EP1766374A2 - Procede d"amelioration de la detection des signaux de fluorescence lors d"un transfert d"energie non radiatif - Google Patents

Procede d"amelioration de la detection des signaux de fluorescence lors d"un transfert d"energie non radiatif

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Publication number
EP1766374A2
EP1766374A2 EP05783888A EP05783888A EP1766374A2 EP 1766374 A2 EP1766374 A2 EP 1766374A2 EP 05783888 A EP05783888 A EP 05783888A EP 05783888 A EP05783888 A EP 05783888A EP 1766374 A2 EP1766374 A2 EP 1766374A2
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EP
European Patent Office
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donor
fluorescent
acceptor
wavelength
plane
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05783888A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Eric Trinquet
Gérard Mathis
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CIS Bio International SA
Original Assignee
CIS Bio International SA
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6445—Measuring fluorescence polarisation

Definitions

  • the invention relates to the use of the fluorescence polarization phenomenon, with a view to improving the detection of fluorescence signals during non-radiative energy transfer (FRET).
  • the invention relates to a method for improving the signal-to-noise ratio in a FRET measurement.
  • Fluorescence non-radiative energy transfer (FRET) is a spectroscopic tool widely used in the detection of biological events and in particular molecular interactions.
  • FRET Fluorescence Activated FRET
  • a spatial approximation between donor and acceptor fluorescent molecules that will be involved in energy transfer proves to be a powerful tool in the demonstration of biological interactions. It can be used in fields as varied as molecular biology, in-vitro or in-cellulo detection of enzymatic phenomena (peptide cleavage, phosphorylation) or interactions between proteins (1, 2, 3). Detection of the FRET phenomenon can be done by measuring different parameters of the fluorescence signal emitted either by the donor, by the acceptor or by the two molecules. Among the most used techniques, we can mention:
  • the FRET phenomenon proves to be complex to detect in many applications based on fluorescence intensities measurements.
  • the need for substantial energy compatibility between the donor and the acceptor often leads to the use of molecules having relatively close fluorescence emission spectra.
  • the overlap of the donor and acceptor spectra that results makes it very difficult to accurately measure the variations of signals recorded on the donor or on the acceptor (9).
  • FRET experiments such as the most widely used Cyan Fluorescent Protein (CFP) / Yellow Fluorescent Protein (YFP) donor / acceptor pair.
  • CFP Cyan Fluorescent Protein
  • YFP Yellow Fluorescent Protein
  • FRET experiments capable of being expressed in fluorescent form in many cell types, allow the demonstration of numerous intracellular events.
  • an important overlap of fluorescence spectra exists between them, resulting in the direct parasitic excitation of the acceptor by the excitation beam of the donor molecule.
  • the signal-to-background ratio of the FRET experiments performed with this donor / acceptor pair is low, often less than 1.5 (1). Therefore, it is necessary to implement complex experimental protocols including many experimental controls to be able to interpret the results obtained.
  • the technical problem to be solved therefore consists in providing a simple and reproducible method for correcting the FRET measurement, in particular by improving the signal-to-noise ratio.
  • a homoFRET between two GFP molecules was detected by measuring their depolarization (12).
  • the depolarization measurement of lectin-coupled rhodamine was used to detect a FRET occurring between fluorescein and rhodamine (5).
  • the measurement of the increase in the polarization of a Concanaviline A-fluorescein donor has made it possible to demonstrate a FRET indicating the formation of a cluster (in English "cluster”) molecular in the lymphocyte membranes (10).
  • GFP-type fluorescent proteins for example, because of their structure and their molecular weight, are highly polarized molecules. Their degree of polarization varies when they are involved in a transfer of energy: as a donor molecule, their polarization increases a little, whereas as an acceptor molecule, they undergo a strong depolarization through the FRET phenomenon.
  • the signal measured at the emission wavelength of the acceptor will comprise:
  • a depolarized signal from the FRET (the specific signal that one wants to measure)
  • the method according to the invention is therefore based on the use of this important polarization variation between the donor and the acceptor to improve the spectral selectivity of the FRET measurement.
  • the measurement of the emitted fluorescence signal is carried out either in the plane of polarization parallel to that of the polarized excitation light, or in the plane of polarization orthogonal to that of the polarized excitation light, according to the state of polarization of the donor molecule and that of the acceptor molecule.
  • the invention therefore relates to a method for detecting an energy transfer between a donor fluorescent compound and an acceptor fluorescent compound present in a measurement medium, wherein the selectivity of the measurement of the energy transfer is improved by using the polarization properties of said fluorescent donor and acceptor compounds.
  • the energy transfer is detected by measuring the signal resulting from the florescence emitted by the acceptor fluorescent compound at a wavelength ⁇ 3. This emission results from the transfer of energy between a fluorescent donor compound, excited in the measuring medium at a wavelength ⁇ 1 and said acceptor fluorescent compound.
  • measuring medium a solution comprising the fluorescent donor and acceptor compounds; this solution may be a biological sample, or may contain the elements necessary for the study of a biological phenomenon.
  • the measuring medium can also be a tissue sample living cells or live cells placed in an appropriate culture medium.
  • the fluorescent donor and acceptor compounds are present either in the culture medium of said sample of tissue or said cells, or in the tissue itself or in the cells.
  • the measuring medium may finally consist of a living organism, an animal, in particular a mammal to which the fluorescent donor and acceptor compounds have been administered.
  • the administration of the fluorescent donor and acceptor compounds to a living animal can be carried out topically, by simply bringing said compounds into contact with the animal; donor and acceptor compounds may also be injected into the animal; fluorescent donor and acceptor compounds may also be directly produced in the body of the animal by genetic engineering.
  • the general method according to the invention solves the problems related to the use of fluorescent compounds donors and acceptors of low spectral selectivity, and in particular to limit the background noise related d part of the emission of light by the donor at the emission wavelength of the acceptor, and secondly at the emission of light by the acceptor not involved in the transfer of energy the acceptor being in this case excited directly by the excitatory light.
  • the invention relates to a method for detecting an energy transfer between a donor fluorescent compound and an acceptor fluorescent compound present in a measurement medium, comprising the following steps: (i) excitation of the measuring medium by a light beam polarized at the wavelength ⁇ 1, ⁇ 1 being the wavelength at which said fluorescent donor compound is excited, and
  • the measurement of the signal emitted at the emission wavelength of the acceptor fluorescent compound in a different (ie non-parallel) plane of the polarization plane of the exciting light will make it possible to promote the measurement of the signal emitted by the strongly depolarized species, and in particular the signal of the acceptor engaged in the transfer of energy, thereby reducing the measured signal portion not resulting from the energy transfer.
  • the plane in which the measurement is made is preferably the plane orthogonal to the plane of polarization of the exciting light. Measures in other plans may also be appropriate.
  • the correction of step (iv) above may, for example, consist of a calculation of the ratio of the intensity of the fluorescence measured at the wavelength ⁇ 3 by that measured at the wavelength ⁇ 2.
  • the measurement of the signal resulting from the fluorescence emitted can be carried out in a parallel or different plane, preferably orthogonal to the plane of the excitatory light.
  • the polarization properties of the donor and acceptor fluorescent compounds are used to improve the selectivity of the energy transfer measurement, in a method for determining the polarization variation due to energy transfer. Like the first method described above, this method will make it possible to improve the selectivity of the measurement, which will thus be better correlated with the energy transfer phenomenon that it is desired to detect.
