CA3179103A1 - Procede de detection d'une forme agregee en feuillet beta d'une proteine formant des agregats de type feuillet beta - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé in vitro de détection dans un échantillon d'une forme agrégée en feuillets ? d'une protéine formant des agrégats de type feuillets ? (????) comprenant une étape qui consiste à ajuster le pH d'un échantillon susceptible de contenir une ???? à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la ???? afin d'obtenir une forme non-agrégée en feuillets ? de la protéine formant des agrégats de type feuillets ? (?????) et la mesure de la teneur en ????? avec une méthode immunologique appropriée à un pH allant de 6 à 9.

Description

Procédé de détection d'une forme agrégée en feuillets 13 d'une protéine formant des agrégats de type feuillets 13 Domaine technique [0001] L'invention concerne un procédé in vitro de détection dans un échantillon d'une forme agrégée en feuillets 13 d'une protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PAU) comprenant une étape de désagrégation d'une PAF13 afin d'obtenir une forme non-agrégée en feuillets 13 de la protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PNAF13) et une étape de mesure de la teneur en PNAF13.
Technique antérieure

[0002] L'accumulation de protéines souvent mal repliées conduit à leur agrégation dans la cellule, entra inant des dérégulations cellulaires, caractéristiques de certaines pathologies neurodégénératives notamment. Les peptides amyloïdes 13 et plus particulièrement le peptide amyloïde 13 1-42 ont été largement étudiés pour la formation de fibrilles contenant des feuillets p puis de plaques dans la maladie d'Alzheimer. Le processus d'agrégation des peptides amyloïdes 13 est bien caractérisé et ce processus dépend d'un certain nombre de facteurs notamment leur concentration, le pH et la température. De nombreuses autres protéines, telles que les protéines de liaison à l'ARN et à
l'ADN, qui contiennent un domaine de type prion ( prion like-domain ) peuvent également former des agrégats du même type [1]. Les protéines contenant un domaine de type prion sont des protéines formant des agrégats de type feuillets 13 (PF13).

[0003] Les domaines de type prion contiennent des acides aminés hydrophobes favorisant la formation de fibrilles riches en feuillets p. Les formes agrégées en feuillets 13 d'une protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PAF[3) ne sont pas solubles dans l'eau à pH neutre.

[0004] Le diagnostic actuel de ces maladies neurodégénératives induites par une PAFp repose le plus souvent sur l'imagerie, qui complète l'examen clinique et neuropsychologique. C'est une procédure lourde et onéreuse qui requiert plusieurs étapes de diagnostic.

[0005] Différentes techniques de diagnostic permettant de mettre en évidence ou de quantifier l'agrégation ou l'oligomérisation des PF13 dans un échantillon biologique ont également été décrites dans la littérature.

[0006] Des techniques d'analyse structurale ont permis de mettre en évidence les différents niveaux d'agrégation de certaines PF[3, notamment les peptides amyloïdes 13 et les protéines Tau ou TDP-43 : microscopie électronique, microscopie de force atomique, Cryo EM, Dichroïsme Circulaire, Résonance Magnétique Nucléaire, diffraction aux rayons X. Néanmoins ces techniques permettent difficilement de mesurer la teneur, même de manière relative, en agrégats présents dans un échantillon. L'effet éventuel de composés sur le niveau d'agrégation (notamment l'inhibition de l'agrégation) d'une PFP
ne peut donc pas vraiment être étudié par ces

[0007] Des techniques capables de séparer des protéines en fonction de leur poids moléculaires permettent de discriminer les PAFP de haut poids moléculaire des PNAFP de faible poids moléculaire. Certaines d'entre elles permettent aussi de discriminer des agrégats de différentes tailles. On peut citer par exemple l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE et SDS-PAGE) associé ou non à une détection par Western Blot.
Les conditions expérimentales actuellement décrites dans ces techniques peuvent toutefois fausser la mesure du niveau d'agrégation. C'est notamment le cas pour le SDS-PAGE dans lequel l'utilisation combinée d'un détergent et d'un agent réducteur (DTT, beta-mercaptoethanol ou TCEP) peut dissocier tout ou partie des agrégats. Du fait de leurs contraintes expérimentales (temps de mise en oeuvre, quantité importante d'échantillons, manque de sensibilité), ces techniques ne sont pas vraiment adaptées à
la caractérisation de composés capables de moduler le niveau d'agrégation des PFp.

[0008] Des techniques basées sur de l'immuno-détection ont également été
décrites :
- Filtration combinée à de l'immuno-détection : dans cette méthode l'échantillon biologique est filtré sur une membrane capable de retenir les espèces de haut poids moléculaire et notamment les PAF. On applique ensuite sur la membrane un anticorps spécifique de la PAFP marqué de manière directe ou indirecte avec un traceur colorimétrique ou fluorescent, voire luminescent. Le signal mesuré est directement proportionnel à la quantité de PAFP. Cette méthode peut être adaptée à un format microplaque pour étudier les paramètres d'agrégation d'une protéine amyloïde ou bien l'effet d'un composé sur son niveau d'agrégation. Toutefois, l'automatisation et le débit de la méthode sont limités du fait des étapes de filtration et lavages que nécessite cette technique [2].
- ELISA : différentes stratégies de test ELISA ont été décrites afin de permettre la caractérisation de l'agrégation des PFP. La première stratégie consiste à
utiliser un même anticorps pour la capture des PAF P sur la phase solide et comme traceur permettant leur détection. Cette méthode permet de détecter uniquement les PAF
p qui possèdent plusieurs épitopes de l'anticorps utilisé en capture et en détection. A l'inverse, l'anticorps de capture et l'anticorps de détection ne pourront donc pas se fixer simultanément sur une PNAFP car celle-ci ne possède qu'un seul épitope reconnu par l'anticorps utilisé. Aucun signal ne sera donc généré en présence de PNAFP
[3]. La seconde stratégie consiste à associer dans un test ELISA un anticorps reconnaissant spécifiquement des PAFp avec un anticorps reconnaissant toutes les formes de PFp présentes dans l'échantillon (PAFp et PNAFp) [4]. Dans ce format, l'anticorps spécifique des PAFp est généralement l'anticorps de capture mais un format utilisant celui-ci comme anticorps de détection a aussi été décrit [5]. Une troisième stratégie consiste à
utiliser deux anticorps différents reconnaissants tous les deux la PAFP
d'intérêt. Cette dernière stratégie semble améliorer la spécificité de détection des agrégats [6]. Tous ces tests ELISA permettent de déterminer le niveau d'agrégation des P193 d'intérêt et de déterminer l'effet d'un composé sur ins, la détection seule de la PAF 13 ne suffit pas car, à un signal donné, on ne peut pas se rendre compte du niveau d'agrégation par rapport à l'état initial, à moins de comparer les mesures à
une gamme standard qui biaise forcément les mesures de l'échantillon biologique testé.
- TR-FRET (Transfert d'énergie en temps résolu) : des kits basés sur cette méthode ont été développés et commercialisés afin de détecter l'agrégation de TAU et de l'alpha-synucléine dans des échantillons biologiques (voir site Web Cisbio, références commerciales 6FTAUPEG et 6FASYPEG). Ces tests utilisent un même anticorps marqué
respectivement au donneur et à l'accepteur de fluorescence. En présence d'une PA193, du fait de l'agrégation, les deux anticorps marqués se lieront simultanément à la induisant un transfert d'énergie entre le donneur et l'accepteur de fluorescence situés à
proximité l'un de l'autre. L'anticorps accepteur émettra alors un signal de FRET
spécifique qui sera mesuré en temps résolu. En revanche, seul un des deux anticorps pourra se lier sur la PNAF13 empêchant ainsi toute proximité entre le donneur et l'accepteur. Il sera alors impossible d'obtenir un signal de FRET sur la PNAFf3. Ces kits permettent de déterminer le niveau d'agrégation de la P193 d'intérêt et de déterminer l'effet d'un composé sur son niveau d'agrégation dans des formats miniaturisés et à haut débit. Néanmoins, ces kits nécessitent l'utilisation d'anticorps capables de reconnaitre des épitopes de P193 même si celles-ci sont agrégées, ce qui s'avère quelquefois limitant voire bloquant dans le développement des tests de détection, étant donné que les immunisations sont généralement réalisées avec des PNAF[3, ce qui peut rendre difficile l'obtention d'anticorps anti-PAF.

[0009] Les méthodes décrites dans l'art antérieur visent donc à détecter directement une PA193 dans un échantillon, notamment en utilisant un ou plusieurs ligands de la PA193.
Néanmoins, détecter directement la PAF13 peut rendre ces techniques difficiles à mettre en oeuvre, peu précises et/ou peu adaptées à une utilisation à grande échelle.
De plus, la détection seule de la PAF13 ne suffit pas car, à un signal donné, on ne peut pas se rendre compte du niveau d'agrégation par rapport à l'état initial, à moins de comparer les mesures à une gamme standard qui biaise forcément les mesures de l'échantillon biologique testé.

[0010] Un diagnostic des maladies liées à l'agrégation d'une P193 plus aisé, plus rapide et plus fiable est donc nécessaire.

[0011] La Demanderesse a mis au point un protocole simple et facile à mettre en oeuvre qui permet de désagréger tout ou partie de la PAF13 présente dans un échantillon afin d'obtenir une PNA93. Ce protocole a permis à la Demanderesse de mettre au point un procédé de détection de la PA193 réalisé au travers de la mesure de la teneur en PNAF13, ce qui permet de s'affranchir de toutes les contraintes liées à la détection de la PAF[3.

Résumé de l'invention 100121 Selon un premier aspect, l'inventice détection dans un échantillon d'une forme agrégée en feuillets 13 d'une protéine formant des agrégats de type feuillets [3 (PAF3), comprenant les étapes suivantes :
a) Dans un premier contenant :
ai) introduire un échantillon susceptible de contenir une PAF[3, a2) ajuster le pH à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la PAF3 afin d'obtenir une forme non-agrégée en feuillets [3 de la protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PNAF[3), a3) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9, b) Mesurer la teneur en PNAF3 dans le premier contenant avec une méthode immunologique appropriée ;
c) Dans un deuxième contenant :
cl) introduire un même échantillon qu'à l'étape al), c2) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9;
d) Mesurer la teneur en PNAF13 dans le deuxième contenant avec la même méthode qu'à
l'étape b) ;
e) Comparer les teneurs mesurées aux l'étapes b) et d), une diminution de la teneur mesurée à l'étape d) par rapport à la teneur mesurée à l'étape b) indiquant que l'échantillon contient une PAF13.
[0013] Selon un deuxième aspect, l'invention concerne un procédé in vitro de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement d'une maladie associée à une PAF[3, comprenant les étapes suivantes :
A) Mettre en oeuvre le procédé selon l'invention sur un premier échantillon dans lequel l'étape e) consiste à déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l'étape b) et la teneur mesurée à l'étape d) ( Ratio b)/d) de l'échantillon 1 ) ;
B) Mettre en oeuvre un même procédé qu'à l'étape A) sur un second échantillon, pour déterminer le Ratio b)/d) de l'échantillon 2 ;
C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité
thérapeutique est observée lorsque le ratio déterminé à l'étape B) est inférieur au ratio déterminé à l'étape A).
[0014] Selon un troisième aspect, l'invention concerne un procédé in vitro de mesure de l'efficacité pharmacologique d'une molécule sur une maladie associée à une PAF13, comprenant les étapes suivantes :
A) Mettre en oeuvre le procédé selon l'invention sur un premier échantillon dans lequel l'étape e) consiste à déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l'étape b) et la teneur mesurée à l'étape d) ( Ratio b)/d) de l'échantillon 1 ) ;
B) Mettre en oeuvre un même procédé qu'à l'étape A) sur un second échantillon, pour déterminer le Ratio b)/d) de l'échantillon 2 ;

C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité
pharmacologique est observée lorsqu est inférieur au ratio déterminé à l'étape A).
5 Description détaillée [0015] Définitions [0016] L'expression protéine formant des agrégats de type feuillets 13 ou désigne une protéine capable de former des agrégats riches en feuillets 13, c'est-à-dire une protéine capable de former une forme multimérique (ou une forme oligomérique) riche en feuillets p. Généralement, une forme non-agrégée de la PF13 est normale, mais une forme agrégée de celle-ci caractérise, en particulier, par une maladie neurodégénérative, telle que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Creutzfeldt-Jakob, la maladie de Parkinson ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Il peut s'agir d'une protéine humaine ou animale, native ou recombinante. Dans le cadre de la présente invention, la forme non-agrégée d'une PF13 est désignée par l'expression forme non-agrégée en feuillets 13 d'une protéine formant des agrégats de type feuillets 13 ou PNAF13 . La forme agrégée d'une PF13 est désignée par l'expression forme agrégée en feuillets 13 d'une protéine formant des agrégats de type feuillets 13 ou PAFI3 .
[0017] La PF13, qui peut être sous forme agrégée (PAF13) ou sous forme non-agrégée (PNAF13), peut être choisie parmi FUS (Fused in sarcoma), TAF15, EVVSR1, DAZAP1, TIA-1, TTR (transthyrétine), cystatine C, 132-microglobuline, peptide amyloïde p (tel que peptide amyloïde 131-40 ou peptide amyloïde 13 1-42), TAU (Tubulin-Associated Unit), a-synucléine, 13-synucléine, y-synucléine, Huntingtine (HTT), SOD1 (superoxyde dismutase 1), prion, et TDP-43 (TAR DNA-binding protein 43). Par exemple, lorsque PF13 est TDP-43, on parlera de TDP-43 NAF13 pour la forme non-agrégée de TDP-43 et de TDP-43 AF13 pour la forme agrégée de TDP-43.
[0018] Les PF13 listées ci-dessus sont notamment impliquées dans des maladies neuro-dégénératives. Par exemple, FUS impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique, TAF15 impliqué dans la sclérose latérale amyotrophique, les peptides amyloïde impliqués dans la maladie d'Alzheimer et l'angiopathie amyloïde cérébrale héréditaire, le prion impliqué dans la maladie de Creutzfeldt-Jakob et l'encéphalopathie spongiforme, l'a-synucléine impliquée dans la maladie de Parkinson, la protéine TAU
impliquée dans la maladie d'Alzheimer, les démences frontotemporales, la transthyrétine impliquée dans l'amylose systémique sénile ou la polyneuropathie familiale amyloïde, la cystatine C
impliquée dans l'angiopathie amyloïde cérébrale héréditaire, la 132-microglobuline impliquée dans l'amylose liée à l'hémodialyse, la Huntingtine impliquée dans la maladie de Huntington, la SOD1 impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique, TDP-impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique et les démences frontotemporales. De préférence, la P93 est choisie parmi le peptide amyloïde 131-42, le peptide amyloïde 13 1-40, l'a-synucléine ou la TDP-43.
[0019] L'échantillon dans lequel le procédé de l'invention est mis en oeuvre peut être tout échantillon susceptible de contenir au moins une PA93. Il peut s'agir d'un échantillon biologique d'origine humaine ou animale, ou d'un échantillon de cellules ou de tissu cultivé in vitro.
[0020] Le terme procédé in vitro signifie un procédé mis en oeuvre en dehors du corps humain ou animal, par exemple sur micro-organismes, organes, tissus, cellules, sous-fractions cellulaires (ex. noyaux, mitochondries) ou des protéines (natives ou recombinantes). Le terme in vitro englobe ex vivo.
[0021] L'échantillon peut par exemple provenir d'un individu, homme ou animal, ayant ou étant suspecté d'avoir une maladie associée à une PA93, par exemple une maladie neurodégénérative telle que décrite ci-dessus. Par exemple, l'échantillon peut être choisi parmi un échantillon de sang, un échantillon de plasma, un échantillon de sérum ou un échantillon de liquide céphalo-rachidien. L'échantillon peut également être préparé à
partir d'un tissu ou de cellules provenant de l'individu, par exemple à partir de cerveau, de tissus du système nerveux central, d'organes tels que la rate et l'intestin.
L'échantillon peut donc être un lysat cellulaire, un homogénat cellulaire, un lysat tissulaire ou un homogénat tissulaire, tel qu'un homogénat de cerveau.
L'échantillon peut également comprendre des cellules (ex. une lignée cellulaire), des sous-fractions cellulaires (ex. noyaux, mitochondries) ou des protéines (natives ou recombinantes).
[0022] L'échantillon peut également provenir de cellules ou d'un tissu cultivé(es) in vitro ou ex vivo, de préférence provenir d'un modèle cellulaire ou tissulaire d'une maladie associée à une PA93. Par exemple, l'échantillon peut être choisi parmi un lysat cellulaire, un homogénat cellulaire, un lysat tissulaire, un homogénat tissulaire, un surnageant de culture cellulaire ou un surnageant de culture tissulaire.
[0023] De préférence, l'échantillon est un lysat cellulaire ou un homogénat cellulaire.
[0024] Le terme contenant désigne un puits d'une plaque, un tube à essai ou tout autre contenant approprié au mélange d'un échantillon avec les réactifs nécessaires à la mise en uvre du procédé selon l'invention.
[0025] Au sens de l'invention, le terme ligand désigne une molécule capable de lier à
une molécule cible. Dans le cadre de l'invention, la molécule cible est la PNA93. On parle alors de ligand de la PNA93 . Le ligand peut être de nature protéique (ex.
une protéine ou un peptide) ou de nature nucléotidique (ex. un ADN ou un ARN).
Dans le cadre de l'invention, le ligand est avantageusement choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un anticorps ou un fragment d'anticorps.

