WO2016128689A1 - Procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique - Google Patents

Procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique Download PDF

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WO2016128689A1
WO2016128689A1 PCT/FR2016/050322 FR2016050322W WO2016128689A1 WO 2016128689 A1 WO2016128689 A1 WO 2016128689A1 FR 2016050322 W FR2016050322 W FR 2016050322W WO 2016128689 A1 WO2016128689 A1 WO 2016128689A1
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protein
acceptor
compound
donor
sample
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PCT/FR2016/050322
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English (en)
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Gérard Mathis
Hervé Bazin
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Cisbio Bioassays
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Definitions

  • the invention relates to a method of quantifying a protein of interest present in a biological sample, this method comprising signal normalization means measured by the amount of biological material present in the measuring medium.
  • the invention also relates to a reagent kit and a fluorimeter for the implementation of this method.
  • Fluorescent compounds are a tool of choice for research in biology as they allow, in combination with equipment capable of detecting their luminescence, to visualize biological processes at the cellular or even the molecular level, by microscopy or simply by measuring their luminescence using a fluorimeter. These compounds can be used as such to stain certain compartments of cells or tissues, or be conjugated to vectors that will transport them to a specific site.
  • vectors may be, for example, antibodies specific for a cellular component (such as a protein) that it is desired to label with a fluorescent compound, or any compound that has a specificity for a compartment or a cellular component.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • This luminescence can be measured by a fluorometer set at the emission wavelengths of the fluorescent compounds, and the FRET signal thus obtained, most often constituted by the ratio of the signal of the acceptor to that of the donor, makes it possible to follow the evolution of the phenomenon observed.
  • the implementation of this technique with chelates or rare earth cryptates, developed in particular by G. Mathis et al. (“Homogeneous time resolved fluorescence ernergy transfer using rare earth cryptates as a tool for molecular biology", Spectrochimica Acta Part A 57 (2001) 2197-2211) has many advantages that have already allowed several applications in the field of diagnosis. in vitro and in the field of high throughput screening in the pharmaceutical industry.
  • reagents including rare earth cryptates, for the study of particular biological phenomena (detection of enzymatic activity, dosage of second messengers, etc.).
  • the luminescent rare earth chelates or cryptates in particular the cryptates or chelates of europium or terbium, have a life of the order of a millisecond which allows the measurement of the FRET signal emitted by the measurement medium after a delay following excitation of the donor compound.
  • This time-resolved FRET measurement technique makes it possible to overcome the parasitic luminescence emitted by the measurement medium immediately after its excitation and is therefore particularly advantageous when the measurement medium includes biological material rich in compounds, in particular proteins, capable of producing this kind of interference.
  • the TR-FRET technique has long been implemented on relatively well-controlled biological systems, such as a given enzyme and its substrate, two proteins interacting with each other, or the assay of an analyte in plasma or blood serum, it has recently been applied to much more complex environments, including cells, cell lysates or tissue explants.
  • One of the problems of in vitro tests carried out on this type of material is the difficulty of controlling the number of cells present in the medium of measurement, making the comparison of the results obtained in different tests all the more difficult. This technical problem is particularly critical when it is desired to apply the TR-FRET technique to the clinical analysis of native tissue samples characterized by a large disparity in cellular content.
  • Evaluation or standardization techniques with respect to the quantity of cells present in the measuring medium are available: it is first possible to introduce into the measuring medium a known number of cells by distribution of a homogeneous suspension of cells. Cell counting techniques are also used, but they are relatively tedious and unsuitable for the analysis of a large number of samples (microscopy, FACS). Another approach is to evaluate the amount of certain "ubiquitous" proteins, the presence of which indirectly reflects the amount of cells present in the measuring medium (eg GAPDH, actin). This approach is used in "Western Blot" type protein assays, which are not based on TR-FRET measurements, and also for the quantification of nucleic acids, especially retrotranscribed messenger RNAs. In this case it is the DNA sequence coding for a ubiquitous protein that is quantified.
  • the inventors have developed a method for detecting the presence of a protein of interest in a measurement medium, which takes into account the total amount of cells present in this medium, or the total amount of a particular type. of cell.
  • This method based on the use of the TR-FRET technique, consists in measuring, in addition to the protein of interest, a reference protein whose level of expression is relatively constant from one cell to another or from one cell type to another.
  • the reference protein may also be characteristic of a given pathophysiological state.
  • the protein of interest is measured by means of a first pair of TR-FRET partners consisting of a first donor and a first acceptor
  • the reference protein is measured by means of a second pair of partners TR-FRET consisting of a second donor and a second acceptor.
  • a TR-FRET signal is conventionally obtained by measuring the luminescence emitted by the measurement medium both at the emission wavelength of the donor compound and at that of the acceptor compound, and by calculating a ratio between the two measurements. , generally the ratio of the signal emitted by the acceptor compound to that emitted by the donor compound. Through the use of this ratio, it has been shown that it is possible to overcome the optical variability of the medium from one sample to another (Mathis G, Clin Chem 1993, 39 (9 ): 1953-1959). Unexpectedly, it is not necessary, in the implementation of the method according to the invention, to perform the measurement at the wavelength of the donors. An essential characteristic of the invention therefore lies in the fact that the luminescence emitted at the wavelength of the donor is not measured.
  • the invention consists, after excitation of the donors, in measuring only the signals emitted at the emission wavelengths of the two acceptors, namely that used for the detection of the protein of interest and that used for the detection of the protein reference.
  • a ratio of the two signals is calculated, preferably that of the signal emitted by the first acceptor (protein of interest) on that emitted by the second acceptor (reference protein). Since the proportion of reference protein chosen is relatively constant from one cell to another, this ratio makes it possible not only to normalize the signal obtained for the protein of interest by the quantity of cells present in the medium of the cell. measurement, but also to normalize it to take into account differences in optical properties between two different measuring medium. These differences in optical properties are related to the composition of the medium, in particular the presence of certain protein or other compounds, which influence the optical quality of the medium.
  • the method according to the invention makes it possible to quantify the presence of a protein of interest present in a measurement medium containing a biological sample, and to compare this quantity with that present in another sample.
  • the measurements obtained can be compared since the method according to the invention makes it possible to correct these measurements to take into account, on the one hand, the quantity of biological material present from one sample to the other, on the other hand, differences in optical properties. from one measurement medium to another.
  • the measurement obtained for a sample is made independent of its environment and the quantity of cells, by determining the density of the protein of interest, which can then be compared from one sample to another. This is particularly useful when the biological sample is from a patient, and that the quantification of the protein of interest makes it possible to obtain information as to the state of the patient, in particular to make a diagnosis, to follow the evolution his state of health or the effectiveness of a treatment.
  • one of the advantages of the method according to the invention is that it does not require measuring the signal emitted by the donor fluorescent compound or compounds, contrary to what is practiced in conventional TR-FRET signal measurements [Mathis G op.cit.].
  • TR-FRET signal measurements [Mathis G op.cit.].
  • two luminescence measurements are necessary to quantify the protein of interest, against four measurements according to the conventional approach.
  • the invention therefore relates to a method of quantifying a protein of interest present in a biological sample containing cells and a reference protein, said sample being itself contained in a measurement medium, characterized in that what it includes the following steps:
  • the wavelength corresponding to the emission peak of the second acceptor is different from that corresponding to the emission peak of the first acceptor
  • steps c), e) and f) are implemented in the first container, and steps d), g) and h) are implemented in the second container.
  • container is meant a tube, a plate or microplate well or any other container generally used to perform biological assays.
  • the first and second donor compounds have different excitation bands.
  • the first and second donor compounds have identical excitation bands.
  • the first and the second donor compound have identical excitation bands, and the sample is distributed in two different containers.
  • the first and second donor compounds have identical excitation bands, the sample is dispensed in a single container, and the method does not include step g). This embodiment is preferred.
  • the steps of measuring the luminescence of the acceptors can be carried out simultaneously.
  • Fluorimeters operating in time-resolved mode and allowing simultaneous measurement of luminescence emitted at two different wavelengths are commercially available (for example from BioTek, BMG LABTECH GmbH, Molecular Devices, BRAHMS GmbH, Tecan Group Ltd., Berthoid Technologies GmbH, Furuno Furuno Electric Co., Ltd., or Perkin Elmer).
  • first and second donor compounds have identical excitation bands, it is advantageous that the first and second donors are identical.
  • the method according to the invention can be implemented in combination with the method of normalization of the luminescence emitted by a measuring medium described in the patent application WO 2013/124544 whose integral content is incorporated by reference to the present application .
  • This patent application describes a method for measuring the luminescence of a long-lived fluorescent compound present in a measurement medium, said medium containing a biological sample, said method comprising the following steps:
  • the measured luminescence is that resulting from a TR-F ET phenomenon in the measurement medium, that is to say a transfer of energy between a compound fluorescent donor and a fluorescent acceptor compound.
  • the long-lived fluorescent compound plays the role of the energy donor and the above method then comprises the following steps: a) introduction into the measuring medium of a fluorescent compound with a long lifetime ,
  • step e) measuring the luminescence emitted by the measuring medium immediately after the excitation of said medium, corresponding mainly to the luminescence of the marking agent, and for a period of 5 ns to 45 ⁇ 5, at a corresponding wavelength at an emission peak of the long-lived fluorescent compound, f) optionally, measurement in time resolved of the luminescence emitted by the measuring medium at the same wavelength as that used in step e), after a delay of 20 to 200 ⁇ discipline depending on the excitation of the measuring medium and for a duration of 200 to 1000 g) measurement in time resolved of the luminescence emitted by the measuring medium after a delay of 20 to 200 ⁇ s after excitation of the measuring medium and for a period of 200 to 600 ⁇ 5 at the wavelength of emission of the acceptor compound,
  • the present invention relates to a kit of reagents for implementing the method according to the invention.
  • This reagent kit includes:
  • a first and a second ligand each of these ligands having a specific binding domain to a protein of interest, and these ligands being respectively labeled with a first donor compound and a first acceptor compound, both forming a pair of TR partners -FRET;
  • a third and a fourth ligand each of these ligands having a specific binding domain to a reference protein, these ligands being respectively labeled by a second donor compound and a second acceptor compound, both forming a pair of partners of TR -FRET, and the wavelength corresponding to the emission peak of this second acceptor being different from that corresponding to the emission peak of the first acceptor.
  • the kit according to the invention may also contain a calibrator and a composition containing a known amount of protein of interest, including a cell lysate containing this protein.
  • the kit according to the invention may also comprise a calibrator consisting of a dilution of lysis of a cell line expressing either the reference protein or the reference protein and the protein of interest.
  • the kit according to the invention may comprise a fluorescent compound having a short lifetime and binding to the DNA or cellular proteins; as well as instructions for normalizing the signal of the protein of interest by the reference protein.
  • the invention relates to a fluorimeter for carrying out the method according to the invention.
  • This fluorimeter is controlled by software for the implementation of the following algorithm:
  • step c) can be omitted.
  • the fluorimeter according to the invention comprises a read head for the simultaneous measurement of the luminescence emitted by the two acceptors at two different wavelengths.
  • the reference protein is preferably a so-called "household” protein.
  • the concept of household protein is known to those skilled in the art: it designates proteins whose presence is necessary to maintain basic cellular functions, they ensure the maintenance of the structural and functional integrity of the cell and are expressed in FIG. relatively constant levels regardless of the type of cell, its environment and the state of the organism to which it belongs (normal or pathological).
  • the reference protein is preferably chosen from the following proteins: ⁇ -actin, GAPDH, HSP70, HSP90, the alpha subunit of NaK-ATPase, TE T, a histone and in particular histone H6.
  • the experimenter may use work on the evaluation of various genes as a "reference gene” such as hypoxanthine ribosyltransferase (HPRT) [De Kok et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab. Invest. 2005, 85: 154-159; Ho-Pun-Cheung et al. Validation of an appropriate reference gene for normalization of reverse transcription - quantitative polymerase chain reaction data from rectal cancer biopsies. Anal. Biochem. 2009, 388: 348-350].
  • a reference gene such as hypoxanthine ribosyltransferase (HPRT) [De Kok et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab. Invest. 2005, 85: 154-159; Ho-Pun-Cheung et al. Validation of an appropriate reference gene for normalization of reverse transcription - quantitative polymerase chain reaction data from rectal cancer bio
  • the reference protein may also be characteristic of a given pathophysiological state.
  • the reference protein may be a protein characteristic of cancer cells, for example cytokeratins for epithelial cells, or characteristic of the behavior of the cancer cell, for example Ki67 which translates an overgrowth or HIF (Hypoxia Inducible Factors) that is overexpressed in hypoxic environments.
  • HIF Hydrophila Inducible Factors
  • the reference protein is naturally contained in the measuring medium (the cells of the medium); the method of the invention therefore comprises no step of adding such a reference protein in the measuring medium.
  • the biological sample is a sample of the biological sample.
  • the biological sample is a tissue sample taken from a patient (so-called “native” tissue), such as a sample of solid tissue taken in the course of a biopsy.
  • tissue sample taken from a patient
  • tissue sample such as a sample of solid tissue taken in the course of a biopsy.
  • the method according to the invention can be implemented in particular from a biological sample in the form of FFPE (acronym for "formalin fixed paraffin embedded") or cryosections.
  • the biological sample may also have been collected by the fine needle aspiration biopsy technique.
  • tissue in the form of FFPE sections are known to those skilled in the art: they may consist in particular of the attachment of the sample by a treatment with formaldehyde, its inclusion in paraffin, in particular in the form of blocks which can then be cut with a microtome (preferably with a thickness of about 1 to 50 ⁇ ).
  • the treatment of these sections with xylene to remove paraffin, their rinsing with ethanol and then with water are also techniques known to those skilled in the art, as well as the regeneration of epitopes by the HIER technique (acronym "English expression” heat induced eptitope recovery ", described in particular in US patent 8,067,241).
  • cryosections preferably from 1 to 50 ⁇ thick, also prepared according to conventional techniques.
  • the method according to the invention comprises a step of homogenizing the biological sample in the form of a cell lysate, said cellular lysate being distributed in one or more different containers before the introduction of the first and second ligand into the measuring medium.
  • This homogenization may be obtained by mechanical treatment, chosen from: the application of ultrasound (sonication), freeze / thaw cycles, the use of mechanical mills, optionally together with the use of hypotonic lysis buffer or lysis buffer containing detergents such as RIPA buffer.
  • a mechanical treatment too violent or a chemical treatment too drastic could degrade or dissociate these structures or oligomers.
  • a gentle mechanical treatment consists of applying ultrasound (sonication), for example, to the measurement medium at a frequency> 16 000 Hz, at a power of 80 W and for a duration of 3 to 10 seconds, and preferably during 4 to 6 seconds.
  • the samples are preferably kept in an ice bath during the treatment to limit their heating.
  • the biological sample When the biological sample is prepared as a homogenate, it can be diluted according to a dilution factor which depends on several factors and in particular on the affinity of the ligands with the protein of interest and the reference protein, and also the normal concentration of protein of interest or reference protein in the sample. Such dilutions are routine in the art for those skilled in the art of detecting proteins in biological media.
  • the sample is preferably diluted after homogenization in the form of cell lysate and before its distribution in one or more containers.
  • the process according to the invention can also be carried out on cells derived from cell cultures.
  • the homogenization can be carried out for example by sonication or by using a lysis buffer.
