JP2008504517A - 共鳴エネルギー移動中における蛍光の信号検出を改善する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）中の蛍光信号の検出を改善するための、蛍光偏光現象の使用に関する。特に本発明はＦＲＥＴ測定における信号／雑音比を改善するための方法に関する。また本発明は測定媒体中でドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物間のエネルギー移動後に蛍光を測定するための装置に関する。

Description

本発明は、共鳴エネルギー移動中の蛍光（ＦＲＥＴ）の信号検出を改善するための蛍光偏光現象の使用に関する。特に本発明は、ＦＲＥＴ測定における信号／雑音比を改善するための方法に関する。

蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は生物学的事象の検出、特に分子相互作用の検出に幅広く使われる分光学的手法である。

多くの場合、エネルギー移動に関与することになるドナー及びアクセプター蛍光分子が一緒に接近することを要求するＦＲＥＴは、生物学的相互作用の検出における強力な手法であることが判っている。これは分子生物学、酵素現象のin-vitro又はin-cellulo検出（ペプチド切断、リン酸化反応）又はタンパク質間の相互作用のような様々な分野で使用できる（引用文献１、２、３)。

ＦＲＥＴ現象の検出はドナーもしくはアクセプターのいずれかにより、又は両方の分子により放射される蛍光信号の様々なパラメータを測定することによって行うことができる。最も一般的な手法の中で特に以下が挙げられる。
・ＦＲＥＴ現象により誘起されたドナー蛍光の減少量測定（引用文献４）
・ＦＲＥＴを経由したドナー起源のエネルギーによって誘起されたアクセプター蛍光の増加量測定（引用文献５）
・（アクセプター蛍光増加量／ドナー蛍光減少量）比の決定（引用文献６）
・ＦＲＥＴ現象により誘起されたドナー蛍光寿命の減少量測定（引用文献７）（後者は特に「蛍光寿命イメージング顕微鏡」（ＦＬＩＭ）法により測定される。）
・アクセプターの光退色後にＦＲＥＴに関与したドナー蛍光の増加量測定（引用文献８）（この光退色法は光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）として知られている。）

長寿命の蛍光ドナーを用いて可能となるＦＲＥＴ及び時間分解検出を組み合わせた手法（例えばＨＴＲＦ）はともかくとして、ＦＲＥＴ現象は蛍光強度測定に基づく多くの応用において検出が複雑であると判っている。ドナー及びアクセプター間にかなりのエネルギー互換性が必要であるため、比較的類似した蛍光放射スペクトルを有する分子を使用することが多い。生じたドナー及びアクセプタースペクトルの重なりによって、ドナー又はアクセプターについて記録された信号の変化を正確に測定することが非常に困難となる（引用文献９）。

最も使用されるシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）／黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ドナー／アクセプター対のような、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に由来する蛍光タンパク質をＦＲＥＴ実験に使用した場合に、このことが特に当てはまる。多くの種類の細胞中に蛍光体の形態で発現させることが可能なこれらの分子は、数多くの細胞内事象の検出を可能にする。しかしながら蛍光スペクトルの顕著な重なりが後者の間に存在するため、ドナー分子の励起ビームによるアクセプターの寄生的な直接励起が生じる。そのためこのドナー／アクセプター対を用いて行われるＦＲＥＴ実験の信号／雑音比は低く、しばしば１．５未満である（引用文献１）。その結果、得られた結果を解釈可能とするためには、数多くの実験コントロールを含む複雑な実験手順を実施する必要がある。

従って解決すべき技術課題には、ＦＲＥＴ測定を補正するための簡単で再現性のある方法、特に信号／雑音比の改善による方法の提供が含まれる。

ＦＲＥＴ測定を補正するために、ドナー及びアクセプターの蛍光放射スペクトルの強い重なりの影響を、これら化合物の偏光特性を用いて顕著に低減できることが見出された。

２つの蛍光分子間でのエネルギー移動が現れると、ドナー準位及びアクセプター準位の両方において偏光の変化が生じることが記載されている。すなわちＦＲＥＴに関与しているドナー偏光は増加し（引用文献１０）、一方ＦＲＥＴに関与しているアクセプター偏光は減少する（引用文献１１）。

このように２つの蛍光プローブ間のこのエネルギー移動を検出する目的で、ドナー及びアクセプターの相対的な偏光に及ぼすＦＲＥＴの影響が異なる分子系に使用されてきた。

特に２つのＧＦＰ分子間のホモＦＲＥＴは、これらの偏光解消を測定することにより検出されている（引用文献１２）。レクチンに結合したローダミンの偏光解消測定は、フルオレセイン及びローダミン間に生じるＦＲＥＴの検出に使用された（引用文献５）。またコンカナバリンＡ−フルオレセインドナーの偏光増加量の測定により、リンパ球膜における分子クラスタの生成の指標となるＦＲＥＴが検出可能になった（引用文献１０）。

以上、これまでに使用されてきた偏光測定は２分子間のＦＲＥＴの存在を検出することを目的としていた。

驚くべきことに、蛍光信号の偏光測定はＦＲＥＴに関与するドナー及びアクセプターにより特異的に放射される信号を良好に分離可能とし、そのため行われる試験の信号／雑音比が増大することが見出されている。

実際にＧＦＰタイプの蛍光タンパク質は例えば、その構造及び分子量に起因して強く偏光した分子である。それらがエネルギー移動に関与する場合の偏光度は様々である。つまりＦＲＥＴ現象を通じて、ドナー分子に関してはその偏光がいくらか増大し、一方アクセプター分子に関しては強い偏光解消を受ける。

ドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物を含む媒体中で、ドナー励起波長で媒体を励起した後にこれら２つの化合物間でエネルギー移動が起こる場合、アクセプター放射波長で測定される信号には以下のものが含まれる。
・ＦＲＥＴに由来する偏光解消信号（測定されることになる特異的信号）
・ドナー励起を意図した光線による直接励起の結果として、アクセプターにより放射される非常に偏光した信号（寄生信号）
・ドナー励起の結果として、ドナーによって放射される非常に偏光した信号（寄生信号）

従って本発明の方法は、ＦＲＥＴ測定のスペクトル選択性を改善するために、ドナー及びアクセプター間の偏光のこの顕著な変化を使用することに基づく。実際に本発明の変形の１つによれば、ドナー分子の偏光状態及びアクセプター分子の偏光状態によって、偏光した励起光と平行な偏光面内又は偏光した励起光と直交する偏光面内のいずれかで、放射された蛍光信号の測定が行われる。

従って本発明は、測定媒体中に存在するドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物間のエネルギー移動の検出方法に関し、ここではエネルギー移動測定の選択性はそのドナー及びアクセプター蛍光化合物の偏光特性を用いて改善される。

エネルギー移動は、波長λ３でアクセプター蛍光化合物の放射する蛍光から生じる信号を測定することによって検出される。この放射は、波長λ１にて測定媒体中で励起されたドナー蛍光化合物及びそのアクセプター蛍光化合物間のエネルギー移動から生じる。

「測定媒体」とはドナー及びアクセプター蛍光化合物を含む溶液を意味する。この溶液は生物学的サンプルであってよく、あるいは生物学的現象を調べるのに必要な要素を含んでいてもよい。

測定媒体は適当な培地に置かれた生体組織のサンプル又は生体細胞であってもよい。この場合ドナー及びアクセプター蛍光化合物はその組織のサンプル又はその細胞の培地の中、又は組織自体もしくは細胞の中のいずれかに存在する。

最終的に測定媒体は、ドナー及びアクセプター蛍光化合物が投与された生体、動物、特にほ乳類によって構成されてもよい。ドナー及びアクセプター蛍光化合物の生きている動物への投与は、単純にその化合物を動物と接触させることによって局所的に行ってもよく、ドナー及びアクセプター蛍光化合物を動物に注射してもよく、ドナー及びアクセプター蛍光化合物を遺伝子工学により動物の生体内で直接生産させてもよい。

この記載で以下示すように、本発明の一般的な方法は低スペクトル選択性のドナー及びアクセプター蛍光化合物の使用に関係した問題を解決し、特に一方ではアクセプターの放射波長でのドナーによる光放射に関連し、及び他方ではエネルギー移動に関与しないアクセプターによる光放射（この場合アクセプターは励起光によって直接励起している）に関連した雑音を制限することを可能にする。

第１の態様によれば、本発明は測定媒体中に存在するドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物間のエネルギー移動の検出方法に関し、この方法は、
（i）該ドナー蛍光化合物が励起される波長である波長λ１で偏光した光線により該測定媒体を励起し、及び
（ii）その励起光の偏光面と異なる偏光面内の、該アクセプター蛍光化合物の蛍光が放射される波長である波長λ３で放射された蛍光から生じる信号を測定する
段階を含み、
（iii）該ドナー蛍光化合物の蛍光が放射される波長である波長λ２で放射された蛍光から生じる信号を測定し、及び
（iv）波長λ３で該アクセプター蛍光化合物によって放射された該蛍光から生じる該信号を、波長λ２で該ドナー蛍光化合物によって放射された該蛍光から生じる該信号により補正する段階をさらに含むこと、その励起光が偏光していること、並びに該波長λ３で放射された該蛍光から生じる該信号を該励起光の偏光面と異なる面内で測定することを特徴とする。

励起光の偏光面と異なる（すなわち平行でない）面内でアクセプター蛍光化合物の放射波長で放射された信号の測定は、強く偏光解消した種によって放射された信号、特にエネルギー移動に関与したアクセプターからの信号の測定を可能にし、こうしてエネルギー移動に由来しない測定信号の一部を低減する。測定が行われる面は励起光の偏光面と直交する面が優先する。また他の面における測定も適当な場合がある。

上記段階（iv）の補正は、例えば波長λ３で測定した蛍光強度と波長λ２で測定した蛍光強度との比を計算することからなっていてもよい。

ドナーの放射波長（λ２）で蛍光測定が行われる場合、放射された蛍光から生じる信号測定を励起光と平行又は異なる面内、好ましくは励起光の面と直交する面内で行うことができる。

第２の実施態様では、エネルギー移動に起因する偏光変化の決定を意図した方法においてエネルギー移動測定の選択性を改善するために、ドナー及びアクセプター蛍光化合物の偏光特性を使用する。上述した第１の方法と同じくこの方法は測定選択性の改善を可能とし、その測定選択性は検出されるエネルギー移動現象とより良好に相関している。

