FR2872287A1 - Procede d'amelioration de la detection des signaux de fluorescence lors d'un transfert d'energie non radiatif - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation du phénomène de polarisation de fluorescence, en vue d'améliorer la détection des signaux de fluorescence lors d'un transfert d'énergie non radiatif (FRET). En particulier, l'invention concerne une méthode d'amélioration du rapport signal / bruit de fond dans une mesure de FRET. L'invention concerne également un appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure.

Description

L'invention concerne l'utilisation du phénomène de polarisation de

fluorescence, en vue d'améliorer la détection des signaux de fluorescence lors d'un transfert d'énergie non radiatif (FRET). En particulier, l'invention concerne une méthode d'amélioration du rapport signal / bruit de fond dans une mesure de FRET.

Le transfert d'énergie non radiatif en fluorescence (FRET) est un outil spectroscopique largement utilisé dans la détection d'évènements biologiques et notamment d'interactions moléculaires.

Dans de nombreux cas, le FRET, qui nécessite un rapprochement spatial entre des molécules fluorescente donneur et accepteur qui vont être impliquées dans le transfert d'énergie, s'avère être un outil puissant dans la mise en évidence des interactions biologiques. Il peut être utilisé dans des domaines aussi variés que la biologie moléculaire, la mise en évidence in-vitro ou in-cellulo de phénomènes enzymatiques (clivage peptidique, phosphorylation) ou d'interactions entre protéines (1,2,3).

La détection du phénomène de FRET peut se faire par la mesure de différents paramètres du signal de fluorescence émis soit par le donneur, soit par l'accepteur, soit par les deux molécules. Parmi les techniques les plus usitées, on peut notamment citer: - la mesure de la baisse de fluorescence du donneur induite par le phénomène de FRET (4), - la mesure de l'augmentation de la fluorescence de l'accepteur induite par l'énergie provenant du donneur au travers du FRET (5), la détermination du ratio [(augmentation fluorescence accepteur)/ (diminution fluorescence donneur)] (6), la mesure de la diminution de la durée de vie de fluorescence du donneur induite par le phénomène de FRET (7). Celle-ci est notamment mesurée par la technique de Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), la mesure de l'augmentation de la fluorescence du donneur impliqué dans un FRET après le photoblanchiment de l'accepteur (8) ; cette technique de photoblanchiment est connue sous le nom de Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP).

Si l'on fait abstraction des techniques associant le FRET et une détection en temps résolu rendue possible par l'utilisation de donneur de fluorescence à durée de vie longue (ex: HTRF), le phénomène de FRET s'avère complexe à détecter dans de nombreuses applications basées sur des mesures d'intensités de fluorescence. La nécessité d'une compatibilité énergétique importante entre le donneur et l'accepteur conduit souvent à l'utilisation de molécules possédant des spectres d'émission de fluorescence relativement proches. Le recouvrement des spectres du donneur et de l'accepteur qui en découle rend très difficile une mesure précise des variations de signaux enregistrées sur le donneur ou sur l'accepteur (9).

Ceci est particulièrement vrai lorsque des protéines fluorescentes dérivant de la Green Fluorescent Protein (GFP) sont utilisées dans des expériences de FRET, telle que la paire donneur/accepteur Cyan Fluorescent Protein (CFP)/ Yellow Fluorescent Protein (YFP)qui est la plus utilisée. Ces molécules, capables d'être exprimées sous forme fluorescente dans de nombreux types cellulaires, permettent la mise en évidence de nombreux évènements intracellulaires. Toutefois, un important recouvrement de spectres de fluorescence existe entre celles-ci, résultant en l'excitation parasite directe de l'accepteur par le faisceau d'excitation de la molécule donneur. De ce fait, le rapport signal /bruit de fond des expériences de FRET réalisées avec cette paire donneur /accepteur est faible, souvent inférieur à 1,5 (1). Par conséquent, il est nécessaire de mettre en oeuvre des protocoles d'expérimentation complexes comprenant de nombreux contrôles expérimentaux pour pouvoir interpréter les résultats obtenus.

Le problème technique à résoudre consiste donc à fournir une méthode simple et reproductible de correction de la mesure de FRET, notamment par l'amélioration du rapport signal /bruit de fond.

On a maintenant trouvé que l'impact du fort recouvrement des spectres d'émission de fluorescence du donneur et de l'accepteur pouvait être significativement diminué en utilisant les propriétés de polarisation de ces composés pour corriger la mesure de FRET.

Il a été décrit que l'apparition d'un transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes provoquait des modifications de polarisation à la fois au niveau du donneur et au niveau de l'accepteur: la polarisation du donneur augmente lorsqu'il est impliqué dans un FRET (10), alors que celle de l'accepteur impliqué dans le FRET diminue (11).

L'influence du FRET sur la polarisation relative du donneur et de l'accepteur a ainsi été utilisée dans différents systèmes moléculaires pour mettre en évidence ce transfert d'énergie entre deux sondes fluorescentes.

Notamment, un homoFRET entre deux molécules de GFP a été détecté en mesurant leur dépolarisation (12). La mesure de la dépolarisation de la rhodamine couplée à une lectine a été utilisée pour détecter un FRET se produisant entre la fluorescéine et la rhodamine (5). Egalement, la mesure de l'augmentation de la polarisation d'un donneur Concanaviline AFluorescéine a permis de mettre en évidence un FRET indiquant la formation d'un amas (en anglais cluster ) moléculaire dans les membranes lymphocytaires (10).