  • the simplest method of lysis called osmotic lysis is to put the cells in a hypotonic medium.
  • a non-ionic detergent such as Triton® or Tween®, or an anionic detergent such as SDS (sodium dodecyl sulphate) is often added.
  • SDS sodium dodecyl sulphate
  • a lysis buffer often contains additives such as glycerol and salts that modify the CMC (critical micellar concentration) value of the detergents, as well as additives that inhibit proteases or phosphatases. Lysis buffers are commercially available. This step may be implemented before or after the introduction of T-FRET partner pairs in the measurement medium.
  • Ligands specific for the protein of interest or the reference protein are Ligands specific for the protein of interest or the reference protein
  • the ligands having a binding domain to the protein of interest and the reference protein are antibodies recognizing these proteins.
  • the term "antibody” must be taken here in the broad sense and includes any protein of the immunoglobulin family or comprising a domain of an immunoglobulin, as well as a binding site specific to the protein of interest.
  • the antibodies can therefore be Fab, Fab 'fragments, single-chain or single-domain antibodies, immunoglobulin heavy or light chain variable domains.
  • the specific ligands may also be aptamers or other bioprobes. Labeling of ligands or antibodies by donor or acceptor compounds
  • the labeling of a ligand or an antibody by a fluorescent donor or acceptor compound is carried out by conventional conjugation techniques using the use of reactive groups.
  • the fluorescent donor or acceptor compounds are generally marketed in "functionalized” form, that is to say that they carry a reactive group capable of reacting with a functional group present on the compound to be labeled, in this case the ligand. or the antibody.
  • the reactive group present on the donor or acceptor fluorescent compound is an electrophilic or nucleophilic group which can form a covalent bond when it is respectively brought into contact with a suitable nucleophilic or electrophilic group.
  • electrophilic or nucleophilic groups which can form a covalent bond when it is respectively brought into contact with a suitable nucleophilic or electrophilic group.
  • the pairs of electrophilic / nucleophilic groups and the type of covalent bond formed when they are brought together are listed below: GROUP ELECTROPH ILE GROUP NUCLEOPH ILE BINDING TYPE Acrylamides thiols thioethers
  • activated ester we mean groups of formula COY, where Y is:
  • a leaving group chosen from succinimidyloxy groups (-OC 4 H 4 NO 2 ), sulfosuccinimidyloxy (-OC 4 H 3 NO 2 SO 3 H);
  • An aryloxy group optionally substituted with at least one electrophilic substituent such as the nitro, fluoro, chloro, cyano or trifluoromethyl groups, thereby forming an activated aryl ester;
  • a carboxylic acid activated by a carbodiimide group forming an anhydride OCORa or -OCN RaN HRb, in which Ra and Rb are identical or different and are chosen from alkyl groups with CC 6 , perfluoroalkyls with 1 to 6 carbon atoms, alkoxy with CC 6 , cyclohexyl;
  • the commercially available donor and acceptor fluorescent compounds generally comprise a maleimide function or an activated ester, most often with an NHS (N-hydroxysuccinimidyl) group, which react with the thiol and amine groups respectively and can therefore be used for labeling.
  • the labeled antibodies are characterized by the final molar ratio (MRF) which represents the average number of ligand-grafted marker molecules.
  • the ligand is of a protein nature, it may be advantageous to use one of the functional groups naturally present in the proteins: the terminal amino group, the terminal carboxylate group, the carboxylate groups of the aspartic and glutamic acids, the amino groups of the lysines, guanidine groups of arginines, thiol groups of cysteines, phenol groups of tyrosines, indole rings of tryptophans, thioether groups of methionines, imidazole groups of histidines.
  • ligand does not have a functional group in the natural state
  • such groups can be introduced.
  • Methods for introducing functional groups are described in C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd edition, L.J. Kricka (1995), Ed. Academy Press Ltd., London, p. 66-72.
  • Another approach for labeling a ligand with a fluorescent compound is to introduce a reactive group into the ligand, for example an NHS group or a maleimide group, and to bring it into the presence of a fluorophore carrying a functional group which will react with the reactive group to form a covalent bond.
  • a reactive group for example an NHS group or a maleimide group
  • the pairs of FRET partners are preferably constituted by a fluorescent donor compound and a fluorescent energy-accepting compound.
  • FRET is defined as a non-radiative energy transfer resulting from a dipole-dipole interaction between a donor and an energy acceptor. This physical phenomenon requires energy compatibility between these molecules. This means that the donor's emission spectrum must cover, at least partially, the absorption spectrum of the acceptor. In agreement with Forster's theory, FRET is a process that depends on the distance between the two molecules, donor and acceptor: when these molecules are close to one of the other, and that the donor compound is excited at a wavelength corresponding to one of its absorption peaks, a transfer of energy will take place, causing a decrease in the luminescence emitted at the wavelength of emission of the donor, and an increase in the luminescence emitted at the emission wavelength of the acceptor.
  • Donor-acceptor pairs that can be used to study FRET phenomena are described in particular in Joseph R. Lakowicz (Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic / Plenum Publishers, NY (1999)), to which profession may refer.
  • Fluorescent compounds that provide long-lived energy (> 0.1 ms, preferably between 0.5 and 6 ms), in particular rare earth chelates or cryptates, are advantageous since they make it possible to carry out measurements in time resolved, that is to say to measure signals of TR-FRET by overcoming the phenomenon of autofluorescence emitted by the measuring medium. They are for this reason and generally preferred for the implementation of the method according to the invention.
  • Dy3 + dysprosium
  • Sm3 + samarium
  • Nd3 + neodymium
  • Yb3 + ytterbium
  • Er3 + erbium
  • the first and the second donor compounds can both be preferably either a chelate or cryptate of Europium, or a chelate or cryptate of Terbium, the latter case being particularly preferred.
  • the first and second donor compounds preferably one is a chelate or europium cryptate, and the other a chelate or cryptate. of Terbium.
  • the first and second donor compounds may both be Europium chelates or cryptates, provided that the chelates or cryptates have different structures. It is the same when the first and the second donor compound are terbium chelates or cryptates.
  • excitation band is meant a range of wavelengths that can be used to pass the donor compound to an excited state.
  • donor compounds having “identical excitation bands” it is to be understood that the excitation bands of the first and second donors overlap sufficiently to allow excitation of the first and second donor compound at the same wavelength.
  • donor compounds with “different excitation bands” it should be understood that it is not possible to excite the two donors satisfactorily with a single wavelength, because of the non-overlapping of their bands. 'excitation.
  • rare earth chelates or cryptates suitable for the purposes of the invention are: Lanthanide cryptates, comprising one or more pyridine units. Such rare earth cryptates are described, for example, in patents EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 and in international application WO 01/96877. Cryptates of terbium (Tb3 +) and europium (Eu3 +) are particularly suitable for the purposes of the present invention. Cryptates of lanthanides are marketed by the company Cisbio Bioassays. By way of nonlimiting example, mention may be made of the europium cryptates of formulas below (which may be coupled to the compound to be labeled via a reactive group, here for example an NH 2 group):
  • Lanthanide complexes consisting of a chelating agent, such as tetraazacyclododecane, substituted by a chromophore comprising aromatic rings, such as those described by Poole R. et al. in Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterization of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for use in cellulo", can also be used. It is also possible to use the complexes described in application WO 2009/10580.
  • Terbium cryptate of formula below (which may be coupled to a compound to be labeled via a reactive group, here for example an NH 2 group):
  • the ruthenium chelates in particular the complexes consisting of a ruthenium ion and several bipyridines such as ruthenium (II) tris (2,2'-bipyridine).
  • the fluorescent donor compound is chosen from: a europium cryptate; a europium chelate; a terbium chelate; a terbium cryptate; a ruthenium chelate; and a quantum dye; chelates and cryptates of europium and terbium are particularly preferred.
  • Complexes of dysprosium (Dy3 +), samarium (Sm3 +), neodymium (Nd3 +), ytterbium (Yb3 +) or erbium (Er3 +) are also rare earth complexes suitable for the purposes of the invention.
  • the fluorescent acceptor compounds must have an absorption spectrum which covers the donor's emission spectrum (Mathis G, op.cit.) And may be chosen from the following group: allophycocyanines, in particular those known under the trade name XL665 ; organic luminescent molecules, such as rhodamines, cyanines (for example Cy5), squaraines, coumarines, proflavines, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives (marketed under the name "Bodipy”), the fluorophores known under the name "Atto", the fluorophores known under the name "DY”, the compounds known under the name "Alexa”, nitrobenzoxadiazole.
  • allophycocyanines in particular those known under the trade name XL665
  • organic luminescent molecules such as rhodamines, cyanines (for example Cy5), squaraines, coumarines, proflavines,
  • the fluorescent acceptor compounds are chosen from allophycocyanins, rhodamines, cyanines, squaraines, coumarins, proflavines, acridines, fluoresceins, boron-dipyrromethene derivatives and nitrobenzoxadiazole.
  • cyanines and “rhodamines” should be understood respectively as “cyanine derivatives” and “rhodamine derivatives”. Those skilled in the art know these different fluorophores, commercially available.
  • the compounds "Alexa” are marketed by the company Invitrogen; the “Atto” compounds are marketed by Atto-tec; the compounds “DY” are marketed by the company Dyomics; the “Cy” compounds are marketed by Amersham Biosciences; the other compounds are marketed by various suppliers of chemical reagents, such as Sigma, Aldrich or Acros.
  • the invention uses two acceptors, it is essential that the first and second acceptors have different emission peaks when the biological sample is dispensed into a single container and that the measurements of the protein of interest and the Reference protein are made in this same container.
  • the emission spectra of the acceptors are generally available and if they are not, they can be easily determined by standard techniques known to those skilled in the art.
  • the first acceptor has an emission peak centered around 520 nm and the second acceptor has an emission peak centered around 665 nm.
  • the first acceptor has an emission peak centered around 665 nm and the second acceptor has an emission peak centered around 520 nm.
  • the first acceptor is Alexa 488 and the second acceptor is fluorophore d2, the first and second donors are identical and are terbium cryptate Lumi4 (Tb).
  • the first acceptor is Cyanine cyanine
  • the second acceptor is fluorophore d2
  • the first and second donors are identical and are europium trisbipyrdin cryptate.
  • the fluorophore d2 is a cyanine whose spectroscopic properties are similar to those of AlexaFluor 647 or cyanine Cy5, namely an absorption spectrum in aqueous solution having an absorption maximum for wavelengths between 645 nm and 650 nm and a molar absorbance greater than 200,000 M -1 cm -1 , a fluorescence spectrum having a fluorescence maximum between 665 nm and 675 nm and characterized by a quantum efficiency greater than 20%.
  • the measurement of the TR-FRET signal is carried out after excitation of the measurement medium by a source pulsed in an excitation band of the donor compound, preferably after a delay of 1 to 500 microseconds ( ⁇ ) and for a period of 10 to 2000 ⁇ . Even more preferably, the delay is 50 ⁇ (time resolved).
  • the TR-FRET signal can be constituted by the intensity of the measured luminescence, or by its lifetime.
  • the EGFR protein was measured quantitatively on the following cell lines:
  • SKBR3 a line that expresses very weakly the EGFR protein
  • A431 a line which strongly expresses the EGFR protein (approximately more than 1 million EGFR proteins per cell according to the literature).
  • the AC74-Lumi4 donor conjugate (Tb) and the AC40-d2 acceptor conjugate were used for TR-FRET quantification of actin contained in cell lysates.
  • Anti-EGFR (A) -lumi4 (Tb) donor conjugate and Anti-EGFR acceptor conjugate (B) - Alexa488 were used for quantification of EGFR.
  • anti-EGFR antibodies are commercially available:
  • Two of these antibodies were labeled according to a protocol similar to that used for the anti-actin antibodies, to obtain an Anti-EGFR (A) -lumi4 (Tb) donor conjugate and an Anti-EGFR (B) -Alexa488 acceptor conjugate. These two conjugates were used for the detection of EGFR. Both antibodies were chosen for their ability to generate a
  • TR-FRET in the presence of recombinant EGFR. Incubation and signal measurement
  • SKBR3 or A431 Cells (SKBR3 or A431) from culture (approximately 17 to 20 x 10 6 confluent cells in a T175 culture flask) were washed with PBS and then dissociated, transferred to a centrifuge tube (50 mL) and centrifuged (400 mL). g / 3 min). After removing the supernatant, the pellet obtained was lysed in 3 ml of "Cellular kinase lysis buffer # 3" (Cisbio ref 64KL3FDF) for 30 min at 20 ° C. (shaking) and then after transfer into an eppendorf tube and centrifugation (15 min.
  • Cells (SKBR3 or A431) from culture (approximately 17 to 20 x 10 6 confluent cells in a T175 culture flask) were washed with PBS and then dissociated, transferred to a centrifuge tube (50 mL) and centrifuged (400 mL
  • the supernatant (lysate) was collected and stored frozen at -80 ° C.
  • Part of the SKBR3 cell lysate was diluted 1/8 th by adding recombinant EGFR so as to obtain a final concentration of 2 nM EGFR by mixing 200 ⁇ of 4 nM EGFR (prediluted in LB3 lysis buffer). 150 ⁇ of LB3 and 50 ⁇ l of SKBR3 lysate obtained as described above.
  • the recombinant EGFR solution was prepared from EGFR OriGene # TP710011 (0.185 ⁇ / ⁇ concentration).
  • [EGFR] 1380 nM was obtained for the stock solution; 2.9 ⁇ l of this solution (qsp 1000 ⁇ l of LB3) were diluted to obtain a 4 nM solution.
  • the resulting lysate was named "SKBR3 + 2nM EGFR”.
  • SKBR3, SKBR3 + 2nM EGFR and A431 lysates was serially diluted half in lysis buffer LB3 and 16 ⁇ l was plated in the wells of a 384w F-bottom, SV, Hibase, White (GREINER #) microplate. 784 075). "White reagent" wells were also prepared by depositing only lysis buffer LB3 in contiguous wells.
  • Anti-EGFR (A) -lumi4 (Tb) 5 nM / Anti-EGFR (B) - Alexa488 25 nM by half dilution in detection buffer,
  • an antibody mixture chosen from:
  • TRF time-resolved mode
  • Measurement height 12 mm
  • Parameters for adjusting the excitation and emission wavelengths as well as the delay and measurement window 340 665 620 60_400 (1) and 340 cache-520 60-400 (1);
  • the luminescence emitted by each well was measured and corrected by subtracting the value of the signal measured in the "reagent blank" well (cell lysate replaced by buffer).
  • a value greater than zero indicates the existence of TR-FRET between the donor (lumi4 cryptate (Tb)) and the acceptor (d2 or Alexa 488) and is representative of the amount of the measured protein.
  • the signal measured at 520nm, which corresponds to an emission peak of Alexa 488, is representative of the amount of EGFR and that measured at 665 (peak emission of d2) is representative of the amount of actin.
  • the EGFR / Actin ratios are constant (with measurement uncertainties) at different dilutions for a given lysate;
  • the EGFR / Actin ratios are identical (with measurement uncertainties), whether the proteins are measured in different wells or in the same well;
  • the EGFR / Actin ratio calculated for the SKBR3 lysate is zero, which is normal insofar as these cells do not express the EGFR; when 2nM of EGFR was added to the lysate, the EGFR / Actin ratio increases, and that the proteins are measured in different wells or in the same well.
