FR3032797A1 - Procede de quantification d'une proteine d'interet presente dans un echantillon biologique - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique contenant des cellules, ledit échantillon étant lui-même contenu dans un milieu de mesure, qui consiste à mesurer en plus de la protéine d'intérêt, une protéine de référence dont le niveau d'expression est relativement constant d'une cellule à l'autre ou d'un type cellulaire à l'autre. L'invention concerne également une trousse et un fluorimètre pour la mise en œuvre de ce procédé.
Description
1 Procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique Objet de l'invention L'invention est relative à un procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique, ce procédé comprenant des moyens de normalisation du signal mesuré par la quantité de matériel biologique présent dans le milieu de mesure. L'invention concerne également une trousse de réactifs et un fluorimètre destinés à la mise en oeuvre de ce procédé.
Etat de la technique Les composés fluorescents constituent un outil de choix pour la recherche en biologie dans la mesure où ils permettent, en combinaison avec les équipements capables de détecter leur luminescence, de visualiser les processus biologiques au niveau cellulaire, voire moléculaire, par microscopie ou bien par simple mesure de leur luminescence à l'aide d'un fluorimètre. Ces composés peuvent être utilisés tels quels pour colorer certains compartiments des cellules ou des tissus, ou bien être conjugués à des vecteurs qui vont les transporter vers un site spécifique. De tels vecteurs peuvent être par exemple des anticorps spécifiques d'un composant cellulaire (tel qu'une protéine) que l'on souhaite marquer par un composé fluorescent, ou bien tout composé qui présente une spécificité pour un compartiment ou un composant cellulaire. Le phénomène de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Fluorescence Resonance Energy Transfer ») est largement utilisé en biologie, notamment pour étudier des interactions moléculaires. Il est basé sur l'utilisation d'un composé donneur fluorescent (par exemple un complexe ou un cryptate de terre rare) et d'un composé accepteur éventuellement fluorescent, chacun de ces composés étant couplé à une molécule biologique. Lorsqu'un phénomène biologique provoque le rapprochement de ces molécules, et que le composé donneur est excité, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur et va résulter en une variation de la luminescence émise par le milieu réactionnel, notamment une augmentation du signal émis par le composé accepteur et une diminution de la luminescence du donneur. Cette variation est quantifiable par la mesure de l'intensité de la luminescence et/ou de sa durée de vie. Cette luminescence peut être mesurée par un fluorimètre réglé aux longueurs d'onde d'émission des composés fluorescents, et le signal de FRET ainsi obtenu, le plus souvent constitué du ratio du signal de l'accepteur sur celui du donneur, permet ainsi de suivre l'évolution du phénomène observé. La mise en oeuvre de cette technique avec des 3032797 2 chélates ou des cryptates de terres rares, développée notamment par G. Mathis et al. (« Homogeneous time resolved fluorescence ernergy transfer using rare earth cryptates as a tool for probing molecular interactions in biology », Spectrochimica Acta Part A 57 (2001) 2197-2211) présente de nombreux avantages qui ont déjà permis plusieurs applications dans 5 le domaine du diagnostic in vitro et dans celui du criblage à haut débit dans l'industrie pharmaceutique. Plusieurs sociétés commercialisent des réactifs permettant la mise en oeuvre de cette approche pour étudier des processus biologiques ; par exemple la Demanderesse fournit différents réactifs, dont des cryptates de terre rare, pour l'étude de phénomènes biologiques particuliers (détection d'activité enzymatique, dosage de seconds messagers 10 etc...). Les chélates ou cryptates de terre rare luminescents, en particulier les cryptates ou chélates d'europium ou de terbium, ont une durée de vie de l'ordre de la milliseconde qui autorise la mesure du signal de FRET émis par le milieu de mesure après un délai suivant l'excitation du composé donneur. Cette technique de mesure de FRET en temps résolu (TR-FRET, pour « Time 15 Resolved FRET ») permet de s'affranchir de la luminescence parasite émise par le milieu de mesure immédiatement après