Les mesures de polarisation utilisées jusqu'ici avaient donc pour but de mettre en évidence l'existence d'un FRET entre deux molécules.

De manière surprenante, on a maintenant trouvé que la mesure polarisée des signaux de fluorescence permet de mieux isoler les signaux émis spécifiquement par le donneur et l'accepteur impliqués dans le FRET et donc d'augmenter le rapport signal/bruit de fond dans les tests réalisés.

En effet, les protéines fluorescentes de type GFP par exemple, du fait de leur structure et de leur poids moléculaire, sont des molécules fortement polarisées. Leur degré de polarisation varie lorsqu'elles sont impliquées dans un transfert d'énergie: en tant que molécule donneur, leur polarisation augmente un peu, tandis qu'en tant que molécule accepteur, elles subissent une forte dépolarisation au travers du phénomène de FRET.

Dans un milieu contenant un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur et où a lieu un transfert d'énergie entre ces deux composés suite à l'excitation du milieu à la longueur d'onde d'excitation du donneur, le signal mesuré à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur comprendra: É un signal dépolarisé issu du FRET (le signal spécifique que l'on veut mesurer), É un signal très polarisé émis par l'accepteur, consécutif à son excitation 10 directe par le faisceau lumineux sensé exciter le donneur (signal parasite), et É un signal très polarisé émis par le donneur, consécutif à l'excitation du donneur (signal parasite).

La méthode selon l'invention est donc basée sur l'utilisation de cette variation importante de polarisation entre le donneur et l'accepteur pour améliorer la sélectivité spectrale de la mesure du FRET. En effet, selon l'une des variantes de l'invention, la mesure du signal de fluorescence émis est effectuée soit dans le plan de polarisation parallèle à celui de la lumière polarisée d'excitation, soit dans le plan de polarisation orthogonal à celui de la lumière polarisée d'excitation, selon l'état de polarisation de la molécule donneur et celui de la molécule accepteur.

L'invention concerne donc un procédé de détection d'un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure, caractérisé en ce que la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie est améliorée en utilisant les propriétés de polarisation desdits composés fluorescents donneur et accepteur.

Le transfert d'énergie est détecté en mesurant le signal résultant de la florescence émise par le composé fluorescent accepteur à une longueur d'onde X3. Cette émission résulte du transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur, excité dans le milieu de mesure à une longueur d'onde 21 et ledit composé fluorescent accepteur.

Par milieu de mesure , on entend une solution comprenant les composés fluorescents donneur et accepteur; cette solution peut être un échantillon biologique, ou bien peut contenir les éléments nécessaires à l'étude d'un phénomène biologique.

Le milieu de mesure peut également être un échantillon de tissu vivant ou des cellules vivantes, placés dans un milieu de culture approprié. Dans ce cas, les composés fluorescents donneurs et accepteurs sont présents soit dans le milieu de culture dudit échantillon de tissu ou desdites cellules, soit dans le tissu lui même ou dans les cellules.

Le milieu de mesure peut enfin être constitué d'un organisme vivant, d'un animal, en particulier d'un mammifère auquel ont été administrés les composés fluorescents donneurs et accepteurs. L'administration des composés fluorescents donneurs et accepteurs à un animal vivant peut être effectuée topiquement, par simple mise en contact desdits composés avec l'animal; les composés donneurs et accepteurs peuvent également être injectés à l'animal; les composés fluorescents donneur et accepteurs peuvent également être directement produit dans l'organisme de l'animal par génie génétique.

Comme cela est montré dans la suite de la description, le procédé général selon l'invention permet de résoudre les problèmes liés à l'utilisation de composés fluorescents donneurs et accepteurs de faible sélectivité spectrale, et en particulier de limiter le bruit de fond lié d'une part à l'émission de lumière par le donneur à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur, et d'autre part à l'émission de lumière par l'accepteur nonimpliqué dans le transfert d'énergie, l'accepteur étant dans ce cas excité directement par la lumière excitatrice.

Selon un premier aspect, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes: (i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la 30 longueur d'onde 2L,1, X1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, et (ii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde a,3 dans un plan de polarisation différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, 2 3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent accepteur.

La mesure du signal émis à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur dans un plan différent (c'est à dire non parallèle) du plan de polarisation de la lumière excitatrice, va permettre de favoriser la mesure du signal émis par les espèces fortement dépolarisées, et en particulier le signal de l'accepteur engagé dans le transfert d'énergie, réduisant ainsi la part de signal mesurée non issue du transfert d'énergie. Le plan dans lequel est effectué la mesure est préférentiellement le plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Des mesures dans d'autres plans pourraient également convenir.

Selon un aspect préféré, ce procédé comprend en outre les étapes suivantes: (iii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde X,2, 2,2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé 20 fluorescent donneur, et (iv) correction du signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent accepteur à la longueur d'onde X3 par le signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent donneur à la longueur d'onde X2. Cette correction peut par exemple consister en un calcul du ratio de l'intensité de la fluorescence mesurée à la longueur d'onde 2 3 par celle mesurée à la longueur d'onde X2.

Dans le cas où l'on effectue une mesure de fluorescence à la longueur d'onde d'émission du donneur (22), la mesure du signal résultant de la fluorescence émise peut être effectuée dans un plan parallèle ou différent, de préférence orthogonal au plan de la lumière excitatrice.