  • This second embodiment comprises the following steps: (i) excitation of the measurement medium by a polarized light beam at the wavelength ⁇ 1, where ⁇ 1 is the wavelength at which said fluorescent donor compound is excited, (ii) measuring the total fluorescence intensity (lt //) ⁇ 2 emitted at the wavelength ⁇ 2 in the plane parallel to the plane of the excitatory light, ⁇ 2 being the wavelength at which the light of the fluorescent donor compound is emitted (iii) measuring the total fluorescence intensity (It 1 K 2 emitted at the wavelength ⁇ 2 in a plane different from the polarization plane of the exciting light,
  • A represents the proportionality factor between the signals resulting from the fluorescence emitted at the wavelengths ⁇ 2 and ⁇ 3 by the donor alone, in a plane parallel to the plane of the excitatory light,
  • G is a factor that makes it possible to correct the sensitivity difference of the detection in the parallel and orthogonal planes. This factor is either provided by the manufacturer, or easily determined by those skilled in the art by measuring the polarization of known polarization substances.
  • a and B are calculated as follows:
  • the measurements made in a plane different from the plane of polarization of the exciting light are preferably carried out in the plane orthogonal to the plane of polarization of the exciting light. Measurements in other planes could also be appropriate, as long as the chosen plane is not the plane parallel to the plane of polarization of the exciting light.
  • the method according to the invention thus makes it possible to improve the selectivity of the measurement of a phenomenon of energy transfer between a donor compound and an acceptor compound.
  • This is particularly advantageous in the case where the spectral selectivity between the donor and the acceptor is not optimal, ie in the following cases: - where the emission spectra of the donor and the acceptor overlap.
  • the methods according to the invention are particularly effective in the case where 5nm ⁇ 3- ⁇ 2 ⁇ 100 nm, ⁇ 3- ⁇ 2 representing the difference between the wavelengths ⁇ 3 and ⁇ 2. - case where a direct parasitic excitation of the acceptor is possible at the excitation wavelength of the donor ( ⁇ 1).
  • the process according to the invention can be carried out with numerous fluorescent donor and acceptor compounds: these compounds can be chosen from fluorescent proteins or organic fluorophores.
  • the donor and the acceptor may be fluorescent proteins chosen from: GFP (Green fluorescent protein), CFP (Cyan fluorescent protein), YFP (Yellow fluorescent protein) and, in general, GFP derivatives ( BFP.eGFP), as well as among the family of Reef Coral Fluorescent Proteins (RCFP) such as DsRed HcRed.
  • the donor and the acceptor may also be organic fluorophores, for example: rhodamines, cyanines, squaraines, fluoresceins, bodipies, compounds of the AlexaFluor family and their derivatives, or the fluorescent compounds described in US Pat. WO2003104685.
  • the donor and the acceptor may be fluorescent microspheres or nano-crystals of Quantom-dots type.
  • the fluorescent donor and acceptor compounds have a high polarization, in particular greater than 50 mP, preferably greater than 10OmP.
  • Donor and acceptor compounds whose intrinsic polarization is less than 50 mP can be coupled or adsorbed to carrier molecules (organic molecules, proteins, peptides, antibodies, or other molecules as described below), which will have the effect of increase the apparent polarization of the fluorophore and allow it to be used in according to the invention.
  • the fluorescent donor and acceptor compounds are chosen such that, following excitation at the donor excitation length ⁇ 1, no emission of the acceptor is detected at the wavelength of donor emission ⁇ 2.
  • the method according to the invention therefore makes it possible to substantially improve the detection of energy transfer phenomena, which makes it possible to study in a more precise manner in particular the biological interactions.
  • the method according to the invention can thus be used in a biological system in which the distance between the donor and acceptor fluorescent compounds varies according to biochemical events occurring in the measuring medium.
  • the fluorescent donor and acceptor compounds are linked to molecules chosen from the group comprising: a peptide, a protein, an antibody, an antigen, an intercellular messenger, an intracellular messenger, a hapten, a lectin, biotin, avidin, streptavidin, a toxin, a carbohydrate, an oligosaccharide, a polysaccharide, a nucleic acid.
  • the fluorescent donor and / or acceptor compounds are fluorescent proteins, they may be linked to other proteins in the form of fusion proteins, produced by recombinant DNA techniques, well known to those skilled in the art.
  • the fluorescent donor and acceptor compounds are directly or indirectly bound to a hydrolyzable substrate.
  • the measuring medium contains, for example, an enzyme capable of cleaving said substrate, the detection of the evolution of the FRET may be correlated with the enzymatic activity.
  • direct or indirect bonding of the fluorescent compounds to the substrate is meant a covalent bond, optionally via spacer arms, or non-covalent bonds via couples. molecules that can bind to each other.
  • Such indirect linkages include, for example, the case where a fluorescent compound is covalently bound to biotin, and the substrate has a streptavidin group, or the case where the fluorescent compound is bound to a specific antibody of a label present on the substrate. the substrate, such as groups 6his, flag etc.
  • the method according to the invention can also be used to study the variation of a FRET in the case of an interaction between two compounds.
  • the fluorescent donor and acceptor compounds are covalently bound to two molecules capable of recognizing each other.
  • the donor compound may be linked to an antibody or antibody fragment and the acceptor compound may be bound to the antigen recognized by that antibody.
  • the donor and acceptor compounds are each bound to a member of a ligand-receptor pair, or to two interacting proteins, or the donor is bound to a compound that regulates the activity of a protein and the acceptor compound is bound to said protein.
  • the method according to the invention can also be used to study the binding of two compounds X and Y to a third compound Z. This may be of interest for studying phenomena of complex recognition between different proteins.
  • compound X is covalently bound to a donor fluorescent compound
  • compound Y is bound to an acceptor fluorescent compound, and energy transfer will occur if X and Y bind to molecule Z.
  • the fluorescent donor and acceptor compounds are different.
  • the invention finally relates to a measuring apparatus adapted to the implementation of the method according to the invention.
  • Such an apparatus comprises the following elements:
  • means for illuminating a measuring medium with a polarized exciter light for example, lasers, flash or continuous lamps associated with a polarizer; means for collecting the fluorescence emitted by the measuring medium at lengths of different waves and in different polarization planes, in particular parallel or non-parallel, preferentially orthogonal to that of the exciting light, the detection means being photomultiplier tubes, CDD cameras or intensified cameras in front of which will be placed the appropriate polarizers, and - computer means for correcting the signal measured at the wavelength of emission of the acceptor fluorescent compound by that measured at the emission wavelength of the donor fluorescent compound, in particular computer programs capable of calculating the ratio of the intensity of the signal collected at the wavelength d emission of the acceptor by the intensity of the signal collected at the emission wavelength of the donor.
  • Another apparatus for implementing the method according to the invention comprises:
  • a polarized excitation light for example, lasers, flash or continuous lamps associated with a polarizer
  • the detection means being able to detect be photomultiplier tubes, CDD cameras or intensified cameras in front of which the appropriate polarisers will be placed, and
  • These devices can be for example microscopes for measuring the fluorescence intensity emitted by a sample.
  • the method according to the invention makes it possible to study in a precise manner the FRET phenomena occurring in complex measuring media and in particular biological media containing mixtures of proteins, animal or plant cells, membranes derived from animal or plant cells or artificial membranes. Since the methods according to the invention fundamentally make it possible to optimize energy transfer measurements (FRET), they are perfectly suitable for all techniques based on FRET measurements.
  • FRET energy transfer measurements
  • the methods according to the invention can also be used to refine the data obtained by the type techniques
  • FLIM Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
  • Time-resolved fluorescence imaging allows for quantitative monitoring of FRET with high sensitivity, via changes induced in the fluorescence lifetime of the donor and / or acceptor.
  • A647 Alexa Fluor 647 from Molecular Probes.