[0026] Au sens de l'invention, le terme ligand capable de se lier spécifiquement à la PNAFI3 ou paire de ligands capabPNAFI3 désigne un ligand ou une paire de ligands qui se lie préférentiellement à la PNAFp par rapport à
la PAF, c'est-à-dire un ligand ou une paire de ligands capable de générer un signal (ex.
un signal ELISA ou un signal de RET) vis-à-vis d'une PNAFp au moins deux fois supérieur, par exemple au moins trois, au moins quatre, au moins cinq ou au moins six fois supérieur, au signal généré vis-à-vis de la PAFP correspondante. Les exemples 1-4 et 25 de la présente demande décrivent des méthodes ELISA et FRET qui permettent de déterminer facilement si un ligand ou une paire de ligands est capable de se lier spécifiquement à la PNAFP.
[0027] Avantageusement, le ligand capable de se lier spécifiquement à la PNAFP ou la paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNAFP est capable de se lier à
une PNAFp avec une affinité au moins 2 fois supérieure à l'affinité pour la PAFp correspondante, par exemple une affinité au moins 2 fois supérieure, au moins 3 fois supérieure, au moins 4 fois supérieure, au moins 5 fois supérieure, au moins 6 fois supérieure, au moins 7 fois supérieure, au moins 8 fois supérieure, au moins 9 fois supérieure, au moins 10 fois supérieure à l'affinité pour la PAFP
correspondante.
Lorsqu'il s'agit d'une paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNAFP, il n'est pas nécessaire que les deux ligands de la paire de ligands soient spécifiques de la PNAFp pour que la paire de ligands soit spécifique de la PNAFp. En effet, il suffit qu'au moins un des deux ligands de la paire de ligands soit un ligand spécifique de la PNAFp pour que la paire de ligands soit spécifique de la PNAFp. Néanmoins, les deux ligands de la paire de ligands peuvent être des ligands spécifiques de la PNAFP.
[0028] Le terme affinité fait référence à la force de l'ensemble des interactions non-covalentes entre un ligand et un antigène. L'affinité est généralement représentée par la constante de dissociation (Kd). Plus la valeur Kd est basse, plus l'affinité
de liaison entre le ligand et sa cible est élevée. La constante de dissociation (Kd) peut être mesurée par des méthodes bien connues, par exemple en FRET, en ELISA ou en SPR. Les techniques décrites dans la littérature permettent donc de savoir aisément si un ligand ou une paire de ligands est spécifique de la PNAFp.
[0029] Le terme anticorps , également appelé immunoglobuline désigne un hétérotétramère constitué de deux chaînes lourdes d'environ 50-70 kDa chacune (dites les chaînes H pour Heavy) et de deux chaînes légères d'environ 25 kDa chacune (dites les chaînes L pour Light), liées entre elles par des ponts disulfures intra et intercaténaires. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable, dit VL pour la chaîne légère, VH pour la chaîne lourde, et en position C-terminale, d'une région constante, constitué d'un seul domaine dit CL pour la chaîne légère et de trois ou quatre domaines nommés CH1, CH2, CH3, CH4, pour la chaîne lourde. Chaque domaine variable comprend généralement 4 régions charnières (appelées FR1, FR2, FR3, FR4) et 3 régions directement responsables de la liaison avec l'antigène, dites CDR (appelées orps peut être d'origine mammifère (ex. humain ou de souris ou de rat ou de camélidé), humanisé, chimérique, recombinant. Il s'agit de préférence d'un anticorps monoclonal produit de manière recombinante par des cellules génétiquement modifiées selon des techniques largement connues de l'homme de l'art. L'anticorps peut être de n'importe quel isotype, par exemple IgG, IgM, IgA, Ig D ou IgE, de préférence IgG.
[0030] On entend par fragment d'anticorps , toute partie d'une immunoglobuline obtenue par digestion enzymatique ou obtenue par bio-production comprenant au moins un pont disulfure et qui est capable de se lier à l'antigène reconnu par l'anticorps entier, par exemple Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, les diabodies, les anticorps linéaires (aussi appelés Single Domain Antibodies ou sdAb, ou nanobodies), les anticorps avec une seule chaine (ex. les scFv). La digestion enzymatique des immunoglobulines par la pepsine génère un fragment F(ab')2 et un fragment Fc scindé en plusieurs peptides.
F(ab')2 est formé de deux fragments Fab' liés par des ponts disulfures intercaténaires.
Les parties Fab sont constituées des régions variables et des domaines CH1 et CL. Le fragment Fab' est constitué de la région Fab et d'une région charnière. Fab'-SH fait référence à un fragment Fab' dans lequel le résidu cystéine de la région charnière porte un groupe thiol libre.
zo [0031] On entend par traceur un agent chimique ou biologique capable d'émettre directement ou indirectement un signal qui pourra être détecté avec un appareil de détection approprié. Il peut s'agir d'un traceur fluorescent, luminescent, radioactif ou enzymatique. Dans un mode de réalisation particulier, le traceur est un membre d'un couple de partenaires de RET.
[0032] Le terme RET (de l'anglais Resonance Energy Transfer ) désigne les techniques de transfert d'énergie. Le RET peut être un FRET ou un BRET.
[0033] Le terme FRET (de l'anglais Fluorescence Resonance Energy Transfer ) désigne le transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes. Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle¨dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à
proximité l'une de l'autre, un signal de FRET sera émis.
[0034] Le terme BRET (de l'anglais Bioluminescence Resonance Energy Transfer ) désigne le transfert d'énergie entre une molécule bioluminescente et une molécule fluorescente.

[0035] Le terme couple de partenaires de RET désigne un couple constitué
d'un composé donneur d'énergie (ci-après mposé accepteur d'énergie (ci-après composé accepteur ); lorsqu'ils sont à proximité l'un de l'autre et lorsqu'ils sont excités à la longueur d'onde d'excitation du composé donneur, ces composés émettent un signal de RET. Il est connu que pour que deux composés soient partenaires de RET, le spectre d'émission du composé donneur doit recouvrir partiellement le spectre d'excitation du composé accepteur. Par exemple, on parle de couples de partenaires de FRET lorsqu'on utilise un composé fluorescent donneur et un composé accepteur ou de couple de partenaires de BRET lorsqu'on utilise un composé bioluminescent donneur et un composé accepteur.
[0036] Le terme signal de RET désigne tout signal mesurable représentatif d'un RET
entre un composé donneur et un composé accepteur. Par exemple, un signal de FRET
peut donc être une variation de l'intensité ou de la durée de vie de luminescence du composé fluorescent donneur ou du composé accepteur lorsque ce dernier est fluorescent.
[0037] Procédé de détection 2 contenants [0038] Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé in vitro de détection dans un échantillon d'une forme agrégée en feuillets 13 d'une protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PAF13), comprenant les étapes suivantes:
a) Dans un premier contenant :
ai) introduire un échantillon susceptible de contenir une PAF13, a2) ajuster le pH à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la PAFB afin d'obtenir une forme non-agrégée en feuillets 13 de la protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PNAF13), a3) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9, b) Mesurer la teneur en PNAF13 dans le premier contenant avec une méthode immunologique appropriée ;
c) Dans un deuxième contenant :
c1) introduire un même échantillon qu'à l'étape a1), c2) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9;
d) Mesurer la teneur en PNAFP dans le deuxième contenant avec la même méthode qu'à l'étape b) ;
e) Comparer les teneurs mesurées aux étapes b) et d), une diminution de la teneur mesurée à l'étape d) par rapport à la teneur mesurée à l'étape b) indiquant que l'échantillon contient une PAF13.
[0039] Le principe général du procédé selon l'invention est illustré à la Figure 1.
[0040] Ci-après, le procédé est décrit en détail étape par étape.
[0041] Etape a) [0042] L'étape al) consiste à, dans un premier contenant, introduire un échantillon susceptible de contenir une PAFI3. L'tnt préparé pour pouvoir réaliser convenablement les étapes du procédé, notamment l'étape de mesure de la teneur en PNAF13. Par exemple, lorsque l'échantillon est un tissu ou des cellules, il 5 peut être préparé préalablement en le lysant, broyant, filtrant et/ou en le mettant en solution dans un solvant approprié tel que de l'eau. L'Homme du métier n'aura aucune difficulté à préparer l'échantillon.
[0043] L'étape a2) consiste à ajuster le pH à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la PAF13 afin d'obtenir une forme non-agrégée en feuillets 13 de la 10 protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PNAF13). La demanderesse s'est en effet aperçue qu'un pH allant de 9,7 à 13,2 permet de désagréger la PAFI3. Ce phénomène de désagrégation permet d'obtenir une PNAF13 à partir de la PAF13.
[0044] Ce phénomène de désagrégation à pH allant de 9,7 à 13,2 est tout à fait surprenant puisque les méthodes de désagrégation décrites dans l'art antérieur consistent plutôt à
traiter les PNAFP à pH acide, avec des détergents puissants et/ou par sonication. Par exemple, les travaux décrits dans [7] montrent différentes méthodes permettant d'obtenir des protéines amyloïdes relativement monomériques à partir de fibres amyloïdes. Dans une première approche, une préparation de fibres amyloïdes est traitée en combinant un acide, l'acide formique à 88%, avec un détergent de type tensioactif fort, le Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Une alternative consiste à combiner un agent chaotropique, une solution saturée de Guanidine Thiocyanate (6.8M) avec le SDS. Dans les 2 cas, les auteurs ont pu noter la disparition des fibres amyloïdes au profit de protéines amyloïdes relativement monomériques (mélange de monomères et de dimères). Une autre étude [8] décrit différentes méthodes de traitement d'échantillons biologiques pour désagréger des protéines amyloïdes (peptide amyloïde fi 1-42) qu'ils contiennent avant de les doser via un test ELISA. Des extraits de cerveaux de souris ou des liquides céphalo-rachidiens de patients sont traités par une solution d'alcool fluoré
(HFIP) ou d'acide (TFA) couplée à une sonication pendant 15 minutes pour désagréger les protéines amyloïdes. L'HFIP ou le TFA sont ensuite enlevés par séchage sous flux constant d'azote. Les échantillons à sec, contenant les protéines amyloïdes désagrégées, sont ensuite repris par une solution à 1% NH4OH avant d'être analysés. Les auteurs suggèrent que ces 2 types de traitement permettent de désagréger les agrégats de peptide amyloïde 13142 et par la même d'améliorer leur quantification.
[0045] Néanmoins la demanderesse a montré que les procédés de désagrégation décrits dans l'art antérieur ne permettent pas de mesurer la teneur en PNAF13 avec des méthodes immunologiques, qui nécessitent d'être mis en uvre à un pH
physiologique (cf. Exemples 5 à 17).
[0046] Le procédé de l'invention ne nécessite pas de traitement à un pH acide pour désagréger la PAF13. Au contraire, la Demanderesse a non seulement montré
qu'une désagrégation était possible en traitant une PAFP à un pH allant de 9,7 à
13,2, mais également que ce traitement était mise en oeuvre ultérieure d'une méthode immunologique visant à mesurer la teneur en PNAF[3.
[0047] Avantageusement, l'étape a2) consiste à ajuster le pH à un pH allant de 10 à 13,2, par exemple un pH allant de 11 à 13,2, un pH allant de 11,5 à 13,2, un pH
allant de 12 à
13,2, un pH allant de 12,5 à 13,2, un pH allant de 12,8 à 13,2, un pH allant de 10 à 13, un pH allant de 11 à 13, un pH allant de 12 à 13, par exemple environ 12,8.
[0048] Le pH est ajusté avec une base, par exemple une base forte telle que KOH ou NaOH, de préférence NaOH.
[0049] La durée de l'étape a2) pourra dépendre de différents paramètres tels que la base utilisée ou la PFP testée. En particulier, l'étape a2) pourra durer au moins 30 secondes, par exemple au moins 1 minute, au moins 2 minutes, au moins 5 minutes, au moins 10 minutes, au moins 15 minutes, par exemple entre 30 secondes et 60 min ou entre minutes et 30 minutes. L'Homme du métier n'aura aucune difficulté à adapter la durée de l'étape a2) pour arriver à désagréger tout ou partie de la PAF 13 afin d'obtenir une PNAF13.
[0050] L'étape a3) consiste à ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9. Cette étape est importante puisqu'elle permet de mettre en oeuvre la méthode immunologique de l'étape b).
[0051] Avantageusement, l'étape a3) consiste à ajuster le pH à un pH allant de 6,4 à 9, par exemple un pH allant de 6,4 à 8,4, un pH allant de 6 à 8,5, un pH allant de 7 à 8,5.
[0052] Le pH est ajusté avec un acide, par exemple un acide fort, tel que HCI.