son excitation et est donc particulièrement avantageuse lorsque le milieu de mesure comprend du matériel biologique riche en composés, notamment protéiques, susceptibles de produire ce genre d'interférence. Si la technique de TR-FRET a longtemps été mise en oeuvre sur des systèmes biologiques 20 relativement bien contrôlés, tels qu'une enzyme donnée et son substrat, deux protéines interagissant l'une avec l'autre, ou encore le dosage d'un analyte dans du plasma ou du sérum sanguin, elle a récemment été appliquée à des environnements beaucoup plus complexes, et notamment des cellules, des lysats cellulaires ou des expiants tissulaires. Un des problèmes des tests in vitro pratiqués sur ce type de matériel (les tests in vitro réalisés sur des tissus 25 prélevés sur un organisme sont également nommés « tests ex vivo ») réside dans la difficulté de contrôler le nombre de cellules présentes dans le milieu de mesure, rendant la comparaison des résultats obtenus dans différents tests d'autant plus difficile. Ce problème technique est particulièrement critique lorsque l'on souhaite appliquer la technique de TR-FRET à l'analyse clinique d'échantillons de tissus natifs caractérisés par une grande disparité en contenu 30 cellulaire. Des techniques d'évaluation ou bien de normalisation par rapport à la quantité de cellules présentes dans le milieu de mesure sont disponibles : il est tout d'abord possible d'introduire dans le milieu de mesure un nombre connu de cellules par distribution d'une suspension homogène de cellules. Des techniques de dénombrement des cellules sont également 3032797 3 utilisées, mais elles sont relativement fastidieuses et peu adaptées à l'analyse d'un grand nombre d'échantillon (microscopie, FACS). Une autre approche consiste à évaluer la quantité de certaines protéines « ubiquitaires », dont la présence reflète indirectement la quantité de cellules présentes dans le milieu de mesure (par exemple GAPDH, actine). Cette approche est 5 utilisée dans les dosages de protéine de type « Western Blot », qui ne sont pas basés sur des mesures de TR-FRET, et également pour la quantification d'acides nucléiques, notamment d'ARN messagers rétrotranscrits. Dans ce cas c'est la séquence d'ADN codant pour une protéine ubiquitaire qui est quantifiée. Des méthodes basées sur l'utilisation d'agents fluorescents s'intercalant dans l'ADN, ou se liant 10 à celui-ci, sont également utilisées : ces agents ont la particularité d'être luminescents à des longueurs d'onde différentes selon qu'ils sont complexés ou non avec l'ADN; le calcul du ratio des signaux mesurés à ces deux longueurs d'onde permet d'évaluer la quantité d'ADN présent dans le milieu. Des exemples de tels agents intercalants sont les produits Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 ou DAPI. Une méthode d'utilisation de tels agents dans un 15 dosage basée sur la mesure d'un signal de FRET est décrite dans la demande internationale de brevet WO 2013/124544. Cette technique nécessite généralement de mettre en présence l'échantillon avec une concentration élevée de fluorophore, ce qui nécessite de ce fait une séparation physique (« lavage ») permettant d'éliminer le fluorophore en excès pour atteindre une sensibilité suffisante.
20 Enfin, il est toujours possible d'utiliser la méthode de Bradford qui permet, grâce à l'utilisation d'un colorant (bleu de coomassie) dont l'absorbance vers 600 nm est modifiée lors de sa liaison avec les protéines, de quantifier la charge protéique du milieu. La valeur obtenue est utilisée pour normaliser le résultat de dosages cellulaires vis-à-vis du nombre de cellules [Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of 25 protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-54, 1976; Total Protein Analysis as a Reliable Loading Control for Quantitative Fluorescent Western Blotting. Eaton et al. PLOS ONE 2013, 8 (8) : e72457]. Il n'existe aujourd'hui aucun moyen satisfaisant d'étudier des phénomènes biologiques par la technique de TR-FRET sur des échantillons de cellules ou des extraits de tissu où, en raison des 30 quantités variables de cellules d'un milieu de mesure à l'autre, il est difficile de comparer les résultats. Les techniques disponibles sont fastidieuses, introduisent des risques d'erreur et ne sont pas adaptées à l'analyse rapide de plusieurs dizaines ou centaines d'échantillons sans avoir à séparer ou centrifuger la solution.