  • VIa-YFP Yellow Fluorescent Protein
  • Receptor fusion protein CXCR4-CFP (Cyan Fluorescent Protein) expressed in HEK293 cells.
  • CAM fusion protein whose structure is as follows: CFP-peptide linker-YFP (this construct is described by Zhou et al in The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 305: 460-466, 2003). Direct Interaction Between the Heterotrimeric G Protein subunit G ⁇ 35 and the G G protein signaling 11: Gain of function of fluorescent cyan protein-tagged G ⁇ 3). This fusion protein has also been expressed in HEK 293 cells.
  • the peptide linker can be any peptide of about 9 amino acids, regardless of these amino acids.
  • HEK293 cells are transiently transfected by electroporation with plasmids encoding different fusion proteins. The cells are then placed at 37 ° C. in a controlled medium. After 24 hours, the cells are recovered, washed in PBS buffer, counted and fixed in a solution based on paraformaldehyde.
  • HEK293 containing the different molecules were distributed in the different wells of the microplate.
  • the same amount of control cells (not containing any fluorescent protein) was distributed in "control" wells.
  • the level of polarization was determined using a microplate fluorescence reader, the Analyst (Molecular Devices). According to the fluorescent molecule to be detected, the Analyst was equipped with the following filters (all from Omega Optical):
  • P is expressed in mP units.
  • Table 1 below reports the polarization levels obtained for the various molecules observed.
  • Example 2 Determination of the signal / noise ratio (S / B) of an intracellular FRET experiment.
  • Receptor fusion protein VIa-YFP Yellow Fluorescent Protein expressed in HEK293 cells.
  • CXCR4-CFP Receptor Fusion Protein CXCR4-CFP Receptor Fusion Protein
  • CAM fusion protein whose structure is as follows: CFP-peptide linker-YFP. This fusion protein was also expressed in HEK 293 cells. The expression of these different proteins was carried out as described in Example 1.
  • the cells containing the CAM are those which allow the measurement of a FRET between the CFP (donor molecule) and the YFP (acceptor molecule).
  • the ratios are then calculated for positive or negative wells for total fluorescence measurements (without polarizers) or for orthogonal fluorescence measurement (with polarizers).
  • the signal / noise (S / B) of the experiment is then calculated as follows for measurements made with or without the polarizers.
  • the graph shown in FIG. 1 gives the signal / noise values obtained in the absence or in the presence of polarizers.
  • the so-called “orthogonal" fluorescence measurement makes it possible to promote the detection of the signal emitted by the acceptor after energy transfer (depolarized fluorescence) with respect to the fluorescence signals emitted by donors or fluorescence acceptors not involved in a FRET phenomenon (highly polarized fluorescence).
  • Example 3 Measurement of the degree of polarization of the acceptor for the detection of a FRET. Correction of donor contamination in measured fluorescence signals and quantification of FRET.
  • the fusion proteins used in this example are identical to those described in Example 2. Their expression was carried out as described in Example 1.
  • P is expressed in mP.
  • I ⁇ 35 nm // is the fluorescence intensity obtained during measurement 3 either on the positive wells or on the negative wells or on the contaminated wells.
  • l 53 5 ⁇ m i is the fluorescence intensity obtained during measurement 4 either on the positive wells or on the negative wells or on the contaminated wells.
  • the overall degree of polarization measured at 535 nm represents the sum of the degree of polarization of the YFP acceptor involved in the FRET and the degree of polarization of the CFP donor measured at 535 nm due to the high contamination of CFP signal at this wavelength.
  • the determination of the degree of polarization of the YFP acceptor involved in the FRET can be obtained by subtracting the signal from the CFP donor from the signals obtained during the fluorescence measurements at 535 nm (measurements 3 and 4).
  • IW n mx is the average of the fluorescence intensities obtained during measurement 2 on the control wells.
  • It 535 nm // is the average of the fluorescence intensities obtained when measuring on three control wells.
  • K 535 nm x is the average of the fluorescence intensities obtained during measurement 4 on the control wells.
  • U ⁇ o n m // is the fluorescence intensity obtained during measurement 1 either on the positive wells or on the negative wells or on the contaminated wells.
  • U ⁇ o nm x is the fluorescence intensity obtained during measurement 2 either on the positive wells or on the negative wells or on the contaminated wells.
  • l535 ⁇ m // is the fluorescence intensity obtained during measurement 3 either on the positive wells or on the negative wells or on the contaminated wells.
  • I535 nm 1 is the fluorescence intensity obtained during measurement 4 either on the positive wells or on the negative wells or on the contaminated wells.
  • Pf is expressed in mP.
  • Table 2 shows the degree of overall polarization (ie Pgiob a) and the degree of polarization of the acceptor YFP involved in the FRET (Pf) for the different samples:

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Abstract

L’invention concerne l’utilisation du phénomène de polarisation de fluorescence, en vue d’améliorer la détection des signaux de fluorescence lors d’un transfert d’énergie non radiatif (FRET). En particulier, l’invention concerne une méthode d’amélioration du rapport signal/bruit de fond dans une mesure de FRET. L’invention concerne également un appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d’énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure.

Description

Procédé d'amélioration de la détection des signaux de fluorescence lors d'un transfert d'énergie non radiatif
L'invention concerne l'utilisation du phénomène de polarisation de fluorescence, en vue d'améliorer la détection des signaux de fluorescence lors d'un transfert d'énergie non radiatif (FRET). En particulier, l'invention concerne une méthode d'amélioration du rapport signal / bruit de fond dans une mesure de FRET. Le transfert d'énergie non radiatif en fluorescence (FRET) est un outil spectroscopique largement utilisé dans la détection d'événements biologiques et notamment d'interactions moléculaires.
Dans de nombreux cas, le FRET, qui nécessite un rapprochement spatial entre des molécules fluorescente donneur et accepteur qui vont être impliquées dans le transfert d'énergie, s'avère être un outil puissant dans la mise en évidence des interactions biologiques. Il peut être utilisé dans des domaines aussi variés que la biologie moléculaire, la mise en évidence in-vitro ou in-cellulo de phénomènes enzymatiques (clivage peptidique, phosphorylation) ou d'interactions entre protéines (1 ,2,3). La détection du phénomène de FRET peut se faire par la mesure de différents paramètres du signal de fluorescence émis soit par le donneur, soit par l'accepteur, soit par les deux molécules. Parmi les techniques les plus usitées, on peut notamment citer :
- la mesure de la baisse de fluorescence du donneur induite par le phénomène de FRET (4),
- la mesure de l'augmentation de la fluorescence de l'accepteur induite par l'énergie provenant du donneur au travers du FRET (5),
- la détermination du ratio [(augmentation fluorescence accepteur)/ (diminution fluorescence donneur)] (6), - la mesure de la diminution de la durée de vie de fluorescence du donneur induite par le phénomène de FRET (7). Celle-ci est notamment mesurée par la technique de « Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy » (FLIM), - la mesure de l'augmentation de la fluorescence du donneur impliqué dans un FRET après le photoblanchiment de l'accepteur (8) ; cette technique de photoblanchiment est connue sous le nom de Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP). Si l'on fait abstraction des techniques associant le FRET et une détection en temps résolu rendue possible par l'utilisation de donneur de fluorescence à durée de vie longue (ex : HTRF), le phénomène de FRET s'avère complexe à détecter dans de nombreuses applications basées sur des mesures d'intensités de fluorescence. La nécessité d'une compatibilité énergétique importante entre le donneur et l'accepteur conduit souvent à l'utilisation de molécules possédant des spectres d'émission de fluorescence relativement proches. Le recouvrement des spectres du donneur et de l'accepteur qui en découle rend très difficile une mesure précise des variations de signaux enregistrées sur le donneur ou sur l'accepteur (9). Ceci est particulièrement vrai lorsque des protéines fluorescentes dérivant de la Green Fluorescent Protein (GFP) sont utilisées dans des expériences de FRET, telle que la paire donneur/accepteur Cyan Fluorescent Protein (CFP)/ Yellow Fluorescent Protein (YFP)qui est la plus utilisée. Ces molécules, capables d'être exprimées sous forme fluorescente dans de nombreux types cellulaires, permettent la mise en évidence de nombreux événements intracellulaires. Toutefois, un important recouvrement de spectres de fluorescence existe entre celles-ci, résultant en l'excitation parasite directe de l'accepteur par le faisceau d'excitation de la molécule donneur. De ce fait, le rapport signal /bruit de fond des expériences de FRET réalisées avec cette paire donneur /accepteur est faible, souvent inférieur à 1 ,5 (1). Par conséquent, il est nécessaire de mettre en oeuvre des protocoles d'expérimentation complexes comprenant de nombreux contrôles expérimentaux pour pouvoir interpréter les résultats obtenus.