[0053] Etape b) [0054] L'étape b) consiste à mesurer la teneur en PNAF13 dans le premier contenant avec une méthode immunologique appropriée (ou immunoassay approprié).
[0055] Il est nécessaire que la méthode immunologique de l'étape b) permette d'obtenir des teneurs qui soient comparables entre elles. Néanmoins, il n'est pas nécessaire que la méthode immunologique de l'étape b) soit quantitative, bien qu'elle puisse l'être. La méthode immunologique de l'étape b) doit permettre a minima de mesurer une teneur relative pouvant être comparée à une autre teneur relative mesurée par une même méthode immunologique.
[0056] Dans un mode de réalisation particulier la méthode immunologique mise en oeuvre à
l'étape b) utilise :
(i) un ligand capable de se lier spécifiquement à la PNAF13, ledit ligand étant marqué
avec un traceur, ou (ii) une paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNA93, au moins un ligand de ladite paire de ligands étant marqué avec un traceur.

12 [0057] Le ligand (i) peut être choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un peptide ou un aptamère, de préférence un &peut être choisie parmi une paire d'anticorps, une paire de fragments d'anticorps, une paire de peptides ou une paire d'aptamères, de préférence une paire d'anticorps.
[0058] L'Homme du métier n'aura aucune difficulté à obtenir et/ou sélectionner des anticorps ou des fragments d'anticorps ayant les propriétés recherchées, par exemple en immunisant une souris avec une PFp, en faisant une hybridation lymphocytaire à
partir des lymphocytes de la rate de la souris immunisée afin de générer des hybridomes et en testant les anticorps de chaque hybridome pour leurs capacités à se lier spécifiquement à la PNAFP. Des exemples de protocole complet de génération d'anticorps anti-PNAFp puis de sélection des anticorps spécifiques sont détaillés aux exemples 1-4 et 25. Il est donc très facile d'obtenir des anticorps ou des paires d'anticorps dirigés contre n'importe quelle PNAFp pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, par exemple en mettant en oeuvre les procédés décrits aux exemples 1-4 et 25.
[0059] L'obtention des PNAFP et des PAFP est à la portée de l'Homme du métier.
Par exemple, pour les protéines dites prion-like , telles que TDP-43, FUS, TAF15 et EWSR1, la production de ces protéines fusionnées à la Gluthatione-S-Transférase (GST) (fusion N- ou C-terminale selon les protéines) permet d'obtenir des protéines en fusion GST dont l'analyse par turbidimétrie montre qu'elles sont sous forme non-agrégées [9][10][13]. Lorsqu'un site de clivage à la Tobacco etch Virus protéase (TEV) est inséré
entre la PFp d'intérêt et la GST, un traitement des protéines GST à la TEV
suivie d'une étape de purification permet d'obtenir les protéines sans étiquette GST.
Lorsque celles-ci sont laissées 1h30 à température ambiante sous agitation, l'analyse par turbidimétrie montre qu'elles sont sous forme agrégées [10][13]. Des PFP fusionnées à GST
sont également disponibles dans le commerce, par exemple chez Abnova : GST-TDP-43 (Réf.
H00023435-P02), GST-FUS1 (Réf. H00002521-P01), GST-TAF15 (Réf. H00008148-P02) GST-EWSR1 (Réf. H00002130-Q01).
[0060] Les peptides amyloïdes, notamment les formes p 1-40 et p 1-42, sont également disponibles auprès de nombreux fournisseurs sous forme de poudre. La solubilisation de ces poudres dans du HFIP ou de NH4OH permet d'obtenir des solutions stocks contenant plus de 90% de formes non-agrégées. L'utilisation extemporanée de ces solutions préalablement diluées dans des tampons présentant des pH physiologiques permet de disposer d'échantillons de formes non-agrégées. A l'inverse, une incubation de plusieurs heures à plusieurs jours, par exemple une incubation de plus de 24 h, de ces mêmes solutions stock dans un tampon physiologique à température ambiante permet d'obtenir un échantillon contenant de très fortes proportions de formes agrégées [11].
[0061] Des échantillons contenant des PNAFP et des PAFP peuvent également être obtenues auprès de la société StressMarq (www.stressmarq.com). C'est notamment le cas pour les

13 alpha, beta et gamma synucléines, la protéine TAU, la protéine Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) ou la Transthyreti [0062] Avantageusement, la méthode immunologique mise en uvre aux étapes b) est une méthode ELISA ou une méthode RET, telle qu'un FRET ou un BRET.
[0063] Selon la méthode utilisée, la mesure de l'étape b) peut se faire directement dans le premier contenant en y rajoutant les réactifs appropriés ou dans un autre contenant avec tout ou partie du contenu du premier contenant. Par exemple, les réactifs d'une méthode RET peuvent être ajoutés directement dans le premier contenant. A
l'inverse, la méthode ELISA se fera de préférence dans un autre contenant adapté à la mise en oeuvre de la méthode ELISA, notamment dans un contenant au fond duquel a préalablement été immobilisé un ligand de la PNAFB.
[0064] Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b) est réalisée par une méthode RET
et consiste à :
(b1) introduire dans le contenant un premier ligand de la PNAFB marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET et un second ligand de la PNAFB
marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFB, et (b2) mesurer le signal de RET émis dans le contenant.
[0065] Bien évidemment, pour la mise en uvre de la méthode RET, le premier ligand et le second ligand ne doivent pas entrer en compétition pour la liaison à la PNAFB, par exemple le premier ligand et le deuxième ligand ne doivent pas lier le même épitope sur la PNAFB. Il est facile de sélectionner une paire de ligands appropriée en mettant en oeuvre le procédé décrit aux exemples 1-4 et 25.
[0066] Les ligands peuvent être marqués de manière directe ou indirecte. Le marquage direct du ligand par un membre d'un couple de partenaires de RET peut être effectué
par les méthodes classiques connues de l'homme du métier, reposant sur la présence de groupes réactifs sur le ligand. Par exemple, lorsque le ligand est un anticorps ou un fragment d'anticorps, les groupes réactifs suivants peuvent être utilisés : le groupe amino terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
[0067] Les groupes réactifs peuvent former une liaison covalente avec un groupe réactif porté par un membre d'un couple de partenaires de RET. Les groupes réactifs appropriés, portés par le membre d'un couple de partenaires de RET, sont bien connus de l'homme du métier, par exemple un composé donneur ou un composé accepteur fonctionnalisé par un groupe maléimide sera par exemple capable de se lier de manière covalente avec les groupes thiols portés par les cystéines portées par une protéine ou un

14 peptide, par exemple un anticorps ou un fragment d'anticorps. De même, un composé
donneur/accepteur portant un ester dole de se fixer de manière covalente à une amine présente sur une protéine ou un peptide.
[0068] Le ligand peut également être marqué par un composé fluorescent ou bioluminescent de manière indirecte, par exemple en introduisant dans le milieu de mesure un anticorps ou un fragment d'anticorps, lui-même lié de manière covalente à un composé accepteur/donneur, ce deuxième anticorps ou fragment d'anticorps reconnaissant de manière spécifique le ligand.
[0069] Un autre moyen de marquage indirect très classique consiste à fixer de la biotine sur le ligand à marquer, puis d'incuber ce ligand biotinylé en présence de streptavidine marquée par un composé accepteur/donneur. Des ligands biotinylés appropriés peuvent être préparés par des techniques bien connues de l'homme du métier ; la société Cisbio Bioassays commercialise par exemple de la streptavidine marquée avec un fluorophore dont la dénomination commerciale est d2 (réf. 610SADLA).
[0070] Avantageusement, l'un des membres du couple de partenaires de RET est un composé fluorescent donneur ou luminescent donneur et l'autre membre du couple de partenaires de RET est un composé fluorescent accepteur ou un composé
accepteur non fluorescent (quencher).
[0071] Lorsque le RET est un FRET, le composé fluorescent donneur peut être un partenaire de FRET choisi parmi : un cryptate d'europium, un chélate d'europium, un chélate de terbium, un cryptate de terbium, un chélate de ruthénium, un quantum dot, les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène et le nitrobenzoxadiazole. Lorsque le RET est un FRET, le composé fluorescent accepteur peut être un partenaire de FRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP
choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP citrine, YFP venus et YPet, le mOrange, le DsRed.
[0072] Lorsque le RET est un BRET, le composé luminescent donneur peut être un partenaire de BRET choisi parmi : la Luciférase (luc), Renilla Luciférase (Rluc), les variants de Rénilla Luciférase (Rluc8) et la Firefly Luciférase. Lorsque le RET est un BRET, le composé fluorescent accepteur est un partenaire de BRET choisi parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole, un quantum dot, la GFP, les variants GFP choisis parmi GFP10, GFP2 et eGFP, la YFP, les variants YFP choisis parmi eYFP, YFP topaz, YFP
citrine, YFP
venus et YPet, le mOrange, le DsRed.

[0073] Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b) est réalisée par une méthode ELISA et consiste à :
(bl) introduire tout ou partie de l'échantillon dans un contenant au fond duquel a été
immobilisé un premier ligand de la PNAFp, puis introduire un second ligand de la PNAFp 5 marqué avec un traceur, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFp, (b2) mesurer le signal ELISA émis dans le contenant.
[0074] La méthode ELISA est largement décrite dans l'art antérieur et ne présente aucune difficulté de mise en oeuvre pour l'Homme du métier.
10 [0075] Etape c) [0076] L'étape c) consiste à, dans un premier contenant, cl) introduire un même échantillon qu'à l'étape al).
[0077] Contrairement à l'étape a), le pH n'est pas ajusté à un pH allant de 9,7 à 13,2 lors de l'étape c). Le pH est directement ajusté à un pH allant de 6 à 9 (étape c2)), de

15 préférence au même pH que le pH de l'étape a3).
[0078] Le pH à l'étape c2) peut être ajusté avec un mélange acide/base, par exemple un mélange acide fort/base forte. Il peut s'agir par exemple d'un mélange Na0H/HCI. De préférence, l'acide utilisé à l'étape c2) est le même que celui utilisé à
l'étape a3) et la base utilisée à l'étape c2) est la même que la base utilisée à l'étape a2).
[0079] Etape d) [0080] L'étape d) consiste à mesurer la teneur en PNAFp dans le deuxième contenant avec la même méthode qu'à l'étape b). L'étape d) est mise en oeuvre de la même manière que l'étape b) pour pouvoir comparer les mesures et mettre en uvre l'étape e).
[0081] Ainsi, lorsque l'étape b) est réalisée par une méthode RET, l'étape d) consiste à :
(dl) introduire dans le contenant un premier ligand de la PNAFp marqué par un premier membre d'un couple de partenaires de RET et un second ligand de la PNAFp marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFp, et (d2) mesurer le signal de RET émis dans le contenant.
[0082] De la même manière, lorsque l'étape b) est réalisée par une méthode ELISA, l'étape d) consiste à :
(dl) introduire tout ou partie de l'échantillon dans un contenant au fond duquel a été
immobilisé un premier ligand de la PNAFp, puis introduire un second ligand de la PNAFp marqué avec un traceur, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFp, (d2) mesurer le signal ELISA émis dans le contenant.
[0083] Etape e)

16 [0084] L'étape e) consiste à comparer les teneurs mesurées à l'étape b) et à
l'étape d), une diminution de la teneur mesurée à l'éiesurée à l'étape b) indiquant que l'échantillon contient une PAF13.
[0085] Bien évidemment, si on permute le premier et le deuxième contenant, l'étape e) consistera à comparer les teneurs mesurées à l'étape b) et à l'étape d), une augmentation de la teneur mesurée à l'étape d) par rapport à la teneur mesurée à
l'étape b) indiquant que l'échantillon contient une PAF13.
[0086] L'homme du métier pourra facilement comparer les teneurs mesurées aux étapes b) et d) et définir un seuil lui permettant de qualifier l'augmentation ou la diminution. Par exemple un écart entre les teneurs mesurées supérieur à 5%, supérieur à 100/0, supérieur à 15%, supérieur à 20%, supérieur à 25%. La détermination du seuil pourra dépendre de la variabilité inhérente à la méthode immunologique choisie.
[0087] L'homme du métier pourra par exemple calculer le ratio entre les teneurs mesurées aux étapes b) et d). De manière générale, plus l'écart entre les teneurs mesurées est important, plus le ratio entre les teneurs mesurées sera important et plus la quantité de PAFB dans l'échantillon sera importante.
[0088] Lorsque la méthode immunologique est une méthode ELISA ou une méthode RET, on va comparer les signaux de RET ou les signaux ELISA mesurés aux étapes b) et d).
Par conséquent, une diminution du signal de RET ou une diminution du signal ELISA
indiquera que l'échantillon contient une PAFB. Avantageusement on calculera un ratio entre le signal mesuré dans le premier contenant (étape b)) et le signal mesuré dans le deuxième contenant (étape d)). Le calcul du ratio pourra se faire manuellement ou automatiquement.
[0089] De préférence, la durée entre l'étape a3) et l'étape b) et/ou entre l'étape c2) et l'étape d) sera adaptée pour éviter que la PNAFB se ré-agrège en PAF13. La durée sera de préférence inférieure à 24 heures, par exemple inférieure à 5 heures.
Avantageusement, les étapes b) et d) sont réalisées dans la foulée des étapes a3) et c2) respectivement, c'est-à-dire moins de 30 minutes après les étapes a3) et c2). L'Homme du métier n'aura aucune difficulté à adapter la durée de l'étape a3) et/ou de l'étape c2) pour éviter que tout ou partie de la PNAFB se ré-agrège en PAFB avant l'étape c) et/ou l'étape d).
[0090] La comparaison des teneurs dans les deux échantillons à l'étape e) permet de mesurer le niveau d'agrégation de façon très précise, notamment par rapport à
la plupart des méthodes de l'art antérieur.
[0091] Procédé de suivi de l'efficacité thérapeutique [0092] La présente invention concerne également un procédé in vitro de suivi de l'efficacité
thérapeutique d'un traitement d'une maladie associée à une PAF B chez un patient, comprenant les étapes suivantes :

17 A) Mettre en uvre le procédé selon l'invention sur un premier échantillon dudit patient, dans lequel l'étape e) consiste à déterurée à l'étape b) et la teneur mesurée à l'étape d) ( Ratio b)/d) de l'échantillon 1 ) ;
B) Mettre en oeuvre un même procédé qu'à l'étape A) sur un second échantillon dudit patient, pour déterminer le Ratio b)/d) de l'échantillon 2 ;
C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité
thérapeutique est observée lorsque le ratio déterminé à l'étape B) est inférieur au ratio déterminé à l'étape A).
[0093] Le traitement peut être un traitement connu de la maladie associée à
une PAF3 ou un traitement expérimental. L'échantillon provient, de préférence, d'un individu ayant une maladie associée à la PAF3.
[0094] Pour pouvoir suivre l'efficacité d'un traitement, le premier échantillon et le second échantillon sont prélevés sur le patient à des moments différents, par exemple le premier échantillon est prélevé à un temps T1 et le deuxième échantillon est prélevé à
un temps T2. Avantageusement, le premier échantillon est prélevé avant le second échantillon, par exemple le premier échantillon est prélevé à un temps Ti avant le traitement du patient ou au cours dudit traitement, et le second échantillon est prélevé à
un temps T2 après ledit traitement ou au cours dudit traitement. Le temps qui s'écoule entre le prélèvement du premier échantillon et le prélèvement du second échantillon sera choisi pour pouvoir détecter une efficacité thérapeutique du traitement.
[0095] Procédé de suivi de mesure de l'efficacité pharmacologique [0096] La présente invention concerne également un procédé in vitro de mesure de l'efficacité pharmacologique d'une molécule médicament ou d'un candidat médicament sur une maladie associée à une PAU; dans un échantillon test, comprenant les étapes suivantes :
A) Mettre en uvre le procédé selon l'invention sur un premier échantillon dudit échantillon test, dans lequel l'étape e) consiste à déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l'étape b) et la teneur mesurée à l'étape d) ( Ratio b)/d) de l'échantillon 1 ) ;
B) Mettre en oeuvre un même procédé qu'à l'étape A) sur un second échantillon dudit échantillon test, pour déterminer le Ratio b)/d) de l'échantillon 2 ;
C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité
pharmacologique est observée lorsque le ratio déterminé à l'étape B) est inférieur au ratio déterminé à l'étape A).
[0097] La molécule peut être un médicament ou un candidat médicament.
L'échantillon provient, de préférence, de cellules ou d'un tissu cultivé(es) in vitro. Par conséquent, la molécule médicament ou le candidat médicament est de préférence testé sur un modèle in vitro de maladie associée à une PAF3. De tels modèles sont largement décrits dans la littérature.