  • the EGFR / actin ratio is even higher in the A431 lysate;
  • the method according to the invention has been carried out on cryosections obtained from mouse tumors, induced by xenografting of cells overexpressing the EGFR receptor (for example Xenograft A431 (2,500,000 EGFR / cell), Heimbrook et al. 1990 87 (12): 4697-701, or Xenogreffes LS-174T (colorectal, 360,000 EGFR / cell), SKOV3 (ovary, 220,000 EGFR / cell), and HT-29 (colorectal, 44,000 EGFR / cell) : Milenic et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals, 2008, 23 (5): 619-632).
  • Xenograft A431 (2,500,000 EGFR / cell
  • Xenogreffes LS-174T colonrectal, 360,000 EGFR / cell
  • SKOV3 ovary, 220,000 EGFR
  • the cells (5x10 6 ) were administered by subcutaneous injection to athymic female mice on their right flank. Mice bearing tumors were sacrificed when the tumors reached a volume greater than 1500 mm 3 . After sacrifice of the animal, the tumor was excised, the surgical piece thus obtained was frozen immediately by immersing it in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C.
  • the metal sample holder of a cryotome was placed on dry ice for 1 min. A few drops of sterile water were then placed on the support and then, without delay, the surgical piece was removed. By freezing, the water fixed the sample on the support.
  • cryosections were collected in eppendorf tubes previously cooled in dry ice.
  • the thickness of the cryosections was generally between 10 ⁇ and 50 ⁇ . For the applications below, a thickness of 25 ⁇ was considered optimum in terms of handling convenience. Cryosections were stored at -80 ° C until the lysis step.
  • cryosections of xenograft tumors (2 sections of 25 ⁇ ) collected in an eppendorf tube were lysed in "Cellular kinase lysis buffer # 3" buffer (Cisbio ref 64KL3FDF) for 30 min at 4 ° C. (with shaking) and the tubes were sonicated (Branson Ss 5s at 20% power / 4 ° C) after centrifugation (15 min 4 ° C to 14,000 g), and the supernatants (lysate) were collected and stored frozen at -80 ° vs.
  • the lysates were serially diluted 1/8, 1/16 and 1/32 in lysis buffer and distributed (16 ⁇ l) into the wells of a microtiter plate (384).
  • x 20 ⁇ ) and 4 ⁇ l of a solution of a mixture of anti-EGFR-Lumi4 antibodies (Tb), an anti-actin-Lumi4 antibody (Tb) of an anti-EGFR-Alexa488 antibody and Anti-Actin-d2 was added to the lysates as well as negative wells containing only lysis buffer.
  • the antibodies were pre-diluted in detection buffer (Cisbio ref 62SDBRDF) so as to obtain a final concentration in the well of 0.5 nM of each of the antibodies-Lumi4 (Tb) and 5 nM of each of the antibodies- acceptor (Alexa488 and d2). After incubation for 3 hours at 20 ° C., a fluorescence reading in the TRF mode was performed (blank supra).
  • the ratio E520 / E665 was measured for wells corresponding to lysates of various lines; it was observed that the E520 / E665 ratio was generally constant for different dilutions of the same line, and that the ratio of E520 / E665 ratios corresponding to lines expressing different levels of EGFR was in proportions similar to the ratio of expressions.
  • the sodium-potassium pump or Na + -K + ATPase [Scheiner-Bobis' The sodium pump. Its molecular properties and mechanics of ion transport ", Eur. J. Biochem., (2002), 269 (10): 2424-33] is a transmembrane protein that can be used as a housekeeping protein (HKPs), mainly in Western blotting [Ke et al. Mol Pharmacol (2007) 72: 1063-1073] [Sukowati et al. (2013) PLoS ONE 8 (10): e76830].
  • the signal normalization corresponding to the expression of HER2 was carried out by assaying the alpha-1 subunit, named ATP1A1, of this receptor.
  • This ATP1A1 protein is expressed on the plasma membrane as are many receptors of pharmacological or diagnostic interest, for example receptors of the family of receptors with Tyrosine Kinase activity (RTK) and more particularly the HER family receptors like HER2.
  • RTK Tyrosine Kinase activity
  • HER2 has been assayed on cell lysates which may initially contain an unknown number of cells, which is the case of biopsies of cancerous tumors.
  • the amount of HER2 receptors in the lysate and the amount of ATP1A1 protein were assayed, the latter being ubiquitously expressed; its concentration in the lysate depends on the number of cells present in the original sample.
  • the ratio of the amount of HER2 to the amount of ATP1A1 is proportional to the expression of HER2 in the cells of the sample.
  • the average amount of transporter (ATP1A1) contained in a cell was estimated to be 8 X 10 5 per cell in the case of the cancer cell line [estimated as the number of ouabain binding site Ash et al. The Journal of Cell Biology 1984; 99 (3): 971-983] [Baker & Willis Biochim Biophys Acta. (1969) 183 (3): 646-9].
  • This number of molecules is intermediate between what is considered a weak expression of HER2 (20,000 HER2 per cell) and a strong expression of HER2 (1,000,000 HER2 per cell).
  • a lysate sample contains these two receptors in proportions not exceeding a ratio of 40 in the case of low HER2 expression.
  • the pair of antibodies CST23565 / AM26492 recognizes the ATP1A1 protein expressed on the membrane of human cells
  • the pair of antibodies labeled CST23565-Lumi4 (Tb) / AM26492-d2 can be used for TR-FRET quantification of ⁇ 1 ⁇ 1 contained in cell lysates.
  • the commercial antibody CST23565 (1 mg / ml) was previously dialyzed against 100mM phosphate buffer pH8. To 100 ⁇ l of antibody (0.7 nmol) were added 8 eq. of Lumi4 (Tb) - NHS cryptate Lumi4 (Tb) activated as NHS ester (solution in anhydrous DMSO CISbio HTRF ® ® Lumi4 -Tb-NHS cryptate labeling kits). After lh of incubation at 20 ° C the mixture was purified on a NAP5 column equilibrated in the 100mM phosphate buffer pH7.
  • the labeling of a mouse monoclonal antibody clone 9A7 (reference Acris Antibodies GmbH # AM26492AF) by an acceptor (d2) is described by way of example:
  • Antibody daughter solutions are prepared:
  • Anti-ATP1Al A) -lumi4 (Tb): 20 nM / Anti-ATPIAI (B) -d2: 100 nM
  • Antibody solutions and dilutions are prepared in detection buffer (CISbio ref 62SDBRDF).
  • Cells (SKBR3 or MDA-MB-453) from culture (approximately 17 to 20 ⁇ 10 6 confluent cells in a T175 culture flask) were washed with PBS and then dissociated, transferred to a centrifuge tube (50 ml) and centrifuged. (400 g / 3 min). After removing the supernatant, the pellet obtained was lysed in 3 ml of "Cellular kinase lysis buffer # 4" (CISbio ref 64KL4FDF) for 30 min at 4 ° C. (shaking) and then after transfer into an eppendorf tube and centrifugation (15 min. 4 ° C to 14,000 g) The supernatant (Lysat) was collected and stored frozen at -80 ° C.
  • lysis buffer # 4 and 10 ⁇ l were plated in the wells of a 384w F-bottom, SV, Hibase microplate. , White (GREINER # 784075).
  • White GREINER # 784075.
  • Each dilution of lysate was deposited (triplets) in three distinct lines of the microplate for example the MB-453 lysate dilution series was deposited in lines B, E and H: wells B1, B2 ; B3, etc. El, E2, E3, etc. H1, H2, H3, etc.
  • the lysate dilution series of SKBR3 was deposited in lines C, F and I: wells C1, C2, C3, etc .... Fl, F2, F3, etc. It, 12, 13, etc.
  • the antibody solutions are prepared in detection buffer (CISbio ref 62SDBRDF).
  • the plate was read in TRF mode on a Pherastar (BMG) reader using the following parameters corresponding to the 665 nm emission filter for the wells corresponding to the ATPlAl assay and the 520 nm emission filter for the wells corresponding to the HER2 assay:
  • Optical module HTRF
  • Optical module TRF 337 620 520
  • D520 E520 - B520.
  • a value greater than zero indicates the existence of TR-FRET between the donor (lumi4 cryptate (Tb)) and the acceptor (A488) and makes it possible here to quantify the HER2 protein.
  • the obtained D520 values (HER2) are calculated from the fluorescence values measured in wells B2, B3, etc.).
  • the obtained D665 values (ATP1A1) are calculated from the fluorescence values measured in the wells E1, E2, etc.).
  • the obtained D520 values (HER2) are calculated from the fluorescence values measured in the wells C2, C3, etc.).
  • the obtained D665 values (ATPIAI) are calculated from the fluorescence values measured in the wells F2, F3, etc.).
  • the number of HER2 receptors expressed per cell was also measured using the quantitative FACS (Quifikit) obtained in the literature. These HER2 / cell expression values reported in the literature range from 162,847 for MB-453 and 510,390 for SKBR3 to 333,544 for MB-453 and 960,000 for SKBR3 (DeFazio Poster in EJC Supplements 6 (12): 30 -30 October 2008). The same authors, by the same technique of quantitative FACS, give 292,984 for MB-453 and 1,402,832 for SKBR3 in another article (De Fazio, Breast Cancer Res 2011; 13 (2): R44).
  • the ratio between the average values of the D520 / D665 ratios representing the amount of HER2 normalized by the amount of ATPlA1 is of the same order of magnitude as the ratios between the amounts of HER2 expressed in the membrane obtained by FACS.
  • the differences observed between the ratios of the expressions obtained from FACS data and the ratios of the expressions measured by the normalized HTRF method can be explained by the fact that the method of the invention measures the totality of HER2 of a cell. (membrane + cytoplasmic) whereas the technique using the FACS measures membrane expression ie. the amount of HER2 on the plasma membrane of the cell.
  • the measurement obtained by the method of the invention being done on a lysate therefore represents the total amount of HER2 in the same way as the measurement of the amount of HER2 obtained by western blot represents the total amount of HER2 (membrane + cytoplasmic). Only the data corresponding to the membrane expression of HER2 expressed in number of receptors per cell measured by FACS (hence membrane) are available in the literature.
  • the HER2 / ATP1A1 ratios are therefore identical (with measurement uncertainties) for a lysate of a given line, whether the measurements are made in separate wells or in the same well ("multiplex" test).
  • SKBR3 cells breast cancer
  • H EK cells Human Embryonic Kidney
  • Lysates were then prepared either from SKBR3 cells alone, or from SKBR3 cells diluted by the same number of HEK cells (ratio 1: 1), or from SKBR3 cells diluted by 3 times more HEK cells ( ratio 1: 3) etc.
  • lysates were then diluted 1/16 in lysis buffer and ⁇ were deposited (triplets) in the wells of a microplate. "White" (triplet) wells were formed by depositing only ⁇ LB4 lysis buffer (A9-A11 wells).
  • a solution of the anti-HER2 (A) -lumi4 antibody (Tb) at a concentration of 4 nM was prepared by dilution of the antibody Abl5-lumi4 (Tb) (see labeling above) in detection buffer ( CISbio ref 62SDBRDF).
  • a solution of the anti-HER2 (B) -d2 antibody at a concentration of 40 nM was prepared by dilution of the Ab8-A488 antibody (see labeling above) in detection buffer (CISbio ref 62SDBRDF) then equal volumes of these solutions were mixed and 10 ⁇ of this mixture was added to the wells.
  • volume of 5 ⁇ of anti-HER2 (A) -Lumi4 (Tb) / anti-HER2 (B) -d2 solution and 5 ⁇ of anti-MUC1 (A) -TBP (Eu) / solution anti-MUC1 (B) -XL665 were added to 10 ⁇ of lysates (or 10 ⁇ of LB4 for "white" A9-A11 wells).
  • the plate was read in TRF mode on a Pherastar (BMG) reader using the parameters corresponding to the 665 nm emission filter for the wells corresponding to the MUC1 assay and the 520 nm emission filter for the wells corresponding to the HER2 assay using the same parameters as indicated above (see example 3).
  • the values of D520 / D665 corresponding to the different lysates are shown in FIG. 2 as a function of the SKBR3 / HEK ratio initially present before the lysis step. This always in order to mimic the situation where in a tumor the cancerous cells represented by SKBR3 are in the presence of a variable number of "normal" cells represented by HEK.
  • the ratio D520 / D665 is constant, it represents the amount of HER2 present in the sample normalized by the amount of MUC1 present in the sample, this ratio characterizes the expression of HER2, that is, that is, the number of HER2 receptors per cell of interest (HER2 expression that characterizes SKBR3 as a cancer cell).
  • the HER2 / MUC1 ratios representing the expression of HER2 calculated from the signal values at 520 nm and at 665 nm for the SKBR3 line are constant (with measurement uncertainties), that these cells represent a homogeneous population of a single cell type (cancer cells), or that these cells represent a heterogeneous mixture of two cell types SKBR3 (cancerous) and HEK (non-cancerous) present in varying proportions in the initial sample from which a lysate.
  • This example shows the possibility of simultaneously measuring in a same well (multiplexing) the signal emitted at 665 nm resulting from a FRET between a europium complex [TBP (Eu)] and an acceptor (like XL665) emitting at 665 nm (measurement of the normalizing protein) and the 520 nm signal resulting from a FRET between a terbium complex [Lumi4 (Tb)] and an acceptor (like Alexa-488) emitting at 520 nm (measurement of the protein of interest that the we want to normalize).

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Abstract

L'invention concerne un procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique contenant des cellules, ledit échantillon étant lui-même contenu dans un milieu de mesure, qui consiste à mesurer en plus de la protéine d'intérêt, une protéine de référence dont le niveau d'expression est relativement constant d'une cellule à l'autre ou d'un type cellulaire à l'autre. L'invention concerne également une trousse et un fluorimètre pour la mise en œuvre de ce procédé.

Description

Procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique Objet de l'invention
L'invention est relative à un procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique, ce procédé comprenant des moyens de normalisation du signal mesuré par la quantité de matériel biologique présent dans le milieu de mesure. L'invention concerne également une trousse de réactifs et un fluorimètre destinés à la mise en œuvre de ce procédé. Etat de la technique
Les composés fluorescents constituent un outil de choix pour la recherche en biologie dans la mesure où ils permettent, en combinaison avec les équipements capables de détecter leur luminescence, de visualiser les processus biologiques au niveau cellulaire, voire moléculaire, par microscopie ou bien par simple mesure de leur luminescence à l'aide d'un fluorimètre. Ces composés peuvent être utilisés tels quels pour colorer certains compartiments des cellules ou des tissus, ou bien être conjugués à des vecteurs qui vont les transporter vers un site spécifique. De tels vecteurs peuvent être par exemple des anticorps spécifiques d'un composant cellulaire (tel qu'une protéine) que l'on souhaite marquer par un composé fluorescent, ou bien tout composé qui présente une spécificité pour un compartiment ou un composant cellulaire.