この第２の実施態様は、
（i）該ドナー蛍光化合物が励起される波長である波長λ１で偏光した光線によって該測定媒体を励起し、
（ii）その励起光の面と平行な面内の、該ドナー蛍光化合物の光が放射される波長である波長λ２で放射された全蛍光強度（Ｉｔ_//）_λ2を測定し、
（iii）該励起光の該偏光面と異なる面内の、該波長λ２で放射された全蛍光強度（Ｉｔ_⊥）_λ2を測定し、
（iv）該励起光の該面と平行な面内の、該アクセプター蛍光化合物の光が放射される波長である波長λ３で放射された全蛍光強度（Ｉｔ_//）_λ3を測定し、
（v）該励起光の該偏光面と異なる面内の、該波長λ３で放射された全蛍光強度（Ｉｔ_⊥）_λ3を測定し、
（vi）該ドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物間の該エネルギー移動に起因する偏光Ｐを次式に従って計算し、並びに

（ここで、
・Ａは該励起光の該面と平行な面内の、該ドナー単独により波長λ２及びλ３で放射された該蛍光から生じる該信号間の比例定数を表し、
・Ｂは該励起光の該偏光面と異なる面内の、該ドナー単独により波長λ２及びλ３で放射された該蛍光から生じる該信号間の比例定数を表し、ｎ＝１又は２である。ｎ＝１の場合は偏光測定という用語を使用し、ｎ＝２の場合は異方性が問題となっている。
・Ｇは平行及び直交面内の検出感度の差を補正可能にする係数である。この係数は製造業者によって提供されるか、あるいは既知の偏光を有する物質の偏光を当業者が測定することによって容易に決定できる。特定の実施において、Ｇは０．１〜２の間に含まれ、好ましくはＧは０．８〜１．２の間に含まれ、特にＧ＝１である。）
（vii）そのＰの計算値を該エネルギー移動が起こっていないコントロール測定媒体中で得られたものと比較して、Ｐの減少量をエネルギー移動の指標とする
段階を含む。

好ましい実施態様によれば、Ａ及びＢは次のように計算される。
Ａ＝（Ｉｄ_／／）_λ３−（Ｉｄ_／／）_λ２
Ｂ＝（Ｉｄ_⊥）_λ３−（Ｉｄ_⊥）_λ２
（（Ｉｄ_//）_λ3、（Ｉｄ_//）_λ2、（Ｉｄ_⊥）_λ3、（Ｉｄ_⊥）_λ2は、そのドナー蛍光化合物を含むがアクセプター蛍光化合物を含まない測定媒体による、励起光の偏光面と平行又は異なる面内で波長λ２又はλ３にて放射された蛍光強度に相当する。）

記載した第１の方法のように、励起光の偏光面と異なる面内で行われる測定は、励起光の偏光面と直交する面内で優先的に行われる。選択した面が励起光の偏光面と平行な面ではないとき、他の面における測定も適当な場合がある。

従って、本発明の方法によりドナー化合物及びアクセプター化合物間のエネルギー移動現象の測定選択性を改善することが可能となる。このことはドナー及びアクセプター間のスペクトル選択性が最適でない場合、すなわち以下の場合に特に有利である。
・ドナー及びアクセプターの放射スペクトルが重なり合う場合。本発明の方法は５ｎｍ＜λ３−λ２＜１００ｎｍ（λ３−λ２は波長λ３及びλ２の差を表す。）の場合に特に効果的である。
・アクセプターの寄生的な直接励起がドナーの励起波長（λ１）で可能な場合。

本発明の方法は数多くのドナー及びアクセプター蛍光化合物を用いて実施できる。これらの化合物は蛍光タンパク質又は有機フルオロフォアから選択できる。

ドナー及びアクセプターは、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）及び一般にＧＦＰ誘導体（ＢＦＰ、ｅＧＦＰ）に加えて、ＤｓＲｅｄ ＨｃＲｅｄのような一群のサンゴ蛍光タンパク質（ＲＣＦＰ）から選択される蛍光タンパク質であってよい。

またドナー及びアクセプターは有機フルオロフォアであってよく、例えばローダミン類、シアニン類、スクアライン類（squaraines）、フルオレセイン類、ｂｏｄｉｐｙ類、一群のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ化合物、及びこれら誘導体、又は国際公開ＷＯ２００３１０４６８５に記載の蛍光化合物であってもよい。

最後にドナー及びアクセプターは量子ドット型の蛍光ミクロスフェア又はナノクリスタルであってもよい。

ドナー及びアクセプター間のＦＲＥＴ系における、これら蛍光化合物及びその使用は文献に幅広く記載されている。さらに当業者は数多くのドナー／アクセプター対を用いて本出願の主題である方法を使用できる。

好ましい態様では、ドナー及びアクセプター蛍光化合物は高い偏光を有しており、特に５０ｍＰより大きく、好ましくは１００ｍＰより大きい。固有偏光が５０ｍＰ未満のドナー及びアクセプター化合物は、キャリア分子（有機分子、タンパク質、ペプチド、抗体又は以下記載する他の分子）に結合又は吸着させてよい。このことはフルオロフォアの見かけの偏光を増加する効果をもたらして、本発明の方法でそれを使用可能にする。

他の好ましい態様では、ドナーの励起波長λ１で励起した後にドナーの放射波長λ２でアクセプターからの放射が検出されないように、ドナー及びアクセプター蛍光化合物が選択される。