18 [0098] L'échantillon test correspond à un échantillon qui permet de tester in vitro un médicament ou un candidat médicamin échantillon de cellules cultivé in vitro ou un échantillon de tissu cultivé in vitro.
L'échantillon test correspond à ce qu'on appelle couramment un modèle in vitro de maladie associée à
une PAF 3 . Ainsi, pour pouvoir mesurer l'efficacité pharmacologique d'une molécule médicament ou d'un candidat médicament, le premier échantillon et le second échantillon sont prélevés à partir de l'échantillon test à des moments différents, par exemple le premier échantillon est prélevé à un temps T1 et le second échantillon est prélevé à un temps T2. Avantageusement, le premier échantillon est prélevé
avant le second échantillon, par exemple le premier échantillon est prélevé à un temps Ti avant le traitement de l'échantillon test avec une molécule médicament ou d'un candidat médicament, et le second échantillon est prélevé à un temps Ti après ledit traitement.
Le temps qui s'écoule entre le prélèvement du premier échantillon et le prélèvement du second échantillon sera choisi pour pouvoir détecter une efficacité
pharmacologique de la molécule médicament ou du candidat médicament.
[0099] La présente invention sera maintenant illustrée par les exemples non limitatifs suivants.
EXEMPLES
[0100] Exemple 1: Méthode permettant d'identifier des anticorps spécifiques d'une PNAFI3 [0101] Génération d'anticorps anti-PNA93 [0102] Immunisations des souris [0103] Des souris BALB/c sont immunisées par injection de la protéine PNA93 préalablement diluée dans du tampon phosphate préparé en conditions physiologiques.
L'absence de présence de multimères ou d'agrégats de la PNA93 est vérifiée dans le tampon destiné à
réaliser les injections afin de diriger la réponse immune des souris sur les formes non-agrégées. La primo-injection est suivie de trois rappels à intervalle d'un mois.
[0104] Quinze jours après chaque injection, des ponctions sanguines sont réalisées sur les souris pour vérifier la présence d'une réponse immunitaire par titration des anticorps.
[0105] Titration des immun-sérums en anticorps anti-PNAFb par tests ELISA
[0106] Pour cela, des tests d'immuno-détection de type ELISA sont mis en place en fonction de la nature de la P93. Pour les P93 de type amyloïde ou les peptides, de la PNA93 est préalablement marquée sur ses lysines primaires avec de la biotine par l'utilisation d'un réactif composé de biotine, d'un linker carboné et d'un groupement réactif NHS
(N-Hydroxysuccinimide). Pour les P93 hors amyloïde ou non, de la PNAFa en fusion GST est directement immobilisée sur des plaques 96 puits via le tag GST par l'utilisation de

19 microplaques ELISA fonctionnalisées avec un groupement glutahion. Les protéines marquées à la biotine sont immobilisémia la biotine par l'utilisation de microplaques fonctionnalisées avec de la streptavidine. Pour cela, 100 pL
de solution de PNAF13 en fusion GST et/ou biotinylées sont ajoutées dans chaque puits puis incubées pendant 2h à température ambiante. Les puits sont ensuite lavés trois fois en tampon PBS supplémenté de 0.05% de Tween-20. Après retrait de la solution de lavage, chaque puits est ensuite incubé pendant toute une nuit à 4 C avec 200 pL d'une solution de saturation composée de PBS, 5% BSA.
[0107] Les dilutions sérielles d'un facteur 10 à 100 millions des ponctions sanguines (immun-sérums) sont ensuite ajoutées, en doublets, à hauteur de 100 pL par puit en tampon PBS + 0.1% BSA et incubées sous agitation pendant 2h. Les anticorps non spécifiques non fixés à la PNAF13 immobilisée sont éliminés par trois étapes de lavages de 200 pL en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20. La présence éventuelle d'anticorps spécifiques est détectée à l'aide de 100 pL par puits d'anticorps secondaire anti-Fc de souris couplé à la HRP (horseradish peroxidase) (Sigma #A0168 diluée au 1/10 000 dans du PBS, BSA 0.1%). Après 1h d'incubation à température ambiante sous agitation puis trois lavages sous 200 pL en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20, la révélation de la HRP
est réalisée par dosage colorimétrique à 450 nm suite à l'incubation de son substrat TMB
(3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20 min à température ambiante et sous agitation. Cette solution de saturation est ensuite retirée par aspiration et les plaques sont stockées à 4 C en vue d'une utilisation future.
[0108] Afin de s'assurer que les anticorps détectés par le test ELISA sont bien dirigés contre la protéine PNAF13 et non contre le tag GST ou la biotine, les mêmes ponctions sont testées sur le test ELISA après pré-incubation avec un excès d'une autre protéine orthogonale tagguée avec la GST ou la biotine. Ainsi, les anticorps anti-TAG
se fixent sur la protéine orthogonale taguée et donc pas sur la protéine PNAF13 immobilisée au fond des puits ; auquel cas aucun signal HRP ou une diminution du signal HRP est détecté.
[0109] Fusion & clonages [0110] Les souris présentant les meilleurs titres d'anticorps anti-PNAF13 (signal, c'est-à-dire densité optique à 450 nm élevée) et le moins de baisse de signal dans le cas contrôle anti-TAG sont sélectionnées pour l'étape suivante d'hybridation lymphocytaire, aussi appelée fusion. La rate des souris est extraite afin d'isoler un mélange des lymphocytes et plasmocytes. Cet échantillon pluri-cellulaire est fusionné i vitro avec une lignée cellulaire de myélome en présence d'un catalyseur de la fusion cellulaire du type polyéthylène glycol (PEG). Une lignée cellulaire de myélome mutante, déficiente pour l'enzyme HGPRT (Hypoxanthine Guanosin Phosphoribosyl Transferase) est utilisée pour permettre une sélection des cellules hybrides, appelées hybridomes. Ces cellules sont cultivées dans un milieu contenant de l'hypoxanthine, de l'aminopterine (methotrexate) et de la thyamine (milieu HAT), pour permettre l'élimination des cellules de myélome non fusionnées et ainsi sélectionner les hybridomes d'intérêt. Les cellules de rate non fusionnées quant à elle meurent puiscer in vitro. Ainsi, seuls les hybridomes survivent à cette pression de sélection in vitro.
[0111] Ces hybridomes sont cultivés dans des plaques de culture. Les surnageants de ces 5 hybridomes sont testés pour évaluer leur capacité à produire des anticorps anti-PNAFp.
Pour cela, un test ELISA comme décrit ci-dessus est réalisé. Le seuil minimal retenu pour sélectionner un clone est de quatre fois celui du non spécifique. Les meilleurs hybridomes sont clonés avec une étape de dilution limite afin d'obtenir des clones stables d'hybridome.
10 [0112] Les clones retenus sont mis en culture en vue de constituer une banque d'hybridomes, testés en viabilité cellulaire et stockés dans de l'azote liquide. A cette étape, les anticorps produits par les clones peuvent être facilement séquences par des méthodes bien décrites dans l'art antérieur afin de pouvoir produire les anticorps, par exemple, dans des cellules productrices. Alternativement, les anticorps sont produits 15 comme décrit ci-après.
[0113] Production d'anticorps anti-PNAFI3 [0114] Les clones d'hybridomes d'intérêt sont remis en culture et l'inoculum cellulaire est ensuite injecté dans des souris BALB/c (injection intra-péritonéale, IP) afin de permettre la production des anticorps en grande quantité dans le liquide d'ascite.

20 [0115] Après caractérisation du contenu des liquides d'ascites par diverses techniques visant à quantifier et à qualifier le contenu en anticorps, ceux-ci sont ensuite purifiés après précipitation éventuelle par des sels, via une chromatographie d'affinité sur des colonnes comportant des résines greffées avec la protéine A. Après lavage de la colonne pour éliminer les constituants en dehors des anticorps, le contenu en anticorps est élue par un choc à pH acide en tampon glycine. Après neutralisation du pH et dialyse contre un tampon à pH neutre, les anticorps anti-PNAFp sont prêts pour stockage à 4 C ou congélation et utilisation/caractérisation ultérieures (isotypage, dosage, tests fonctionnels).
[0116] Sélection d'une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement à
une PNAFp (méthode ELISA) [0117] Afin de sélectionner une paire d'anticorps reconnaissant préférentiellement une PNAFp vis-à-vis d'une PAFp, un test de type ELISA est mis en place. Pour se faire, un des anticorps de la paire testée est biotinylé en utilisant le kit Lightning-Link Rapid Biotin Type A (Expedeon, référence SKU 370-0005) selon les recommandations du fournisseur.
Le deuxième anticorps de la paire testée, préalablement dilué en tampon PBS à
des concentrations comprises entre 1 et 20 pg/mL, est adsorbé sur des plaques 96 puits de type ELISA high binding . Pour cela 100 pL d'anticorps sont ajoutés dans chaque puits puis incubés pendant 20h à 4 C suivi de trois lavages en tampon PBS lx, 0.05%

21 Tween20. Après retrait de la solution de lavage, chaque puits est ensuite incubé pendant toute une nuit à 4 C avec 200 pL d'tsée de PBS, 5%
BSA. Cette solution de saturation est ensuite retirée par aspiration et les plaques sont stockées à 4 C en vue d'une utilisation future.
[0118] Des dilutions sérielles d'un facteur 1 à 1/100ème d'échantillons contenant la même concentration initiale de PNAF5 ou de PAFP sont ajoutées à hauteur de 100 pL/puit et incubées pendant 2h à température ambiante sous agitation. Les PNAFp ou PAFp non fixés à l'anticorps adsorbé sur les plaques sont éliminés par trois étapes de lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20. L'anticorps biotinylé, préalablement dilué en tampon PBS à une concentration comprise entre 10 et 200 ng/nnL, est ajouté à hauteur de 100 pL/puits et incubé pendant 2h à température ambiante sous agitation. Les anticorps biotinylés non fixés aux PNAFp ou PAFp sont éliminés par trois étapes de lavages en tampon PBS 1X, 0.05% Tween20. La détection des anticorps fixés est réalisée à
l'aide d'une streptavidine-HRP (R&D Systems, Réf. DY998) diluée au 1/10ème dans du PBS, BSA 0.1%. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante sous agitation, puis trois lavages en tampon PBS 1X, 0,05% Tween20, la révélation de la HRP est réalisée par mesure de la densité optique à 450 nm (D.O. 450 nm) suite à l'incubation de son substrat TMB (3,3',5,5'-Tétraméthylbenzidine, Sigma #T0440) pendant 20 min à
température ambiante sous agitation.
zo [0119] Dans une première étape, la dilution de référence des échantillons de PNAFP ou PAFp est déterminée en analysant la D.O. 450 nm mesurée avec les différentes dilutions de PNAFp. Comme indiqué dans la Figure 2, la dilution de référence est celle pour laquelle 80% de la D.O. 450nm maximale est obtenue.
[0120] Dans une deuxième étape, la D.O. 450nm obtenue avec la dilution de référence de l'échantillon de PNAFp est comparée avec la D.O. 450 nm mesurée avec une dilution identique de l'échantillon de PAFp. Comme illustré dans la Figure 3, une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement à la PNAFp donnera une D.O. 450nm 50% plus faible sur l'échantillon PAFp par rapport à la D.O. 450 nm mesurée sur l'échantillon PNAFp.
[0121] Sélection d'une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement à
une PNAFp (méthode FRET) Afin de sélectionner une paire d'anticorps reconnaissant préférentiellement une PNAFp vis-à-vis d'une PAFp, un test de FRET est mis en place. Ce test est basé sur la Technologie HTRFC) de Cisbio Bioassays. Le principe de cette technique repose sur un transfert d'énergie de fluorescence entre une molécule donneuse, un cryptate de Terbium (Donneur), et une molécule fluorescente acceptrice d'énergie le d2 (Accepteur).
Ces deux molécules fluorescentes sont greffées par couplage covalent à des anticorps pour mettre en oeuvre un dosage immunologique tel qu'illustré à la Figure 4.
Pour se faire, un des anticorps de la paire testée est marqué avec le donneur Lumi4 Terbium en utilisant le kit Terbium Cryptate labeling kit (Cisbio Bioassays, référence 62TBSPEA)

22 selon les recommandations du fabricant. Avant utilisation, l'anticorps marqué
au donneur est dilué dans un tampon Hepes 20rruentration de 0.5 nM. Le deuxième anticorps de la paire testée est marqué avec l'accepteur d2 en utilisant le kit d2 labeling kit (Cisbio Bioassays référence 62D2DPEA) selon les recommandations du fournisseur. Avant utilisation, l'anticorps marqué au donneur est dilué
dans un tampon Hepes 20mM pH=7.4, BSA 0.1% à une concentration de 5nM. Des dilutions sérielles d'un facteur 1 à 1/100ème d'échantillons contenant la même concentration initiale de PNAFp ou de PAFp sont distribuées dans une microplaque 384 à
hauteur de 16pL/puits. 2pL de la solution à 0.5nM d'anticorps marqué au donneur et 2pL de la solution à 5 nM d'anticorps marqué à l'accepteur sont ensuite ajoutés dans chaque puits.
La microplaque est incubée 20 h à température ambiante. La détection du signal de FRET dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG
Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0122] Dans une première étape, la dilution de référence des échantillons de PNAFp ou PAFp est déterminée en analysant le signal HTRF mesuré avec les différentes dilutions de PNAFp. Comme indiqué dans la Figure 5, la dilution de référence est celle pour laquelle 80% du signal HTRF maximum est obtenu, avant le plateau de saturation de l'immuno-essai.
[0123] Dans une deuxième étape, le signal HTRF obtenu avec la dilution de référence de l'échantillon de PNAFp est comparé avec le signal HTRF mesuré avec une dilution identique de l'échantillon de PAFp. Comme illustré dans la Figure 6, une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement à la PNAFP donnera un signal HTRF 50% plus faible sur l'échantillon PAFP par rapport au signal HTRF mesuré sur l'échantillon PNAFP.
[0124]
Exemple 2: Méthode permettant d'identifier des couples d'anticorps capables de se lier spécifiquement à la TDP-43 NAFI3 (Méthode FRET) [0125] Une méthode alternative d'obtention d'échantillons contenant des TDP-43 AFp ou des TDP-43 NAFP consiste à cultiver des cellules HeLa et à les traiter ou non pendant au moins 6h par de la staurosporine. L'analyse des lysats cellulaires réalisée par SDS-PAGE
et Western-Blot montre que les lysats de cellules HeLa non traitées contiennent des TDP-43 NAFp tandis que les lysats de HeLa traités à la staurosporine contiennent essentiellement des TDP-43 AFp [12].
[0126] La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF de Cisbio Bioassays) décrite dans l'exemple 1.
[0127] Préparation des anticorps à tester [0128] Cinq anticorps dirigés contre TDP-43 ont été marqués respectivement avec le Donneur et avec l'Accepteur. Ces marquages ont été réalisés en utilisant les kits de marquage commercialisés par Cisbio Bioassays (Références commerciales 62EUSUEA
et 62D2DPEA). Les taux de marquage obtenus (nombre de molécules fluorescentes par