Le problème technique à résoudre consiste donc à fournir une méthode simple et reproductible de correction de la mesure de FRET, notamment par l'amélioration du rapport signal /bruit de fond.
On a maintenant trouvé que l'impact du fort recouvrement des spectres d'émission de fluorescence du donneur et de l'accepteur pouvait être significativement diminué en utilisant les propriétés de polarisation de ces composés pour corriger la mesure de FRET.
Il a été décrit que l'apparition d'un transfert d'énergie entre deux molécules fluorescentes provoquait des modifications de polarisation à la fois au niveau du donneur et au niveau de l'accepteur : la polarisation du donneur augmente lorsqu'il est impliqué dans un FRET (10), alors que celle de l'accepteur impliqué dans le FRET diminue (11).
L'influence du FRET sur la polarisation relative du donneur et de l'accepteur a ainsi été utilisée dans différents systèmes moléculaires pour mettre en évidence ce transfert d'énergie entre deux sondes fluorescentes.
Notamment, un homoFRET entre deux molécules de GFP a été détecté en mesurant leur dépolarisation (12). La mesure de la dépolarisation de la rhodamine couplée à une lectine a été utilisée pour détecter un FRET se produisant entre la fluorescéine et la rhodamine (5). Egalement, la mesure de l'augmentation de la polarisation d'un donneur Concanaviline A-Fluorescéine a permis de mettre en évidence un FRET indiquant la formation d'un amas (en anglais « cluster ») moléculaire dans les membranes lymphocytaires (10).
Les mesures de polarisation utilisées jusqu'ici avaient donc pour but de mettre en évidence l'existence d'un FRET entre deux molécules.
De manière surprenante, on a maintenant trouvé que la mesure polarisée des signaux de fluorescence permet de mieux isoler les signaux émis spécifiquement par le donneur et l'accepteur impliqués dans le FRET et donc d'augmenter le rapport signal/bruit de fond dans les tests réalisés. En effet, les protéines fluorescentes de type GFP par exemple, du fait de leur structure et de leur poids moléculaire, sont des molécules fortement polarisées. Leur degré de polarisation varie lorsqu'elles sont impliquées dans un transfert d'énergie : en tant que molécule donneur, leur polarisation augmente un peu, tandis qu'en tant que molécule accepteur, elles subissent une forte dépolarisation au travers du phénomène de FRET.
Dans un milieu contenant un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur et où a lieu un transfert d'énergie entre ces deux composés suite à l'excitation du milieu à la longueur d'onde d'excitation du donneur, le signal mesuré à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur comprendra :
• un signal dépolarisé issu du FRET (le signal spécifique que l'on veut mesurer),
• un signal très polarisé émis par l'accepteur, consécutif à son excitation directe par le faisceau lumineux sensé exciter le donneur (signal parasite), et
• un signal très polarisé émis par le donneur, consécutif à l'excitation du donneur (signal parasite). La méthode selon l'invention est donc basée sur l'utilisation de cette variation importante de polarisation entre le donneur et l'accepteur pour améliorer la sélectivité spectrale de la mesure du FRET . En effet, selon l'une des variantes de l'invention, la mesure du signal de fluorescence émis est effectuée soit dans le plan de polarisation parallèle à celui de la lumière polarisée d'excitation, soit dans le plan de polarisation orthogonal à celui de la lumière polarisée d'excitation, selon l'état de polarisation de la molécule donneur et celui de la molécule accepteur.
L'invention concerne donc un procédé de détection d'un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure, dans lequel la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie est améliorée en utilisant les propriétés de polarisation desdits composés fluorescents donneur et accepteur.
Le transfert d'énergie est détecté en mesurant le signal résultant de la florescence émise par le composé fluorescent accepteur à une longueur d'onde λ3. Cette émission résulte du transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur, excité dans le milieu de mesure à une longueur d'onde λ1 et ledit composé fluorescent accepteur.
Par « milieu de mesure », on entend une solution comprenant les composés fluorescents donneur et accepteur; cette solution peut être un échantillon biologique, ou bien peut contenir les éléments nécessaires à l'étude d'un phénomène biologique.
Le milieu de mesure peut également être un échantillon de tissu vivant ou des cellules vivantes, placés dans un milieu de culture approprié. Dans ce cas, les composés fluorescents donneurs et accepteurs sont présents soit dans le milieu de culture dudit échantillon de tissu ou desdites cellules, soit dans le tissu lui même ou dans les cellules. Le milieu de mesure peut enfin être constitué d'un organisme vivant, d'un animal, en particulier d'un mammifère auquel ont été administrés les composés fluorescents donneurs et accepteurs. L'administration des composés fluorescents donneurs et accepteurs à un animal vivant peut être effectuée topiquement, par simple mise en contact desdits composés avec l'animal ; les composés donneurs et accepteurs peuvent également être injectés à l'animal ; les composés fluorescents donneur et accepteurs peuvent également être directement produit dans l'organisme de l'animal par génie génétique.
Comme cela est montré dans la suite de la description, le procédé général selon l'invention permet de résoudre les problèmes liés à l'utilisation de composés fluorescents donneurs et accepteurs de faible sélectivité spectrale, et en particulier de limiter le bruit de fond lié d'une part à l'émission de lumière par le donneur à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur, et d'autre part à l'émission de lumière par l'accepteur non-impliqué dans le transfert d'énergie, l'accepteur étant dans ce cas excité directement par la lumière excitatrice. Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de détection d'un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure, comprenant les étapes suivantes : (i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde λ1 , λ1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, et
(ii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ3 dans un plan de polarisation différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, λ3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent accepteur, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : (iii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ2, λ2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent donneur, et
(iv) correction du signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent accepteur à la longueur d'onde λ3 par le signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent donneur à la longueur d'onde λ2, en ce que la lumière excitatrice est polarisée, et en ce que le signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ3 est mesuré dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice. La mesure du signal émis à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur dans un plan différent (c'est à dire non parallèle) du plan de polarisation de la lumière excitatrice, va permettre de favoriser la mesure du signal émis par les espèces fortement dépolarisées, et en particulier le signal de l'acceptateur engagé dans le transfert d'énergie, réduisant ainsi la part de signal mesurée non issue du transfert d'énergie. Le plan dans lequel est effectué la mesure est préférentiellement le plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Des mesures dans d'autres plans pourraient également convenir.
La correction de l'étape (iv) ci-dessus peut, par exemple, consister en un calcul du ratio de l'intensité de la fluorescence mesurée à la longueur d'onde λ3 par celle mesurée à la longueur d'onde λ2.