従って本発明の方法はエネルギー移動現象の検出をかなり改善することが可能であり、特により正確に生物学的相互作用を調べることが可能になる。

このように本発明の方法は、ドナー及びアクセプター蛍光化合物間の距離が測定媒体中で起こる生物学的事象の関数として変化する生体系に使用できる。

好ましい実施においては、ドナー及びアクセプター蛍光化合物は、ペプチド、タンパク質、抗体、抗原、細胞間情報伝達物質、細胞内情報伝達物質、ハプテン、レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸を含む群から選択される分子と結合する。ドナー及び／又はアクセプター蛍光化合物が蛍光タンパク質の場合、当業者に周知の遺伝子組み換え技術により生成する、融合タンパク質の形態でそれらを他のタンパク質と結合させてもよい。

これは例えばドナー及びアクセプター化合物が直接又は間接的に加水分解性の基質に結合している場合であってもよい。測定媒体が例えばその基質を切断可能な酵素を含む場合、ＦＲＥＴの発生の検出は酵素活性と相関させることができる。酵素活性におけるその影響を調べることになる化合物をそのような系に添加し、ＦＲＥＴの変化、従って酵素活性の変化を測定媒体に添加した化合物の関数として観察可能である。

基質への蛍光化合物の直接的又は間接的結合とは、必要に応じてスペーサーアームを介した共有結合、又は互いに結合可能な分子対による非共有結合を意味する。そのような間接的結合には、例えば蛍光化合物が共有結合的にビオチンに結合し、基質がストレプトアビジン群を含む場合、又は蛍光化合物が６ｈｉｓ、ｆｌａｇ群などのような基質上に存在するタグに特異的な抗体と結合している場合が含まれる。

また２つの化合物間の相互作用の場合のＦＲＥＴの変化を調べるために本発明の方法を実施できる。この場合ドナー及びアクセプター蛍光化合物は、互いに認識可能な２つの分子に共有結合的に結合している。例えばドナー化合物は抗体又は抗体フラグメントに結合していてよく、アクセプター化合物はこの抗体が認識する抗原に結合していてよい。あるいはドナー及びアクセプター化合物はリガンド受容体対の一方と、もしくは互いに相互作用している２つのタンパク質とそれぞれ結合しており、又はドナーはタンパク質の活性を調節する化合物と結合し、かつアクセプター化合物はそのタンパク質と結合している。

最後に２つの化合物Ｘ及びＹの第３の化合物Ｚへの結合を調べるためにもまた、本発明の方法を実施できる。これは異なるタンパク質間での複合体認識現象を調べるのに有用な場合がある。この場合、化合物Ｘはドナー蛍光化合物に共有結合的に結合し、化合物Ｙはアクセプター蛍光化合物に結合し、かつエネルギー移動はＸ及びＹが分子Ｚに結合している場合に起こる。

好ましい態様ではドナー及びアクセプター蛍光化合物が異なる。

最後に本発明は本発明の方法を実施するのに適した測定装置に関する。

そのような装置には以下の要素が含まれる。
・偏光させた励起光により測定媒体を照射する手段。例えば偏光子と組み合わせたレーザー、フラッシュ又は連続ランプ。
・様々な波長にて、かつ様々な偏光面内、特に該励起光の偏光面と平行の又は非平行の、優先的には直交する面内で、該測定媒体により放射された蛍光を収集する手段。その検出手段は適当な偏光子の配置箇所の前にある光電子増倍管、ＣＣＤカメラ又は高感度カメラであってよい。
・ドナー蛍光化合物の放射波長で測定された信号により、アクセプター蛍光化合物の放射波長で測定された信号を補正可能にする計算手段。特にアクセプターの放射波長で収集した信号強度の、ドナーの放射波長で収集した信号強度との比を計算可能なコンピュータプログラム。

本発明の方法を実施可能にする他の装置には以下が含まれる。
・偏光させた励起光により測定媒体を照射する手段。例えば偏光子と組み合わせたレーザー、フラッシュ又は連続ランプ。
・様々な波長にて、かつ様々な偏光面内、特に該励起光の偏光面と平行の又は非平行の、優先的には直交する面内で、該測定媒体により放射された蛍光を収集する手段。その検出手段は適当な偏光子の配置箇所の前にある光電子増倍管、ＣＣＤカメラ又は高感度カメラであってよい。
・上述の方法に従って、該測定媒体中で起こるエネルギー移動に特異的に起因する該測定媒体の偏光を計算可能にする計算手段。

これらの装置は例えばサンプルの放射した蛍光強度の測定を可能にする顕微鏡であってよい。

本発明の方法、その異なる実施方法に加えてこの方法の実施を可能にする装置によって、複雑な測定媒体、特にタンパク質、動物もしくは植物細胞、動物もしくは植物細胞に由来する膜、又は人工膜の混合物を含有する生体媒体で起こるＦＲＥＴ現象を正確に調べることが可能となる。

基本的にエネルギー移動（ＦＲＥＴ）測定の最適化を可能にする本発明の方法は、ＦＲＥＴ測定に基づく全ての手法に完全に適している。

例えば「ＦＬＩＭ」（蛍光寿命イメージング顕微鏡）型の手法により得られたデータを精緻化するために本発明の方法を実施することもできる。この目的のためには、調べる細胞又は生物学的サンプルのイメージ取得、及びエネルギー移動現象の測定の両方を可能にする顕微鏡装置（特に共焦点顕微鏡システム）を用いて本発明の方法を実施する。

蛍光寿命イメージング顕微鏡（ＦＬＩＭ）は、ドナー及び／又はアクセプターの蛍光寿命中に誘起された変化を介して高感度でＦＲＥＴの定量的監視を可能にする。より一般的には、蛍光プローブの近接環境における物理化学的パラメータの変化を知る手段を提供する。

