WO2006010839B1 - Procede d’amelioration de la detection des signaux de fluorescence lors d’un transfert d’energie non radiatif - Google Patents
Procede d’amelioration de la detection des signaux de fluorescence lors d’un transfert d’energie non radiatifInfo
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Abstract
L’invention concerne l’utilisation du phénomène de polarisation de fluorescence, en vue d’améliorer la détection des signaux de fluorescence lors d’un transfert d’énergie non radiatif (FRET). En particulier, l’invention concerne une méthode d’amélioration du rapport signal/bruit de fond dans une mesure de FRET. L’invention concerne également un appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d’énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure.
Claims
1. Procédé de détection d'un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure comprenant les étapes suivantes :
(i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux à la longueur d'onde λ1 , λ1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, et (ii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ3, λ3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent accepteur, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : (iii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ2, λ2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent donneur, et
(iv) correction du signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent accepteur à la longueur d'onde λ3 par le signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent donneur à la longueur d'onde λ2, le composé fluorescent donneur et le composé fluorescent accepteur étant différents, en ce que la lumière excitatrice est polarisée, et en ce que le signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ3 est mesuré dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ2 est également mesuré dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice.
3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la correction du signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent accepteur à la longueur d'onde λ3 par le signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent donneur à la longueur d'onde λ2 comprend la détermination du rapport des signaux mesurés aux longueurs d'ondes λ3 et λ2.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et/ou λ3 sont mesurés dans un plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice.
5. Procédé selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes : (i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde λ1 , λ1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité,
(ii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (lt//)λ2 émise à la longueur d'onde λ2 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, λ2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent donneur,
(iii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (ltj_)λ2 émise à la longueur d'onde λ2 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, (iv) mesure de l'intensité de fluorescence totale (lt//)λ3 émise à la longueur d'onde λ3 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, λ3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent accepteur,
(v) mesure de l'intensité de fluorescence totale (lti)λ3 émise à la longueur d'onde λ3 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice,
(vi) calcul de la polarisation P due au transfert d'énergie entre le composé fluorescent donneur et le composé fluorescent accepteur selon la formule suivante :
FEUILLE MODIFIEE M
[(lt//)λ3 - (lt//)λ2 x A)] - GI(It1)X3 - (It1)X2 x B)]
P =
[(lt//)χ3 - (lt//)λ2 x A)] + nG[(ltjL)χ3 - (It1)X2 x B)]
dans laquelle :
- A représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et λ3 par le donneur seul, dans un plan parallèle au plan de la lumière excitatrice,
- B représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et λ3 par le donneur seul, dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, - n= 1 ou 2
- G est un facteur de correction de sensibilité spécifique de l'appareil de mesure utilisé, compris entre 0,1 et 2, et (vii) comparaison de la valeur de P calculée avec celle obtenue dans un milieu de mesure témoin dans lequel le transfert d'énergie n'a pas lieu, une diminution de P étant indicative d'un transfert d'énergie.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, dans l'étape (vi), on calcule la polarisation P selon la formule :
[(lt//)λ3 - (lt//)λ2 x A)] - GI(IUx3 - (lti)λ2 x B)] P =
[(lt//)λ3 - (lt//)λ2 x A)] + nG[(ltj.)λ3 - (It1)X2 x B)]
dans laquelle : - n = 1 ou 2
- G est un facteur de correction de sensibilité spécifique de l'appareil de mesure utilisé, compris entre 0,1 et 2
- A = (IdZz)X3 Z (IdZz)X2 
(Id//)λ3, (Id//)λ2, (ldi)χ3, (Id±)λ2 correspondant aux intensités de fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 ou λ3, dans les plans parallèle (//) ou différent (1) du plan de la lumière excitatrice, par un milieu de mesure
FEUILLE MODIFIEE contenant ledit composé fluorescent donneur mais pas le composé fluorescent accepteur.
7. Procédé selon les revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que ledit plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice est le plan orthogonal audit plan de polarisation de la lumière excitatrice.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que 5 nm< λ3-λ2 < 100 nm.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis parmi : des protéines fluorescentes, des fluorophores organiques.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis parmi : les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les bodipys , les fluorescéines, la GFP, la CFP, l'YFP, la BFP, l'eGFP, les RCFP, DsRed HcRed, les Alexafluors et leurs dérivés.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur ont une polarisation supérieure à 5OmP.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur ont une polarisation supérieure à
10OmP.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis de telle sorte que suite à une excitation à la longueur d'excitation du donneur λ1 , aucune émission de l'accepteur n'est détecté à la longueur d'onde d'émission du donneur λ2.
14. Procédé selon les revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la distance entre les composés donneur et accepteur est susceptible de varier en fonction d'événements biochimiques ayant lieu dans le milieu de mesure.
15. Procédé selon les revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés à des molécules choisies parmi le groupe comprenant : peptides, protéines, anticorps, antigènes,
FEUILLE MODIFIEE 33
messagers intercellulaire, messagers intracellulaire , haptène, lectine, la biotine, avidine, streptavidine, toxine, glucide, oligosaccharide, polysaccharide, un acide nucléique.
16. Procédé selon les revendications 1 à 15, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont liés de manière directe ou indirecte à un substrat hydrolysable.
17. Procédé selon les revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont chacun liés de manière covalente à un couple de molécules susceptibles de se reconnaître.
18. Procédé selon les revendications 1 à 17, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont chacun liés à deux molécules capables de reconnaître une troisième molécule présente dans le milieu de mesure.
19. Appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure comprenant :
- des moyens d'illumination dudit milieu par une lumière excitatrice polarisée,
- des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu à des longueur d'ondes différentes et dans des plans de polarisation différents, parallèles ou non parallèles, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, et
- des moyens informatiques permettant de corriger le signal mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur par celui mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent donneur.
20. Appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure, comprenant :
- des moyens d'illumination dudit milieu par une lumière excitatrice polarisée,
- des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu à des longueur d'ondes différentes et dans des plans de polarisation différents, parallèles ou non parallèles, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, et
FEUILLE MODIFIEE - des moyens informatiques permettant de calculer la polarisation du milieu de mesure spécifiquement due au transfert d'énergie ayant lieu dans le milieu de mesure, selon le procédé décrit dans les revendications 3 à 7.
21. Appareil selon les revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que ledit appareil est un microscope.
FEUILLE MODIFIEE
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