23 anticorps) étaient conformes aux attentes. Les taux de marquage au Donneur étaient compris entre 5.9 et 7.9. Les taux de ompris entre 2.3 et 3.3.
[0129] Le tableau ci-dessous donne les caractéristiques des anticorps qui ont été testés.
[0130] [Table 1]
Identification de Référence Fournisseur l'anticorps commerciale Ac1 SIG-39854 Biolegend Ac2 89789BF Cell Signaling Technology Ac3 MABN774 Merck Millipore Ac4 ab238443 Abcam Ac5 ab248546 Abcam [0131] Pour être testés, tous les anticorps ont été dilués dans un tampon pour obtenir des concentrations respectives de 3 nM pour les anticorps marqués au Donneur et de 30 nM
pour ceux marqués à l'Accepteur.
[0132] Préparation d'un échantillon de TDP-43 NAFB (Monomères) [0133] Des cellules HeLa ont été ensemencées à 5 millions de cellules en flasque (175 cm2) en milieu de culture complet (MEM alpha medium + 2 mM Hepes + 10% sérum de veau foetal décomplémenté + 1% d'antibiotiques, Pénicilline 5000 ( mi et Streptomycine 5000 pg/ml). Après 78 heures, le milieu de culture a été aspiré. Les cellules ont ensuite été
lysées avec un tampon de lyse cellulaire. Le lysat obtenu (ci-après échantillon Monomères ), contenant la TDP-43 NAF13, a été congelé à -80 C en vue de son utilisation. Un contrôle de cet échantillon a été réalisé par western blot comme préconisé
dans la littérature [12] afin de s'assurer que celui-ci contient essentiellement de la TDP43 non agrégée (TDP-43 NAF[3).
[0134] Préparation d'un échantillon de TDP-43 AFB (Agrégats) [0135] Des cellules HeLa ont été ensemencées à 5 millions de cellules en flasque (175 cm2) en milieu de culture complet (MEM alpha medium + 2 mM Hepes + 10% sérum de veau foetal décomplémenté + 1% d'antibiotiques, Pénicilline 5000 U/ml et Streptomycine 5000 pg/ml). Après 72 heures, le milieu de culture a été aspiré. Une solution de staurosporine à 1 pM en milieu complet a été ajoutée sur les cellules en culture pendant 6h.
Le traitement des cellules à la staurosporine permet d'agréger TDP-43 pour obtenir des TDP-43 AFB. Le milieu de culture a ensuite été aspiré avant d'ajouter un tampon de lyse cellulaire. Le lysat obtenu (ci-après échantillon Agrégats ), contenant la TDP-43 AFB, a été congelé à -80 C en vue de son utilisation ultérieure. Un contrôle de cet échantillon a été réalisé par western blot comme préconisé dans la littérature [12] afin de s'assurer que celui-ci contient essentiellement de la TDP43 agrégée (TDP-43 AFI3).

24 [0136] Criblage des paires d'anticorps sur les Monomères ou les Agrégats _ I-01371 Le jour du test, es échantillons écongelés avant distribution dans des microplaques 384 puits (Greiner référence 784075).
[0138] Les réactifs suivants ont été ajoutés dans les microplaques selon l'ordre ci-dessous :
- 16 pL d'échantillon Monomères ou d'échantillon Agrégats, - 2 pL d'anticorps Donneur - 2 pL d'anticorps Accepteur [0139] Les plaques ont ensuite été incubées une nuit à température ambiante.
[0140] La détection du signal de FRET dans les différentes plaques a été
réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
Pour toutes les paires d'anticorps testés, les signaux obtenus en FRET sur l'échantillon Monomères et sur l'échantillon Agrégats ont été comparés en calculant un rapport des signaux de FRET (Monomères / Agrégats), tel qu'illustré dans la Figure 7 avec la paire Ac1-Donneur / Ac4-Accepteur.
[0141] Le rapport des signaux de FRET (Monomères / Agrégats) a été calculé
pour toutes les paires d'anticorps testés. Le tableau 2 ci-dessous récapitule les résultats obtenus.
Toutes les paires d'anticorps présentant un rapport (Monomère / Agrégats) supérieur à 2 sont considérées sélectives de la TDP-43 NAFp vis-à-vis de la TDP-43 AFp.
[0142] [Table 2]
Donneur _____________________________ Acl Ac2 Ac3 Ac4 Ac5 Acl 5.5 1.0 1.1 4.2 Ac2 2.2 1.1 1.1 1.9 Ac3 1.1 0.9 1.1 1.0 al Ac4 6.0 1.3 1.0 2.9 Ac5 3.9 3.0 1.0 1.1 [0143] 7 paires d'anticorps ont permis de discriminer la TDP-43 NAFp de la TDP-43 AFp car elles présentent un rapport Monomère / Agrégats supérieur à 2. Elles sont listées dans le tableau 3.
[0144] [Table 3]
Donneur Accepteur Acl Ac2 Acl Ac4 Ad. Ac5 Ac2 Acl Ac2 Ac5 Ac5 Acl Ac5 Ac4 [0145] Exemple 3: Méthode permettant d'identifier des couples d'anticorps capable de se lier spécifiquemde 1-40 NAFI3 (Méthode FRET) [0146] La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF de Cisbio 5 Bioassays), comme détaillé dans l'exemple 1.
[0147] Paire d'anticorps testée [0148] Les anticorps dirigés contre le peptide beta amyloïde 1-40 marqués respectivement au Donneur et à l'Accepteur sont ceux contenus dans le kit Amyloid Beta 1-40 HTRF
commercialisé par Cisbio Bioassays (référence 62B4OPEG). Ils ont été dilués dans le 10 diluant référence 62RB3FDG tel que préconisé par le manuel du kit Amyloid Beta 1-40 HTRF.
[0149] Préparation de peptide beta amyloïde 1-40 NAFp (Monomères) [0150] Le peptide amyloïde beta 1-40 humain lyophilisé (ERI275BAS, The ERI
Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur 15 puis dilué en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30 pM.
La solution (ci-après échantillon Monomères ), contenant le peptide amyloïde beta 1-40 NAFP, a ensuite été congelée à -80 C. Un test à la Thioflavine T a été
réalisé sur cette solution. Il indique que celle-ci contient plus de 90% de monomères de peptide beta amyloïde 1-40.
20 [0151] Préparation de peptide beta amyloïde 1-40 AFP (Agrégats) [0152] Le peptide amyloïde beta 1-40 humain lyophilisé (ERI275BAS, The ERI
Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30pM.
Cette solution est ensuite incubée 495 heures à 25 C, ce qui permet d'agréger le peptide

25 beta amyloïde 1-40 pour obtenir le peptide beta amyloïde 1-40 AFP. La solution (ci-après échantillon Agrégats ), contenant le peptide beta amyloïde 1-40 AFp, a ensuite été
congelée à -80 C. Un test à la Thioflavine T a été réalisé sur cette solution.
Il indique que celle-ci contient plus de 90% d'agrégats de peptide beta amyloïde 1-40.
[0153] Test de la paire d'anticorps sur les Monomères ou les Agrégats [0154] Le jour du test, les échantillons Monomères et Agrégats ont été
décongelés puis dilués en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 20,3 ng/mL
avant distribution dans une microplaque 384 puits (Greiner référence 784075).
[0155] Les réactifs suivants ont été ajoutés dans les microplaques selon l'ordre ci-dessous :
- 5 pL d'échantillon Monomère ou d'échantillon Agrégat - 5 pL de diluant (Réf. 62DL1DDD, Cisbio Bioassays) - 5 pL d'anticorps Donneur - 5 pL d'anticorps Accepteur

26 [0156] Les plaques ont ensuite été incubées une nuit à une température comprise entre 2 C
et 8 C.
[0157] La détection du signal FRET dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Les signaux obtenus en FRET sur l'échantillon Monomères et sur l'échantillon Agrégats ont été comparés en calculant le rapport des signaux de FRET (Monomères /
Agrégats) tel que montré à la Figure 8.
[0158] Le rapport des signaux de FRET (Monomère / Agrégat) de la paire d'anticorps est supérieur à 2 (valeur de 3,1). Cela indique que cette paire d'anticorps discrimine le peptide beta amyloïde 1-40 NAFp du peptide beta amyloïde 1-40 AFE, c'est-à-dire que cette paire d'anticorps est spécifique du peptide beta amyloïde 1-40 NAFp.
[0159] Exemple 4: Méthode permettant d'identifier des couples d'anticorps capable de se lier spécifiquement au peptide amyloïde beta 1-42 NAFI3 (Méthode FRET) [0160] La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRFC) de Cisbio Bioassays), comme détaillé dans l'exemple 1.
[0161] Paire d'anticorps testée [0162] Deux anticorps dirigés contre le peptide amyloïde beta 1-42 marqués respectivement au Donneur et à l'Accepteur ont été dilués à des concentrations respectives de 3 nM
(Donneur) et 30 nM (Accepteur).
[0163] Préparation de peptide beta amyloïde 1-42 NAFp (Monomères) [0164] Le peptide amyloïde beta 1-42 humain lyophilisé (The ERI Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué
en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30 pM. La solution (ci-après échantillon Monomères ), contenant le peptide beta amyloïde 1-42 NAFp, a ensuite été congelée à -80 C. Un test à la Thioflavine T a été réalisé sur cette solution. Il indique que celle-ci contient plus de 90% de monomères de peptide beta amyloïde 1-42.
[0165] Préparation de peptide beta amyloïde 1-42 AFp (Agrégats) [0166] Le peptide amyloïde beta 1-42 humain lyophilisé (ERI275BAS, The ERI
Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué en tampon 10 nnM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 30 pM.
Cette solution est ensuite incubée 188 heures à 25 C. La solution (ci-après échantillon Agrégats ), contenant le peptide beta amyloïde 1-42 AFp, a ensuite été
congelée à -80 C. Un test à la Thioflavine T a été réalisé sur cette solution. Il indique que celle-ci contient plus de 90% d'agrégats de peptide beta amyloïde 1-42.
[0167] Test de la paire d'anticorps sur les Monomères ou les Agrégats

27 [0168] Le jour du test, les échantillons Monomère et Agrégat ont été
décongelés puis dilués en tampon 10 mM Sodium PhosphatE2,4 ng/mL avant distribution dans des microplaques 384 puits (Greiner référence 784075).
[0169] Les réactifs suivants ont été ajoutés dans les microplaques selon l'ordre ci-dessous :
- 16 pL d'échantillon Monomères ou d'échantillon Agrégats - 2 pL d'anticorps Donneur - 2 pL d'anticorps Accepteur [0170] Les plaques ont été incubées une nuit à température comprise entre 2 C
et 8 C.
[0171] La détection du signal FRET dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF. Le signal obtenu en FRET sur l'échantillon Monomères et sur l'échantillon Agrégats ont été
comparés en calculant le rapport des signaux de FRET (Monomère / Agrégats) tel que montré à la Figure 9.
[0172] Le rapport des signaux de FRET (Monomère / Agrégat) de la paire d'anticorps étudiée est supérieur à 2 (valeur de 4,5). Cela indique que cette paire d'anticorps discrimine la amyloïde beta 1-42 NAFB de la amyloïde beta 1-42 AFB, c'est-à-dire que cette paire d'anticorps est spécifique du peptide amyloïde beta 1 -42 NA93.
[0173] Exemple 5 : Test de l'effet du Hexafluoroisopropanol (HFIP) sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFI3 [0174] Le HFIP a été utilisé pur (100%) ou dilué dans du tampon de lyse pour obtenir des solutions à 20%, 10% et 2%.
[0175] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant:
1) 8 pL d'un échantillon de TDP-43 NAFB préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL des différentes solutions de HFIP à 100%, 20%, 10% et 2% ou de tampon de lyse supplémenté.
3) Ajout des réactifs de détection FRET :
- 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0176] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0177] La Figure 10 donne les signaux obtenus avec les différentes concentrations de HFIP
testées. Pour des concentrations supérieures à 2%, le HFIP diminue de plus de 75% le signal de détection du TDP-43 NAFB. Son effet éventuel sur les agrégats sera donc évalué dans ce format avec une concentration de 2%.

28 [0178]
Exemple 6 : Test du HFIP comme agent désagrégeant deTDP-43 AFP
1-01791 Le HFIP a été dilué dans du tamp à 2%.
[0180] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant:
1) 8 pL d'un échantillon de TDP-43 AFB préparé selon le protocole décrit à
l'exemple 2.
2) 8 pL d'une solution de HFIP à 2% ou de tampon de lyse.
3) Ajout des réactifs de détection FRET :
- 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0181] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0182] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :
[0183] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec le HFIP 2%) /
(Signal échantillon traité avec tampon de lyse).
[0184] La Figure 11 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à
1 (0.89) ce qui indique que le traitement au HFIP 2% n'augmente pas la détection du PNAFB dans l'échantillon contenant TDP-43 AFB. On peut en conclure que le traitement au HFIP 2% ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AFP.
[0185]
Exemple 7 : Test de l'effet de l'Urée sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAF8 [0186] L'urée a été diluée dans du tampon de lyse pour obtenir des solutions à
7M, 3,5M, 1,75 M et 0,88 M.
[0187] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant :
1) 8 pL d'un échantillon de TDP-43 NAF13 préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL des différentes solutions d'Urée à 7M, 3,5M, 1,75M et 0,88M ou de tampon de lyse.
3) Ajout des réactifs de détection FRET :
- 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0188] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.

29 [0189] La Figure 12 donne les signaux obtenus avec les différentes concentrations d'Urée testées. Pour des concentrations supé plus de 75% le signal de détection du TDP-43 NAF13. Son effet éventuel sur les agrégats sera donc évalué dans ce format avec des concentrations inférieures ou égales à 3,5M.
[0190] Exemple 8 : Test de l'Urée comme agent désagrégeant de TDP-43 [0191] L'urée a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à
3,5 NI, 1,75 M et 0,88 M.
[0192] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant :
1) 8 pL d'un échantillon de TDP-43 AFB préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL d'une solution d'Urée aux différents concentrations (3,5 M, 1,75 M et 0,88 M) ou de tampon de lyse.
3) Ajout des réactifs de détection FRET :
- 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
- 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0193] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0194] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :
[0195] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec l'Urée 3,5M) /
(Signal échantillon traité avec tampon de lyse supplémenté).
[0196] La Figure 13 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à
1 pour toutes les concentrations d'Urée testées ce qui indique que ces traitements n'augmentent pas la détection de TDP-43 PNAFB dans l'échantillon agrégat. On peut en conclure qu'un traitement avec des concentrations d'Urée inférieures ou égales à 3,5M
ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AFB.
[0197] Exemple 9 : Test de l'effet du chlorure de Guanidinium sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFI3 [0198] Le Chlorure de Guanidinium a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 6 M, 3 M et 1,5 M.
[0199] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant :

1) 8 pL d'un échantillon de TDP-43 NAFB préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL des différentes solutions de 01 et 1,5 M ou de tampon de lyse supplémenté.
3) Ajout des réactifs de détection FRET :
5 - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0200] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.