以下の例は本発明を非限定的に説明するものである。

例１．様々な蛍光分子の偏光量の決定

様々な蛍光分子をこの実験で使用した。
・Ａ６４７（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Molecular Probes））
・ＨＥＫ２９３細胞中に発現させたｅＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）タンパク質
・ＨＥＫ２９３細胞中に発現させたＶ１ａ−ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）受容体融合タンパク質
・ＨＥＫ２９３細胞中に発現させたＣＸＣＲ４−ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）受容体融合タンパク質
・次の構造のＣＡＭ融合タンパク質：ＣＦＰ−ペプチドリンカー−ＹＦＰ（この構造は、Zhou et al. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 305: 460 -466, 2003, "Direct interaction between the heterotrimeric G protein subunit Gβ35 and the G protein γ subunit-like domain containing regulator of G protein signaling 11: Gain of function of cyan fluorescent protein-tagged Gγ3"に記載されている。）この融合タンパク質もＨＥＫ２９３細胞中に発現させた。ペプチドリンカーはアミノ酸が何であるかに関わらずおよそ９個のアミノ酸を有する任意のペプチドであってよい。

ＨＥＫ２９３細胞における様々な融合タンパク質の発現は次のように実現した。

様々な融合タンパク質をコードするプラスミドを用いたエレクトロポレーションによってＨＥＫ細胞を一過性にトランスフェクトする。次に調節した媒体中で細胞を３７℃に置く。２４時間後細胞を回収し、ＰＢＳバッファー中で洗浄し、数を数え、及びパラホルムアルデヒド系溶液に固定する。

全ての蛍光分子をＰＢＳ又はＰＯ₄（Ａ６４７について）バッファー中体積１００μＬで黒色のＣｏｓｔａｒマイクロプレートに分配した。Ａ６４７の濃度は１０ｎＭであった。様々な蛍光タンパク質の偏光量を測定するために、様々な分子を含む５００００個のＨＥＫ２９３細胞をマイクロプレートの別々のウェルに分配した。同量のコントロール細胞（蛍光タンパク質を含まない）を「コントロール」ウェルに分配した。

マイクロプレート蛍光リーダーであるＡｎａｌｙｓｔ（Molecular Devices）を用いて偏光量を測定した。検出する蛍光分子に応じてＡｎａｌｙｓｔに次のフィルター（全てOmega Optical製）を装着した。

励起源及びサンプル間（励起偏光子）又はサンプル及び検出器間（放射偏光子）のいずれか一方に挿入された偏光子の存在下、放射された同一ウェルの蛍光を連続的に測定することによって分子の偏光量が計算可能になる。このように次の２種類の蛍光強度測定が行われる。
・励起偏光子と同じ面内にある放射偏光子を用いて測定した蛍光強度に相当する、いわゆる「平行」蛍光強度（Ｉ_//）
・励起偏光子と直交する面内にある放射偏光子を用いて測定した蛍光強度に相当する、いわゆる「直交」蛍光強度（Ｉ_⊥）

各蛍光分子の偏光量（Ｐ）は次式によって得られる。
Ｐ＝［（Ｉ_//−Ｉ_⊥）／（Ｉ_//＋Ｉ_⊥）］×１０００（ＰはｍＰ単位で表される。）

以下の表１は測定した様々な分子について得られた偏光量を示すものである。

得られた値は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（−１７ｍＰ）のような小さい有機分子の偏光と比較して、本実験で用いた様々な蛍光タンパク質の偏光が非常に高い（＞２００ｍＰ）ことを示している。

例２．細胞内ＦＲＥＴ実験の信号／雑音（Ｓ／Ｎ）比の決定

次の融合タンパク質をこの実験で使用した。
・ＨＥＫ２９３細胞中に発現させたＶ１ａ−ＹＦＰ融合タンパク質受容体（ＹＦＰ＝黄色蛍光タンパク質）
・ＨＥＫ２９３細胞中に発現させたＣＸＣＲ４−ＣＦＰ融合受容体タンパク質（ＣＦＰ＝シアン蛍光タンパク質）
・次の構造のＣＡＭ融合タンパク質：ＣＦＰ−ペプチドリンカー−ＹＦＰ：この融合タンパク質もＨＥＫ２９３細胞中に発現させた。

これら様々なタンパク質の発現は例１に記載したように行った。

ＣＡＭを含む細胞はＣＦＰ（ドナー分子）及びＹＦＰ（アクセプター分子）間のＦＲＥＴ測定を可能にするものである。マイクロプレートの異なったいわゆる「ポジティブ」ウェルに、あらかじめＰＢＳバッファーに希釈したＣＡＭを含む２５０００個の細胞を体積で１００μＬ分配した。

マイクロプレートの異なったいわゆる「ネガティブ」ウェルに、Ｖ１ａ−ＹＦＰを含む５００００個の細胞及びＣＸＣＲ４−ＣＦＰを含む５００００個の細胞をＰＢＳバッファー中総体積１００μＬで分配した。この場合、ＣＦＰ及びＹＦＰ間の近接の欠如はこれら２つの分子間のＦＲＥＴを妨げ、蛍光雑音のみが測定される。

２つの連続する蛍光測定を次のフィルターを用いＡｎａｌｙｓｔ上で行った。

４８０ｎｍ（Ｉ_480nm）又は５３５ｎｍ（Ｉ_535nm）におけるこれら２つの蛍光測定は偏光子の存在下又は不存在下で行う。偏光子の存在下で例１に定義したいわゆる「直交」蛍光強度（Ｉ_⊥）のみを測定する。