Le phénomène de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Fluorescence Résonance Energy Transfer ») est largement utilisé en biologie, notamment pour étudier des interactions moléculaires. Il est basé sur l'utilisation d'un composé donneur fluorescent (par exemple un complexe ou un cryptate de terre rare) et d'un composé accepteur éventuellement fluorescent, chacun de ces composés étant couplé à une molécule biologique. Lorsqu'un phénomène biologique provoque le rapprochement de ces molécules, et que le composé donneur est excité, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur et va résulter en une variation de la luminescence émise par le milieu réactionnel, notamment une augmentation du signal émis par le composé accepteur et une diminution de la luminescence du donneur. Cette variation est quantifiable par la mesure de l'intensité de la luminescence et/ou de sa durée de vie. Cette luminescence peut être mesurée par un fluorimètre réglé aux longueurs d'onde d'émission des composés fluorescents, et le signal de FRET ainsi obtenu, le plus souvent constitué du ratio du signal de l'accepteur sur celui du donneur, permet ainsi de suivre l'évolution du phénomène observé. La mise en œuvre de cette technique avec des chélates ou des cryptâtes de terres rares, développée notamment par G. Mathis et al. (« Homogeneous time resolved fluorescence ernergy transfer using rare earth cryptâtes as a tool for probing molecular interactions in biology », Spectrochimica Acta Part A 57 (2001) 2197-2211) présente de nombreux avantages qui ont déjà permis plusieurs applications dans le domaine du diagnostic in vitro et dans celui du criblage à haut débit dans l'industrie pharmaceutique. Plusieurs sociétés commercialisent des réactifs permettant la mise en uvre de cette approche pour étudier des processus biologiques ; par exemple la Demanderesse fournit différents réactifs, dont des cryptâtes de terre rare, pour l'étude de phénomènes biologiques particuliers (détection d'activité enzymatique, dosage de seconds messagers etc.).
Les chélates ou cryptâtes de terre rare luminescents, en particulier les cryptâtes ou chélates d'europium ou de terbium, ont une durée de vie de l'ordre de la milliseconde qui autorise la mesure du signal de FRET émis par le milieu de mesure après un délai suivant l'excitation du composé donneur. Cette technique de mesure de FRET en temps résolu (TR-FRET, pour « Time Resolved FRET ») permet de s'affranchir de la luminescence parasite émise par le milieu de mesure immédiatement après son excitation et est donc particulièrement avantageuse lorsque le milieu de mesure comprend du matériel biologique riche en composés, notamment protéiques, susceptibles de produire ce genre d'interférence.
Si la technique de TR-FRET a longtemps été mise en œuvre sur des systèmes biologiques relativement bien contrôlés, tels qu'une enzyme donnée et son substrat, deux protéines interagissant l'une avec l'autre, ou encore le dosage d'un analyte dans du plasma ou du sérum sanguin, elle a récemment été appliquée à des environnements beaucoup plus complexes, et notamment des cellules, des lysats cellulaires ou des explants tissulaires. Un des problèmes des tests in vitro pratiqués sur ce type de matériel (les tests in vitro réalisés sur des tissus prélevés sur un organisme sont également nommés « tests ex vivo ») réside dans la difficulté de contrôler le nombre de cellules présentes dans le milieu de mesure, rendant la comparaison des résultats obtenus dans différents tests d'autant plus difficile. Ce problème technique est particulièrement critique lorsque l'on souhaite appliquer la technique de TR-FRET à l'analyse clinique d'échantillons de tissus natifs caractérisés par une grande disparité en contenu cellulaire.
Des techniques d'évaluation ou bien de normalisation par rapport à la quantité de cellules présentes dans le milieu de mesure sont disponibles : il est tout d'abord possible d'introduire dans le milieu de mesure un nombre connu de cellules par distribution d'une suspension homogène de cellules. Des techniques de dénombrement des cellules sont également utilisées, mais elles sont relativement fastidieuses et peu adaptées à l'analyse d'un grand nombre d'échantillon (microscopie, FACS). Une autre approche consiste à évaluer la quantité de certaines protéines « ubiquitaires », dont la présence reflète indirectement la quantité de cellules présentes dans le milieu de mesure (par exemple GAPDH, actine). Cette approche est utilisée dans les dosages de protéine de type « Western Blot », qui ne sont pas basés sur des mesures de TR-FRET, et également pour la quantification d'acides nucléiques, notamment d'ARN messagers rétrotranscrits. Dans ce cas c'est la séquence d'ADN codant pour une protéine ubiquitaire qui est quantifiée.
Des méthodes basées sur l'utilisation d'agents fluorescents s'intercalant dans l'ADN, ou se liant à celui-ci, sont également utilisées : ces agents ont la particularité d'être luminescents à des longueurs d'onde différentes selon qu'ils sont complexés ou non avec l'ADN; le calcul du ratio des signaux mesurés à ces deux longueurs d'onde permet d'évaluer la quantité d'ADN présent dans le milieu. Des exemples de tels agents intercalants sont les produits Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 ou DAPI. Une méthode d'utilisation de tels agents dans un dosage basée sur la mesure d'un signal de FRET est décrite dans la demande internationale de brevet WO 2013/124544. Cette technique nécessite généralement de mettre en présence l'échantillon avec une concentration élevée de fluorophore, ce qui nécessite de ce fait une séparation physique (« lavage ») permettant d'éliminer le fluorophore en excès pour atteindre une sensibilité suffisante.
Enfin, il est toujours possible d'utiliser la méthode de Bradford qui permet, grâce à l'utilisation d'un colorant (bleu de coomassie) dont l'absorbance vers 600 nm est modifiée lors de sa liaison avec les protéines, de quantifier la charge protéique du milieu. La valeur obtenue est utilisée pour normaliser le résultat de dosages cellulaires vis-à-vis du nombre de cellules [Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-54, 1976; Total Protein Analysis as a Reliable Loading Control for Quantitative Fluorescent Western Blotting. Eaton et al. PLOS ONE 2013, 8 (8) : e72457].
Il n'existe aujourd'hui aucun moyen satisfaisant d'étudier des phénomènes biologiques par la technique de TR-FRET sur des échantillons de cellules ou des extraits de tissu où, en raison des quantités variables de cellules d'un milieu de mesure à l'autre, il est difficile de comparer les résultats. Les techniques disponibles sont fastidieuses, introduisent des risques d'erreur et ne sont pas adaptées à l'analyse rapide de plusieurs dizaines ou centaines d'échantillons sans avoir à séparer ou centrifuger la solution. Il serait donc particulièrement avantageux de pouvoir mesurer par T -F ET, et sans étapes de lavage et séparation, la luminescence émise dans des milieux contenant des quantités indéterminées de cellules, et par voie de conséquence un signal spécifique d'une protéine d'intérêt indépendamment de la variabilité de la teneur cellulaire.
Description de l'invention
Les inventeurs ont mis au point un procédé de détection de la présence d'une protéine d'intérêt dans un milieu de mesure, qui tient compte de la quantité totale de cellules présentes dans ce milieu, ou de la quantité totale d'un type particulier de cellule.
Ce procédé, basé sur l'utilisation de la technique de TR-FRET, consiste à mesurer, en plus de la protéine d'intérêt, une protéine de référence dont le niveau d'expression est relativement constant d'une cellule à l'autre ou d'un type cellulaire à l'autre. La protéine de référence peut également être caractéristique d'un état physiopathologique donné.
Selon l'invention, la protéine d'intérêt est mesurée grâce à un premier couple de partenaires de TR-FRET constitué d'un premier donneur et d'un premier accepteur, et la protéine de référence est mesurée grâce à un second couple de partenaires de TR-FRET constitué d'un second donneur et d'un second accepteur.
Un signal de TR-FRET est classiquement obtenu en mesurant la luminescence émise par le milieu de mesure à la fois à la longueur d'onde d'émission du composé donneur et à celle du composé accepteur, et en calculant un ratio entre les deux mesures, généralement le ratio du signal émis par le composé accepteur sur celui émis par le composé donneur. Grâce à l'utilisation de ce ratio, il a été montré qu'il était possible de s'affranchir de la variabilité optique du milieu, d'un échantillon à l'autre (Mathis G, Clin. Chem. 1993, 39(9):1953-1959). De manière inattendue, il n'est pas nécessaire, dans la mise en œuvre du procédé selon l'invention, d'effectuer la mesure à la longueur d'onde des donneurs. Une caractéristique essentielle de l'invention réside donc dans le fait que la luminescence émise à la longueur d'onde du donneur n'est pas mesurée. L'invention consiste, après excitation des donneurs, à mesurer seulement les signaux émis aux longueurs d'onde d'émission des deux accepteurs, à savoir celui utilisé pour la détection de la protéine d'intérêt et celui utilisé pour la détection de la protéine de référence. Un ratio des deux signaux est calculé, de préférence celui du signal émis par le premier accepteur (protéine d'intérêt) sur celui émis par le second accepteur (protéine de référence). La proportion de protéine de référence choisie étant relativement constante d'une cellule à l'autre, ce ratio permet non seulement de normaliser le signal obtenu pour la protéine d'intérêt par la quantité de cellules présente dans le milieu de mesure, mais également de le normaliser pour tenir compte des différences de propriétés optiques entre deux milieu de mesure différents. Ces différences de propriétés optiques sont liées à la composition du milieu, notamment la présence de certains composés protéiques ou autres, qui influencent la qualité optique du milieu.
Finalement, le procédé selon l'invention permet de quantifier la présence d'une protéine d'intérêt présente dans un milieu de mesure contenant un échantillon biologique, et de comparer cette quantité à celle présente dans un autre échantillon. Les mesures obtenues peuvent être comparées puisque le procédé selon l'invention permet de corriger ces mesures pour tenir compte d'une part de la quantité de matériel biologique présent d'un échantillon à l'autre, d'autre part des différences de propriétés optiques d'un milieu de mesure à l'autre. La mesure obtenue pour un échantillon est rendue indépendante de son milieu et de la quantité de cellules, par la détermination de la densité de protéine d'intérêt, que l'on peut alors comparer d'un échantillon à l'autre. Cela est particulièrement utile lorsque l'échantillon biologique est issu d'un patient, et que la quantification de la protéine d'intérêt permet d'obtenir une information quant à l'état du patient, notamment pour poser un diagnostic, suivre l'évolution de son état de santé ou encore l'efficacité d'un traitement.
Par ailleurs, un des avantages du procédé selon l'invention est qu'il ne nécessite pas de mesurer le signal émis par le ou les composés fluorescents donneurs, contrairement à ce qui est pratiqué dans les mesures de signaux de TR-FRET classiques [Mathis G op.cit.]. Dans une mise en œuvre préférée explicitée plus loin, après excitation des donneurs, seulement deux mesures de luminescence sont nécessaires pour quantifier la protéine d'intérêt, contre quatre mesures selon l'approche classique.
Dans son premier aspect, l'invention concerne donc un procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique contenant des cellules et une protéine de référence, ledit échantillon étant lui-même contenu dans un milieu de mesure, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) homogénéisation de l'échantillon sous forme de lysat cellulaire ;
b) distribution du lysat cellulaire dans un seul contenant ou bien dans des contenants différents ;
c) introduction dans le milieu de mesure d'un premier et d'un deuxième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à la protéine d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués par un premier composé donneur et un premier composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ; d) introduction dans le milieu de mesure d'un troisième et d'un quatrième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique de la protéine de référence, ces ligands étant respectivement marqués par un deuxième composé donneur et un deuxième composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ;
e) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du premier composé donneur ;
f) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ;
g) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du deuxième composé donneur ;
h) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième composé accepteur;
i) calcul du ratio des signaux mesurés aux étapes f) et h), ce ratio étant représentatif de la quantité de protéine d'intérêt présente dans l'échantillon, normalisée par la quantité de protéine de référence;
sous réserve que :
lorsque l'échantillon est distribué dans un seul contenant, la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième accepteur est différente de celle correspondant au pic d'émission du premier accepteur, et que
lorsque l'échantillon est distribué dans deux contenants, les étapes c), e) et f) sont mises en œuvre dans le premier contenant, et les étapes d), g) et h) sont mises en oeuvre dans le deuxième contenant.
Par « contenant » on entend un tube, un puits de plaque ou de microplaque ou tout autre contenant généralement utilisé pour procéder à des dosages biologiques.
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation différentes.
Dans un second mode de réalisation de l'invention, le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques.
Dans un troisième mode de réalisation de l'invention, le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, et l'échantillon est distribué dans deux contenants différents. Dans un quatrième mode de réalisation de l'invention, le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, l'échantillon est distribué dans un seul contenant, et le procédé ne comprend pas d'étape g). Ce mode de réalisation est préféré. Dans les modes de réalisation de l'invention selon lesquels l'échantillon est distribué dans un seul contenant, les étapes de mesure de la luminescence des accepteurs (étapes f) et h)), peuvent être mise en œuvre simultanément. Des fluorimètres fonctionnant en mode temps résolu et permettant une mesure simultanée de luminescence émise à deux longueurs d'onde différentes sont disponibles dans le commerce (par exemple auprès des sociétés BioTek, BMG LABTECH GmbH, Molecular Devices, BRAHMS GmbH, Tecan Group Ltd., Berthoid Technologies GmbH, Furuno Furuno Electric Co., Ltd, ou encore Perkin Elmer).
Dans les modes de réalisation de l'invention selon lesquels le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, il est avantageux que le premier et le deuxième donneur soient identiques.
Le procédé conforme à l'invention peut être mis en œuvre en combinaison avec le procédé de normalisation de la luminescence émise par un milieu de mesure décrit dans la demande de brevet WO 2013/124544 dont le contenu intégral est incorporé par référence à la présente demande.
Cette demande de brevet décrit un procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue,
b) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, c) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue,
mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 μ5, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, e) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape d), après un délai de 20 à 200 μ≤ suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 \xs, cette luminescence correspondant principalement à celle du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) calcul d'un signal de luminescence normalisé correspondant au ratio : (signal obtenu à l'étape e) / (signal obtenu à l'étape d).
Dans une mise en œuvre préférée du procédé décrit dans WO 2013/124544, la luminescence mesurée est celle consécutive à un phénomène de TR-F ET dans le milieu de mesure, c'est-à- dire un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur. Dans cette mise en œuvre, le composé fluorescent à durée de vie longue joue le rôle du donneur d'énergie et le procédé précédent comprend alors les étapes suivantes : a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue,
b) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET,
c) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, d) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue,
e) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 μ5, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, f) éventuellement, mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape e), après un délai de 20 à 200 μ≤ suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 g) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure après un délai de 20 à 200 \is après l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 600 μ5, à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur,
h) détermination d'un signal de TR-FRET normalisé comprenant le calcul du ratio : (signal obtenu à l'étape g) / [(éventuellement signal obtenu à l'étape f) X (signal obtenu à l'étape e)] .
Dans son deuxième aspect, la présente invention concerne une trousse de réactifs pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention. Cette trousse de réactifs comprend :
un premier et un deuxième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à une protéine d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués par un premier composé donneur et un premier composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ;
un troisième et d'un quatrième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à une protéine de référence, ces ligands étant respectivement marqués par un deuxième composé donneur et un deuxième composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET, et la longueur d'onde correspondant au pic d'émission de ce deuxième accepteur étant différente de celle correspondant au pic d'émission du premier accepteur.
La trousse selon l'invention peut également contenir un calibrateur ainsi qu'une composition contenant une quantité connue de protéine d'intérêt, y compris un lysat cellulaire contenant cette protéine. La trousse selon l'invention peut également comprendre un calibrateur constitué d'une dilution de lyse d'une lignée cellulaire exprimant soit la protéine de référence soit la protéine de référence et la protéine d'intérêt. De plus, la trousse selon l'invention peut comprendre un com posé fluorescent possédant une durée de vie courte et se liant à l'ADN ou aux protéines cellulaires ; ainsi que des instructions pour normaliser le signal de la protéine d'intérêt par la protéine de référence.