[0201] La Figure 14 donne les signaux obtenus avec les différentes concentrations de Chlorure de Guanidinium testées. Quelle que soit sa concentration, le Chlorure de Guanidinium diminue de plus de 75% le signal de détection de TDP-43 NAFB. Son effet éventuel sur les agrégats ne pourra donc pas être évalué dans ce format car ce composé
empêche la détection de TDP-43 NAFB.
15 [0202]
Exemple 10 : Test de l'effet l'Acide Formique (AF) et l'Acide Trifluoroacétique (TFA) sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFI3 [0203] L'AF et le TFA ont été dilués dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à 20%, 10% et 2%.

[0204] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant:
1) 8pL d'un TDP-43 NAFB préparé selon le protocole décrit à l'Exemple 2.
2) 8pL des différentes solutions de d'AF ou de TFA à 20%, 10% et 2% ou de tampon de lyse supplémenté.
25 3) Ajout des réactifs de détection FRET :
- 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0205] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS

30 Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0206] La Figure 15 donne les signaux obtenus avec les différentes concentrations d'AF ou de TFA testées. Quelle que soit leurs concentrations, ces réactifs diminuent de plus de 75% le signal de détection du TDP-43 NAFB. Leur effet éventuel sur les agrégats ne pourra donc pas être évalué dans ce format car ils empêchent la détection de NAFB.
[0207]
Exemple 11 : Test de l'effet de l'acide formique (AF) suivi d'une neutralisation au NaOH sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAM

31 [0208] L'AF a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à
20%.
[0209] Le NaOH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N
[0210] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l'ordre suivant:
1) 60 pL d'un échantillon de TDP-43 NAFp préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL d'une solution d'AF à 20% ou de tampon de lyse supplémenté. Le mélange a été
incubé 15 minutes à température ambiante. Le pH mesuré à cette étape est égal à 2,5.
3) 9 pL d'une solution de NaOH 5N ou de tampon de lyse supplémenté. Le pH
mesuré
après ces ajouts est égal à 7,6.
[0211] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Acl Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0212] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0213] La Figure 16 compare le signal de détection de la PNAFp obtenu avec le traitement AF puis NaOH avec celui obtenu en absence de traitement. Le traitement provoque une disparition quasi-totale du signal de détection de TDP-43 NAFp. Leur effet éventuel sur la désagrégation de TDP-43 AFp ne pourra donc pas être évalué.
[0214] Exemple 12 : Test de l'effet de l'Acide Trifluoroacétique (TFA) suivi d'une neutralisation au NaOH sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAM
[0215] Le TFA a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à
20%.
[0216] Le NaOH a été dilué dans un tampon HEPES 450 mM pour obtenir une solution 5N.
[0217] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l'ordre suivant:
1) 60 pL d'un échantillon de TDP-43 NAFP préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL d'une solution de TFA à 20% ou de tampon de lyse supplémenté. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. Le pH mesuré à cette étape est égal à
0,6.
3) 4,5 pL d'une solution de NaOH 5N ou de tampon de lyse supplémenté. Le pH
mesuré
après cet ajout est égal à 7,5.

32 [0218] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajo avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0219] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0220] La Figure 17 compare le signal de détection de la PNAFp obtenu avec le traitement TFA puis NaOH avec celui obtenu en absence de traitement. Même si ce traitement affecte significativement le signal de détection de TDP-43 NAFp (-62%), le signal restant permet de tester celui-ci sur la désagrégation de la TDP-43 AFp.
[0221] Exemple 13 : Test de l'effet de l'Acide Trifluoroacétique (TFA) suivi d'une neutralisation au NaOH comme agent désagrégeant de TDP-43 AF13 [0222] Le TFA a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à
20%.
[0223] Le NaOH a été dilué dans un tampon HEPES 450 mM pour obtenir une solution 5 N.
[0224] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l'ordre suivant:
1) 60 pl d'un échantillon de TDP-43 AFp préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL d'une solution de TFA à 20% ou d'un mélange TFA/NaOH (obtenu en mélangeant 8 volumes d'une solution de TFA 20% avec 4.5 volumes d'une solution de NaOH 5N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante.
3) 4,5 pL d'une solution de NaOH 5N ou d'un mélange TFA/NaOH. Le pH mesuré
après cet ajout est égal à 7,5.
[0225] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0226] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0227] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :
[0228] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec TFA 20% puis NaOH
5N) / (Signal échantillon traité avec le mélange TFA/NaOH).

33 [0229] La Figure 18 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à
1 (0,56) ce qui indique que le traiterrde TDP-43 NAFB
dans l'échantillon agrégat. On peut en conclure que le traitement au TFA 20%
suivi d'une neutralisation au NaOH ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AFB.
[0230] Exemple 14 : Test de l'effet de l'acide formique (AF) suivi d'une neutralisation au NH4OH sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFI3 [0231] L'AF a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à
20%.
[0232] Le NH4OH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N.
[0233] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l'ordre suivant:
1) 60 pL d'un échantillon de TDP-43 NAFB préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL d'une solution d'AF à 20% ou de tampon de lyse supplémenté. Le mélange a été
incubé 15 minutes à température ambiante. Le pH mesuré à cette étape est égal à 2,5.
3) 12 pL d'une solution de NH4OH 5N. Le pH mesuré après cet ajout est égal à
7,2.
[0234] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0235] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0236] La Figure 19 compare le signal de détection de TDP-43 NAFB obtenu avec le traitement AF puis NH4OH avec celui obtenu en absence de traitement. Même si ce traitement affecte significativement le signal de détection de la TDP-43 NAFB
(-68%), le signal restant permet de tester celui-ci sur la désagrégation de TDP-43 AF.
[0237] Exemple 15 : Test de l'effet de l'acide formique (AF) suivi d'une neutralisation au NH4OH comme agent désagrégeant de TDP-43 AFI3 [0238] L'AF a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à
20%.
[0239] Le NI-140H a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N
Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l'ordre suivant:
1) 60 pL d'un échantillon de TDP-43 AFB préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2

34 2) 8 pL d'une solution d'AF à 20% ou d'un mélange AF/ NH4OH (obtenu en mélangeant 8 volumes d'une solution de TFA 20%e NH4OH 5N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante.
3) 12 pL d'une solution de NH4OH 5N ou d'un mélange AF/ NH4OH. Le pH mesuré
après cet ajout est égal à 7,2.
[0240] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0241] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0242] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :
[0243] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec AF 20% puis NH4OH
5N) / (Signal échantillon traité avec le mélange AF/NH4OH).
[0244] La Figure 20 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à
1 (0,78) ce qui indique que le traitement n'augmente pas la détection de TDP-dans l'échantillon agrégat. On peut en conclure que le traitement à l'AF 20%
suivi d'une neutralisation au NH4OH ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-AFB.
[0245] Exemple 16 : Test de l'effet de l'acide trifluoroacétique (TFA) suivi d'une neutralisation au NH4OH sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAM
[0246] Le TFA a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à
20%.
[0247] Le NH4OH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N.
[0248] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l'ordre suivant:
1) 60 pL d'un échantillon de TDP-43 NAFB préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
2) 8 pL d'une solution de TFA à 20% ou de tampon de lyse supplémenté. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante. Le pH mesuré à cette étape est égal à
0,6.
3) 7 pL d'une solution de NH4OH 5N. Le pH mesuré après cet ajout est égal à
7,5.

[0249] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajo avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 5 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0250] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0251] La Figure 21 compare le signal de détection de la PNAFP obtenu avec le traitement TFA puis NH4OH avec celui obtenu en absence de traitement. Même si ce traitement affecte significativement le signal de détection de TDP-43 NAF13 (-72%), le signal restant permet de tester celui-ci sur la désagrégation de TDP-43 AFB.
[0252]
Exemple 17 : Test de l'effet de l'acide trifluoroacétique (TFA) suivi d'une neutralisation au NH4OH comme agent désagrégeant de TDP-43 AFI3 [0253] Le TFA a été dilué dans du tampon de lyse supplémenté pour obtenir des solutions à
20%.
[0254] Le NH4OH a été dilué dans un tampon HEPES 450mM pour obtenir une solution 5N.
Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l'ordre suivant:
1) 60 pL d'un échantillon de TDP-43 AFP préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2 2) 8 pL d'une solution de TFA à 20% ou d'un mélange TFA/NH4OH (obtenu en mélangeant 8 volumes d'une solution de TFA 20% avec 7 volumes d'une solution de NH4OH 5N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante.
3) 7 pl d'une solution de NH4OH 5N ou d'un mélange TFA/ NH4OH. Le pH mesuré
après cet ajout est égal à 7,5.

[0255] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.

[0256] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0257] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :

35 [0258] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec TFA 20% puis NH4OH
5N) /
(Signal échantillon traité avec le mélange TFA/NH4OH).

36 [0259] La Figure 22 donne les résultats obtenus. Le ratio des signaux est inférieur ou égal à
1 (0,42) ce qui indique que le traiterrde TDP-43 NAFI3 dans l'échantillon agrégat. On peut en conclure que le traitement au TFA 20%
suivi d'une neutralisation au NH4OH ne permet pas de désagréger, même partiellement, TDP-43 AF13.
[0260] Exemple 18 : effet de solutions de NaOH donnant des pH
compris entre 8,2 et 13,3 suivi d'une neutralisation au HCI sur la méthode utilisant les réactifs de détection de TDP-43 NAFI3 [0261] Solutions de NaOH testées [0262] [Table 4]
Condition Solution NaOH pH mesuré après ajout sur l'échantillon de TDP-43 NAF13 A 0,5N 8,2 0,6N 8,5 0,8N 9,6 D 1,2N 12,8 2,4N 13,2 5N 13,3 [0263] Solutions de HCI testées [0264] [Table 5]
Condition Solution HCI
A 0,34N
0,34N
0,5N

[0265] Mélanges NaOH/HCI testés (obtenus en mélangeant un volume identique d'une solution de NaOH et d'une solution de HCI) [0266] [Table 6]
pH mesuré après ajout sur l'échantillon de Condition Solution NaOH Solution HCI TDP-43 NAFI3 A 0,5N 0,34N 7,6 0,6N 0,34N 7,4 0,8N 0,5N 7,4 D 1,2N 1N 7,2 2,4N 2N 7,4

37 [0267] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits:
- 60 pL d'un échantillon de TDP-43 NAit à l'Exemple 2.
- 10 pL des différentes solutions de NaOH (A, B, C, D, E ou F) ou de tampon. Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante.
- 10 pL des différentes solutions de HCI (A, 6, C, D, E ou F) ou de tampon.
[0268] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0269] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0270] La Figure 23 montre les résultats obtenus avec les différentes modes de traitement.
Le traitement avec une solution de NaOH aboutissant à un pH de 13.3 suivi d'une neutralisation à l'HCI ne permet pas de détecter TDP-43 NA93. Le pouvoir désagrégeant de toutes les autres solutions a pu être testé sur TDP-43 AF[3.
[0271] Exemple 19 : détermination du pH minimum et maximum pour désagréger TDP-43 AF13 avec NaOH
[0272] Solutions de NaOH testées [0273] [Table 7]
Condition Solution NaOH pH mesuré après ajout sur l'échantillon de TDP-43 AFP
A 0,5N 8,2 0,6N 8,5 0,8N 9,6 D 1,2N 12,8 2,4N 13,2 [0274] Solutions de HCI testées [0275] [Table 8]
Condition Solution HCI
A 0,34N
0,34N
0,5N

38 [0276] Mélanges NaOH/HCI testés (obtenus en mélangeant un volume identique d'une solution de NaOH et d'une solution de [0277] [Table 9]
pH mesuré après ajout sur l'échantillon de Condition Solution NaOH Solution HCI TDP-43 AFf3 A 0,5N 0,34N 7,6 0,6N 0,34N 7,4 0,8N 0,5N 7,4 D 1,2N 1N 7,2 2,4N 2N 7,4 [0278] Les réactifs suivants ont été distribués Dans une plaque 96 puits:
- 60 pL d'un échantillon de TDP-43 AF13 préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
- 10 pL des différentes solutions de NaOH (A, B, C, D ou E) ou des mélanges NaOH/HCI
correspondants (A, B, C, D ou E). Le mélange a été incubé 15 minutes à
température ambiante.
- 10 pL des différentes solutions de HCI (A, B, C, D, E) ou des mélanges NaOH/HCI
correspondants (A, B, C, D, E).
[0279] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0280] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0281] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :
[0282] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec NaOH puis HCI) /
(Signal échantillon traité avec mélange NaOH/HCI).
[0283] La Figure 24 montre les résultats obtenus en fonction du pH induit par les différentes solutions de NaOH testées. La détection de TDP-43 NAF13 est possible lorsque le pH va de 8,5 à 13,2 durant l'étape de désagrégation. Toutefois, le pH permettant d'avoir une amplitude optimale de détection de TDP-43 NA93 est d'environ pH 12,8.
[0284]
Exemple 20 : détermination du temps nécessaire pour désagréger TDP-43 AFI3 à un pH de 12,8 [0285] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 96 puits dans l'ordre suivant:
1) 60 pL d'un échantillon de TDP-43 AF113 préparé selon le protocole décrit à
l'exemple 2

39 2) 10 pL d'une solution de NaOH à 1,2N (pH de l'échantillon porté à 12,8) ou d'un mélange NaOH/HCI (obtenu en mélançolution de NaOH
à 1,2N et d'une solution de HCI à 1N). Le mélange a été incubé entre 30 secondes et 1h à température ambiante selon les puits.
3) 10 pL d'une solution de HCI à 1N (pH de l'échantillon porté à 7,5) dans les puits traités avec NaOH à 1,2N ou 10 pL du mélange NaOH/HCI dans les puits traités avec le mélange NaOH/HCI.
[0286] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0287] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0288] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :
[0289] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec NaOH à 1,2N puis HCI à 1N) /
(Signal échantillon traité avec mélange NaOH/HCI).
[0290] La Figure 25 donne les résultats obtenus en fonction du temps de contact avec NaOH à 1,2N. Les résultats montrent que le traitement au NaOH à 1,2N a permis de désagréger au moins partiellement TDP-43 AFB indépendamment du temps de contact (ratio des signaux toujours supérieur à 1. Toutefois, la meilleure désagrégation a été
obtenue pour des temps de contact allant de 5 minutes à 30 minutes.
[0291] Exemple 21 : détermination du pH minimum et maximum lors de la mesure la détection de TDP-43 NAFI3 [0292] Solutions de NaOH testées [0293] Solution de NaOH à 1,2N (permet de porter le pH de l'échantillon à
12,8) [0294] Solutions de HCI testées [0295] [Table 10]
Condition Solution HCI
A 1,4N
B 1,3N
C 1,2N

E 0,7N
F 0,6N
G 0,5N
H 0,4N
I 0,3N

[0296] Mélanges NaOH/HCI testés (obtenus en mélangeant un volume identique d'une solution de NaOH et d'une solution de [0297] [Table 11]
pH mesuré après ajout sur l'échantillon de Condition Solution NaOH Solution HCI TDP-43 AFp A 1,2N 1,4N 5,7 1,2N 1,3N 6 1,2N 1,2N 6,4 D 1,2N 1N 7,2 1,2N 0,7N 8 1,2N 0,6N 8,4 G 1,2N 0,5N 10,4 H 1,2N 0,4N 11,2 1,2N 0,3N 12,8 5 [0298] Les réactifs suivants ont été distribués Dans une plaque 96 puits:
- 60 pL d'un échantillon de TDP-43 AFp préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
- 10 pL des différentes solutions de NaOH à 1,2N ou des mélanges NaOH/HCI
correspondants (A, B, C, D, E, F, G, H ou I). Le mélange a été incubé 15 minutes à
température ambiante.
10 - 10 pL des différentes solutions de HCI (A, B, C, D, E, F, G, H ou I ) ou des mélanges NaOH/HCI correspondants (A, B, C, D, E, F, G, H ou I).
[0299] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits 15 - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0300] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
20 [0301] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :
[0302] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec NaOH à 1,2N puis HCI) / (Signal échantillon traité avec mélange NaOH/HCI).
[0303] La Figure 26 montre que la TDP-43 NAFp peut être détecté après traitement à
25 pH=12,8 lorsque le pH est ensuite ramené entre pH=6 et pH=10,5. La détection est optimale lorsque le pH est compris entre 6 et 8,5.