3032797 4 Il serait donc particulièrement avantageux de pouvoir mesurer par TR-FRET, et sans étapes de lavage et séparation, la luminescence émise dans des milieux contenant des quantités indéterminées de cellules, et par voie de conséquence un signal spécifique d'une protéine d'intérêt indépendamment de la variabilité de la teneur cellulaire.
5 Description de l'invention Les inventeurs ont mis au point un procédé de détection de la présence d'une protéine d'intérêt dans un milieu de mesure, qui tient compte de la quantité totale de cellules présentes dans ce milieu, ou de la quantité totale d'un type particulier de cellule.
10 Ce procédé, basé sur l'utilisation de la technique de TR-FRET, consiste à mesurer, en plus de la protéine d'intérêt, une protéine de référence dont le niveau d'expression est relativement constant d'une cellule à l'autre ou d'un type cellulaire à l'autre. La protéine de référence peut également être caractéristique d'un état physiopathologique donné. Selon l'invention, la protéine d'intérêt est mesurée grâce à un premier couple de partenaires 15 de TR-FRET constitué d'un premier donneur et d'un premier accepteur, et la protéine de référence est mesurée grâce à un second couple de partenaires de TR-FRET constitué d'un second donneur et d'un second accepteur. Un signal de TR-FRET est classiquement obtenu en mesurant la luminescence émise par le milieu de mesure à la fois à la longueur d'onde d'émission du composé donneur et à celle du 20 composé accepteur, et en calculant un ratio entre les deux mesures, généralement le ratio du signal émis par le composé accepteur sur celui émis par le composé donneur. Grace à l'utilisation de ce ratio, il a été montré qu'il était possible de s'affranchir de la variabilité optique du milieu, d'un échantillon à l'autre (Mathis G, Clin. Chem. 1993, 39(9):1953-1959). De manière inattendue, il n'est pas nécessaire, dans la mise en oeuvre du procédé selon 25 l'invention, d'effectuer la mesure à la longueur d'onde des donneurs. Une caractéristique essentielle de l'invention réside donc dans le fait que la luminescence émise à la longueur d'onde du donneur n'est pas mesurée. L'invention consiste, après excitation des donneurs, à mesurer seulement les signaux émis aux longueurs d'onde d'émission des deux accepteurs, à savoir celui utilisé pour la détection de la protéine d'intérêt et celui utilisé pour la détection de 30 la protéine de référence. Un ratio des deux signaux est calculé, de préférence celui du signal émis par le premier accepteur (protéine d'intérêt) sur celui émis par le second accepteur (protéine de référence). La proportion de protéine de référence choisie étant relativement constante d'une cellule à l'autre, ce ratio permet non seulement de normaliser le signal obtenu pour la protéine d'intérêt par la quantité de cellules présente dans le milieu de 3032797 5 mesure, mais également de le normaliser pour tenir compte des différences de propriétés optiques entre deux milieu de mesure différents. Ces différences de propriétés optiques sont liées à la composition du milieu, notamment la présence de certains composés protéiques ou autres, qui influencent la qualité optique du milieu.