Dans un troisième aspect, l'invention concerne un fluorimètre pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Ce fluorimètre est contrôlé par un logiciel pour la mise en œuvre de l'algorithme suivant :
a) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du premier composé donneur ;
b) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ; c) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du deuxième composé donneur ;
d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième composé accepteur, cette longueur d'onde étant différente de celle correspondant à un pic d'émission du premier composé accepteur ;
e) calcul du ratio des signaux mesurés aux étapes b) et d).
Dans le cas du mode de réalisation selon lequel le premier et le deuxième donneur ont des bandes d'excitation identiques, l'étape c) peut être omise. De préférence, le fluorimètre selon l'invention comporte une tête de lecture permettant la mesure simultanée de la luminescence émise par les deux accepteurs à deux longueurs d'onde différentes.
Protéine de référence :
La protéine de référence est de préférence une protéine dite « de ménage ». La notion de protéine de ménage est connue de l'homme du métier : elle désigne des protéines dont la présence est nécessaire au maintien des fonctions cellulaires de base, elles assurent le maintien de l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la cellule et sont exprimées à des niveaux relativement constants et cela indépendamment du type de la cellule, de son environnement et de l'état de l'organisme auquel elle appartient (normal ou pathologique). La protéine de référence est choisie de manière préférée parmi les protéines suivantes : β- actine, GAPDH, HSP70, HSP90, la sous-unité alpha de la NaK-ATPase, TE T, une histone et en particulier l'histone H6. En ce qui concerne le choix d'une protéine de référence adéquate l'expérimentateur peut s'aider des travaux portant sur l'évaluation de divers gènes en tant que « gène de référence » comme l'hypoxanthine ribosyltransférase (HPRT) [De Kok et al: Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab. Invest. 2005, 85:154-159; Ho-Pun-Cheung et al. Validation of an appropriate référence gene for normalization of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction data from rectal cancer biopsies. Anal. Biochem. 2009, 388:348- 350].
La protéine de référence peut également être caractéristique d'un état physiopathologique donné. Par exemple, la protéine de référence peut être une protéine caractéristique des cellules cancéreuses comme par exemple les cytokératines pour les cellules épithéliales, ou caractéristique du comportement de la cellule cancéreuse comme par exemple Ki67 qui traduit une prolifération ou HIF (acronyme de l'expression anglaise « Hypoxia Inducible Factors ») qui est surexprimée dans des environnements hypoxiques.
La protéine de référence est naturellement contenue dans le milieu de mesure (les cellules du milieu) ; le procédé de l'invention ne comprend donc aucune étape d'addition d'une telle protéine de référence dans le milieu de mesure.
L'échantillon biologique :
Dans une mise en œuvre préférée, l'échantillon biologique est un échantillon de tissu prélevé sur un patient (tissu dit « natif »), comme par exemple un échantillon de tissu solide prélevé dans le cadre d'une biopsie. Le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre notamment à partir d'un échantillon biologique sous forme de coupes FFPE (acronyme de l'expression anglaise « formalin fixed paraffin embedded »), ou encore de cryosections. L'échantillon biologique peut également avoir été prélevé par la technique de biopsie d'aspiration à l'aiguille fine.
Les techniques de préparation de tissu sous forme de coupes FFPE sont connues de l'homme du métier : elles peuvent consister en particulier en la fixation de l'échantillon par un traitement avec du formaldéhyde, son inclusion dans de la paraffine, en particulier sous forme de blocs qui peuvent être ensuite découpés au microtome (de préférence avec une épaisseur d'environ 1 à 50 μιη). Le traitement de ces sections au xylène pour enlever la paraffine, leur rinçage à l'éthanol puis à l'eau sont également des techniques connues de l'homme du métier, de même que la régénération des épitopes par la technique HIER (acronyme de l'expression anglaise « heat induced eptitope recovery », décrite notamment dans le brevet américain US 8,067,241).
De manière alternative, le procédé selon l'invention peut également être mis en œuvre sur des cryosections, de préférence de 1 à 50 μιη d'épaisseur, également préparées selon les techniques classiques.
Le procédé selon l'invention comporte une étape d'homogénéisation de l'échantillon biologique sous forme de lysat cellulaire, ledit lysat cellulaire étant distribué dans un ou plusieurs contenants différents avant l'introduction du premier et du deuxième ligand dans le milieu de mesure. Cette homogénéisation peut être obtenue par un traitement mécanique, choisi parmi : l'application d'ultrasons (sonication), des cycles de congélation / décongélation, l'utilisation de broyeurs mécaniques, éventuellement conjointement à l'utilisation de tampon de lyse hypotonique ou de tampon de lyse contenant des détergents comme le tampon RIPA. En fonction de la nature de la protéine d'intérêt et de la protéine de référence, on veillera à utiliser des conditions de traitement ménagées. En particulier, si le procédé est mis en œuvre dans le cadre de l'étude de structures subcellulaires ou encore d'agrégats ou d'oligomères de protéines, un traitement mécanique trop violent ou un traitement chimique trop drastique, pourrait dégrader ou dissocier ces structures ou oligomères. L'homme du métier peut facilement ajuster ces paramètres de traitement chimique ou mécanique en fonction du matériel étudié. Un exemple de traitement mécanique ménagé consiste à appliquer par exemple au milieu de mesure des ultrasons (sonication) à une fréquence > 16 000 Hz, à une puissance de 80 W et pendant une durée de 3 à 10 secondes, et de préférence pendant 4 à 6 secondes. Les échantillons sont de préférence maintenus dans un bain de glace pendant le traitement pour limiter leur échauffement.
Lorsque l'échantillon biologique est préparé sous forme d'homogénat, il peut être dilué selon un facteur de dilution qui dépend de plusieurs facteurs et en particulier de l'affinité des ligands avec la protéine d'intérêt et la protéine de référence, et également de la concentration normale de protéine d'intérêt ou de protéine de référence dans l'échantillon. Ces dilutions relèvent de mise au point de routine pour l'homme du métier spécialiste de la détection de protéines dans des milieux biologiques. L'échantillon est dilué de préférence après son homogénéisation sous forme de lysat cellulaire et avant sa distribution dans un ou plusieurs contenants.
Le procédé selon l'invention peut également être mis en oeuvre sur des cellules issues de cultures cellulaires. Dans ce cas, l'homogénéisation peut être effectuée par exemple par sonication ou encore en utilisant un tampon de lyse. La méthode de lyse la plus simple appelée lyse osmotique, consiste à mettre les cellules dans un milieu hypotonique. Pour faciliter la rupture de cellules, on ajoute souvent un détergent non ionique comme le Triton® ou le Tween®, ou un détergent anionique comme le SDS (dodécylsulfate de sodium). Le SDS est un surfactant très efficace pour la solubilisation de presque toutes les protéines. Il détruit les ponts non-covalents des protéines, les dénaturant de telle sorte qu'elles perdent leur conformation originale et leur fonction, de ce fait, il ne doit théoriquement pas être utilisé quand des protéines actives sont nécessaires ou quand les interactions protéine-protéine sont étudiées. Généralement pour une lyse cellulaire complète, l'échantillon doit être traité aux ultrasons à l'aide d'un sonicateur. D'autre surfactants moins « abrasifs » tels que le Triton® X-100, NP-40, CHAPS, le Tween® 20, sont utilisés soit seuls soit en combinaison. Un tampon de lyse contient souvent des additifs tels que du glycérol et des sels qui modifient la valeur de la CMC (concentration micellaire critique) des détergents, ainsi que des additifs inhibiteurs de protéases ou de phosphatases. Des tampons de lyse sont disponibles dans le commerce. Cette étape peut être mise en œuvre préalablement ou postérieurement à l'introduction des couples de partenaires de T -FRET dans le milieu de mesure.
Les ligands spécifiques de la protéine d'intérêt ou de la protéine de référence
Dans une mise en œuvre préférée, les ligands comportant un domaine de liaison à la protéine d'intérêt et à la protéine de référence sont des anticorps reconnaissant ces protéines. Le terme « anticorps » doit ici être pris au sens large et comprend toute protéine de la famille des Immunoglobulines ou bien comportant un domaine d'une immunoglobuline, ainsi qu'un site de liaison spécifique à la protéine d'intérêt. Les anticorps peuvent donc être des fragments Fab, Fab', des anticorps simple chaîne ou simple domaine, des domaines variables de chaînes lourdes ou légères d'immunoglobulines.
L'homme du métier est à même de fabriquer des anticorps spécifiques de la protéine d'intérêt et de la protéine de référence en utilisant les techniques classiques. De nombreux anticorps sont également disponibles dans le commerce. L'homme du métier veillera à sélectionner des anticorps reconnaissant des épitopes différents sur la protéine d'intérêt et sur la protéine de référence, cela pour permettre la fixation simultanée de l'anticorps marqué par le donneur et de celui marqué par l'accepteur.
Les ligands spécifiques peuvent également être des aptamères ou autres bioprobes. Marquage des ligands ou anticorps par des composés donneurs ou accepteurs d'énergie
Le marquage d'un ligand ou d'un anticorps par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation de groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme « fonctionnalisée », c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le composé à marquer, en l'occurrence, le ligand ou l'anticorps.
Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou accepteur est un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est respectivement mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous : GROUPE ELECTROPH ILE GROUPE NUCLEOPH ILE TYPE DE LIAISON acrylamides thiols thioéthers
halogénures d'acyle amines/anilines carboxamides
aldéhydes amines/anilines imines
aldéhydes ou cétones hydrazines hydrazones
aldéhydes ou cétones hydroxylamines oximes
alkyl sulfonates thiols thioéthers
anhydrides amines/anilines carboxamides
halogénure d'aryle thiols thioéthers
halogénure d'aryle aminés aryl aminés
aziridines thiols thioéthers
carbodiimides acides carboxyliques N-acylurées ou anhydrides esters activés* amines/anilines carboxamides
haloacétamides thiols thioéthers
halotriazines amines/anilines aminotriazines
imido esters amines/anilines amidines
isocyanates amines/anilines urées
isothiocyanates amines/anilines thiourées
maléimides thiols thioéthers
sulfonate esters amines/anilines alkyl aminés
halogénures de sulfonyle amines/anilines sulfonamides
* par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est :
• un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-OC4H4N02), suifo succinimidyloxy (-OC4H3NO2-SO3H) ;
« un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tel que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ;
• un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride - OCORa ou -OCN RaN HRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et sont choisis parmi les groupes alkyles en C C6, perfluoroalkyles en Ci-C6, alkoxy en C C6, cyclohexyle ;
• le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle. Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et aminés respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les anticorps marqués sont caractérisés par le rapport molaire final (RMF) qui représente le nombre moyen de molécules de marqueur greffés au ligand.
Lorsque le ligand est de nature protéique, il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement présent dans les protéines : le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les groupes aminés des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines.
Si le ligand ne comporte pas de groupe fonctionnel à l'état naturel, de tels groupes peuvent être introduits. Des méthodes d'introduction de groupes fonctionnels sont notamment décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd édition, L.J. Kricka (1995), Ed. Académie press Ltd., Londres, p. 66-72.
Une autre approche pour le marquage d'un ligand par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans le ligand, par exemple un groupe NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore portant un groupe fonctionnel qui réagira avec le groupe réactif pour former une liaison covalente.
Il est important de vérifier que le ligand marqué conserve une affinité suffisante pour la protéine d'intérêt ou la protéine de référence ; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante d'affinité du ligand marqué pour la protéine.
Couples de partenaires de FRET
Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie.
Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Forster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de l'autre, et que le composé donneur est excité à une longueur d'onde correspondant à un de ses pics d'absorption, un transfert d'énergie aura lieu, provoquant une diminution de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission du donneur, et une augmentation de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur.
La sélection des fluorophores donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd édition, Kluwer academic/plenum publishers, NY (1999)), auquel l'homme du métier pourra se référer.
Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et 6 ms), en particulier les chélates ou cryptâtes de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET en s'affranchissant du phénomène d'autofluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptâtes d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés.
Dans le mode de réalisation du procédé selon l'invention selon lequel le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, ils peuvent être tous deux de préférence soit un chélate ou cryptate d'Europium, soit un chélate ou cryptate de Terbium, ce dernier cas étant particulièrement préféré.
Dans le mode de réalisation du procédé selon l'invention selon lequel le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation différentes, de préférence l'un est un chélate ou cryptate d'Europium, et l'autre un chélate ou cryptate de Terbium. Dans ce mode de réalisation, le premier et le deuxième composé donneur peuvent être tous deux des chélates ou cryptâtes d'Europium, sous réserve que les chélates ou cryptâtes possèdent des structures différentes. Il en est de même lorsque le premier et le deuxième composé donneur sont des chélates ou cryptâtes de Terbium.
Par « bande d'excitation », on entend une plage de longueurs d'onde qui peuvent être utilisées pour faire passer le composé donneur à un état excité. Par composés donneurs ayant des « bandes d'excitation identiques », il faut comprendre que les bandes d'excitation du premier et du deuxième donneur se chevauchent suffisamment pour permettre l'excitation du premier et deuxième composé donneur à la même longueur d'onde. Par composés donneurs à « bandes d'excitation différentes », il faut comprendre qu'il n'est pas possible d'exciter les deux donneurs de manière satisfaisante avec une seule longueur d'onde, du fait du non- chevauchement de leurs bandes d'excitation.
De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays.
Des exemples de chélates ou cryptâtes de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont : • Les cryptâtes de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptâtes de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96877. Les cryptâtes de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptâtes de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptâtes d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
Figure imgf000018_0001
TrisBiPy-Eu
Figure imgf000019_0001
Py-BiPy-Eu
Figure imgf000019_0002
TrisBiPy-tetraacide-Eu
Figure imgf000020_0001
Py-BiPy-tetraacide-Eu
• Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer.
• Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/10580.
· Les cryptâtes de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables.
• Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
Figure imgf000021_0001
et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page 89).
· Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays.
• Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
Figure imgf000021_0002
• Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(ll) tris(2,2'-bipyridine).
• Le chélate de terbium DTPA-csl24 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821.
Figure imgf000022_0001
• Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal Luminescence 1997, 75: 149-169) :
Figure imgf000022_0002
Tb-W14016
De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les cryptâtes d'europium et de terbium étant particulièrement préférés. Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont également des complexes de terres rares appropriés aux fins de l'invention.
Les composés fluorescents accepteurs doivent posséder un spectre d'absorption qui recouvre le spectre d'émission du donneur (Mathis G, op. cit.) et peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination « Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron- dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » sont commercialisés par la société Atto-tec ; les composés « DY» sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
L'invention mettant en œuvre deux accepteurs, il est essentiel que le premier et le deuxième accepteur possèdent des pics d'émissions différents lorsque l'échantillon biologique est distribué dans un seul contenant et que les mesures de la protéine d'intérêt et de la protéine de référence sont effectuées dans ce même contenant. Les spectres d'émission des accepteurs sont généralement disponibles et s'ils ne le sont pas, ils peuvent être aisément déterminés par des techniques classiques connues de l'homme du métier.