Dans le cas où l'on effectue une mesure de fluorescence à la longueur d'onde d'émission du donneur (λ2), la mesure du signal résultant de la fluorescence émise peut être effectuée dans un plan parallèle ou différent, de préférence orthogonal au plan de la lumière excitatrice.
Dans un second mode de réalisation, les propriétés de polarisation des composés fluorescents donneur et accepteur sont utilisées pour améliorer la sélectivité de la mesure du transfert d'énergie, dans un procédé visant à déterminer la variation de polarisation due au transfert d'énergie. Comme le premier procédé décrit ci-dessus, ce procédé va permettre d'améliorer la sélectivité de la mesure, qui sera ainsi mieux corrélée au phénomène de transfert d'énergie que l'on veut détecter. Ce second mode de réalisation comprend les étapes suivantes : (i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde λ1 , λ1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, (ii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (lt//)λ2 émise à la longueur d'onde λ2 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, λ2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent donneur, (iii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (It1K2 émise à la longueur d'onde λ2 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice,
(iv) mesure de l'intensité de fluorescence totale (lt//)λ3 émise à la longueur d'onde λ3 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, λ3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent accepteur, (v) mesure de l'intensité de fluorescence totale (ltj.)λ3 émise à la longueur d'onde λ3 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice,
(vi) calcul de la polarisation P due au transfert d'énergie entre le composé fluorescent donneur et le composé fluorescent accepteur selon la formule suivante :
[(lt//)λ3 - (lt//)λ2 x A)] - Gt(It1)X3 - (It1K2 x B)] P=
[(lt//)λ3 - (lt//)λ2 x A)] + nG[(ltχ)λ3 - (It1)X2 x B)]
dans laquelle :
- A représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et λ3 par le donneur seul, dans un plan parallèle au plan de la lumière excitatrice,
- B représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et λ3 par le donneur seul, dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice, n= 1 ou 2. Lorsque n = 1 , on parle de mesure de polarisation ; lorsque n = 2, il est question d'anisotropie.
- G est un facteur permettant de corriger la différence de sensibilité de la détection dans les plans parallèle et orthogonal. Ce facteur est soit fourni par le constructeur, soit aisément déterminable par l'homme du métier en mesurant la polarisation de substances de polarisation connue. Dans une mise en œuvre particulière, G est compris entre 0,1 et 2, de préférence G est compris entre 0,8 et 1 ,2, et en particulier G= 1 ; et (vii) comparaison de la valeur de P calculée avec celle obtenue dans un milieu de mesure témoin dans lequel le transfert d'énergie n'a pas lieu, une diminution de P étant indicative d'un transfert d'énergie.
Selon un mode préféré de mise en œuvre, A et B sont calculés de la manière suivante :
(Id//)λ3, (Id//)λ2, (Idχ)λ3, (Id-L)λ2 correspondant aux intensités de fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 ou λ3, dans les plans parallèles ou différents du plan de polarisation de la lumière excitatrice, par un milieu de mesure contenant ledit composé fluorescent donneur mais ne contenant pas le composé fluorescent accepteur.
Comme dans le premier procédé décrit, les mesures effectuées dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice sont effectuées préférentiellement dans le plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice. Des mesures dans d'autres plans pourraient également convenir, du moment que le plan choisi n'est pas le plan parallèle au plan de polarisation de la lumière excitatrice.
Le procédé selon l'invention permet donc d'améliorer la sélectivité de la mesure d'un phénomène de transfert d'énergie entre un composé donneur et un composé accepteur. Cela est particulièrement avantageux dans le cas où la sélectivité spectrale entre le donneur et l'accepteur n'est pas optimale, c'est à dire dans les cas suivants : - cas où les spectres d'émission du donneur et de l'accepteur se chevauchent. Les procédés selon l'invention sont particulièrement efficaces dans le cas où 5nm < λ3-λ2 < 100 nm, λ3-λ2 représentant la différence entre les longueurs d'onde λ3 et λ2. - cas où une excitation parasite directe de l'accepteur est possible à la longueur d'onde d'excitation du donneur (λ1).
Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre avec de nombreux composés fluorescents donneurs et accepteurs : ces composés peuvent être choisis parmi des protéines fluorescentes ou des fluorophores organiques. Le donneur et l'accepteur peuvent être des protéines fluorescentes choisies parmi : la GFP (Green fluorescent protein), la CFP (Cyan fluorescent protein), l'YFP (Yellow fluorescent protein) et, de manière générale, les dérivés de la GFP (BFP.eGFP), ainsi que parmi la famille des Reef Coral Fluorescent Proteins (RCFP) telles que la DsRed HcRed. Le donneur et l'accepteur peuvent également être des fluorophores organiques, par exemple : les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les fluorescéines, les bodipy, les composés de la famille des AlexaFluors et leurs dérivés, ou encore les composés fluorescents décrits dans la demande WO2003104685. Enfin, le donneur et l'accepteur peuvent être des microsphères fluorescentes ou des nano-cristaux de type Quantom-dots.
Ces composés fluorescents et leur utilisation dans des systèmes de FRET entre un donneur et un accepteur sont largement décrits dans la littérature. Par ailleurs, l'homme du métier est à même d'utiliser le procédé objet de la présente demande avec un grand nombre de couples donneur / accepteur.
Dans un aspect préféré, les composés fluorescents donneur et accepteur ont une polarisation élevée, en particulier supérieure à 50 mP, de préférence supérieure à 10OmP. Les composés donneur et accepteur dont la polarisation intrinsèque est inférieure à 50 mP peuvent être couplés ou adsorbés à des molécules porteuses (molécules organiques, protéines, peptides, anticorps, ou autres molécules telle que décrites ci-après), ce qui aura pour effet d'augmenter la polarisation apparente du fluorophore et permettra de l'utiliser dans les procédés selon l'invention.
Dans un autre aspect préféré, les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis de telle sorte que suite à une excitation à la longueur d'excitation du donneur λ1 , aucune émission de l'accepteur n'est détectée à la longueur d'onde d'émission du donneur λ2.
Le procédé selon l'invention permet donc d'améliorer substantiellement la détection de phénomènes de transfert d'énergie, ce qui permet d'étudier de manière plus précise notamment les interactions biologiques.
Le procédé selon l'invention peut ainsi être utilisé dans un système biologique dans lequel la distance entre les composés fluorescent donneur et accepteur varie en fonction d'événement biochimiques se produisant dans le milieu de mesure.
Dans une mise en œuvre préférée, les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés à des molécules choisies parmi le groupe comprenant : un peptide, une protéine, un anticorps, un antigène, un messager intercellulaire, un messager intracellulaire, un haptène, une lectine, la biotine, l'avidine, la streptavidine, une toxine, un glucide, un oligosaccharide, un polysaccharide, un acide nucléique. Si les composés fluorescents donneur et / ou accepteur sont des protéines fluorescentes, ils peuvent être liés à d'autres protéines sous formes de protéines de fusion, produites par les techniques de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier.
Cela peut par exemple être le cas si les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés directement ou indirectement à un substrat hydrolysable. Si le milieu de mesure contient par exemple une enzyme capable de cliver ledit substrat, la détection de l'évolution du FRET pourra être corrélée à l'activité enzymatique. On pourra ajouter dans un tel système des composés dont on veut étudier l'impact sur l'activité enzymatique, et observer la variation du FRET, et donc la variation de l'activité enzymatique, en fonction des composés ajoutés au milieu de mesure. Par liaison directe ou indirecte des composés fluorescents au substrat, on entend une liaison covalente, éventuellement via des bras d'espacement, ou bien des liaisons non covalentes par l'intermédiaire de couples de molécules capables de se lier entre elles. De telle liaison indirectes comprennent par exemple le cas où un composé fluorescent est lié de manière covalente à la biotine, et le substrat comporte un groupe streptavidine, ou encore le cas où le composé fluorescent est lié à un anticorps spécifique d'une étiquette présente sur le substrat, telle que les groupes 6his, flag etc..