5 Finalement, le procédé selon l'invention permet de quantifier la présence d'une protéine d'intérêt présente dans un milieu de mesure contenant un échantillon biologique, et de comparer cette quantité à celle présente dans un autre échantillon. Les mesures obtenues peuvent être comparées puisque le procédé selon l'invention permet de corriger ces mesures pour tenir compte d'une part de la quantité de matériel biologique présent d'un échantillon à 10 l'autre, d'autre part des différences de propriétés optiques d'un milieu de mesure à l'autre. La mesure obtenue pour un échantillon est rendue indépendante de son milieu et de la quantité de cellules, par la détermination de la densité de protéine d'intérêt, que l'on peut alors comparer d'un échantillon à l'autre. Cela est particulièrement utile lorsque l'échantillon biologique est issu d'un patient, et que la quantification de la protéine d'intérêt permet 15 d'obtenir une information quant à l'état du patient, notamment pour poser un diagnostic, suivre l'évolution de son état de santé ou encore l'efficacité d'un traitement. Par ailleurs, un des avantages du procédé selon l'invention est qu'il ne nécessite pas de mesurer le signal émis par le ou les composés fluorescents donneurs, contrairement à ce qui est pratiqué dans les mesures de signaux de TR-FRET classiques [Mathis G op.citl. Dans une 20 mise en oeuvre préférée explicitée plus loin, après excitation des donneurs, seulement deux mesures de luminescence sont nécessaires pour quantifier la protéine d'intérêt, contre quatre mesures selon l'approche classique. Dans son premier aspect, l'invention concerne donc un procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique contenant des cellules et une 25 protéine de référence, ledit échantillon étant lui-même contenu dans un milieu de mesure, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) homogénéisation de l'échantillon sous forme de lysat cellulaire ; b) distribution du lysat cellulaire dans un seul contenant ou bien dans des contenants différents ; 30 c) introduction dans le milieu de mesure d'un premier et d'un deuxième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à la protéine d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués par un premier composé donneur et un premier composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ; 3032797 6 d) introduction dans le milieu de mesure d'un troisième et d'un quatrième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique de la protéine de référence, ces ligands étant respectivement marqués par un deuxième composé donneur et un deuxième composé accepteur, tous deux formant un couple de 5 partenaires de TR-FRET ; e) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du premier composé donneur ; f) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ; 10 g) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du deuxième composé donneur ; h) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième composé accepteur; i) calcul du ratio des signaux mesurés aux étapes f) et h), ce ratio étant représentatif de 15 la quantité de protéine d'intérêt présente dans l'échantillon, normalisée par la quantité de protéine de référence; sous réserve que : - lorsque l'échantillon est distribué dans un seul contenant, la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième accepteur est différente de celle 20 correspondant au pic d'émission du premier accepteur, et que - lorsque l'échantillon est distribué dans deux contenants, les étapes c), e) et f) sont mises en oeuvre dans le premier contenant, et les étapes d), g) et h) sont mises en oeuvre dans le deuxième contenant. Par « contenant » on entend un tube, un puits de plaque ou de microplaque ou tout autre 25 contenant généralement utilisé pour procéder à des dosages biologiques. Dans un premier mode de réalisation de l'invention, le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation différentes. Dans un second mode de réalisation de l'invention, le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques.
30 Dans un troisième mode de réalisation de l'invention, le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, et l'échantillon est distribué dans deux contenants différents.