Dans un second mode de réalisation, les propriétés de polarisation des composés fluorescents donneur et accepteur sont utilisées pour améliorer la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie, dans un procédé visant à déterminer la variation de polarisation due au transfert d'énergie. Comme le premier procédé décrit ci-dessus, ce procédé va permettre d'améliorer la sélectivité de la mesure, qui sera ainsi mieux corrélée au phénomène de transfert d'énergie que l'on veut détecter.

Ce second mode de réalisation comprend les étapes suivantes: (i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la 10 longueur d'onde X1, Xl étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, (ii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It//)22 émise à la longueur d'onde X2 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, X2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent donneur, (iii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (Itl)12 émise à la longueur d'onde 2 2 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, (iv) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It//)u émise à la longueur d'onde X3 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, 7L3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent accepteur, (v) mesure de l'intensité de fluorescence totale (Itl)23 émise à la longueur d'onde 7^,3 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière 25 excitatrice, (vi) calcul de la polarisation P due au transfert d'énergie entre le composé fluorescent donneur et le composé fluorescent accepteur selon la formule suivante: [(lt//)M (It//)X2 x A)] - GI(Itl)u (Itl)) 2 x B)] [(It//)X3 (It//)X2 X A)] + nG[(ltl)u (lt1)X2 X B)] P= dans laquelle: - A représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde a,2 et par le donneur seul, dans un plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, - B représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde X2 et X3 par le donneur seul, dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, n= 1 ou 2. Lorsque n = 1, on parle de mesure de polarisation; lorsque n = 2, il est question d'anisotropie.

- G est un facteur permettant de corriger la différence de sensibilité de la détection dans les plans parallèle et orthogonal. Ce facteur est soit fourni par le constructeur, soit aisément déterminable par l'homme du métier en mesurant la polarisation de substances de polarisation connue. Dans une mise en oeuvre particulière, G est compris entre 0,1 et 2, de préférence G est compris entre 0,8 et 1,2, et en particulier G=1; et (vii) comparaison de la valeur de P calculée avec celle obtenue dans un milieu de mesure témoin dans lequel le transfert d'énergie n'a pas lieu, une diminution de P étant indicative d'un transfert d'énergie.

Selon un mode préféré de mise en oeuvre, A et B sont calculés de la manière suivante: A = (Idn)) 3 / (Idii)x2 B = (Idl)a3 / (Idi)a.2 (Id ),3, (Id )x2, (Idl)x3, (IdI)u correspondant aux intensités de fluorescence émise aux longueurs d'onde X2 ou X3, dans les plans parallèles ou différents du plan de polarisation de la lumière excitatrice, par un milieu de mesure contenant ledit composé fluorescent donneur mais ne contenant pas le composé fluorescent accepteur.

Comme dans le premier procédé décrit, les mesures effectuées dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice sont effectuées préférentiellement dans le plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Des mesures dans d'autres plans pourraient également convenir, du moment que le plan choisi n'est pas le plan parallèle au plan de polarisation de la lumière excitatrice.

Le procédé selon l'invention permet donc d'améliorer la sélectivité de la mesure d'un phénomène de transfert d'énergie entre un composé donneur et un composé accepteur. Cela est particulièrement avantageux dans le cas où la sélectivité spectrale entre le donneur et l'accepteur n'est pas optimale, c'est à dire dans les cas suivants: - cas où les spectres d'émission du donneur et de l'accepteur se chevauchent. Les procédés selon l'invention sont particulièrement efficaces dans le cas où 5nm < X3-X2 < 100 nm, X3-2,2 représentant la différence entre les longueurs d'onde X3 et ? 2.

- cas où une excitation parasite directe de l'accepteur est possible à la longueur d'onde d'excitation du donneur RI).

Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre avec de nombreux composés fluorescents donneurs et accepteurs: ces composés peuvent être choisis parmi des protéines fluorescentes ou des fluorophores organiques.

Le donneur et l'accepteur peuvent être des protéines fluorescentes choisies parmis: la GFP (Green fluorescent protein), la CFP (Cyan fluorescent protein), I'YFP (Yellow fluorescent protein) et de manière générale les dérivés de la GFP (BFP,eGFP) ainsi que parmi la famille des Reef Coral Fluorescent Proteins (RCFP) telles que la DsRed HcRed.

Le donneur et l'accepteur peuvent également être des fluorophores organiques, par exemple: les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorescéines, les bodipy, les composés de la famille des AlexaFluors et leurs 2872287 10 dérivés, ou encore les composés fluorescents décrits dans la demande WO2003104685.

Enfin le donneur et l'accepteur peuvent être des microsphères 5 fluorescentes ou des nano-cristaux de type Quantom-dots.

Ces composés fluorescents et leur utilisation dans des systèmes de FRET entre un donneur et un accepteur sont largement décrits dans la littérature. Par ailleurs, l'homme du métier est à même d'utiliser le procédé objet de la présente demande avec un grand nombre de couples donneur I accepteur.

Dans un aspect préféré, les composés fluorescents donneur et accepteur ont une polarisation élevée, en particulier supérieure à 50 mP, de préférence supérieure à 100mP. Les composés donneur et accepteur dont la polarisation intrinsèque est inférieure à 50 mP peuvent être couplés ou adsorbés à des molécules porteuses (molécules organiques, protéines, peptides, anticorps, ou autres molécules telle que décrites ci-après), ce qui aura pour effet d'augmenter la polarisation apparente du fluorophore et permettra de l'utiliser dans les procédés selon l'invention.