次にＲ＝（Ｉ_535nm／Ｉ_480nm）の比を、ポジティブ又はネガティブウェルについて、及び全蛍光測定（偏光子無し）又は直交蛍光測定（偏光子有り）について計算する。

その後この実験の信号／雑音（Ｓ／Ｎ）を、偏光子有り無しで行った測定について次のように計算する。
（Ｓ／Ｎ）＝（Ｒ_{535/480ポジティブ}／Ｒ_{535/480ネガティブ}）

図１に表示したグラフは偏光子の不存在下又は存在下で得られた信号／雑音値を示す。

このことは、検出系に偏光子を使用すると実験の信号／雑音比を大幅に増大（＋４８％）できることを示している。

実際に、いわゆる「直交」蛍光測定は、ＦＲＥＴ現象に関与しない蛍光ドナー又はアクセプターによって放射された蛍光信号（非常に偏光した蛍光）と比較して、エネルギー移動後のアクセプターによって放射された信号（偏光解消された蛍光）の検出を促す。

例３．ＦＲＥＴ検出のためのアクセプターの偏光度測定−測定した蛍光信号におけるドナー混成の補正及びＦＲＥＴの定量化

この例で使用した融合タンパク質は例２に記載したものと同一である。それらの発現は例１に記載したように行った。

ＣＸＣＲ４−ＣＦＰを含む５００００個の細胞をＰＢＳバッファー中総体積１００μＬで分配した。これらのいわゆる「コントロール」ウェルは、波長５３５ｎｍでＣＦＰにより放射される蛍光信号について、この波長での蛍光信号を補正するために使用される係数Ａ及びＢの決定を可能にする。

マイクロプレートの異なったいわゆる「ネガティブ」ウェルに、Ｖ１ａ−ＹＦＰを含む５００００個の細胞及びＣＸＣＲ４−ＣＦＰを含む５００００個の細胞をＰＢＳバッファー中総体積１００μＬで分配した。ＣＦＰ及びＹＦＰ間の近接の欠如はこれら２つの分子間のＦＲＥＴを妨げる。

あらかじめＰＢＳバッファー中に希釈してあり、ＣＦＰ（ドナー）及びＹＦＰ（アクセプター）間のＦＲＥＴ測定を可能にするＣＡＭを含む２５０００個の細胞を、体積で１００μＬ、マイクロプレートの異なったいわゆる「ポジティブ」ウェルに分配した。

あらかじめＰＢＳバッファーに希釈したＣＡＭを含む様々な量の細胞、及びＣＸＣＲ４−ＣＦＰを含む様々な量の細胞を、体積で１００μＬ、マイクロプレートの異なったいわゆる「混成した」ウェルに分配した。混合物は次の比率で作った。

いわゆる「混成した」ウェルの各組は、様々な比率のＦＲＥＴに関与する分子（ＣＡＭ）及び自由ドナー（ＣＦＰ）を含む。

アクセプターの偏光度を決定するために、４つの連続した蛍光測定を以下の表に記載したフィルター及び偏光子を用いてＡｎａｌｙｓｔ上で行う。

異なるサンプルについての５３５ｎｍにおける全体の偏光量（Ｐ_overall）は次式によって得られる。
Ｐ_overall＝［（Ｉ_535nm//−Ｉ_535nm⊥）／（Ｉ_535nm//＋Ｉ_535nm⊥）］×１０００（ＰはｍＰで表される。）

Ｉ_535nm//はポジティブウェルあるいはネガティブウェルのいずれか一方、又は混成したウェルにおいて測定３の最中に得られた蛍光強度である。

Ｉ_535nm⊥はポジティブウェルあるいはネガティブウェルのいずれか一方、又は混成したウェルにおいて測定４の最中に得られた蛍光強度である。

５３５ｎｍで測定された全体の偏光度は、ＦＲＥＴに関与したＹＦＰアクセプターの偏光度、及びこの波長での強いＣＦＰ信号混成に起因して５３５ｎｍで測定されたＣＦＰドナーの偏光度の合計を表している。

ＦＲＥＴに関与したＹＦＰアクセプターの偏光度の決定は、５３５ｎｍでの蛍光測定（測定３及び４）において得られた信号からＣＰＦドナーに由来する信号の部分を差し引くことにより可能である。

これは、異なる偏光子を用いて４８０ｎｍでＣＦＰにより放射された信号（測定１及び２）と、上述のコントロールウェルにおいて５３５ｎｍで放射する信号との間の比を定めることによって行うことができる。この目的のため次式を用いる。
Ａ＝（Ｉｔ_535nm//／Ｉｔ_480nm//）
Ｂ＝（Ｉｔ_535nm⊥／Ｉｔ_480nm⊥）

Ｉｔ_480nm//はコントロールウェルにおいて測定１の最中に得られた蛍光強度の平均である。

Ｉｔ_480nm⊥はコントロールウェルにおいて測定２の最中に得られた蛍光強度の平均である。

Ｉｔ_535nm//はコントロールウェルにおいて測定３の最中に得られた蛍光強度の平均である。

Ｉｔ_535nm⊥はコントロールウェルにおいて測定４の最中に得られた蛍光強度の平均である。

偏光子の異なる配置を用いて５３５ｎｍで得られる、ＦＲＥＴに関与したＹＦＰアクセプターの蛍光信号（Ｉｆ_535nm//及びＩｆ_535nm⊥）は、試験した異なるサンプルについて次式を用いて計算する。
Ｉｆ_535nm//＝Ｉ_535nm//−（Ｉ_480nm//×Ａ）
Ｉｆ_535nm⊥＝Ｉ_535nm⊥−（Ｉ_480nm⊥×Ｂ）