3032797 7 Dans un quatrième mode de réalisation de l'invention, le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, l'échantillon est distribué dans un seul contenant, et le procédé ne comprend pas d'étape g). Ce mode de réalisation est préféré. Dans les modes de réalisation de l'invention selon lesquels l'échantillon est distribué dans un 5 seul contenant, les étapes de mesure de la luminescence des accepteurs (étapes f) et h)), peuvent être mise en oeuvre simultanément. Des fluorimètres fonctionnant en mode temps résolu et permettant une mesure simultanée de luminescence émise à deux longueurs d'onde différentes sont disponibles dans le commerce (par exemple auprès des sociétés BioTek, BMG LABTECH GmbH, Molecular Devices, BRAHMS GmbH, Tecan Group Ltd., Berthold Technologies 10 GmbH, Furuno Furuno Electric Co., Ltd, ou encore Perkin Elmer). Dans les modes de réalisation de l'invention selon lesquels le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, il est avantageux que le premier et le deuxième donneur soient identiques. Le procédé conforme à l'invention peut être mis en oeuvre en combinaison avec le procédé de 15 normalisation de la luminescence émise par un milieu de mesure décrit dans la demande de brevet WO 2013/124544 dont le contenu intégral est incorporé par référence à la présente demande. Cette demande de brevet décrit un procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un 20 échantillon biologique, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle 25 utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, c) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue, 30 d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, 3032797 8 e) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape d), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 pts, cette luminescence correspondant principalement à celle du composé fluorescent à durée 5 de vie longue, f) calcul d'un signal de luminescence normalisé correspondant au ratio : (signal obtenu à l'étape e) / (signal obtenu à l'étape d). Dans une mise en oeuvre préférée du procédé décrit dans WO 2013/124544, la luminescence mesurée est celle consécutive à un phénomène de TR-FRET dans le milieu de mesure, c'est-à- 10 dire un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur. Dans cette mise en oeuvre, le composé fluorescent à durée de vie longue joue le rôle du donneur d'énergie et le procédé précédent comprend alors les étapes suivantes : a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, 15 b) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET, c) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le 20 spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, d) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic 25 d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue, e) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 lis, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, 30 f) éventuellement, mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape e), après un délai de 20 à 200 lis suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 3032797 9 g) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure après un délai de 20 à 200 us après l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 600 p.s, à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur, h) détermination d'un signal de TR-FRET normalisé comprenant le calcul du ratio : (signal 5 obtenu à l'étape g) / [(éventuellement signal obtenu à l'étape f) X (signal obtenu à l'étape e)]. Dans son deuxième aspect, la présente invention concerne une trousse de réactifs pour mettre en oeuvre le procédé selon l'invention. Cette trousse de réactifs comprend : un premier et un deuxième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine 10 de liaison spécifique à une protéine d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués par un premier composé donneur et un premier composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ; un troisième et d'un quatrième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à une protéine de référence, ces ligands étant 15 respectivement marqués par un deuxième composé donneur et un deuxième composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET, et la longueur d'onde correspondant au pic d'émission de ce deuxième accepteur étant différente de celle correspondant au pic d'émission du premier accepteur. La trousse selon l'invention peut également contenir un calibrateur ainsi qu'une composition 20 contenant une quantité connue de protéine d'intérêt, y compris un lysat cellulaire contenant cette protéine. De plus, la trousse selon l'invention peut comprendre un composé fluorescent possédant une durée de vie courte et se liant à l'ADN ou aux protéines cellulaires ; ainsi que des instructions pour normaliser le signal de la protéine d'intérêt par la protéine de référence. Dans un troisième aspect, l'invention concerne un fluorimètre pour la mise en oeuvre du 25 procédé selon