Dans un autre aspect préféré, les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis de telle sorte que suite à une excitation à la longueur d'excitation du donneur 2A, aucune émission de l'accepteur n'est détectée à la longueur d'onde d'émission du donneur X2.

Le procédé selon l'invention permet donc d'améliorer substantiellement la détection de phénomènes de transfert d'énergie, ce qui permet d'étudier de manière plus précise notamment les interactions biologiques.

Le procédé selon l'invention peut ainsi être utilisé dans un système biologique dans lequel la distance entre les composés fluorescent donneur et accepteur varie en fonction d'évènement biochimiques se produisant dans le milieu de mesure.

Dans une mise en oeuvre préférée, les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés à des molécules choisies parmi le groupe comprenant: un peptide, une protéine, un anticorps, un antigène, un messager intercellulaire, un messager intracellulaire, un haptène, une lectine, la biotine, l'avidine, la streptavidine, une toxine, un glucide, un oligosaccharide, un polysaccharide, un acide nucléique. Si les composés fluorescents donneur et / ou accepteur sont des protéines fluorescentes, ils peuvent être liés à d'autres protéines sous formes de protéines de fusion, produites par les techniques de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier.

Cela peut par exemple être le cas si les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés directement ou indirectement à un substrat hydrolysable. Si le milieu de mesure contient par exemple une enzyme capable de cliver ledit substrat, la détection de l'évolution du FRET pourra être corrélée à l'activité enzymatique. On pourra ajouter dans un tel système des composés dont ori veut étudier l'impact sur l'activité enzymatique, et observer la variation du FRET, et donc la variation de l'activité enzymatique, en fonction des composés ajoutés au mileu de mesure.

Par liaison directe ou indirecte des composés fluorescents au substrat, on entend une liaison covalente, éventuellement via des bras d'espacement, ou bien des liaisons non covalentes par l'intermédiaire de couples de molécules capables de se lier entre elles. De telle liaison indirectes comprennent par exemple le cas où un composé fluorescent est lié de manière covalente à la biotine, et le substrat comporte un groupe streptavidine, ou encore le cas où le composé fluorescent est lié à un anticorps spécifique d'une étiquette présente sur le substrat, telle que les groupes 6his, flag etc...

Le procédé selon l'invention peut aussi être mis en oeuvre pour étudier la variation d'un FRET dans le cas d'une interaction entre deux composés. Dans ce cas, les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés de manière covalente à deux molécules capables de se reconnaître. Par exemple, le composé donneur peut être lié à un anticorps ou fragment d'anticorps et le composé accepteur peut être lié à l'antigène reconnu par cet anticorps. Ou encore, les composés donneur et accepteur sont chacun liés à un membre d'un couple ligand-récepteur, ou bien à deux protéines interagissant entre elle, ou encore le donneur est lié à un composé régulant l'activité d'une protéine et le composé accepteur est lié à ladite protéine.

Enfin, le procédé selon l'invention peut aussi être mis en oeuvre pour étudier la liaison de deux composés X et Y à un troisième composé Z. Cela peut être intéressant pour étudier des phénomènes de reconnaissance complexe entre différentes protéines. Dans ce cas, le composé X est lié de manière covalente à un composé fluorescent donneur, le composé Y est lié à un composé fluorescent accepteur, et un transfert d'énergie aura lieu si X et Y se lient à la molécule Z. Dans un aspect préféré, les composés fluorescents donneur et accepteur sont différents.

L'invention concerne enfin un appareil de mesure adapté à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention.

Un tel appareil comprend les éléments suivants: des moyens d'illumination d'un milieu de mesure par une lumière excitatrice polarisée, par exemple, lasers, lampes flash ou continues associés à un 25 polariseur, des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu de mesure à des longueurs d'ondes différentes et dans des plans de polarisation différents, notamment parallèles ou non-parallèle, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, les moyens de détection pouvant être des tubes photomultiplicateurs, des caméras CDD ou des caméras intensifiées devant lesquels seront placés les polariseurs appropriés, et des moyens informatiques permettant de corriger le signal mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur par celui mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent donneur, en particulier des programmes d'ordinateur capable de calculer le ratio de l'intensité du signal collecté à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur par l'intensité du signal collecté à la longueur d'onde d'émission du donneur.

Un autre appareil permettant de mettre en oeuvre le procédé selon 10 l'invention comprend: des moyens d'illumination d'un milieu de mesure par une lumière excitatrice polarisée. Par exemple, lasers, lampes flash ou continues associés à un polariseur.

des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu de mesure à des longueur d'ondes différentes et dans des plans de polarisation différents, notamment parallèles ou non-parallèle, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, les moyens de détection pouvant être des tubes photomultiplicateurs, des caméras CDD ou des caméras intensifiées devant lesquels seront placés les polariseurs appropriés, et des moyens informatiques permettant de calculer la polarisation du milieu de mesure spécifiquement due au transfert d'énergie ayant lieu dans le milieu de mesure, selon le procédé décrit plus haut.

Ces appareils peuvent être par exemple des microscopes permettant la mesure de l'intensité de fluorescence émise par un échantillon.

