇性之胜肽配體固定於該基材之一表面，其中該具抗體選擇性之胜肽配體係由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體，該胜肽配體具有一親水端與一疏水端，其中該胜肽配體係以非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區(Fragment crystallizable region；Fc)，，使得上述抗體可以在上述基材上呈現位向式固定。
  5. 根據申請專利範圍第4項之使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體位向性固定裝置，其中該胜肽配體係選自下列群組中之一者：EGEW、EEGW、EELW、RRGW、EGEGE、EGEGW、EGELW、 EEGGW、EELLW、EELWL、EEWLW、EGEGW、EEGGLW、EGEGLW、RRGGLW、RGRGLW。
  6. 根據申請專利範圍第4項之使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體位向性固定裝置，其中該胜肽配體係藉由疏水作用力與靜電吸引力結合於該抗體之底部區域。
  7. 根據申請專利範圍第4項之使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體位向性固定裝置，其中該基材係選自下列群組之一者：金(Au)、玻璃(SiO2)、矽晶片(Silicon wafer)、四氧化三鐵(Fe3O4)、氧化鐵(Fe2O3)、有機高分子。
  8. 一種使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料，其包含：複數個介質；以及複數個具抗體選擇性之胜肽配體，其中每一介質上固定有至少一具抗體選擇性之胜肽配體，其中該具抗體選擇性之胜肽配體係由4至6個胺基酸序列所組成之胜肽配體，該胜肽配體具有一親水端與一疏水端，其中該胜肽配體係以非共價鍵結的方式結合於一抗體的抗原結晶區(Fragment crystallizable region；Fc)。
  9. 根據申請專利範圍第8項之使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料，其中該胜肽配體係選自下列群組中之一者：EGEW、EEGW、EELW、RRGW、EGEGE、EGEGW、EGELW、EEGGW、EELLW、EELWL、EEWLW、EGEGW、EEGGLW、EGEGLW、RRGGLW、RGRGLW。
  10. 根據申請專利範圍第8項之使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料，其中該胜肽配體胜肽配體係藉由疏水作用力與 靜電吸引力結合於該抗體之底部區域。
  11. 根據申請專利範圍第8項之使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料，其中該介質係一珠粒(bead)、粒子(particle)、薄膜(membrane)、半透膜(semi-permeablemembrane)、毛細管(capillary)、微陣列(microarray)、具複數實驗井的平板(multiple well plate)、玻璃板(Glass plate)、矽晶片(silicon wafer)、細胞培養盤(Tissue culture plate)。
  12. 根據申請專利範圍第8項之使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料，其中該介質包含無機材料，該無機材料係選自下列群組之至少一者：玻璃(glass)、鋁(alumina)、二氧化矽(silica)、矽(silicon)、氧化鋯(zirconia)、磁鐵礦(magnetite)、半導體材質(semiconductors)。
  13. 根據申請專利範圍第8項之使用具抗體選擇性之胜肽配體的抗體純化材料，其中該介質包含有機材料，該有機材料係選自下列群組之至少一者：多糖(polysaccharides)、聚丙烯酰胺(polyacrylamide)、聚丙烯酸酯(polyacrylate)、聚苯乙烯(polystyrene)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)，其中上述的多糖係選自下列群組之一者：瓊脂糖(agarose)、聚葡萄糖(dextran)、纖維素(cellulose)、幾丁聚醣(chitosan)、瓊脂糖凝膠(Sepharose)。
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