Ｉ_480nm//はポジティブウェルあるいはネガティブウェルのいずれか一方、又は混成したウェルにおいて測定１の最中に得られた蛍光強度である。

Ｉ_480nm⊥はポジティブウェルあるいはネガティブウェルのいずれか一方、又は混成したウェルにおいて測定２の最中に得られた蛍光強度である。

Ｉ_535nm//はポジティブウェルあるいはネガティブウェルのいずれか一方、又は混成したウェルにおいて測定３の最中に得られた蛍光強度である。

Ｉ_535nm⊥はポジティブウェルあるいはネガティブウェルのいずれか一方、又は混成したウェルにおいて測定４の最中に得られた蛍光強度である。

次にＦＲＥＴに関与したＹＦＰアクセプターの偏光度（Ｐｆ）を次式を用いてポジティブ、ネガティブ、又は混成したウェルについて計算する。
Ｐｆ＝［（Ｉｆ_535nm//−Ｉｆ_535nm⊥）／（Ｉｆ_535nm//＋Ｉｆ_535nm⊥）］×１０００（ＰｆはｍＰで表される。）

以下の表２は異なるサンプルについて全体の偏光度（Ｐ_overall）及びＦＲＥＴに関与したＹＦＰアクセプターの偏光度（Ｐｆ）を示すものである。

上の表２に示した値は、たとえサンプルがエネルギー移動に関与しない大量のＣＦＰドナーを含む場合であっても、上述の式により異なる偏光した蛍光測定からＦＲＥＴに関与したアクセプターの偏光度を再計算できることを示している。

本発明者の実験では−５０ｍＰ辺りに位置している、ＦＲＥＴにおけるＹＦＰの偏光度もまた、ＦＲＥＴに関与している場合にＹＦＰアクセプターが強く偏光解消している（例１に見られる初期偏光値は２２２ｍＰ）ことを裏付けている。

引用文献：
１．Sato et al. (2002) Nature Biotechnology, 20, 287-294
２．Giulano et al. (1998) Tibtech, 16, 135-140
３．Miyawaki (2003) Developmental Cell, 4, 295-305
４．Sokol et al. (1998) PNAS, 95, 11538-11543
５．Chan et al. (1979) J Histochem Cytochem, 27-1, 56-64
６．Miyawaki et al. (1997) Nature, 388, 882-887
７．Bastiaens (2000) Patent WO00/43780
８．He et al. (2003) Cytometry part A, 53A, 39-54
９．Gaits et al. (2003) Science's STKE,
www.stke.org/cgi/content/full/sigtrans;2003/165/pe3
１０．Yishai et al. (2003) Phys. Med. Biol, 48, 2255-2268
１１．Clayton et al. (2002) Biophysical Journal, 83, 1631-1649
１２．Ventre et al. (2003) Molecular Microbiology, 48(1), 187-198
１３．Knight et al. (2002) J. Biochem. Biophys. Methods, 51, 165-177

偏光子の不存在下又は存在下で得られた信号／雑音値を示す。

Claims (22)

1. 測定媒体中に存在するドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物間のエネルギー移動を検出する方法であって、
   （i）該ドナー蛍光化合物が励起される波長である波長λ１の光線により該測定媒体を励起し、及び
   （ii）該アクセプター蛍光化合物の蛍光が放射される波長である波長λ３で放射された蛍光から生じる信号を測定する
   段階を含み、
   （iii）該ドナー蛍光化合物の蛍光が放射される波長である波長λ２で放射された蛍光から生じる信号を測定し、及び
   （iv）該波長λ３で該アクセプター蛍光化合物によって放射された該蛍光から生じる該信号を、該波長λ２で該ドナー蛍光化合物によって放射された該蛍光から生じる該信号により補正する
   段階をさらに含むこと、
   その励起光が偏光していること、並びに該波長λ３で放射された該蛍光から生じる該信号を該励起光の偏光面と異なる面内で測定すること
   を特徴とする方法。
2. 前記波長λ２で放射された前記蛍光から生じる前記信号もまた、前記励起光の前記偏光面と異なる面内で測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記波長λ３で前記アクセプター蛍光化合物によって放射された前記蛍光から生じる前記信号を、前記波長λ２で前記ドナー蛍光化合物によって放射された前記蛍光から生じる前記信号により補正することが、波長λ３及びλ２で測定された前記信号比を決定することを含むことを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
4. 波長λ２及び／又はλ３で放射された前記蛍光から生じる前記信号が、前記励起光の前記偏光面と直交する面内で測定されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
5. （i）前記ドナー蛍光化合物が励起される波長である前記波長λ１で偏光した光線によって前記測定媒体を励起し、
   （ii）前記励起光の前記面と平行な面内の、前記ドナー蛍光化合物の光が放射される波長である前記波長λ２で放射された全蛍光強度（Ｉｔ_//）_λ2を測定し、
   （iii）前記励起光の前記偏光面と異なる面内の、前記波長λ２で放射された全蛍光強度（Ｉｔ_⊥）_λ2を測定し、
   （iv）前記励起光の前記面と平行な面内の、前記アクセプター蛍光化合物の光が放射される波長である前記波長λ３で放射された全蛍光強度（Ｉｔ_//）_λ3を測定し、
   （v）前記励起光の前記偏光面と異なる面内の、前記波長λ３で放射された全蛍光強度（Ｉｔ_⊥）_λ3を測定し、
   （vi）前記ドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物間の前記エネルギー移動に起因する偏光Ｐを次式に従って計算し、並びに
   