Le procédé selon l'invention, ses différentes mises en oeuvre, ainsi que les instruments permettant de mettre en oeuvre ce procédé permettent d'étudier de manière précise les phénomènes de FRET ayant lieu dans des milieu de mesure complexes et notamment des milieux biologiques contenant des mélanges de protéines, des cellules animales ou végétales, des membranes issues de cellules animales ou végétales ou des membranes artificielles.

Les procédés selon l'invention permettant fondamentalement d'optimiser les mesures de transfert d'énergie (FRET), ils sont parfaitement appropriés pour toutes les techniques basées sur des mesures de FRET.

Par exemple, les procédés selon l'invention peuvent être également mis en oeuvre pour affiner les données obtenues par les techniques de type FLIM (pour Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Pour cela, les procédés selon l'invention seront mis en oeuvre en utilisant des instruments de microscopie (notamment des système de microscopie confocale) qui permettent d'obtenir à la fois des images des cellules ou échantillons biologiques étudiés, et de mesurer les phénomènes de transfert d'énergie.

L'imagerie de fluorescence en temps résolue (FLIM) permet un suivi quantitatif du FRET avec une grande sensibilité, via les changements induits dans la durée de vie de fluorescence du donneur et / ou de l'accepteur. Plus généralement, elle donne accès aux variations de paramètres physico-chimiques dans l'environnement immédiat des sondes fluorescentes.

Les exemples ci-dessous illustrent non limitativement l'invention.

Exemple 1: détermination du niveau de polarisation de différentes molécules fluorescentes Différentes molécules fluorescentes ont été utilisées dans cette expérience: A647 (Alexa Fluor 647 de Molecular Probes).

Protéine eGFP (Green Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules HEK293.

- Protéine de fusion récepteur V1a-YFP (Yellow Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules HEK293.

- Protéine de fusion récepteur CXCR4-CFP (Cyan Fluorescent Protein) 30 exprimée dans des cellules HEK293.

- Protéine de fusion CAM dont la structure est la suivante: CFP-peptide linker-YFP (cette construction est décrite par Zhou et al dans The Journal of pharmacology and experimental therapeutics, 305:460 466, 2003 Direct interaction between the heterotrimeric G protein subunit GR35 and the G protein y subunit-like domain containing regulator of G protein signaling 11: Gain of function of cyan fluorescent protein-tagged Gy3). Cette protéine de fusion a aussi été exprimée dans des cellules HEK 293. Le linker peptidique peut être tout peptide d'environ 9 acides aminés, quels que soient ces acides aminés.

L'expression des différentes protéines de fusion dans les cellules HEK293 a été réalisée de la manière suivante: Les cellules HEK293 sont transfectées transitoirement par électroporation avec des plasmides codantpour différentes protéines de fusion. Les cellules sont ensuite placées à 37 C en milieu régulé. Après 24 heures, les cellules sont récupérées, lavées dans un tampon PBS, comptabilisées et fixées dans une solution à base de paraformaldéhyde.

Toutes les molécules fluorescentes ont été ensuite distribuées dans des microplaques noires Costar sous un volume de 100pI dans un tampon PBS ou PO4 (pour A647). La concentration en A647 était de 10 nM. Pour mesurer le niveau de polarisation des différentes protéines fluorescentes, 50000 cellules HEK293 contenant les différentes molécules ont été distribuées dans les différents puits de la microplaque. La même quantité de cellules témoins (ne contenant aucune protéine fluorescente) a été distribuée dans des puits contrôles .

Le niveau de polarisation a été déterminé à l'aide d'un lecteur de fluorescence sur microplaque, l'Analyst (Molecular Devices). Selon la molécule fluorescente à détecter, l'Analyst était équipé des filtres suivants (tous provenant de chez Omega Optical): Excitation Dichroïque Émission Molécule Nom Longueur Nom Filtre Nom Longueur Filtre d'onde Filtre d'onde EGFP XF1015 485 nm 505DRLP XF3007 535 nm YFP (hors XF 1019 535 nm 570DRLP XF3022 580 nm FRET) A647 XF1027 640 nm 650DRLP XF3031 682 nm YFP (FRET) XF1071 440 nm 455DRLP XF3079 535 nm CFP XF1071 440 nm 455DRLP XF3075 480 nm La mesure successive sur un même puits des fluorescences émises en présence de polariseurs insérés soit entre la source d'excitation et l'échantillon (polariseur à l'excitation) soit entre l'échantillon et le détecteur (polariseur à l'émission) va permettre de calculer le niveau de polarisation des molécules. On réalise ainsi deux mesures d'intensité de fluorescence: l'intensité de fluorescence dite parallèle (I ) qui correspond à l'intensité de fluorescence mesurée avec le polariseur à l'émission situé dans le même plan que le polariseur à l'excitation, et - l'intensité de fluorescence dite orthogonale (Il) qui correspond à l'intensité de fluorescence mesurée avec le polariseur à l'émission situé dans un plan perpendiculaire au polariseur à l'excitation.

Pour chaque molécule fluorescente, le niveau de polarisation (P) est ensuite obtenu grâce à la formule suivante: P= [(I - Il) / (1 +11)j x 1000 P est exprimée en unités mP.

Le tableau 1 ci-dessous rapporte les niveaux de polarisation obtenus pour les différentes molécules observées.