Dans le cas où les composés donneurs sont des cryptâtes de terbium, éventuellement identiques, de préférence, le premier accepteur possède un pic d'émission centré autour de 520 nm et le deuxième accepteur possède un pic d'émission centré autour de 665 nm. Alternativement, le premier accepteur possède un pic d'émission centré autour de 665 nm et le deuxième accepteur possède un pic d'émission centré autour de 520 nm. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le premier accepteur est l'Alexa 488 et le deuxième accepteur est le fluorophore d2, le premier et le deuxième donneur sont identiques et sont le cryptate de terbium Lumi4(Tb). Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, le premier accepteur est la cyanine Cy7, le deuxième accepteur est le fluorophore d2, et le premier et le deuxième donneur sont identiques et sont le cryptate d'europium trisbipyrdine. Le fluorophore d2 est une cyanine dont les propriétés spectroscopiques sont similaires à celles de l'AlexaFluor 647 ou la cyanine Cy5, à savoir un spectre d'absorption en solution aqueuse présentant un maximum d'absorption pour des longueurs d'onde entre 645 nm et 650 nm et une absorbance molaire supérieure à 200 000 M^.cm"1 , un spectre de fluorescence présentant un maximum de fluorescence entre 665 nm et 675 nm et caractérisé par un rendement quantique supérieur à 20%.
Mesure du signal de TR-FRET
La mesure du signal de TR-FRET est effectuée après excitation du milieu de mesure par une source puisée dans une bande d'excitation du composé donneur, de préférence après un délai de 1 à 500 microsecondes (με) et pendant une durée de 10 à 2000 μ≤. De manière encore plus préférée, le délai est de 50 μ≤ (temps résolu).
Le signal de TR-FRET peut être constitué par l'intensité de la luminescence mesurée, soit par sa durée de vie.
EXEMPLE 1
Dans cet exemple, la protéine EGFR a été mesurée de manière quantitative sur les lignées cellulaires suivantes:
SKBR3 : une lignée qui exprime très faiblement la protéine EGFR,
- A431 : une lignée qui exprime fortement la protéine EGFR (environ plus d'1 million de protéines d'EGFR par cellule d'après la littérature).
Le conjugué donneur AC74- Lumi4(Tb) et le conjugué accepteur AC40-d2 ont été utilisés pour la quantification par TR-FRET de l'actine contenue dans des lysats cellulaires.
Le conjugué donneur Anti-EGFR(A)-lumi4(Tb) et le conjugué accepteur Anti-EGFR(B)- Alexa488 ont été utilisés pour la quantification d'EGFR.
Préparation des ligands marqués (conjugués donneurs et conjugués accepteurs)
Marquage d'un anticorps monoclonal anti-beta-Actine (« a-Actine ») clone AC74 par un cryptate de terbium: L'anticorps commercial AC74 (2,5 mg/mL) a été dialysé contre du tampon phosphate lOOmM pH8 et dilué dans le même tampon de façon à obtenir une concentration de 1 mg/mL. A 67 pL d'anticorps (0,41 nmol) ont été ajoutés 9 éq. de Lumi4(Tb)-NHS (0,27 pL de cryptate Lumi4(Tb) activé sous forme ester de NHS 13,6 mM dans le DMSO anhydre, Cisbio HTRF® Lumi4®-Tb-NHS « cryptate labeling kits »). Après lh d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate 100 mM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué AC74-Lumi4(Tb) ([Ac] = 1,04 μΜ ; taux de marquage moyen = 6,4 cryptâtes par anticorps).
Marquage par un accepteur (d2) d'un anticorps monoclonal anti-actine, l'anticorps commercial AC-40 (référence Sigma # A 3853)
A 67 pL d'anticorps (0,41 nmol) ont été ajoutés 5 éq. de d2-NHS (0,24 pL de d2 activé sous forme ester de NHS 8,6 mM dans le DMSO anhydre, Cisbio HTRF® d2 « dye labeling kits »). Après lh d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate lOOmM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué AC40-d2 ([Ac] = 1,26 μΜ ; taux de marquage moyen = 2 molécules de d2 par anticorps).
Marquage par un accepteur Alexa-488 de l'anticorps monoclonal Anti-Actine, Clone AC-40 (référence Sigma # A 3853)
A 74 pL d'anticorps lmg/mL (0,5 nmol) dans du tampon 100 mM phosphate pH8, ont été ajoutés 17 éq. d'Alexa-488 activé sous forme ester de NHS (8,5 nmol , 5pL de A488-NHS 1,7 mM dans le DMSO). Après lh d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne
NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate lOOmM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué AC40-A488 ([Ac] = 1,25 μΜ ; taux de marquage moyen = 3 molécules d' Alexa-488 par anticorps).
Marquage des anticorps anti-EGFR :
Les anticorps anti-EGFR suivants sont disponibles dans le commerce :
Abl5(EGFR) (clone H9B4 / Mouse mAb/ NeoMarkers #MS-665),
CST#2646 (clone C74B9/ Rabbit mAb / Cell Signaling technology),
CST#4267 (clone D38B1 / Rabbit mAb/ Cell Signaling technology),
anti-EGFR (clone REGF01 / Mouse mAb / Cisbio).
Deux de ces anticorps ont été marqués selon un protocole similaire à celui utilisé pour les anticorps anti-actine, pour obtenir un conjugué donneur Anti-EGFR(A)-lumi4(Tb) et un conjugué accepteur Anti-EGFR(B)-Alexa488. Ces deux conjugués ont été utilisés pour la détection d'EGFR. Les deux anticorps ont été choisis pour leur capacité à générer un signal de
TR-FRET en présence d'EGFR recombinant. Incubation et mesure du signal
Les cellules (SKBR3 ou A431) provenant de culture (environ 17 à 20 x 106 cellules à confluence dans un flacon de culture T175) ont été lavées au PBS puis dissociées, transférées dans un tube (50 mL) pour centrifugeuse et centrifugées (400 g / 3 min). Après avoir éliminé le surnageant, le culot obtenu a été lysé dans 3 mL de « Cellular kinase lysis buffer #3 » (Cisbio réf 64KL3FDF) pendant 30 min à 20°C (agitation) puis après transfert en tube eppendorf et centrifugation (15 min à 14 000 g à 4°C) le surnageant (lysat) a été collecté et conservé congelé à -80°C. Une partie du lysat de cellule SKBR3 a été dilué au 1/8 ème en ajoutant de l'EGFR recombinant de façon à obtenir une concentration finale en EGFR de 2nM en mélangeant 200μί d'EGFR 4 nM (prédilué dans du tampon de lyse LB3), 150μί de LB3 et 50μί de lysat de SKBR3 obtenu comme décrit ci-dessus. La solution d'EGFR recombinant a été préparée à partir d'EGFR OriGene # TP710011 (concentration 0,185 μ§/μΙ). En considérant une masse moléculaire de 134 KDa on a obtenu [EGFR] = 1380 nM pour la solution mère ; on a dilué 2,9 μί de cette solution (qsp 1000 μί de LB3) pour obtenir une solution 4 nM. Le lysat résultant a été nommé « SKBR3 + 2nM EGFR ».
Chacun des lysats SKBR3, SKBR3 + 2nM EGFR et A431 a été dilué en série au demi dans le tampon de lyse LB3 et 16 μί ont été déposés dans les puits d'une microplaque 384w F-bottom, SV, Hibase, White (GREINER#784075). Des puits « blancs réactifs » ont également été préparés en déposant uniquement le tampon de lyse LB3 dans des puits contigus.
Les solutions filles d'anticorps suivantes ont été préparées dans du tampon de détection (Cisbio ref 62SDBRDF). :
- Anti-EGFR(A)-lumi4(Tb) 10 nM,
- Anti-EGFR(B)- Alexa488 50nM,
- Anti-Actine(A)-lumi4(Tb) 15 nM,
- Anti-Actine(B)- d2 200 nM.
A partir de ces solutions filles, les solutions suivantes ont également été préparées :
- Mix a-EGFR . Anti-EGFR(A)-lumi4(Tb) 5 nM / Anti-EGFR(B)- Alexa488 25 nM par dilution au demi dans du tampon de détection,
- Mix a-Actine : Anti-Actine(A)-lumi4(Tb) 7,5 nM / Anti-Actine(B)-d2 100 n M,
Mix a-Actine/a-EGFR pour test "multiplex" : Anti-Actine(A)-lumi4(Tb) 7,5 nM / Anti- EGFR(A)-lumi4(Tb) 5 nM / Anti-Actine(B)-d2 100 nM / anti-EGFR(B)-Alexa488 25 nM. Aux 16 μΙ (tampon ou dilutions de lysats) déjà distribués dans les puits ont été ajoutés 4μΙ_ d'un mélange d'anticorps choisi parmi :
Mix a-EGFR dans les puits dans lesquels EGFR seul a été mesuré,
Mix a-Actine dans les puits dans lesquels l'actine seule a été mesurée,
- Mix a-Actine/a-EGFR dans les puits dans lesquels à la fois EGFR et l'actine ont été mesurés.
La fluorescence en mode temps-résolu (TRF) a été mesurée sur un appareil ENVISION (Perkin
Elmer). Les paramètres suivants ont été rentrés sur la machine:
« Hauteur de mesure » = 12 mm ;
Paramètres de réglage des longueurs d'onde d'excitation et d'émission ainsi que du délai et de la fenêtre de mesure : 340 665 620 60_400(1) et 340 cache-520 60-400(1) ;
Filtres nécessaires : filtre excitation = UV (TRF) 340 [#101]; filtre émission = APC 665 [#205], filtre émission = Cy5 620[#118] ; 2nd filtre émission = Emission 520 [#226];
Réglages des paramètres temporels d'excitation ( nombre de flashes = 100 ) et d'émission (délai 60μ≤ ; durée de la mesure après délai = 400 μ≤).
La luminescence émise par chaque puits a été mesurée et corrigée en soustrayant la valeur du signal mesuré dans le puits « blanc réactifs » (lysat de cellule remplacé par tampon). Une valeur supérieure à zéro indique l'existence de TR-FRET entre le donneur (cryptate lumi4(Tb)) et l'accepteur (d2 ou Alexa 488) et est représentative de la quantité de la protéine mesurée Le signal mesuré à 520nm, qui correspond à un pic d'émission de l'Alexa 488, est représentatif de la quantité d'EGFR et celui mesuré à 665 (pic d'émission de d2) est représentatif de la quantité d'actine.
Les expériences ont été effectuées en doublet, et les mesures ont été faites après 3 heures d'incubation ; les signaux obtenus sont présentés dans la table 1 ci-après.
Table 1
Figure imgf000028_0001
♦expériences en doublets, la valeur présentée est la moyenne des signaux mesurés, en unité arbitraire de fluorescence. § le ratio a été multiplié par 1000 pour s'affranchir des chiffres décimaux.
On observe que
Les ratios EGFR/Actine sont constants (aux incertitudes de mesure près) à différentes dilutions pour un lysat donné ;
Les ratios EGFR/Actine sont identiques (aux incertitudes de mesure près), que les protéines soient mesurées dans des puits différents ou dans le même puits ;
Le ratio EGFR/Actine calculé pour le lysat SKBR3 est nul, ce qui est normal dans la mesure où ces cellules n'expriment pas l'EGFR ; lorsque 2nM d'EGFR ont été ajoutés au lysat, le ratio EGFR/Actine augmente, et cela que les protéines soient mesurées dans des puits différents ou dans le même puits. Le ratio EGFR/actine est encore plus élevé dans le lysat A431 ;
Les rapports des ratios EGFR/Actine sont identiques (aux incertitudes de mesure près -
640/240 = 2,7 et 600/200 =3) entre deux lysats donnés.
Ces résultats montrent que le procédé selon l'invention permet d'obtenir un signal représentatif de la quantité de protéine d'intérêt (ici EGFR), normalisé par une protéine de référence (ici l'actine), et cela en utilisant une seule longueur d'onde d'excitation et deux longueurs d'onde d'émission.
EXEMPLE 2 : Quantification EGFR sur tissu
Le procédé selon l'invention a été mis en œuvre sur des cryosections obtenues à partir de tumeurs de souris, induites par xénogreffe de cellules surexprimant le récepteur EGFR (par exemple Xenogreffe A431 (2 500 000 EGFR/cellule), Heimbrook et al. PNAS 1990 87(12):4697- 701, ou encore Xenogreffes LS-174T (colorectal, 360 000 EGFR/cellule), SKOV3 (ovaire, 220 000 EGFR/cellule), et HT-29 (colorectal, 44 000 EGFR/cellule) : Milenic et al. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 2008, 23(5): 619-632).
Après culture à partir de lignées cellulaires surexprimant EGFR à des niveaux connus et mesurés par FACS quantitatif (Quifikit), les cellules (5 x 106) ont été administrées par injection sous cutanée à des souris femelles athymiques sur leur flanc droit. Les souris portant des tumeurs ont été sacrifiées quand les tumeurs atteignaient un volume supérieur à 1500 mm3. Après sacrifice de l'animal, la tumeur a été excisée, la pièce chirurgicale ainsi obtenue a été congelée immédiatement en la plongeant dans de l'azote liquide, puis conservée à -80°C. Pour la réalisation des cryosections, le support métallique porte-échantillon d'un cryotome a été placé sur de la carboglace pendant 1 min. On a ensuite déposé quelques gouttes d'eau stérile sur le support, puis, sans attendre, déposé la pièce chirurgicale. En se congelant, l'eau a fixé l'échantillon sur le support. Ensuite l'échantillon congelé a été coupé à l'épaisseur désirée avec le microtome contenu dans le cryostat (-25°C) et les sections encore congelées (cryosections) ont été collectées dans des tubes eppendorf préalablement refroidis dans de la carboglace. L'épaisseur des cryosections était généralement comprise entre 10 μιτι et 50 μιτι. Pour les applications ci-dessous, une épaisseur de 25 μηη a été considérée comme optimum en termes de praticité de manipulation. Les cryosections ont été conservées à -80°C jusqu'à l'étape de lyse.
Les cryosections de tumeurs xenogreffes (2 coupes de 25 μιτι) collectées dans un tube eppendorf ont été lysées dans du tampon « Cellular kinase lysis buffer #3 » (Cisbio ref 64KL3FDF) pendant 30 min à 4°C (sous agitation) puis les tubes ont été soumis à une sonication (Sonicateur Branson 5s à 20% de puissance / 4°C) après centrifugation (15 min 4°C à 14 000 g), et les surnageants (lysat) ont été collectés et conservés congelés à -80°C.
De manière similaire à l'exemple 1, les lysats ont été dilués en série au 1/8 , 1/16 et 1/32 dans du tampon de lyse et distribués (16 μί) dans les puits d'une plaque de microtitration (384 x 20 μί) et 4 μί d'une solution d'un mélange d'anticorps anti-EGFR-Lumi4(Tb), d'un anticorps anti- actine-Lumi4(Tb) d'un anticorps anti-EGFR-Alexa488 et d'un anti-Actine-d2 ont été ajoutés aux lysats ainsi qu'à des puits servant de négatifs ne contenant que du tampon de lyse. Les anticorps ont été pré-dilués dans du tampon de détection (Cisbio réf 62SDBRDF) de façon à obtenir une concentration finale dans le puits de 0,5 nM de chacun des anticorps-Lumi4(Tb) et de 5 nM de chacun des anticorps-accepteur (Alexa488 et d2). Après 3h d'incubation à 20°C une lecture de fluorescence en mode TRF a été effectuée (vide supra). Le ratio E520/E665 a été mesuré pour les puits correspondant aux lysats de diverses lignées ; il a été observé que le ratio E520/E665 était globalement constant pour des dilutions différentes de la même lignée, et que le rapport des ratios E520/E665 correspondant à des lignées exprimant des niveaux différents d'EGFR était dans des proportions semblables au rapport des expressions.