Le procédé selon l'invention peut aussi être mis en œuvre pour étudier la variation d'un FRET dans le cas d'une interaction entre deux composés.
Dans ce cas, les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés de manière covalente à deux molécules capables de se reconnaître. Par exemple, le composé donneur peut être lié à un anticorps ou fragment d'anticorps et le composé accepteur peut être lié à l'antigène reconnu par cet anticorps. Ou encore, les composés donneur et accepteur sont chacun liés à un membre d'un couple ligand- récepteur, ou bien à deux protéines interagissant entre elle, ou encore le donneur est lié à un composé régulant l'activité d'une protéine et le composé accepteur est lié à ladite protéine.
Enfin, le procédé selon l'invention peut aussi être mis en œuvre pour étudier la liaison de deux composés X et Y à un troisième composé Z. Cela peut être intéressant pour étudier des phénomènes de reconnaissance complexe entre différentes protéines. Dans ce cas, le composé X est lié de manière covalente à un composé fluorescent donneur, le composé Y est lié à un composé fluorescent accepteur, et un transfert d'énergie aura lieu si X et Y se lient à la molécule Z.
Dans un aspect préféré, les composés fluorescents donneur et accepteur sont différents.
L'invention concerne enfin un appareil de mesure adapté à la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Un tel appareil comprend les éléments suivants :
- des moyens d'illumination d'un milieu de mesure par une lumière excitatrice polarisée, par exemple, lasers, lampes flash ou continues associés à un polariseur, - des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu de mesure à des longueurs d'ondes différentes et dans des plans de polarisation différents, notamment parallèles ou non-parallèles, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, les moyens de détection pouvant être des tubes photomultiplicateurs, des caméras CDD ou des caméras intensifiées devant lesquels seront placés les polariseurs appropriés, et - des moyens informatiques permettant de corriger le signal mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur par celui mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent donneur, en particulier des programmes d'ordinateur capable de calculer le ratio de l'intensité du signal collecté à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur par l'intensité du signal collecté à la longueur d'onde d'émission du donneur.
Un autre appareil permettant de mettre en œuvre le procédé selon l'invention comprend :
- des moyens d'illumination d'un milieu de mesure par une lumière excitatrice polarisée, par exemple, lasers, lampes flash ou continues associés à un polariseur,
- des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu de mesure à des longueur d'ondes différentes et dans des plans de polarisation différents, notamment parallèles ou non-parallèles, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, les moyens de détection pouvant être des tubes photomultiplicateurs, des caméras CDD ou des caméras intensifiées devant lesquels seront placés les polariseurs appropriés, et
- des moyens informatiques permettant de calculer la polarisation du milieu de mesure spécifiquement due au transfert d'énergie ayant lieu dans le milieu de mesure, selon le procédé décrit plus haut. Ces appareils peuvent être par exemple des microscopes permettant la mesure de l'intensité de fluorescence émise par un échantillon.
Le procédé selon l'invention, ses différentes mises en œuvre, ainsi que les instruments permettant de mettre en œuvre ce procédé permettent d'étudier de manière précise les phénomènes de FRET ayant lieu dans des milieu de mesure complexes et notamment des milieux biologiques contenant des mélanges de protéines, des cellules animales ou végétales, des membranes issues de cellules animales ou végétales ou des membranes artificielles. Les procédés selon l'invention permettant fondamentalement d'optimiser les mesures de transfert d'énergie (FRET), ils sont parfaitement appropriés pour toutes les techniques basées sur des mesures de FRET.
Par exemple, les procédés selon l'invention peuvent être également mis en œuvre pour affiner les données obtenues par les techniques de type
« FLIM » (pour Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy). Pour cela, les procédés selon l'invention seront mis en œuvre en utilisant des instruments de microscopie (notamment des système de microscopie confocale) qui permettent d'obtenir à la fois des images des cellules ou échantillons biologiques étudiés, et de mesurer les phénomènes de transfert d'énergie.
L'imagerie de fluorescence en temps résolue (FLIM) permet un suivi quantitatif du FRET avec une grande sensibilité, via les changements induits dans la durée de vie de fluorescence du donneur et / ou de l'accepteur.
Plus généralement, elle donne accès aux variations de paramètres physico- chimiques dans l'environnement immédiat des sondes fluorescentes.
Les exemples ci-dessous illustrent non limitativement l'invention.
Exemple 1 : détermination du niveau de polarisation de différentes molécules fluorescentes Différentes molécules fluorescentes ont été utilisées dans cette expérience :
A647 (Alexa Fluor 647 de Molecular Probes).
Protéine eGFP (Green Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules
HEK293. - Protéine de fusion récepteur VIa-YFP (Yellow Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules HEK293.
Protéine de fusion récepteur CXCR4-CFP (Cyan Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules HEK293.
Protéine de fusion CAM dont la structure est la suivante : CFP-peptide linker- YFP (cette construction est décrite par Zhou et al dans The Journal of pharmacology and expérimental therapeutics, 305 :460 - 466, 2003 « Direct interaction between the heterotrimeric G protein subunit Gβ35 and the G protein γ subunit-like domain containing regulator of G protein signaling 11 : Gain of function of cyan fluorescent protein-tagged Gγ3). Cette protéine de fusion a aussi été exprimée dans des cellules HEK 293. Le linker peptidique peut être tout peptide d'environ 9 acides aminés, quels que soient ces acides aminés.
L'expression des différentes protéines de fusion dans les cellules HEK293 a été réalisée de la manière suivante :
Les cellules HEK293 sont transfectées transitoirement par électroporation avec des plasmides codant pour différentes protéines de fusion. Les cellules sont ensuite placées à 37°C en milieu régulé. Après 24 heures, les cellules sont récupérées, lavées dans un tampon PBS, comptabilisées et fixées dans une solution à base de paraformaldéhyde.
Toutes les molécules fluorescentes ont été ensuite distribuées dans des microplaques noires Costar sous un volume de 100μl dans un tampon PBS ou PO4 (pour A647). La concentration en A647 était de 10 nM. Pour mesurer le niveau de polarisation des différentes protéines fluorescentes, 50000 cellules
HEK293 contenant les différentes molécules ont été distribuées dans les différents puits de la microplaque. La même quantité de cellules témoins (ne contenant aucune protéine fluorescente) a été distribuée dans des puits « contrôles ».
Le niveau de polarisation a été déterminé à l'aide d'un lecteur de fluorescence sur microplaque, l'Analyst (Molecular Devices). Selon la molécule fluorescente à détecter, l'Analyst était équipé des filtres suivants (tous provenant de chez Oméga Optical):
La mesure successive sur un même puits des fluorescences émises en présence de polariseurs insérés soit entre la source d'excitation et l'échantillon (polariseur à l'excitation) soit entre l'échantillon et le détecteur (polariseur à l'émission) va permettre de calculer le niveau de polarisation des molécules. On réalise ainsi deux mesures d'intensité de fluorescence : l'intensité de fluorescence dite « parallèle » (l//) qui correspond à l'intensité de fluorescence mesurée avec le polariseur à l'émission situé dans le même plan que le polariseur à l'excitation, et - l'intensité de fluorescence dite « orthogonale » (L) qui correspond à l'intensité de fluorescence mesurée avec le polariseur à l'émission situé dans un plan perpendiculaire au polariseur à l'excitation.