Tableau 1

Molécule niveau de polarisation A647 -17mP EGFP 395mP YFP (hors FRET) 222mP YFP (FRET) 86mP CFP 352mP Les valeurs obtenues montrent que la polarisation des différentes protéines fluorescentes utilisées dans l'expérience est très élevée (> 200mP) en comparaison de celle d'une petite molécule organique comme l'Alexa Fluor 647 (-17mP).

Exemple 2: Détermination du rapport Signal/Bruit (S/B) d'une expérience de 10 FRET intracellulaire.

Les protéines de fusion suivantes ont été utilisées dans cette expérience: Protéine de fusion récepteur Vla-YFP (YFP = Yellow Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules HEK293.

Protéine de fusion récepteur CXCR4-CFP (CFP = Cyan Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules HEK293.

Protéine de fusion CAM dont la structure est la suivante: CFP-peptide linker-YFP. Cette protéine de fusion a aussi été exprimée dans des cellules HEK 293.

L'expression de ces différentes protéines a été réalisée tel que décrit dans l'Exemple 1.

Les cellules contenant le CAM sont celles qui permettent la mesure d'un FRET entre la CFP (molécule donneur) et la YFP (molécule accepteur). Dans les différents puits dits positifs d'une microplaque, 25000 cellules contenant le CAM, préalablement diluées dans un tampon PBS, ont été distribuées sous un volume de 100pl.

Dans les différents puits dits négatifs d'une microplaque, 50000 cellules contenant le V1 a-YFP et 50000 cellules contenant le CXCR4-CFP ont été distribuées dans un tampon PBS sous un volume total de 100p1. Dans ce cas, l'absence de proximité entre la CFP et l'YFP interdit tout FRET entre ces deux molécules et seul le bruit de fond de fluorescence sera mesuré.

Deux mesures de fluorescence successives sont réalisées sur l'Analyst à l'aide des filtres suivants: Excitation Dichroïque Emission Nom Longueur Nom Filtre Nom Longueur Filtre d'onde Filtre d'onde Mesure 1 XF1071 440 nm 455DRLP XF3075 480 nm Mesure 2 XF1071 440 nm 455DRLP XF3079 535 nm Ces deux mesures de fluorescence à 480 nm (148o nm) ou 535 nm (1535 nm) vont être effectuées en présence ou en absence de polariseurs. En présence de polariseurs, seule l'intensité de fluorescence dite orthogonale (L) telle que définie dans l'exemple 1 sera mesurée.

On calcule ensuite les ratios R=(1535 nm/1480 nm) pour les puits positifs ou négatifs et cela pour les mesures de fluorescence totale (sans polariseurs) ou pour la mesure de fluorescence orthogonale (avec polariseurs).

Le signal/bruit (S/B) de l'expérience est ensuite calculé comme suit pour les mesures réalisées avec ou sans les polariseurs.

(S/B)= (R535/480 positif/ R 535/480 négatif) Le graphe représenté sur la figure 1 donne les valeurs de signal/bruit obtenues en absence ou en présence de polariseurs.

Celui-ci montre que l'utilisation de polariseurs dans le système de 25 détection permet d'augmenter de manière significative le rapport signal/bruit de l'expérience (+48%).

En effet, la mesure de fluorescence dite orthogonale permet de favoriser la détection du signal émis par l'accepteur après transfert d'énergie (fluorescence dépolarisée) par rapport aux signaux de fluorescence émis par des donneurs ou des accepteurs de fluorescence non impliqués dans un phénomène de FRET (fluorescence fortement polarisées).

Exemple 3: Mesure du degré de polarisation de l'accepteur pour la détection d'un FRET. Correction de la contamination du donneur dans les signaux de fluorescence mesurés et quantification du FRET.

Les protéines de fusion utilisées dans cet exemple sont identiques 10 à celles décrites dans l'exemple 2. Leur expression a été réalisée tel que décrit dans l'exemple 1.

50000 cellules contenant le CXCR4-CFP ont été distribuées dans un tampon PBS sous un volume total de 100pI. Ces puits dits témoins vont permettre la détermination des facteurs A et B qui vont être utilisés pour corriger le signal de fluorescence à 535 nm du signal de fluorescence émis par la CFP à cette longueur d'onde.

Dans les différents puits dits négatifs d'une microplaque, 50000 cellules contenant le Vla-YFP et 50000 cellules contenant le CXCR4-CFP ont été distribuées dans un tampon PBS sous un volume total de 100pI.

L'absence de proximité entre la CFP et l'YFP interdit tout FRET entre ces deux molécules.

25000 cellules contenant le CAM permettant la mesure d'un FRET entre la CFP (le donneur) et la YFP (l'accepteur), préalablement diluées dans un tampon PBS, ont été distribuées sous un volume de 100pI dans les différents puits dits positifs d'une microplaque.

Des quantités variables de cellules contenant le CAM et de cellules contenant le CXCR4-CFP, préalablement diluées dans un tampon PBS, ont été distribuées sous un volume de 100pl dans les différents puits dits contaminés d'une microplaque. Les mélanges ont été réalisés dans les proportions suivantes: Nombre de Cellules CAM I Nombre de Cellules CXCR4CFP / Puits Puits Contaminé 1 25000 50000 Contaminé 2 12500 50000 Contaminé 3 6250 50000 Chaque série de puits dit contaminés contient une proportion variable de molécules impliquées dans un FRET (CAM) et de donneurs libres (CFP).

Afin de déterminer le degré de polarisation de l'accepteur, quatre mesures de fluorescence successives sont réalisées sur l'Analyst à l'aide des filtres et polariseurs décrits dans le tableau ci-dessous.