l'invention. Ce fluorimètre est contrôlé par un logiciel pour la mise en oeuvre de l'algorithme suivant : a) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du premier composé donneur ; b) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde 30 correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ; c) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du deuxième composé donneur ; d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième composé accepteur, cette longueur 3032797 10 d'onde étant différente de celle correspondant à un pic d'émission du premier composé accepteur ; e) calcul du ratio des signaux mesurés aux étapes b) et d). Dans le cas du mode de réalisation selon lequel le premier et le deuxième donneur ont des 5 bandes d'excitation identiques, l'étape c) peut être omise. De préférence, le fluorimètre selon l'invention comporte une tête de lecture permettant la mesure simultanée de la luminescence émise par les deux accepteurs à deux longueurs d'onde différentes. Protéine de référence : 10 La protéine de référence est de préférence une protéine dite « de ménage ». La notion de protéine de ménage est connue de l'homme du métier : elle désigne des protéines dont la présence est nécessaire au maintien des fonctions cellulaires de base, elles assurent le maintien de l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la cellule et sont exprimées à des niveaux relativement constants et cela indépendamment du type de la cellule, de son 15 environnement et de l'état de l'organisme auquel elle appartient (normal ou pathologique). La protéine de référence est choisie de manière préférée parmi les protéines suivantes : pactine, GAPDH, HSP70, HSP90, la sous-unité alpha de la NaK-ATPase, TERT, une histone et en particulier l'histone H6. En ce qui concerne le choix d'une protéine de référence adéquate l'expérimentateur peut s'aider des travaux portant sur l'évaluation de divers gènes en tant que 20 « gène de référence » comme l'hypoxanthine ribosyltransférase (HPRT) [De Kok et al: Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab. Invest. 2005, 85:154-159; Ho-Pun-Cheung et al. Validation of an appropriate reference gene for normalization of reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction data from rectal cancer biopsies. Anal. Biochem. 2009, 388:348- 25 350]. La protéine de référence peut également être caractéristique d'un état physiopathologique donné. Par exemple, la protéine de référence peut être une protéine caractéristique des cellules cancéreuses comme par exemple les cytokératines pour les cellules épithéliales, ou caractéristique du comportement de la cellule cancéreuse comme par exemple Ki67 qui traduit 30 une prolifération ou HIF (acronyme de l'expression anglaise « Hypoxia Inducible Factors ») qui est surexprimée dans des environnements hypoxiques. La protéine de référence est naturellement contenue dans le milieu de mesure (les cellules du milieu) ; le procédé de l'invention ne comprend donc aucune étape d'addition d'une telle protéine de référence dans le milieu de mesure.
3032797 11 L'échantillon biologique : Dans une mise en oeuvre préférée, l'échantillon biologique est un échantillon de tissu prélevé sur un patient (tissu dit « natif »), comme par exemple un échantillon de tissu solide prélevé 5 dans le cadre d'une biopsie. Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre notamment à partir d'un échantillon biologique sous forme de coupes FFPE (acronyme de l'expression anglaise « formalin fixed paraffin embedded »), ou encore de cryosections. L'échantillon biologique peut également avoir été prélevé par la technique de biopsie d'aspiration à l'aiguille fine.
10 Les techniques de préparation de tissu sous forme de coupes FFPE sont connues de l'homme du métier : elles peuvent consister en particulier en la fixation de l'échantillon par un traitement avec du formaldéhyde, son inclusion dans de la paraffine, en particulier sous forme de blocs qui peuvent être ensuite découpés au microtome (de préférence avec une épaisseur d'environ 1 à 50 um). Le traitement de ces sections au xylène pour enlever la paraffine, leur 15 rinçage à l'éthanol puis à l'eau sont également des techniques connues de l'homme du métier, de même que la régénération des épitopes par la technique HIER (acronyme de l'expression anglaise « heat induced eptitope recovery », décrite notamment dans le brevet américain US 8,067,241). De manière alternative, le procédé selon l'invention peut également être mis en oeuvre sur des 20 cryosections, de préférence de 1 à 50 um d'épaisseur, également préparées selon les techniques classiques. Le procédé selon l'invention comporte une étape d'homogénéisation de l'échantillon biologique sous forme de lysat cellulaire, ledit lysat cellulaire étant distribué dans un ou plusieurs contenants différents avant l'introduction du premier et du deuxième ligand dans le 25 milieu de mesure. Cette homogénéisation peut être obtenue par un traitement