[0304] Exemple 22 : mesure du niveau d'agrégation d'un peptide béta amyloïde 1-42 en utilisant le Pigeant et l'HCI
comme agent neutralisant [0305] La méthode décrite ci-dessous est basée sur la technologie HTRF (voir Exemple 1 pour principe).
[0306] Les solutions de NaOH 1,2N et d'HCI 1N ont été préparées comme décrit dans les exemples précédents.
[0307] Préparation d'échantillons contenant du peptide amyloïde beta 1-42 mononnérique (1-42 NAFB) ou agrégé (1-42 AFB) : le peptide amyloïde beta 1-42 humain lyophilisé
(ERI275BAS, The ERI Amyloid Laboratory, LLC, Oxford) a été re-suspendu selon les recommandations du fournisseur puis dilué en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH
7,4 à une concentration de 30 pM (1-42 NAFB). Une solution identique de peptide amyloïde beta 1-42 est incubée 188 heures à 25 C pour obtenir du 1-42 AFp. Les 2 échantillons ont été congelés à -80 C avant utilisation future. Avant utilisation, le niveau d'agrégation des 2 échantillons a été contrôlé par la méthode à la Thioflavine T.
[0308] Le jour du test, les échantillons 1-42 NAFp et 1-42 AFB ont été
décongelés puis dilués en tampon 10 mM Sodium Phosphate pH 7,4 à une concentration de 2,4 ng/mL
avant distribution dans la microplaque.
[0309] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant:
1) 12 pL d'un échantillon de 1-42 AFB ou d'un échantillon de 1-42 NAFB.
2) 2 pL d'une solution de NaOH à 1,2N ou d'un mélange NaOH/HCI (obtenu en mélangeant un volume identique d'une solution de NaOH à 1,2N et d'une solution de HCI
à 1N). Le mélange a été incubé 15 minutes à température ambiante.
3) 2 pL d'une solution de HCI à 1N ou d'un mélange NaOH/HCI.
4) Ajout des réactifs de détection FRET :
- 2 pL d'anticorps Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 4.
- 2 pL d'anticorps Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 4.
[0310] Les plaques ont été incubées une nuit à température comprise entre 2 C
et 8 C.
[0311] La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0312] Le Ratio d'Agrégation est calculé comme suit à partir des signaux HTRF
obtenus sur les échantillons :
[0313] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité NaOH 1.2N puis HCI 1N) /
(Signal échantillon traité avec le mélange NaOH/HCI).
[0314] La Figure 27 montre les ratios de signaux obtenus avec les échantillons 1-42 NAFB et 1-42 AFB. Le ratio de signal obtenu sur l'échantillon 1-42 AFB est très supérieur à celui obtenu sur l'échantillon 1-42 NAFP. Ce résultat nous indique que la méthode est capable de mesurer le niveau d'agrégation du [0315] Exemple 23 : Effet d'un traitement au NaOH, à l'hydroxyde de potassium (KOH) ou au NH4OH suivi d'une neutralisation à l'HCI sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAF13 [0316] Préparation de solutions de NaOH, de KOH, de NH4OH et de HCI pour traiter des lysats de TDP43-AFp [0317] [Table 12]
Condition Solution de base pH mesuré
après ajout sur l'échantillon de TDP-43 NAFp A NaOH 1,2N 12,8 KOH 1,2N 12,5 NH4OH 10N 10,9 D NaOH 1,2N 9,6 NH4OH 1,2N 9,6 [0318] Solutions de HCI testées [0319] [Table 13]
Condition Solution HCI pH mesuré après ajout sur l'échantillon de TDP-43 NAFp A 1N 7,2 0,67N 7,5 6,6N 7,4 D 0,5N 7,4 0,5N 7,6 [0320] Mélanges Bases/HCI testés (obtenus en mélangeant un volume identique d'une solution de NaOH et d'une solution de HCI).
[0321] [Table 14]
Condition Solution de base Solution HCI
pH mesuré après ajout sur l'échantillon de TDP-43 NAFp A NaOH 1,2N 1N 7,2 KOH 1,2N 0,67N 7,5 NH4OH 10N 6,6N 7,4 D NaOH 1,2N 0,5N 7,4 NI-140H 1,2N 0,5N 7,6 [0322] Les réactifs suivants ont été distribués Dans une plaque 96 puits:
- 60 pL d'un échantillon de TDP-43 NFrit à l'exemple 2.
- 10 pL des différentes solutions de Bases (A, B, C, D ou E) ou des mélanges Bases/HCI
correspondants (A, B, C, D ou E). Le mélange a été incubé 15 minutes à
température ambiante.
- 10 pL des différentes solutions de HCI (A, B, C, D, E) ou des mélanges Bases/HCI
correspondants (A, B, C, D, E).
[0323] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0324] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0325] La Figure 28 montre les signaux de détection de TDP-NAFB obtenus avec les différents traitements. La détection de TDP-43 NAFB est possible quelles que soient les bases utilisées lorsqu'une étape de neutralisation au HCI permettant d'avoir un pH
compris entre 7 et 8 est réalisée. L'effet désagrégeant de ces bases sera donc testés sur TDP-43 A193.
[0326] Exemple 24 : Effet d'un traitement au NaOH, à l'hydroxyde de potassium (KOH) ou au NH4OH suivi d'une neutralisation à l'HCI sur la désagrégation de TDP-43 A93 [0327] Préparation de solutions de NaOH, de KOH, de NH4OH et de HCI pour traiter des lysats de TDP43-AFB
[0328] [Table 15]
Condition Solution de base pH mesuré après ajout sur l'échantillon de TDP-43 AFB
A NaOH 1,2N 12,8 KOH 1,2N 12,5 NH4OH 10N 10,9 D NaOH 1,2N 9,6 NH4OH 1,2N 9,6 [0329] Solutions de HCI testées [0330] [Table 16]
.1 Condition 1 Solution HCI
sur l'échantillon de TDP-43 AF8 A 1N 7,2 0,67N 7,5 6,6N 7,4 D 0,5N 7,4 0,5N 7,6 [0331] Mélanges Bases/HCI testés (obtenus en mélangeant un volume identique d'une solution de NaOH et d'une solution de HCI) [0332] [Table 17]
Condition Solution de base Solution HCI pH mesuré après ajout sur l'échantillon de TDP-43 AF[3 A NaOH 1,2N 1N 7,2 KOH 1,2N 0,67N 7,5 NH4OH 10N 6,6N 7,4 D NaOH 1,2N 0,5N 7,4 NH4OH 1,2N 0,5N 7,6 [0333] Les réactifs suivants ont été distribués Dans une plaque 96 puits:
- 60 pL d'un échantillon de TDP-43 AFP préparé selon le protocole décrit à
l'Exemple 2.
- 10 pL des différentes solutions de Bases (A, B, C, D ou E) ou des mélanges Bases/HCI
correspondants (A, B, C, D ou E). Le mélange a été incubé 15 minutes à
température ambiante.
- 10 pL des différentes solutions de HCI (A, B, C, D, E) ou des mélanges Bases/HCI
correspondants (A, B, C, D, E).
[0334] Une partie du volume contenu dans les puits de la plaque 96 puits a été
transféré
dans une plaque 384 puits avant d'ajouter les réactifs de détection FRET avec :
- 16 pL du mélange issu de la plaque 96 puits - 2 pL d'anticorps Ac1 Donneur préparé comme décrit à l'Exemple 2 - 2 pL d'anticorps Ac2 Accepteur préparé comme décrit à l'Exemple 2.
[0335] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS
Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0336] Le Ratio des signaux obtenus a été calculé comme suit à partir des signaux FRET
obtenus sur les échantillons :

[0337] Ratio des signaux = (Signal échantillon traité avec Base puis HCI) /
(Signal échantillon traité avec mélange Base/F
[0338] La Figure 29 montre le ratio des signaux obtenus avec les différents traitements. Les deux conditions de traitement au NaOH (1,2N et 0.8N), donnant respectivement des pH
5 de 12,8 et 9,6, permettent de détecter TDP43-NAFp confirmant leur effet désagrégeant sur TDP-43 AFp. Le traitement au KOH 1,2N (pH=12,5) permet une faible détection de TDP43-NAF13 montrant un faible effet désagrégeant de TDP-43 AFp. Les 2 traitements au NH4OH (10N et 1,2N) qui donnent des pH similaires aux traitements au NaOH ne permettent pas de détecter TDP43-NAFp. Ce résultat montre que le NH4OH n'a aucun 10 effet désagrégeant de TDP-43 AFp.
[0339] Exemple 25: Méthode permettant d'identifier des paires d'anticorps capables de se lier spécifiquement à l'Alpha-Synucléine NAFI3 (Alpha-Syn NAM) [0340] La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF de Cisbio 15 Bioassays), comme détaillé à l'Exemple 1.
[0341] Paire d'anticorps testée [0342] Une paire d'anticorps dirigée contre l'Alpha-Synucléine marquée respectivement au Donneur et à l'Accepteur est celle contenue dans le kit HTRF Total-Alpha-Synuclein commercialisée par Cisbio Bioassays (réf. 6FNSYPEG). Chaque anticorps a été
dilué dans 20 le diluant du kit tel que préconisé par le manuel d'utilisation.
[0343] Préparation d'échantillons dA/pha-Syn NA93 et d'Alpha-Syn N'AFP
L'Alpha-Syn NAFp et l'Alpha-Syn AFp ont été obtenues auprès de la société
StressMarq (StressMarq Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Monomer, ref SPR-325 et Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Preformed 25 Fibrils Type 1 réf. SPR-326). Elles ont été diluées à 15,6ng/mL dans le tampon de lyse du kit HTRF Total-A Synuclein.
[0344] Test de /a paire d'anticorps sur A/pha-Syn NAFI3 et Alpha-Syn AFI3 Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant:
1) 12 pL d'Alpha-Syn NAFp ou d'Alpha-Syn AFp à 15,6ng/mL
30 2) 2 pL de tampon de lyse. Le mélange a été incubé 15 minutes à
température ambiante.
3) 2 pL de tampon de lyse.
4) 2 pL d'anticorps Donneur.
5) 2 pL d'anticorps Accepteur.
35 [0345] La détection du signal FRET dans les différentes plaques été
réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.

[0346] Les signaux obtenus en FRET sur l'échantillon Alpha-Syn NA193 (Monomères) et sur l'échantillon Alpha-Syn AFP (Agrégatt le rapport des signaux de FRET (Monomères/Agrégats) tel que montré à la Figure 30.
[0347] Le rapport des signaux de FRET (Monomère / Agrégat) de la paire d'anticorps est supérieur à 2 (valeur de 6,64). Cela indique que cette paire d'anticorps est capable de lier spécifiquement l'Alpha-Syn NAF[3 par rapport à l'Alpha-Syn AF[3.
[0348]
Exemple 26 : effet d'une solution de NaOH 1.2N suivi d'une neutralisation au HCI 1N sur la capacité de détection d'une méthode utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement à l'Alpha-Syn NAF13 [0349] L'Alpha-Syn NAF13 (StressMarq, Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Monomer, réf. SPR-326) a été dilué dans le tampon de lyse du kit HTRF Total-Alpha Synuclein (Cisbio Bioassays, réf. 6FNSYPEG) à 15,6ng/mL. Les anticorps donneur et accepteur du kit HTRF Total-A Synuclein ont été dilués comme recommandé par le fournisseur dans le manuel du kit.
[0350] Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant:
1) 12 pL d'Alpha-Syn NAF13 à 15,6 ng/mL
2) 2 pL d'une solution de NaOH à 1,2N (pH de l'échantillon porté à 12,8) ou d'un mélange NaOH/HCI (obtenu en mélangeant un volume identique d'une solution de NaOH
à 1,2N et d'une solution de HCI à 1N). Le mélange a été incubé 15 minutes à
température ambiante.
3) 2 pL d'une solution de HCI à 1N (pH de l'échantillon porté à 7,5) dans les puits traités avec NaOH à 1,2N ou 2pL du mélange NaOH/HCI dans les puits traités avec le mélange NaOH/HCI.
4) 2 pL d'anticorps Donneur préparé comme décrit dans l'exemple 25 5) 2 pL d'anticorps Accepteur préparé comme décrit dans l'exemple 25 [0351] Les plaques ont été incubées une nuit à température ambiante. La détection du signal HTRF dans les différentes plaques été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0352] La Figure 31 donne les résultats obtenus. Ils montrent que le traitement au NaOH à
1,2N suivi d'une neutralisation au HCI 1N affecte peu la détection de l'Alpha-Syn NAFF3 par les anticorps. L'effet de ce traitement pour désagréger l'Alpha-Syn AFP
pourra donc être évalué.
[0353]
Exemple 27 : mesure du niveau d'agrégation de l'Alpha-Synucléine en utilisant le NaOH comme Agent Désagrégeant et l'HCI comme Agent Neutralisant [0354] La méthode est basée sur la technologie FRET (Technologie HTRF de Cisbio Bioassays), comme détaillé à l'Exemple 1.