Exemple 3 : Exemplification de la mesure de l'expression d'une protéine HER2 obtenue par la normalisation du signal TR-FRET correspondant par un deuxième signal TR-FRET proportionnel à la concentration en protéine ATP1A1 permettant de quantifier le nombre de cellules
La pompe sodium-potassium ou Na+-K+ ATPase [Scheiner-Bobis «The sodium pump. Its molecular properties and mechanics of ion transport», Eur. J. Biochem., (2002), 269(10):2424- 33] est une protéine transmembranaire qui peut être utilisée com me protéine de normalisation (housekeeping proteins : HKPs), principalement en « western blot » [Ke et al. Mol Pharmacol (2007) 72:1063-1073] [Sukowati et al. (2013) PLoS ONE 8(10): e76830] . Dans le cas présent la normalisation du signal correspondant à l'expression de HER2 a été effectuée en dosant la sous-unité alpha-1, nommée ATP1A1, de ce récepteur. Cette protéine ATP1A1 est exprimée à la membrane plasmique comme le sont de nombreux récepteurs d'intérêt pharmacologique ou diagnostique comme par exemple les récepteurs de la famille des Récepteurs à activité Tyrosine Kinase (RTK) et plus particulièrement les récepteurs de la famille HER comme HER2. Dans ce contexte on a dosé HER2 sur des lysats de cellules qui peuvent contenir à l'origine un nombre inconnu de cellules, ce qui est le cas des biopsies de tumeurs cancéreuses. On a dosé la quantité de récepteurs HER2 dans le lysat ainsi que la quantité de protéine ATP1A1, cette dernière étant exprimée de façon ubiquitaire ; sa concentration dans le lysat dépend du nombre de cellules présentes dans le prélèvement d'origine. Ainsi le rapport de la quantité de HER2 sur la quantité de ATP1A1 est proportionnelle à l'expression de HER2 dans les cellules de l'échantillon. La quantité moyenne du transporteur (ATP1A1) contenu dans une cellule a été estimée à 8 X 105 par cellule dans le cas de la lignée de cellule cancéreuse [estimé comme le nombre de site de liaison à l'ouabaïne Ash et al. The Journal of Cell Biology 1984;99(3):971-983] [Baker & Willis Biochim Biophys Acta. (1969) 183(3):646-9]. Ce nombre de molécules est intermédiaire entre ce qui est considéré comme une expression faible de HER2 (20 000 HER2 par cellule) et une expression forte de HER2 (1 000 000 HER2 par cellule). Un échantillon de lysat contient ces deux récepteurs dans des proportions ne dépassant pas un rapport de 40 dans le cas d'une faible expression de HER2.
Le couple d'anticorps CST23565 / AM26492 reconnaît la protéine ATP1A1 exprimée à la membrane des cellules humaines, le couple d'anticorps marqués CST23565- Lumi4(Tb) / AM26492-d2 est utilisable pour la quantification par TR-FRET de ΓΑΤΡ1Α1 contenu dans des lysats cellulaires.
Le marquage d'un anticorps monoclonal anti-ATPlAl clone D4Y7E (référence Cell Signaling Technology ( # 23565)) par un cryptate de terbium utilisé comme donneur TR-FRET est décrit à titre d'exemple :
L'anticorps commercial CST23565 (1 mg/ml) a été préalablement dialysé contre du tampon phosphate lOOmM pH8. A 100 μί d'anticorps (0,7 nmol) ont été ajoutés 8 éq. de Lumi4(Tb)- NHS cryptate Lumi4(Tb) activé sous forme ester de NHS (solution dans le DMSO anhydre, CISbio HTRF® Lumi4®-Tb-NHS cryptate labeling kits). Après lh d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate lOOmM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué CST23565 -Lumi4(Tb) ([Ac] = 1,04 μΜ ; taux de marquage moyen = 3,2 cryptâtes par anticorps). Le marquage d'un anticorps monoclonal de souris clone 9A7 (référence Acris Antibodies GmbH # AM26492AF) par un accepteur (d2) est décrit à titre d'exemple :
Le marquage par un accepteur (d2) d'un anticorps monoclonal Anti-ATPIAI (référence Acris
Antibodies GmbH # AM26492AF) a été réalisé selon le protocole suivant. A 80 μί d'anticorps (0,61 nmol) ont été ajoutés 5 éq. de d2 activé sous forme ester de NHS (solution dans DMSO anhydre, CISbio HTRF® d2 dye labeling kits). Après lh d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate lOOmM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué AM26492-d2 ([Ac] = 1,8 μΜ ; taux de marquage moyen =
3,4 molécules de d2 par anticorps).
Le marquage par un accepteur Alexa-488 de l'anticorps monoclonal Anti-HER2 Ab8, Clone e2-
4001 (référence Thermo Scientific # MS-325) a été réalisé selon le protocole suivant. A 74 μί d'anticorps lmg/ml (0,5 nmol) dans du tampon lOOmM phosphate pH8, on a ajouté 17 éq. d'Alexa-488 activé sous forme ester de NHS (8,5 nmol , 5μί de A488-NHS 1,7 mM dans le
DMSO, Molecular Probe #A-20000). Après lh d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate lOOmM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué Ab-A488 ([Ac] = 1,7 μΜ ; taux de marquage moyen = 3,5 molécules d'Alexa-488 par anticorps).
On prépare des solutions filles d'anticorps :
Anti-HER2(A)-lumi4(Tb) : 20 nM / Anti-HER2(B)- A488 : ΙΟΟηΜ
Anti-ATPlAl(A)-lumi4(Tb) : 20 nM / Anti-ATPIAI(B)- d2 : 100 nM
Les solutions d'anticorps et les dilutions sont préparées dans du tampon de détection (CISbio réf. 62SDBRDF).
Test « MULTIPLEX » HER2 & ATP1A1 en puits séparés et dans le même puits
Des cellules (SKBR3 ou MDA-MB-453) provenant de culture (environ 17 à 20 xlO6 cellules à confluence dans un flacon de culture T175) ont été lavées au PBS puis dissociées, transférées dans un tube (50ml) pour centrifugeuse et centrifugées (400 g / 3 min). Après avoir éliminé le surnageant, le culot obtenu a été lysé dans 3 mL de « Cellular kinase lysis buffer #4 » (CISbio réf 64KL4FDF) pendant 30 min à 4°C (agitation) puis après transfert en tube eppendorf et centrifugation (15 min 4°C à 14 000 g) le surnageant (Lysat) a été collecté et conservé congelé à -80°C.
Chacun des lysats SKBR3 et MDA-MB-453 a été dilué en série au demi dans le tampon de lyse LB4 (lysis buffer #4) et 10 μί ont été déposés dans les puits d'une microplaque 384w F-bottom, SV ,Hibase, White (GREINER#784075). On a constitué également des puits « blancs » en déposant uniquement le tampon de lyse LB4 dans des puits contigus (par exemple dans les puits A1-A3 , D1-D3, G1-G3).
Chaque dilution de lysat a été déposée (triplets) dans trois lignes distinctes de la microplaque par exemple la série de dilution de lysat de MB-453 a été déposée dans les lignes B, E et H : puits Bl, B2; B3, etc.... El, E2, E3, etc.. Hl, H2, H3, etc.. la série de dilution de lysat de SKBR3 a été déposée dans les lignes C, F et I : puits Cl, C2, C3, etc.... Fl, F2, F3, etc.. Il, 12, 13, etc..
Aux 10 μί déjà déposés dans les puits Al, A2 Bl, B2 .... Cl, C2 ... ont été ajoutés ensuite
ΙΟμί de chaque solution d'anticorps anti-HER2(A)-lumi4(Tb) de façon à obtenir une concentration finale de 1 nM, et anti-HER2 (B)-Alexa488 de façon à obtenir une concentration finale de ΙΟηΜ. Les solutions d'anticorps sont préparées dans du tampon de détection (CISbio ref 62SDBRDF).
Aux ΙΟμί déjà déposé dans les puits Dl, D2 El, E2 .... Fl, F2 .... ont été ajoutés ensuite 5μί de chaque solution d'anticorps anti-ATPlAl(A)-lumi4(Tb) de façon à obtenir une concentration finale de 1 nM, et d'anticorps anti-ATPlAl(B)-d2 de façon à obtenir une concentration finale de ΙΟηΜ.
Aux 10 μί déjà déposé dans les puits Gl, G2 Hl, H2 .... Il, 12 .... ont été ajoutés ensuite un total de ΙΟμί de solution d'anticorps anti-ATPlAl(A)-lumi4(Tb) anti-HER2(A)-lumi4(Tb) de façon à obtenir une concentration finale de 1 nM de chaque anticorps et de solution d'anticorps anti-ATPlAl(B)-d2 et anti-HER2(B)-A488 de façon à obtenir une concentration finale de ΙΟηΜ de chaque anticorps.
Les puits « blancs réactifs a-HER2 », pour mesurer HER2, étaient donc A1-A3.
Les puits « blancs réactifs a-ATPlAl ", pour mesurer ATP1A1 étaient donc D1-D3.
Les puits « blancs réactifs a-HER2 & a-ΑΤΡΙΑΙ ", pour mesurer "multiplexe" HER2 & ATP1A1 étaient donc 11-13.
La plaque a été lu en mode TRF sur un lecteur Pherastar (BMG) en utilisant les paramètres suivants correspondant au filtre émission 665 nm pour les puits correspondant au dosage d'ATPlAl et au filtre émission 520 nm pour les puits correspondant au dosage HER2 :
Module optique: HTRF
Excitation: 337
Emission A: 665
Emission B: 620
Module optique: TRF 337 620 520
Excitation: 337
Emission B: 520 Début d'intégration [μ5] : 60
Temps d'intégration [με]: 400
Hauteur focale [mm]: 12
Source lumineuse: lampe flash
Moyenne de la valeur d'émission à 520 nm des blancs réactifs : B520 = 5 870 (puits « blanc réactifs a-HER2 », pour mesure HER2 : puits A1-A3).
Moyenne de la valeur d'émission à 665 nm des blancs réactifs : B665 = 10 000 (« blancs réactifs a-ATPlAl ", pour mesure ATP1A1 : puits D1-D3).
Moyenne de la valeur d'émission à 520 nm des blancs réactifs : B520 = 10 900 (« blancs réactifs a-ΑΤΡΙΑΙ ", pour test "multiplex" HER2 : puits G1-G3).
Moyenne de la valeur d'émission à 665 nm des blancs réactifs : B665 = 19 100 (« blancs réactifs a-HER2 & a-ΑΤΡΙΑΙ ", pour test "multiplex" ATP1A1 : puits G1-G3). Pour chaque puits on calcule la variation d'émission de fluorescence en temps résolu entre le puits considéré et la valeur moyenne mesurée dans le blanc réactif correspondant. Par exemple pour le puits correspondant au lysat SKBR3 au ½ les émissions E665 sont mesurées dans le canal 665 nm (exprimées en UAF665 : Unité Arbitraire de Fluorescence) E665 = 25 966 et on calcul la variation d'émission D665 = E665 - B665 = 25 966 - 10 000 = 15 966 UAF665. Une valeur supérieure à zéro indique l'existence de TR-FRET entre le donneur (cryptate lumi4(Tb)) et l'accepteur (d2) et permet ici de quantifier la protéine ATP1A1.
On procédera de façon similaire pour les émissions E520 mesurées dans le canal 520nm : D520 = E520 - B520. Une valeur supérieure à zéro indique l'existence de TR-FRET entre le donneur (cryptate lumi4(Tb)) et l'accepteur (A488) et permet ici de quantifier la protéine HER2.
Ici la lecture a été effectuée après 16h d'incubation à 20°C.
HER2 Lysat MDA-MB-453 (t= 16h)
Les valeurs de D520 obtenues (HER2) sont calculées à partir des valeurs de fluorescence mesurées dans les puits B2, B3 etc.).
Les valeurs de D665 obtenues (ATP1A1) sont calculées à partir des valeurs de fluorescence mesurées dans les puits El, E2 etc.).
HER2 Lysat SKBR3 (t= 16h)
Les valeurs de D520 obtenues (HER2) sont calculées à partir des valeurs de fluorescence mesurées dans les puits C2, C3 etc.). Les valeurs de D665 obtenues (ATPIAI) sont calculées à partir des valeurs de fluorescence mesurées dans les puits F2, F3 etc.).
Les résultats sont présentés dans la table 2.
Table 2
Figure imgf000036_0001
*expériences en triplets, la valeur présentée est la moyenne des signaux mesurés, en unité arbitraire de fluorescence. § le ratio a été multiplié par 1000 pour s'affranchir des chiffres décimaux.
On a mesuré par ailleurs le nombre de récepteur HER2 exprimés par cellules en utilisant le FACS quantitatif (Quifikit) obtenu dans la littérature. Ces valeurs d'expression de HER2/cellule rapportées dans la littérature vont de 162 847 pour MB-453 et 510 390 pour SKBR3 à 333 544 pour MB-453 et 960 000 pour SKBR3 (DeFazio Poster in EJC Suppléments 6(12):30-30 October 2008). Les mêmes auteurs, par la même technique de FACS quantitatif, donnent 292 984 pour MB-453 et 1 402 832 pour SKBR3 dans un autre article (De Fazio, Breast Cancer Res. 2011; 13(2): R44). Cette variation montre que la technique de mesure par FACS quantitatif, considérée comme « méthode de référence » pour analyser l'expression des récepteurs de surface (Vasilyev, Cytotechnology. 2013 ; 65(5): 795-802) est caractérisée par une incertitude relativement élevée. Les expressions sont présentées dans la table 3, qui reprend également les valeurs de ratio D520/D665 mesurées en TR-FRET par le procédé de l'invention.
Table 3
Figure imgf000037_0001
Le rapport entre les valeurs moyennes des ratios D520/D665 représentant la quantité d'HER2 normalisée par la quantité d'ATPlAl sont du même ordre de grandeur que les rapports entre les quantités d'HER2 exprimées à la membrane obtenu par FACS.
Les différences observées entre les rapports des expressions obtenus à partir de données de FACS et les rapports des expressions mesurés par la méthode HTRF avec normalisation peut s'expliquer par le fait que la méthode de l'invention mesure la totalité de HER2 d'une cellule (membranaire + cytoplasmique) alors que la technique utilisant le FACS mesure l'expression membranaire ie. la quantité de HER2 sur la membrane plasmique de la cellule. La mesure obtenue par la méthode de l'invention se faisant sur un lysat représente donc la quantité totale d'HER2 de la même façon que la mesure de la quantité d'HER2 obtenu par western blot représente la quantité totale d'HER2 (membranaire + cytoplasmique). Seules les données correspondant à l'expression membranaire de HER2 exprimée en nombre de récepteurs par cellules mesuré par FACS (donc membranaire) sont disponibles dans la littérature.
On observe que
- Les ratios HER2/ATP1A1 représentant l'expression de HER2 calculés à partir des valeurs de signal à 520 nm et à 665 nm pour la lignée MB-453 sont constants (aux incertitudes de mesure près) à différentes dilutions pour un lysat donné, la valeur moyenne étant = 710 (mesures en puits séparés).