Pour chaque molécule fluorescente, le niveau de polarisation (P) est ensuite obtenu grâce à la formule suivante : P= [(l/r L) / (1//+LL)] * 1000
P est exprimée en unités mP.
Le tableau 1 ci-dessous rapporte les niveaux de polarisation obtenus pour les différentes molécules observées. Tableau 1
Les valeurs obtenues montrent que la polarisation des différentes protéines fluorescentes utilisées dans l'expérience est très élevée (> 20OmP) en comparaison de celle d'une petite molécule organique comme l'Alexa Fluor 647 (-17mP).
Exemple 2 : Détermination du rapport Signal/Bruit (S/B) d'une expérience de FRET intracellulaire.
Les protéines de fusion suivantes ont été utilisées dans cette expérience :
Protéine de fusion récepteur VIa-YFP (YFP = Yellow Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules HEK293. Protéine de fusion récepteur CXCR4-CFP (CFP = Cyan
Fluorescent Protein) exprimée dans des cellules HEK293.
Protéine de fusion CAM dont la structure est la suivante : CFP- peptide linker-YFP. Cette protéine de fusion a aussi été exprimée dans des cellules HEK 293. L'expression de ces différentes protéines a été réalisée tel que décrit dans l'Exemple 1.
Les cellules contenant le CAM sont celles qui permettent la mesure d'un FRET entre la CFP (molécule donneur) et la YFP (molécule accepteur).
Dans les différents puits dits « positifs » d'une microplaque, 25000 cellules contenant le CAM1 préalablement diluées dans un tampon PBS, ont été distribuées sous un volume de 100μl. Dans les différents puits dits « négatifs » d'une microplaque, 50000 cellules contenant le VIa-YFP et 50000 cellules contenant le CXCR4-CFP ont été distribuées dans un tampon PBS sous un volume total de 100μl. Dans ce cas, l'absence de proximité entre la CFP et l'YFP interdit tout FRET entre ces deux molécules et seul le bruit de fond de fluorescence sera mesuré.
Deux mesures de fluorescence successives sont réalisées sur l'Analyst à l'aide des filtres suivants:
Ces deux mesures de fluorescence à 480 nm (Uβo nm) ou 535 nm
(Iδ35 nm) vont être effectuées en présence ou en absence de polariseurs. En présence de polariseurs, seule l'intensité de fluorescence dite « orthogonale » (li) telle que définie dans l'exemple 1 sera mesurée.
On calcule ensuite les ratios pour les puits positifs ou négatifs et cela pour les mesures de fluorescence totale (sans polariseurs) ou pour la mesure de fluorescence orthogonale (avec polariseurs).
Le signal/bruit (S/B) de l'expérience est ensuite calculé comme suit pour les mesures réalisées avec ou sans les polariseurs.
(S/B)- (R535/480 positif / R 535/480 négatif)
Le graphe représenté sur la figure 1 donne les valeurs de signal/bruit obtenues en absence ou en présence de polariseurs.
Celui-ci montre que l'utilisation de polariseurs dans le système de détection permet d'augmenter de manière significative le rapport signal/bruit de l'expérience (+48%).
En effet, la mesure de fluorescence dite « orthogonale » permet de favoriser la détection du signal émis par l'accepteur après transfert d'énergie (fluorescence dépolarisée) par rapport aux signaux de fluorescence émis par des donneurs ou des accepteurs de fluorescence non impliqués dans un phénomène de FRET (fluorescence fortement polarisées).
Exemple 3 : Mesure du degré de polarisation de l'accepteur pour la détection d'un FRET. Correction de la contamination du donneur dans les signaux de fluorescence mesurés et quantification du FRET.
Les protéines de fusion utilisées dans cet exemple sont identiques à celles décrites dans l'exemple 2. Leur expression a été réalisée tel que décrit dans l'exemple 1.
50000 cellules contenant le CXCR4-CFP ont été distribuées dans un tampon PBS sous un volume total de 100μl. Ces puits dits « témoins » vont permettre la détermination des facteurs A et B qui vont être utilisés pour corriger le signal de fluorescence à 535 nm du signal de fluorescence émis par la CFP à cette longueur d'onde.
Dans les différents puits dits « négatifs » d'une microplaque, 50000 cellules contenant le VIa-YFP et 50000 cellules contenant le CXCR4-CFP ont été distribuées dans un tampon PBS sous un volume total de 100μl. L'absence de proximité entre la CFP et l'YFP interdit tout FRET entre ces deux molécules.
25000 cellules contenant le CAM permettant la mesure d'un FRET entre la CFP (le donneur) et la YFP (l'accepteur), préalablement diluées dans un tampon PBS, ont été distribuées sous un volume de 100μl dans les différents puits dits « positifs » d'une microplaque. Des quantités variables de cellules contenant le CAM et de cellules contenant le CXCR4-CFP, préalablement diluées dans un tampon PBS, ont été distribuées sous un volume de 100μl dans les différents puits dits « contaminés » d'une microplaque. Les mélanges ont été réalisés dans les proportions suivantes :
Chaque série de puits dit « contaminés » contient une proportion variable de molécules impliquées dans un FRET (CAM) et de donneurs libres (CFP). Afin de déterminer le degré de polarisation de l'accepteur, quatre mesures de fluorescence successives sont réalisées sur l'Analyst à l'aide des filtres et polariseurs décrits dans le tableau ci-dessous.
Pour les différents échantillons, le niveau de polarisation global à
535 nm (Pgiobaie) est ensuite obtenu grâce à la formule suivante :
Pglobale= [('535 nm/T '535 nm l) / (Iδ35 nm //+'s35 nm ±)] x 1000
P est exprimée en mP. Iδ35 nm// est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 3 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés. l535 πm i est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 4 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.
Le degré de polarisation globale mesurée à 535 nm représente la somme du degré de polarisation de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET et du degré de polarisation du donneur CFP mesurée à 535 nm du fait de la forte contamination en signal CFP à cette longueur d'onde.
La détermination du degré de polarisation de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET peut être obtenu en retranchant des signaux obtenus lors des mesures de fluorescence à 535 nm (mesures 3 et 4) la part du signal provenant du donneur CFP.
Ceci peut être réalisé en établissant une proportionnalité entre le signal émis par la CFP à 480 nm avec les différents polariseurs (mesures 1 et 2) et le signal qu'elle émet à 535 nm sur les puits témoins décrits plus haut. Pour cela on utilise les formules suivantes :
A= (lt.535 nm// / lt480 nm//) πml)
Ittβonm// est la moyenne des intensités de fluorescence obtenues lors de la mesure 1 sur les puits témoins.
IW nm x est la moyenne des intensités de fluorescence obtenues lors de la mesure 2 sur les puits témoins.
It535 nm// est la moyenne des intensités de fluorescence obtenues lors de la mesure 3 sur les puits témoins. K535 nm x est la moyenne des intensités de fluorescence obtenues lors de la mesure 4 sur les puits témoins.
Les signaux de fluorescence de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET obtenu à 535 nm avec les différentes configurations de polariseurs (If535 nm// et If53S nm x ) sont ensuite calculés à l'aide des formules suivantes pour les différents échantillons testés:
If 535 nm// = 1535 nm// " (UδO nm// X A) Ifδ35 nmX = Iδ35 nmX " (UβO nmX X B)
Uβo nm// est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 1 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.
Uβo nm x est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 2 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés. l535 πm// est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 3 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.
I535 nm 1 est l'intensité de fluorescence obtenue lors de la mesure 4 soit sur les puits positifs soit sur les puits négatifs soit sur les puits contaminés.