[0355] Paire d'anticorps testée I-03561 Les anticorps dirigés contre l'Alphaent au Donneur et à l'Accepteur sont ceux contenus dans le kit HTRF Total-Alpha-Synuclein commercialisé par Cisbio Bioassays (réf. 6FNSYPEG). Ils ont été dilués dans le diluant du kit tel que préconisé par le manuel d'utilisation.
[0357] Préparation d'échantillons d'Alpha-Syn NAFI3 et d'Alpha-Syn NAi93 [0358] L'Alpha-Syn NAFp et l'Alpha-Syn AFp ont été obtenues auprès de la société
StressMarq (StressMarq Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Monomer, ref SPR-325 et Active Human recombinant A53T Mutant Alpha Synuclein Protein Preformed Fibrils Type 1 ref SPR-326). Elles ont été diluées à 15.6 ng/mL dans le tampon de lyse du kit HTRF Total-Alpha Synuclein.
[0359] Test de la paire d'anticorps sur Alpha-Syn NAFI3 et Alpha-Syn )4F3 Les réactifs suivants ont été distribués dans une plaque 384 puits dans l'ordre suivant:
1) 12 pL d'Alpha-Syn NAFp ou d'Alpha-Syn AFp à 15,6 ng/mL
2) 2 pL d'une solution de NaOH à 1,2N (pH de l'échantillon porté à 12,8) ou d'un mélange NaOH/HCI (obtenu en mélangeant un volume identique d'une solution de NaOH
à 1,2N et d'une solution de HCI à 1N). Le mélange a été incubé 15 minutes à
température ambiante.
3) 2 pL d'une solution de HCI à 1N (pH de l'échantillon porté à 7,5) dans les puits traités avec NaOH à 1,2N ou 2 pL du mélange NaOH/HCI dans les puits traités avec le mélange NaOH/HCI.
4) 2 pL d'anticorps Donneur.
5) 2 pL d'anticorps Accepteur.
[0360] La détection du signal FRET dans les différentes plaques a été réalisée sur un appareil PHERAstar FS Lamp (BMG Labtech) en utilisant un module de détection HTRF.
[0361] La Figure 32 montre les ratios de signaux obtenus avec les échantillons d'Alpha-Syn NAFp et d'Alpha-Syn AFp. Le ratio de signal obtenu sur l'échantillon d'Alpha-Syn AFp est très supérieur à celui obtenu sur l'échantillon d'Alpha-Syn NAFp. Ce résultat nous indique que la méthode selon l'invention permet de mesurer le niveau d'agrégation de l'Alpha-Brève description des dessins - -[Fid._1] La Figure 1 illustre le principe dé La comparaison -des teneurs en PNAFp (Ratio des signaux) permet donc de savoir si l'échantillon testé
comprend une PAFp. Le ratio des signaux pour un échantillon ne comprenant pas de PAFP sera égal à 1. Le ratio des signaux pour un échantillon comprenant des PAFp sera supérieur à 1.
[Fig. 2] La Figure 2 représente le signal ELISA (DØ) obtenu pour différentes dilutions de PNAFp. La valeur de D.O. correspondant à 80% du signal maximum permet de déterminer la dilution de référence à utiliser dans la suite de l'expérience.
[Fig. 3] La Figure 3 représente les résultats obtenus dans un test ELISA
visant à
déterminer si une paire d'anticorps reconnait sélectivement ou non une PNAFP.
A) paire d'anticorps non sélective d'une PNAFP. B) paire d'anticorps sélective d'une PNAFP.
[Fig. 4] La Figure 4 représente le principe d'un immunoessai HTRF. Ce type d'immunoessai permet de savoir si deux anticorps, respectivement marqués au Donneur et à
l'Accepteur sont capables de créer une paire d'anticorps capables de reconnaitre simultanément un antigène d'intérêt. A) les 2 anticorps testés ne sont pas capables de créer une paire d'anticorps capable de reconnaitre l'antigène d'intérêt ; il n'y a pas de transfert d'énergie entre le Donneur et l'Accepteur et donc aucun signal de fluorescence émis par l'Accepteur. B) Les deux anticorps testés sont capables de reconnaitre simultanément l'antigène d'intérêt. Un transfert d'énergie se produit alors entre le Donneur et l'Accepteur. Il en résulte une émission de fluorescence spécifique à 665 nm qui est émise par l'accepteur.
[Fig. 5] La Figure 5 représente le signal HTRF obtenu pour différentes dilutions de PNAFP.
La valeur de signal HTRF correspondant à 80% du signal maximum permet de déterminer la dilution de référence à utiliser dans la suite de l'expérience.
[Fig. 6] La Figure 6 représente les résultats obtenus dans un test HTRF visant à déterminer si une paire d'anticorps reconnait sélectivement ou non une PNAFp. A) paire d'anticorps non sélective d'une PNAFp. B) paire d'anticorps sélective d'une PNAFp.
[Fig. 7] La Figure 7 représente le calcul du rapport des signaux entre un échantillon agrégat TDP-43 AFp et un échantillon monomère TDP-43 NAFp obtenu avec une paire d'anticorps dirigée contre la protéine TDP-43. Un rapport de signaux supérieur à 2 indique que la paire testée est sélective de TDP-43 NAFp.
[Fig. 8] La Figure 8 représente le calcul du rapport des signaux entre un échantillon agrégat de peptide amyloïde beta 1-40 et un échantillon monomère de ce même peptide obtenu avec une paire d'anticorps dirigée contre le peptide amyloïde beta 1-

40. La valeur du rapport des signaux supérieure à 2 indique que la paire testée est sélective du peptide amyloïde 1-40 NAFp (forme monomérique).

[Fig. 9] La Figure 9 représente le calcul du rapport des signaux entre un échantillon agrégat de peptide amyloïde beta 1-4e même peptide obtenu avec une paire d'anticorps dirigée contre le peptide amyloïde beta 1-42. La valeur du rapport des signaux supérieure à 2 indique que la paire testée est sélective du peptide amyloïde 1-42 NAFp (forme monomérique).
[Fig. 10] La Figure 10 représente l'effet de l'Hexafluoroisopropanol (HFIP) sur la capacité
de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
[Fig. 11] La Figure 11 représente l'absence d'effet désagrégeant de l'Hexafluoroisopropanol (HFIP) sur un échantillon de TDP-43 AFp.
[Fig. 12] La Figure 12 représente l'effet de l'Urée sur la capacité de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
[Fig. 13] La Figure 13 représente l'absence d'effet désagrégeant de l'Urée sur un échantillon de TDP-43 AFp.
[Fig. 14] La Figure 14 représente l'effet du Chlorure de Guanidinium sur la capacité de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
[Fig. 15] La Figure 15 représente l'effet de l'Acide Formique (A) ou du TFA
(B) sur la capacité de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFP.
[Fig. 16] La Figure 16 représente l'effet de l'Acide Formique suivi d'une neutralisation au NaOH sur la capacité de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
[Fig. 17] La Figure 17 représente l'effet du TFA suivi d'une neutralisation au NaOH sur la capacité de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
[Fig. 18] La Figure 18 représente l'absence d'effet désagrégeant du TFA suivi d'une neutralisation au NaOH sur un échantillon de TDP-43 AFp.
[Fig. 19] La Figure 19 représente l'effet de l'Acide Formique suivi d'une neutralisation au NH4OH sur la capacité de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
[Fig. 20] La Figure 20 représente l'absence d'effet désagrégeant de l'Acide Formique suivi d'une neutralisation au NH4OH sur un échantillon de TDP-43 AFp.

[Fig. 21] La Figure 21 représente l'effet du TFA suivi d'une neutralisation au NH4OH sur la capacité de détection d'une méthode ps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
[Fig. 22] La Figure 22 représente l'absence d'effet désagrégeant du TFA suivi d'une 5 neutralisation au NH4OH sur un échantillon de TDP-43 AFp.
[Fig. 23] La Figure 23 représente l'effet de solutions de NaOH donnant des pH
compris entre 8.2 et 13.3 suivi d'une neutralisation au HCI sur la capacité de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
10 [Fig. 24] La Figure 24 représente la détermination du pH minimum et maximum pour désagréger un échantillon de TDP-43 AFP avec de solutions de NaOH.
[Fig. 25] La Figure 25 représente la détermination du temps nécessaire pour désagréger un échantillon de TDP-43 AFp avec une solution de NaOH à pH=12.8.
[Fig. 26] La Figure 26 représente la détermination du pH minimum et maximum lors de la 15 mesure de la détection de TDP-43 NAFp.
[Fig. 27] La Figure 27 représente la mesure du niveau d'agrégation d'un peptide béta amyloïde 1-42 en utilisant le NaOH comme agent désagrégeant suivi d'une neutralisation à l'HCI.
[Fig. 28] La Figure 28 représente l'effet de solutions de NaOH, KOH et NH4OH
suivi d'une 20 neutralisation à l'HCI sur la capacité de détection d'une méthode HTRF
utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement au TDP-43 NAFp.
[Fig. 29] La Figure 29 représente l'effet de solutions de NaOH, KOH et NH4OH
suivi d'une neutralisation à l'HCI sur la désagrégation de TDP-43 NAFp.
[Fig. 30] La Figure 30 représente le calcul du rapport des signaux entre un échantillon 25 agrégat d'Alpha-Synucléine (Alpha-Syn AFp) et un échantillon monomère de cette même protéine (Alpha-Syn NAFp) obtenu avec une paire d'anticorps dirigée contre l'Alpha-Synucléine. La valeur du rapport des signaux supérieure à 2 indique que la paire testée est sélective de l'Alpha-Syn NAFp.
[Fig. 31] La Figure 31 représente l'effet d'une solution de NaOH suivi d'une neutralisation à
30 l'HCI sur la capacité de détection d'une méthode HTRF utilisant une paire d'anticorps capable de se lier spécifiquement à l'Alpha-Syn NAFp.
[Fig. 32] La Figure 32 représente la mesure du niveau d'agrégation de l'Alpha-Synucléine en utilisant le NaOH comme agent désagrégeant suivi d'une neutralisation à
l'HCI.

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Claims (17)

Revendications

1. Procédé in vitro de détection dans un échantillon d'une forme agrégée en feuillets 13 d'une protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PAFp), comprenant les étapes suivantes :
a) Dans un premier contenant :
al) introduire un échantillon susceptible de contenir une PAFp, a2) ajuster le pH à un pH allant de 9,7 à 13,2 pour désagréger tout ou partie de la PAFp afin d'obtenir une forme non-agrégée en feuillets p de la protéine formant des agrégats de type feuillets p (PNAFp), a3) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9, b) Mesurer la teneur en PNAFP dans le premier contenant avec une méthode immunologique appropriée ;
c) Dans un deuxième contenant :
cl) introduire un même échantillon qu'a l'étape al), c2) ajuster le pH à un pH allant de 6 à 9 ;
d) Mesurer la teneur en PNAFP dans le deuxième contenant avec la même méthode qu'à l'étape b) ;
e) Comparer les teneurs mesurées aux étapes b) et d), une diminution de la teneur mesurée à l'étape d) par rapport à la teneur rnesurée à l'étape b) indiquant que l'échantillon contient une PAFp.

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la protéine formant des agrégats de type feuillets 13 (PFp) est choisie parmi FUS (Fused in sarcoma), TAF15, EWSR1, DAZAP1, TIA-1, TTR (transthyrétine), cystatine C, 132-microglobuline, peptide amyloïde beta (tel que peptide amyloïde P 1-40 ou peptide amyloïde p 1-42), TAU
(Tubulin-Associated Unit), SOD1 (superoxyde dismutase 1), a-synucléine, y-synucléine, Huntingtine (HTT), prion et TDP-43 (TAR DNA-binding protein).

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans lequel la PF[3 est choisie parmi amyloïde beta 1-42, a-synucléine et TDP-43.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel l'échantillon provient d'un individu ayant ou étant suspecté d'avoir une maladie associée à
la PAF13.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'échantillon provient de cellules ou d'un tissu cultivé(es) in vitro.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'échantillon est choisi parmi un échantillon de sEn échantillon de sérum, un échantillon de liquide céphalo-rachidien, un lysat cellulaire, un homogénat cellulaire, un lysat tissulaire ou un homogénat tissulaire, tel qu'un homogénat de cerveau.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ou 5, dans lequel l'échantillon est choisi parmi un lysat cellulaire, un homogénat cellulaire, un lysat tissulaire, un homogénat tissulaire, un surnageant de culture cellulaire, un surnageant de culture tissulaire, des sous-fractions cellulaires ou des protéines (natives ou recombinantes).

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel le pH
à l'étape a2) est ajusté avec une base, telle que NaOH.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel le pH
à l'étape a3) est ajusté avec un acide, tel que HCI.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le pH
est ajusté à l'étape c2) avec un mélange acide/base, tel qu'un mélange Na0H/HCI.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel la méthode immunologique mise en oeuvre aux étapes b) et d) utilise :
(i) un ligand capable de se lier spécifiquement à la PNAFp, ledit ligand étant marqué avec un traceur, ou (ii) (ii) une paire de ligands capable de se lier spécifiquement à la PNAFP, au moins un ligand de ladite paire de ligands étant marqué avec un traceur.

12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel :
- le ligand (i) est choisi parmi un anticorps, un fragment d'anticorps, un peptide ou un aptamère, ou - la paire de ligands (ii) est choisie parmi une paire d'anticorps, une paire de fragments d'anticorps, une paire de peptides ou une paire d'aptamères, de préférence une paire d'anticorps.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 dans lequel la méthode immunologique mise en uvre aux étapes b) et d) est une méthode ELISA ou une méthode RET.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel les étapes b) et d) sont réalisées par une métho (b1)/(d1) introduire dans le contenant un premier ligand de la PNAFp marqué
par un premier membre d'un couple de partenaires de RET et un second ligand de la PNAFp marqué par un second membre du couple de partenaires de RET, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à la PNAFp, et (b2)/(d2) mesurer le signal de RET émis dans le contenant.

15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, dans lequel les étapes b) et d) sont réalisées par une méthode ELISA et consistent à :
(b1)/(d1) introduire dans le contenant, au fond duquel a préalablement été
immobilisé un premier ligand de la PNAFp, un deuxième ligand de la PNAFp marqué
avec un traceur, la paire de ligands étant capable de se lier spécifiquement à
la PNAFp, (b2)/(d2) mesurer le signal ELISA émis dans le contenant.

16. Procédé in vitro de suivi de l'efficacité thérapeutique d'un traitement d'une maladie associée à une PAFp chez un patient, comprenant les étapes suivantes :
A) Mettre en uvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 sur un premier échantillon dudit patient, dans lequel l'étape e) consiste à
déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l'étape b) et la teneur mesurée à l'étape d) ( Ratio b)/d) de l'échantillon 1 ) ;
B) Mettre en uvre un même procédé qu'à l'étape A) sur un second échantillon dudit patient, pour déterminer le Ratio b)/d) de l'échantillon 2 ;
C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité
thérapeutique est observée lorsque le ratio déterminé à l'étape B) est inférieur au ratio déterminé à l'étape A).

17. Procédé in vitro de mesure de l'efficacité pharmacologique d'une molécule médicament ou d'un candidat médicament sur une maladie associée à une PAFP
dans un échantillon test, comprenant les étapes suivantes :
A) Mettre en uvre le procédé selon l'invention sur un premier échantillon dudit échantillon test, dans lequel l'étape e) consiste à déterminer le ratio entre la teneur mesurée à l'étape b) et la teneur mesurée à l'étape d) ( Ratio b)/d) de l'échantillon 1 ) ;
B) Mettre en uvre un même procédé qu'à l'étape A) sur un second échantillon dudit échantillon test, pour déterminer le Ratio b)/d) de l'échantillon 2 ;
C) Comparer les ratios déterminés aux étapes A) et B), dans lequel une efficacité
pharmacologique est observée lorsque le ratio déterminé à l'étape B) est inférieur au ratio déterminé à l'étape A).