De même les ratios HER2/ATP1A1 représentant l'expression de HER2 calculés à partir des valeurs de signal à 520 nm et à 665 nm pour la lignée SKBR3 sont constants (aux incertitudes de mesure près) à différentes dilutions pour un lysat donné la valeur moyenne étant = 1273 (mesures en puits séparés).
Pour la lignée Mb-453, le ratio moyen HER2/ATP1A1 = 701 mesuré dans le même puits est peu différent du ratio moyen HER2/ATP1A1 = 710, mesuré en puits séparés. De même pour la lignée SKBR3, le ratio moyen HER2/ATP1A1 = 1330 mesuré dans le même puits est peu différent du ratio moyen HER2/ATP1A1 = 1273, mesuré en puits séparés. Les ratios HER2/ATP1A1 sont donc identiques (aux incertitudes de mesure près) pour un lysat d'une lignée donnée, que les mesures soient faites dans des puits séparés ou dans un même puits (test "multiplex").
- Le ratio HER2/ATP1A1 augmente entre la lignée MB-453 (ratio moyen = 701) et SKBR3
(ratio moyen = 1330) ce qui montre que ce ratio représente une mesure de l'expression de HER2, ce chiffre augmente avec l'expression du récepteur (nombre de récepteur HER2 par cellule).
Ces résultats montrent que le procédé selon l'invention permet d'obtenir un signal représentatif de la quantité de protéine d'intérêt (ici HER2) normalisée par une protéine de référence ubiquitaire (ici ATP1A1) cela en utilisant une seule longueur d'onde d'excitation et deux longueurs d'onde d'émission.
Ces résultats montrent qu'il est possible de mesurer simultanément dans un même puits le signal à 665 nm provenant du FRET entre un complexe d'europium [Lumi4(Tb)] et un accepteur (comme d2) émettant à 665nm (mesure de la protéine normalisatrice) et le signal à 520 nm résultant d'un FRET entre un complexe de terbium [Lumi4(Tb)] et un accepteur (comme Alexa-488) émettant à 520 nm (mesure de la protéine d'intérêt que l'on veut normaliser). Exemple4 : Exemplification de la mesure de l'expression d'une protéine HER2 obtenue par la normalisation du signal TR-FRET correspondant par un deuxième signal TR-FRET proportionnel à la concentration en protéine MUC1 permettant de quantifier le nombre de cellules cancéreuses.
Pour montrer la possibilité de normaliser un signal correspondant à la quantité d'un récepteur H ER2 exprimé par des cellules cancéreuses par un signal correspondant au nombre de cellules cancéreuses présentes dans un échantillon, des cellules SKBR3 (cancer du sein) ont été diluées dans une population de cellules « normales » [Le. non-cancéreuses) HEK (Human Embryonic Kidney). Les cellules SKBR3 expriment à la fois H ER2 et la protéine M UC1 (également nommée CA 15.3) qui est un marqueur du cancer du sein, alors que les cellules H EK n'expriment pas HER2 ni la protéine M UC1.
Des lysats ont ensuite été préparés soit à partir de cellules SKBR3 seules, soit à partir de cellules SKBR3 diluées par un même nombre de cellules HEK (rapport 1:1), soit à partir de cellules SKBR3 diluées par 3 fois plus de cellules HEK (rapport 1:3) etc.
Un dosage de protéine totale (Bradford) a été effectué sur les lysats : la quantité moyenne de protéine totale mesurée dans ces lysats était de 693 μg/ml avec une variation de 3%. Ceci montre que la quantité de protéine totale varie peu entre les lysats ce qui est en accord avec le fait que les lysats contiennent des quantités globales (SKBR3 + HEK) équivalentes.
Ces lysats ont ensuite été dilués au 1/16 dans du tampon de lyse et ΙΟμΙ ont été déposés (triplets) dans les puits d'une microplaque. Des puits « blancs » (en triplets) ont été constitués en déposant uniquement ΙΟμΙ de tampon de lyse LB4 (puits A9-A11).
La solution du couple d'anticorps marqués anti-MUCl(A)-TBP(Eu) et anti-MUCl(B)-XL665 utilisé pour la détection de M UC1, a été préparée à partir des solutions commerciales du kit KRYPTOR CA15.3 (TH ERMO FISH ER / Brahms # 808.075). Les concentrations d'anticorps n'étant pas connues on a préparé un mélange de 400μΙ de anti-MUCl(A)-TBP(Eu) du kit et de 500μΙ de anti-MUCl(B)-XL665 du kit. On a cherché à obtenir une émission mesurée dans les puits de l'ordre de 25 000 UAF620 pour l'ajout de 5μΙ de mélange anti-M UCl(A)-TBP(Eu) / anti- M UC1(B)-XL665 à 5μΙ de tampon de détection et 10μΙ de tampon de lyse LB4.
Une solution de l'anticorps anti-HER2(A)-lumi4(Tb) à une concentration de 4 nM a été préparée par dilution de l'anticorps Abl5-lumi4(Tb) (voir marquage plus haut) dans du tampon de détection (CISbio ref 62SDBRDF). De même une solution de l'anticorps anti-HER2(B)-d2 à une concentration de 40 nM a été préparée par dilution de l'anticorps Ab8-A488 (voir marquage plus haut) dans du tampon de détection (CISbio ref 62SDBRDF) puis des volumes égaux de ces solutions ont été mélangées et 10 μΙ de ce mélange ont été ajoutés aux puits. On a cherché à obtenir une émission mesurée dans les puits de l'ordre de 50 000 UAF620 pour l'ajout de 5μΙ de mélange anti-HER2(A)-lumi4(Tb)/ anti-HER2(B)-d2 à 5μΙ de tampon de détection et 10μΙ de tampon de lyse LB4.
Pour la détection simultanée de HER2 et MUCl des volumes de 5μΙ de solution anti-HER2(A)- lumi4(Tb)/ anti-HER2(B)-d2 et 5μΙ de solution anti-MUCl(A)-TBP(Eu) / anti-MUCl(B)-XL665 ont été ajoutés à 10μΙ de lysats (ou 10μΙ de LB4 pour les puits « blancs » A9-A11).
La plaque a été lue en mode TRF sur un lecteur Pherastar (BMG) en utilisant les paramètres correspondant au filtre émission 665 nm pour les puits correspondant au dosage de MUCl et au filtre émission 520 nm pour les puits correspondant au dosage HER2 en utilisant les mêmes paramètres que ceux indiqués plus haut (voir exemple 3).
Moyenne de la valeur d'émission à 520 nm des blancs réactifs : B520 = 3750 (« blancs réactifs MUCl & HER2 » test multiplex : puits A9-A11).
Moyenne de la valeur d'émission à 665 nm des blancs réactifs : B665 = 6450 (« blancs réactifs MUCl & HER2 » test multiplex : puits A9-A11).
Pour chaque puits les valeurs du signal du signal à 520 nm sont calculées à partir de la valeur d'Emission de fluorescence (E520) par soustraction de la valeur B520 mesurée dans le puits « blanc réactifs » correspondant D520 = E520 - B520.
Pour chaque puits les valeurs du signal à 665 nm (D665) sont calculées à partir de la valeur d'Emission de fluorescence (E665) par soustraction de la valeur B665 mesurée dans les puits « blanc réactifs » correspondant D665 = E665 - B520.
Les valeurs obtenues sous formes de moyennes, sont regroupées dans la table 4 ci-dessous.
Table 4
*expériences en triplets, la valeur présentée est la moyenne des signaux mesurés, en unité arbitraire de fluorescence.
§ le ratio a été multiplié par 1000 pour s'affranchir des chiffres décimaux.
Les valeurs de D520 correspondant au lysat de cellules SKBR3 et aux lysats de mélanges de SKBR3 et HEK en proportion variables, sont reportées sur la figure 1 en fonction du rapport SKBR3/HEK initialement présent avant l'étape de lyse. Ceci a pour but de mimer la situation où dans une tumeur les cellules cancéreuses représentées par SKBR3 sont en présence d'un nombre variable de cellules « normales » représentées par HEK. On observe que le signal D520 augmente linéairement en fonction du rapport SKBR3/HEK ce qui montre que la dilution des cellules s'est effectuée correctement. Ceci montre qu'en absence d'une normalisation faisant intervenir le nombre de cellules cancéreuses on obtient une « expression apparente » de HER2 ici représentée par D520.
Les valeurs de D520/D665 correspondant aux différents lysats, sont reportées sur la figure 2 en fonction du rapport SKBR3/HEK initialement présent avant l'étape de lyse. Ceci toujours dans le but de mimer la situation où dans une tumeur les cellules cancéreuses représentées par SKBR3 sont en présence d'un nombre variable de cellules « normales » représentées par HEK. Dans ce cas on observe que le ratio D520/D665 est constant, il représente la quantité de HER2 présent dans l'échantillon normalisée par la quantité de MUC1 présent dans l'échantillon, ce ratio caractérise l'expression de HER2, c'est-à-dire le nombre de récepteurs HER2 par cellule d'intérêt (expression de HER2 qui caractérise SKBR3 en tant que cellule cancéreuse). On observe également que les ratios HER2/MUC1 représentant l'expression de HER2 calculé à partir des valeurs de signal à 520 nm et à 665 nm pour la lignée SKBR3 sont constants (aux incertitudes de mesure près), que ces cellules représentent une population homogène d'un type cellulaire unique (cellules cancéreuses), ou que ces cellules représentent un mélange hétérogène de deux types cellulaires SKBR3 (cancéreuse) et HEK (non-cancéreuses) présent en des proportions variables dans l'échantillon initial à partir duquel a été préparé un lysat.
Ces résultats montrent que le procédé selon l'invention permet d'obtenir un signal représentatif de la quantité de protéine d'intérêt (ici HER2) normalisée par une protéine de référence (ici MUC1) dont l'expression traduit un caractère (phénotype) cancéreux. Ce signal reste constant même si les cellules cancéreuses représentent une fraction minoritaire du nombre de cellules totales, il représente l'expression de HER2 caractéristique des cellules cancéreuses.
Cet exemple montre la possibilité de mesurer simultanément dans un même puits (multiplexage) le signal émis à 665 nm résultant d'un FRET entre un complexe d'europium [TBP(Eu)] et un accepteur (comme XL665) émettant à 665nm (mesure de la protéine normalisatrice) et le signal à 520 nm résultant d'un FRET entre un complexe de terbium [Lumi4(Tb)] et un accepteur (comme Alexa-488) émettant à 520 nm (mesure de la protéine d'intérêt que l'on veut normaliser).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique contenant des cellules et une protéine de référence, ledit échantillon étant lui- même contenu dans un milieu de mesure, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) homogénéisation de l'échantillon sous forme de lysat cellulaire ;
b) distribution du lysat cellulaire dans un seul contenant ou bien dans deux contenants différents ;
c) introduction dans le milieu de mesure d'un premier et d'un deuxième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à la protéine d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués par un premier composé donneur et un premier composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-F ET ; d) introduction dans le milieu de mesure d'un troisième et d'un quatrième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique de la protéine de référence, ces ligands étant respectivement marqués par un deuxième composé donneur et un deuxième composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ;
e) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du premier composé donneur ;
f) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ;
g) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du deuxième composé donneur ;
h) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième composé accepteur ;
i) calcul du ratio des signaux mesurés aux étapes f) et h), ce ratio étant représentatif de la quantité de protéine d'intérêt présente dans l'échantillon, normalisée par la quantité de protéine de référence;
sous réserve que :
lorsque l'échantillon est distribué dans un seul contenant, la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième accepteur est différente de celle correspondant au pic d'émission du premier accepteur, et que lorsque l'échantillon est distribué dans deux contenants, les étapes c), e) et f) sont mises en oeuvre dans le premier contenant, et les étapes d), g) et h) sont mises en œuvre dans le deuxième contenant.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation différentes.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, et en ce que l'échantillon est distribué dans deux contenants différents.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, en ce que l'échantillon est distribué dans un seul contenant, et en ce qu'il ne comprend pas d'étape g).
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les étapes f) et h) sont mises en œuvre simultanément.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur sont identiques.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine de référence est une protéine de ménage.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la protéine de ménage est choisie parmi : β-actine, GAPDH, HSP70, HSP90, la sous-unité alpha de la NaK-ATPase, TE T, une histone et en particulier l'histone H6.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine de référence est une protéine caractéristique d'un état physiopathoiogique donné.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine de référence est une protéine caractéristique des cellules cancéreuses.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de tissu.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de tissu solide ayant été prélevé dans le cadre d'une biopsie et sous forme de coupes FFPE ou de cryosections.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué de cellules issues de cultures cellulaires.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les premier, deuxième, troisième et quatrième ligands sont des anticorps.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés donneurs sont choisis parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye.
17. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur sont identiques, et en ce qu'ils sont choisis parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium.
18. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur sont différents, et en ce que soit l'un est un chélate ou cryptate d'Europium, et l'autre un chélate ou cryptate de Terbium, soit le premier et le deuxième composé donneur sont des chélates ou cryptâtes d'Europium, soit le premier et le deuxième composé donneur sont des chélates ou cryptâtes de Terbium.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés accepteurs sont choisis parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
20. Procédé selon la revendication 3, caractérisée en ce que le premier et le deuxième donneur sont des cryptâtes de terbium, en ce que le premier accepteur possède un pic d'émission centré autour de 520 nm et le deuxième accepteur possède un pic d'émission centré autour de 665 nm.
21. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le premier accepteur est l'Alexa488, le deuxième accepteur est le fluorophore d2, et le premier et le deuxième donneur sont identiques et sont le cryptate de Terbium Lumi4Tb.
22. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le premier accepteur est la cyanine Cy7, le deuxième accepteur est le fluorophore d2, et le premier et le deuxième donneur sont identiques et sont le cryptate d'europium trisbipyrdine.
23. Trousse de réactifs pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant :
un premier et un deuxième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à une protéine d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués par un premier composé donneur et un premier composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ;
un troisième et d'un quatrième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à une protéine de référence, ces ligands étant respectivement marqués par un deuxième composé donneur et un deuxième composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET, la longueur d'onde correspondant au pic d'émission de ce deuxième accepteur étant différente de celle correspondant au pic d'émission du premier accepteur ;
éventuellement, un composé fluorescent possédant une durée de vie courte et se liant à l'ADN ou aux protéines cellulaires ;
éventuellement, des instructions pour normaliser le signal de la protéine d'intérêt par la protéine de référence.
24. Trousse de réactifs selon la revendication 23, qui comprend en outre un calibrateur constitué d'une dilution de lyse d'une lignée cellulaire exprimant soit la protéine de référence soit la protéine de référence et la protéine d'intérêt.
25. Fluorimètre pour la mise en œuvre du procédé selon les revendications 1 à 22, caractérisé en ce qu'il est contrôlé par un logiciel pour la mise en œuvre de l'algorithme suivant :
a) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du premier composé donneur ;
b) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ;
c) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du deuxième composé donneur ;
d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième composé accepteur, cette longueur d'onde étant différente de celle correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ;
e) calcul du ratio des signaux mesurés aux étapes b) et d).
26. Fluorimètre pour la mise en œuvre du procédé selon les revendications 1 à 22 caractérisé en ce qu'il est contrôlé par un logiciel pour la mise en œuvre de l'algorithme suivant :
a) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du premier composé donneur;
b) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ;
c) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième composé accepteur, cette longueur d'onde étant différente de celle correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ;
d) calcul du ratio des signaux mesurés aux étapes b) et c).
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