Excitation Dichroïque Emission Nom Filtre Longueur Nom Filtre Nom Filtre Longueur Polariseur d'onde d'onde Mesure 1 XF1071 440 nm 455DRLP XF3075 480 nm Parallèle Mesure 2 XF1071 440 nm 455DRLP XF3075 480 nm Orthogonal Mesure 3 XF1071 440 nm 455DRLP XF3079 535 nm Parallèle Mesure 4 XF1071 440 nm 455DRLP XF3079 535 nm Orthogonal Pour les différents échantillons, le niveau de polarisation global à 535 nm (Pglobale) est ensuite obtenu grâce à la formule suivante: Pglobale (1535 nm//- 1535 nm 1) / (1535 nm //+1535 nm 1)] X 1000 P est exprimée en mP.

1535 nm// est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 3 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.

1535 nm 1 est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 4 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.

Le degré de polarisation globale mesurée à 535 nm représente la somme du degré de polarisation de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET et du degré de polarisation du donneur CFP mesurée à 535 nm du fait de la forte contamination en signal CFP à cette longueur d'onde.

La détermination du degré de polarisation de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET peut être obtenu en retranchant des signaux obtenus lors des mesures de fluorescence à 535 nm (mesures 3 et 4) la part du signal provenant du donneur CFP.

Ceci peut être réalisé en établissant une proportionnalité entre le signal émis par la CFP à 480 nm avec les différents polariseurs (mesures 1 et 2) et le signal qu'elle émet à 535 nm sur les puits témoins décrits plus haut.

Pour cela on utilise les formules suivantes: A= (1t535 nm// / It480 nm//) B= (1t535 nml I It480 nml) lt480 nm// est la moyenne des intensités de fluorescence obtenues 15 lors de la mesure 1 sur les puits témoins.

It48o nm est la moyenne des intensités de fluorescence obtenues lors de la mesure 2 sur les puits témoins.

It535 nm// est la moyenne des intensités de fluorescence obtenues lors de la mesure 3 sur les puits témoins.

It535 nm l est la moyenne des intensités de fluorescence obtenues lors de la mesure 4 sur les puits témoins.

Les signaux de fluorescence de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET obtenu à 535 nm avec les différentes configurations de polariseurs (If535 nm// et If535 nm l) sont ensuite calculés à l'aide des formules suivantes pour les différents échantillons testés: If535 nm// = 1535 nm// ' (1480 nm// X A) If535 nml = 1535 nml - (1480 nml X B) 1480 nm// est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 1 30 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.

1480 nm i est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 2 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.

1535 nm// est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 3 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.

1535 nm 1 est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 4 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.

Le degré de polarisation de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET (Pf) est alors calculé pour les puits positifs, négatifs ou contaminés à l'aide de la formule suivante: Pf= [(If535 nm//- 1f535 nm 1) / (1f535 nm //+If535 nm 1)] X 1000 Pf est exprimée en mP.

Le tableau 2 ci-dessous donne le degré de polarisation globale (Pglobale) et le degré de polarisation de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET (Pf) pour les différents échantillons:

Tableau 2

Pglobale Pf Négatif 289mP 322mP Positif 84mP -42mP Contaminé 1 129mP 45mP Contaminé 2 154mP -51 mP Contaminé 3 182mP -54mP Les valeurs rapportées dans le tableau 2 ci-dessus montrent que les formules décrites précédemment permettent de recalculer à partir de différentes mesures de fluorescence polarisée le degré de polarisation de l'accepteur impliqué dans le FRET, ceci même si l'échantillon contient une quantité importante de donneur CFP non impliqué dans un transfert d'énergie.

Le degré de polarisation de I'YFP en FRET, situé autour de - 50mP dans notre expérience, confirme aussi que l'accepteur YFP se dépolarise fortement lorsqu'il est impliqué dans un FRET (valeur initiale de polarisation 222mP trouvée dans l'exemple 1).

Bibliographie citée: 1. Sato et al. (2002) Nature Biotechnology, 20, 287-294.

2. Giulano et al. (1998) Tibtech, 16, 135-140.

3. Miyawaki (2003) Developmental CeJI, 4, 295-305.

4. Sokol et al. (1998) PNAS, 95, 11538-11543.

5. Chan et al. (1979) J Histochem Cytochem, 27-1,56-64.

6. Miyawaki et al. (1997) Nature, 388, 882-887.

7. Bastiaens (2000) Patent WO 00/43780.

8. He et al (2003) Cytometry part A, 53A, 39-54.

9. Gaits et al. (2003) Science's STKE, www.stke. org/cgi/content/full/sigtrans;2003/165/pe3.

10.Yishai et al. (2003) Phys. Med. Biol, 48, 2255-2268.

11.Clayton et al. (2002) Biophysical Journal, 83, 1631-1649. 15 12. Ventre et al. (2003) Molecular Microbiology, 48(1), 187-198. 13.Knight et al. (2002) J. Biochem. Biophys. Methods, 51, 165-177.

Claims (23)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détection d'un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure, caractérisé en ce que la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie est améliorée en utilisant les propriétés de polarisation desdits composés fluorescents donneur et accepteur.

2. Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes: (i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux à la longueur d'onde X1, X1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, et (ii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde X3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent accepteur, caractérisé en ce que la lumière excitatrice est polarisée, et en ce que le signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde X3 est mesuré dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes: (iii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde X2, 2L.2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent donneur, et (iv) correction du signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent accepteur à la longueur d'onde 2,3 par le signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent donneur à la longueur d'onde 2,2.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde X2 est également mesuré dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice.

5. Procédé selon les revendications 3 et 4, caractérisé en ce que la correction du signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent accepteur à la longueur d'onde 2.3 par le signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent donneur à la longueur d'onde 22 comprend la détermination du rapport des signaux mesurés aux longueurs d'ondes 2,3 et 2.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde 22 et/ou a,3 sont mesurés dans un plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice.

7. Procédé selon la revendication 1, comprenant les étapes suivantes: (i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde M, X1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, (ii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It,,)x2 émise à la longueur d'onde X2 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, 22 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent donneur, (iii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (Itl)x2 émise à la longueur d'onde X2 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, (iv) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It )x3 émise à la longueur d'onde 2,3 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, X3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent accepteur, (v) mesure de l'intensité de fluorescence totale (Itl))3 émise à la longueur d'onde 2.3 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, (vi) calcul de la polarisation P due au transfert d'énergie entre le composé fluorescent donneur et le composé fluorescent accepteur selon la formule suivante: I(Itn)X3 (Itu)X2 x A)] - G[(Itl)u - (It_ 2 x B)] [(It//)X3 (It//)a2 X A)] + nG[(Itl)a3 (Itl)u x B)] dans laquelle: - A représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde X2 et X3 par le donneur seul, dans un plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, - B représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde 2.2 et X3 par le donneur seul, dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, - n= 1 ou 2 G est un facteur de correction de sensibilité spécifique de l'appareil de mesure utilisé, compris entre 0,1 et 2, et (vii) comparaison de la valeur de P calculée avec celle obtenue dans un milieu de mesure témoin dans lequel le transfert d'énergie n'a pas lieu, une diminution de P étant indicative d'un transfert d'énergie.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que, dans l'étape (vi), on calcule la polarisation P selon la formule: [(Itu)a3 (It//)n x A)] - G[(ltl)u (Itl)a2 x B)] [(Itu)X3 (!t//)a.2 x A)] + nG[(ltl)a3 (Itl)),2 x B)] dans laquelle: - n = 1 ou 2 P 10

P

- G est un facteur de correction de sensibilité spécifique de l'appareil de mesure utilisé, compris entre 0,1 et 2 - A = (Idn)a3 / (Idii)a,2 - B = (Idl)u / (Id1)a2 (Id )13, (Id )x2, (Idl)x3, (Id1)u correspondant aux intensités de fluorescence émise aux longueurs d'onde 2..2 ou a.3, dans les plans parallèle (/I) ou différent (1) du plan de la lumière excitatrice, par un milieu de mesure contenant ledit composé fluorescent donneur mais pas le composé fluorescent accepteur.

9. Procédé selon les revendications 7 ou 8, caractérisé en ce que ledit plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice est le plan orthogonal audit plan de polarisation de la lumière excitatrice.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que 5 nm< 7^,3-a,2 < 100 nm

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis parmi: des protéines fluorescentes, des fluorophores organiques.

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis parmi: les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les bodipys, les fluorescéines, la GFP, la CFP, I'YFP, la BFP, l'eGFP, les RCFP, DsRed HcRed, les Alexafluors et leurs dérivés.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur ont une polarisation supérieure à 100mP.

14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis de telle sorte que suite à une excitation à la longueur d'excitation du donneur X1, aucune émission de l'accepteur n'est détecté à la longueur d'onde d'émission du donneur X2.

15. Procédé selon les revendications 1 à 14, caractérisé en ce que la distance entre les composés donneur et accepteur est susceptible de varier en fonction d'évènements biochimiques ayant lieu dans le milieu de mesure.

16. Procédé selon les revendications 1 à 15, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés à des molécules choisies parmi le groupe comprenant: peptides, protéines, anticorps, antigènes, messagers intercellulaire, messagers intracellulaire, haptène, lectine, la biotine, avidine, streptavidine, toxine, glucide, oligosaccharide, polysaccharide, un acide nucléique.

17. Procédé selon les revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont liés de manière directe ou indirecte à un substrat hydrolysable.

18. Procédé selon les revendications 1 à 17, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont chacun liés de manière covalente à un couple de molécules susceptibles de se reconnaître.

19. Procédé selon les revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont chacun liés à deux molécules capables de reconnaître une troisième molécule présente dans le milieu de mesure.

20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont différents.

21.Appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure comprenant: des moyens d'illumination dudit milieu par une lumière excitatrice polarisée, des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu à des longueur d'ondes différentes et dans des plans de polarisation parallèles ou différents, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, et des moyens informatiques permettant de corriger le signal mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur par celui mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent donneur.

22.Appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure, comprenant: des moyens d'illumination dudit milieu par une lumière excitatrice polarisée, des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu à des longueur d'ondes différentes et dans des plans de polarisation parallèles ou différents, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, et des moyens informatiques permettant de calculer la polarisation du milieu de mesure spécifiquement due au transfert d'énergie ayant lieu dans le milieu de mesure, selon le procédé décrit dans les revendications 7 à 9.

23.Appareil selon les revendications 21 ou 22, caractérisé en ce que ledit appareil est un microscope.