   

   （ここで、
   ・Ａは前記励起光の前記面と平行な面内の、前記ドナー単独により波長λ２及びλ３で放射された前記蛍光から生じる前記信号間の比例定数を表し、
   ・Ｂは前記励起光の前記偏光面と異なる面内の、前記ドナー単独により波長λ２及びλ３で放射された前記蛍光から生じる前記信号間の比例定数を表し、
   ・ｎ＝１又は２であり、
   ・Ｇは０．１〜２の間の、使用する測定装置に固有の感度補正係数である。）
   （vii）そのＰの計算値を前記エネルギー移動が起こっていないコントロール測定媒体中で得られたものと比較して、Ｐの減少量をエネルギー移動の指標とする
   段階を含む、請求項１に記載の方法。
6. 段階（vi）において、前記偏光Ｐを次式に従って計算することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
   

   

   （ここで、
   ・ｎ＝１又は２であり、
   ・Ｇは０．１〜２の間の、使用する測定装置に固有の感度補正係数であり、
   ・Ａ＝（Ｉｄ_//）_λ3−（Ｉｄ_//）_λ2、
   ・Ｂ＝（Ｉｄ_⊥）_λ3−（Ｉｄ_⊥）_λ2であって、
   （Ｉｄ_//）_λ3、（Ｉｄ_//）_λ2、（Ｉｄ_⊥）_λ3、（Ｉｄ_⊥）_λ2は、前記ドナー蛍光化合物を含むが前記アクセプター蛍光化合物を含まない測定媒体による、前記励起光の前記面と平行（／／）又は異なる（⊥）面内の、波長λ２又はλ３で放射された前記蛍光強度に相当する。）
7. 前記励起光の前記偏光面と異なる前記面が、前記励起光の前記偏光面と直交する面であることを特徴とする、請求項５又は６のいずれかに記載の方法。
8. ５ｎｍ＜λ３−λ２＜１００ｎｍであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
9. 前記ドナー及びアクセプター蛍光化合物が蛍光タンパク質、有機フルオロフォアから選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
10. 前記ドナー及びアクセプター蛍光化合物が、ローダミン類、シアニン類、スクアライン類（squaraines）、ｂｏｄｉｐｙ類、フルオレセイン類、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ｅＧＦＰ、ＲＣＦＰ類、ＤｓＲｅｄ ＨｃＲｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ類、及びこれら誘導体から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
11. 前記ドナー及びアクセプター蛍光化合物の偏光が５０ｍＰより大きいことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
12. 前記ドナー及びアクセプター蛍光化合物の偏光が１００ｍＰより大きいことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ドナー及びアクセプター蛍光化合物が、前記ドナーの前記励起波長λ１で励起した後に前記ドナーの前記放射波長λ２で前記アクセプターの放射が検出されないように選択されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
14. 前記ドナー及びアクセプター化合物間の距離が、前記測定媒体中で起こる生物学的事象の関数として変化可能であることを特徴とする、請求項１〜１３に記載の方法。
15. 前記ドナー及びアクセプター蛍光化合物が、ペプチド、タンパク質、抗体、抗原、細胞間情報伝達物質、細胞内情報伝達物質、ハプテン、レクチン、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、炭水化物、オリゴ糖、多糖、核酸を含む群から選択される分子と結合していることを特徴とする、請求項１〜１４に記載の方法。
16. 前記ドナー及びアクセプター化合物が加水分解性の基質と直接又は間接的に結合していることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
17. 前記ドナー及びアクセプター化合物が、互いに認識可能な２つの分子に共有結合的にそれぞれ結合していることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
18. 前記ドナー及びアクセプター化合物が、前記測定媒体中に存在する第３の分子を認識可能な２つの分子にそれぞれ結合していることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
19. 前記ドナー及びアクセプター蛍光化合物が異なることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
20. 測定媒体中に存在するドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物間のエネルギー移動から生じる蛍光を測定可能にする装置であって、
    ・偏光した励起光により測定媒体を照射する手段、
    ・様々な波長にて、かつ該励起光の偏光面と平行の又は非平行の、優先的には直交する様々な偏光面内で、該媒体により放射された蛍光を収集する手段、並びに
    ・該ドナー蛍光化合物の放射波長で測定された信号により、該アクセプター蛍光化合物の放射波長で測定された信号を補正可能にする計算手段
    を含む装置。
21. 測定媒体中に存在するドナー蛍光化合物及びアクセプター蛍光化合物間のエネルギー移動から生じる蛍光を測定可能にする装置であって、
    ・偏光した励起光により該媒体を照射する手段、
    ・様々な波長にて、かつ該励起光の偏光面と平行の又は非平行の、優先的には直交する様々な偏光面内で、該媒体により放射された蛍光を収集する手段、
    ・請求項３〜７のいずれか１つに記載の方法により、該測定媒体中で起こる該エネルギー移動に特異的に起因する該測定媒体の偏光を計算可能にする計算手段
    を含む装置。
22. 前記装置が顕微鏡であることを特徴とする、請求項２０又は２１のいずれかに記載の装置。

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