Le degré de polarisation de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET (Pf) est alors calculé pour les puits positifs, négatifs ou contaminés à l'aide de la formule suivante :
Pf= [(Ifδ35 nm/r If5SS nm l) / (If 535 nm //+^535 nm l)] * 1000
Pf est exprimée en mP.
Le tableau 2 ci-dessous donne le degré de polarisation globale (Pgiobaie) et le degré de polarisation de l'accepteur YFP impliqué dans le FRET (Pf ) pour les différents échantillons : Tableau 2
Les valeurs rapportées dans le tableau 2 ci-dessus montrent que les formules décrites précédemment permettent de recalculer à partir de différentes mesures de fluorescence polarisée le degré de polarisation de l'accepteur impliqué dans le FRET, ceci même si l'échantillon contient une quantité importante de donneur CFP non impliqué dans un transfert d'énergie.
Le degré de polarisation de l'YFP en FRET, situé autour de - 5OmP dans notre expérience, confirme aussi que l'accepteur YFP se dépolarise fortement lorsqu'il est impliqué dans un FRET (valeur initiale de polarisation 222mP trouvée dans l'exemple 1). Bibliographie citée :
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection d'un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure comprenant les étapes suivantes :
(i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux à la longueur d'onde λ1 , λ1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, et (ii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ3, λ3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent accepteur, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : (iii) mesure du signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ2, λ2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la fluorescence du composé fluorescent donneur, et
(iv) correction du signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent accepteur à la longueur d'onde λ3 par le signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent donneur à la longueur d'onde λ2, en ce que la lumière excitatrice est polarisée, et en ce que le signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ3 est mesuré dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le signal résultant de la fluorescence émise à la longueur d'onde λ2 est également mesuré dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice.
3. Procédé selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la correction du signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent accepteur à la longueur d'onde λ3 par le signal résultant de la fluorescence émise par le composé fluorescent donneur à la longueur d'onde λ2 comprend la détermination du rapport des signaux mesurés aux longueurs d'ondes λ3 et λ2.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et/ou λ3 sont mesurés dans un plan orthogonal au plan de polarisation de la lumière excitatrice.
5. Procédé selon la revendication 1 , comprenant les étapes suivantes :
(i) excitation du milieu de mesure par un faisceau lumineux polarisé à la longueur d'onde λ1 , λ1 étant la longueur d'onde à laquelle ledit composé fluorescent donneur est excité, (ii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (lt//)λ2 émise à la longueur d'onde λ2 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, λ2 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent donneur,
(iii) mesure de l'intensité de fluorescence totale (ltj.)λ2 émise à la longueur d'onde λ2 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice,
(iv) mesure de l'intensité de fluorescence totale (lt//)λ3 émise à la longueur d'onde λ3 dans le plan parallèle au plan de la lumière excitatrice, λ3 étant la longueur d'onde à laquelle est émise la lumière du composé fluorescent accepteur,
(v) mesure de l'intensité de fluorescence totale (lt±)λ3 émise à la longueur d'onde λ3 dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice,
(vi) calcul de la polarisation P due au transfert d'énergie entre le composé fluorescent donneur et le composé fluorescent accepteur selon la formule suivante :
[(lt//)λ3 - (lt//)λ2 x A)] - Gt(It1)^ - (lti)λ2 x B)]
P =
[(lt//h3 - (lt//)λ2 x A)] + nG[(ltj.)λ3 - (IU)λ2 x B)] dans laquelle :
- A représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et λ3 par le donneur seul, dans un plan parallèle au plan de la lumière excitatrice,
- B représente le facteur de proportionnalité entre les signaux résultant de la fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 et λ3 par le donneur seul, dans un plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice,
- n= 1 ou 2 - G est un facteur de correction de sensibilité spécifique de l'appareil de mesure utilisé, compris entre 0,1 et 2, et
(vii) comparaison de la valeur de P calculée avec celle obtenue dans un milieu de mesure témoin dans lequel le transfert d'énergie n'a pas lieu, une diminution de P étant indicative d'un transfert d'énergie.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, dans l'étape (vi), on calcule la polarisation P selon la formule :
[(lt//)w - (lt//)λ2 x A)] - GI(It1)W - (Hi)312 x B)] P = [(lt//)λ3 - (lt//)λ2 x A)] + nG[(ltx)λ3 - (ltx)λ2 x B)]
dans laquelle :
- n = 1 ou 2
- G est un facteur de correction de sensibilité spécifique de l'appareil de mesure utilisé, compris entre 0,1 et 2
(Id//)χ3, (ld//)λ2, (ldi)λ3, (ldl)λ2 correspondant aux intensités de fluorescence émise aux longueurs d'onde λ2 ou λ3, dans les plans parallèle (//) ou différent (±) du plan de la lumière excitatrice, par un milieu de mesure contenant ledit composé fluorescent donneur mais pas le composé fluorescent accepteur.
7. Procédé selon les revendications 5 ou 6, caractérisé en ce que ledit plan différent du plan de polarisation de la lumière excitatrice est le plan orthogonal audit plan de polarisation de la lumière excitatrice.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que 5 nm< λ3-λ2 < 100 nm.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis parmi : des protéines fluorescentes, des fluorophores organiques.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis parmi : les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les bodipys , les fluorescéines, la GFP, la CFP, I1YFP, la BFP, l'eGFP, les RCFP, DsRed HcRed, les Alexafluors et leurs dérivés.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur ont une polarisation supérieure à 5OmP.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur ont une polarisation supérieure à 10OmP.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont choisis de telle sorte que suite à une excitation à la longueur d'excitation du donneur λ1, aucune émission de l'accepteur n'est détecté à la longueur d'onde d'émission du donneur λ2.
14. Procédé selon les revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la distance entre les composés donneur et accepteur est susceptible de varier en fonction d'événements biochimiques ayant lieu dans le milieu de mesure.
15. Procédé selon les revendications 1 à 14, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont liés à des molécules choisies parmi le groupe comprenant : peptides, protéines, anticorps, antigènes, messagers intercellulaire, messagers intracellulaire , haptène, lectine, la biotine, avidine, streptavidine, toxine, glucide, oligosaccharide, polysaccharide, un acide nucléique.
16. Procédé selon les revendications 1 à 15, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont liés de manière directe ou indirecte à un substrat hydrolysable.
17. Procédé selon les revendications 1 à 16, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont chacun liés de manière covalente à un couple de molécules susceptibles de se reconnaître.
18. Procédé selon les revendications 1 à 17, caractérisé en ce que les composés donneur et accepteur sont chacun liés à deux molécules capables de reconnaître une troisième molécule présente dans le milieu de mesure.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que les composés fluorescents donneur et accepteur sont différents.
20. Appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure comprenant :
- des moyens d'illumination dudit milieu par une lumière excitatrice polarisée,
- des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu à des longueur d'ondes différentes et dans des plans de polarisation différents, parallèles ou non parallèles, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, et
- des moyens informatiques permettant de corriger le signal mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur par celui mesuré à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent donneur.
21. Appareil permettant de mesurer la fluorescence consécutive à un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur présents dans un milieu de mesure, comprenant :
- des moyens d'illumination dudit milieu par une lumière excitatrice polarisée,
- des moyens de collecte de la fluorescence émise par le milieu à des longueur d'ondes différentes et dans des plans de polarisation différents, parallèles ou non parallèles, préférentiellement orthogonaux à celui de la lumière excitatrice, et - des moyens informatiques permettant de calculer la polarisation du milieu de mesure spécifiquement due au transfert d'énergie ayant lieu dans le milieu de mesure, selon le procédé décrit dans les revendications 3 à 7.
22. Appareil selon les revendications 20 ou 21 , caractérisé en ce que ledit appareil est un microscope.
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