mécanique, choisi parmi : l'application d'ultrasons (sonication), des cycles de congélation / décongélation, l'utilisation de broyeurs mécaniques, éventuellement conjointement à l'utilisation de tampon de lyse hypotonique ou de tampon de lyse contenant des détergents comme le tampon RIPA. En fonction de la nature de la protéine d'intérêt et de la protéine de référence, on veillera à 30 utiliser des conditions de traitement ménagées. En particulier, si le procédé est mis en oeuvre dans le cadre de l'étude de structures subcellulaires ou encore d'agrégats ou d'oligomères de protéines, un traitement mécanique trop violent ou un traitement chimique trop drastique, pourrait dégrader ou dissocier ces structures ou oligomères. L'homme du métier peut facilement ajuster ces paramètres de traitement chimique ou mécanique en fonction du 3032797 12 matériel étudié. Un exemple de traitement mécanique ménagé consiste à appliquer par exemple au milieu de mesure des ultrasons (sonication) à une fréquence > 16 000 Hz, à une puissance de 80 W et pendant une durée de 3 à 10 secondes, et de préférence pendant 4 à 6 secondes. Les échantillons sont de préférence maintenus dans un bain de glace pendant le 5 traitement pour limiter leur échauffement. Lorsque l'échantillon biologique est préparé sous forme d'homogénat, il peut être dilué selon un facteur de dilution qui dépend de plusieurs facteurs et en particulier de l'affinité des ligands avec la protéine d'intérêt et la protéine de référence, et également de la concentration normale de protéine d'intérêt ou de protéine de référence dans l'échantillon. Ces dilutions 10 relèvent de mise au point de routine pour l'homme du métier spécialiste de la détection de protéines dans des milieux biologiques. L'échantillon est dilué de préférence après son homogénéisation sous forme de lysat cellulaire et avant sa distribution dans un ou plusieurs contenants. Le procédé selon l'invention peut également être mis en oeuvre sur des cellules issues de 15 cultures cellulaires. Dans ce cas, l'homogénéisation peut être effectuée par exemple par sonication ou encore en utilisant un tampon de lyse. La méthode de lyse la plus simple appelée lyse osmotique, consiste à mettre les cellules dans un milieu hypotonique. Pour faciliter la rupture de cellules, on ajoute souvent un détergent non ionique comme le Triton® ou le Tween®, ou un détergent anionique comme le SDS (dodécylsulfate de sodium). Le SDS est un surfactant très 20 efficace pour la solubilisation de presque toutes les protéines. Il détruit les ponts non-covalents des protéines, les dénaturant de telle sorte qu'elles perdent leur conformation originale et leur fonction, de ce fait, il ne doit théoriquement pas être utilisé quand des protéines actives sont nécessaires ou quand les interactions protéine-protéine sont étudiées. Généralement pour une lyse cellulaire complète, l'échantillon doit être traité aux ultrasons à l'aide d'un sonicateur. D'autre 25 surfactants moins « abrasifs » tels que le Triton® X-100,1\IP-40, CHAPS, le Tween® 20, sont utilisés soit seuls soit en combinaison. Un tampon de lyse contient souvent des additifs tels que du glycérol et des sels qui modifient la valeur de la CMC (concentration micellaire critique) des détergents, ainsi que des additifs inhibiteurs de protéases ou de phosphatases. Des tampons de lyse sont disponibles dans le commerce.
30 Cette étape peut être mise en oeuvre préalablement ou postérieurement à l'introduction des couples de partenaires de TR-FRET dans le milieu de mesure.
3032797 13 Les ligands spécifiques de la protéine d'intérêt ou de la protéine de référence Dans une mise en oeuvre préférée, les ligands comportant un domaine de liaison à la protéine d'intérêt et à la protéine de référence sont des anticorps reconnaissant ces protéines. Le terme « anticorps » doit ici être pris au sens large et comprend toute protéine de la famille des 5 Immunoglobulines ou bien comportant un domaine d'une immunoglobuline, ainsi qu'un site de liaison spécifique à la protéine d'intérêt. Les anticorps peuvent donc être des fragments Fab, Fab', des anticorps simple chaîne ou simple domaine, des domaines variables de chaînes lourdes ou légères d'immunoglobulines. L'homme du métier est à même de fabriquer des anticorps spécifiques de la protéine d'intérêt 10 et de la protéine de référence en utilisant les techniques classiques. De nombreux anticorps sont également disponibles dans le commerce. L'homme du métier veillera à sélectionner des anticorps reconnaissant des épitopes différents sur la protéine d'intérêt et sur la protéine de référence, cela pour permettre la fixation simultanée de l'anticorps marqué par le donneur et de celui marqué par l'accepteur.
15 Les ligands spécifiques peuvent également être des aptamères ou autres bioprobes. Marquage des ligands ou anticorps par des composés donneurs ou accepteurs d'énergie Le marquage d'un ligand ou d'un anticorps par un composé donneur ou accepteur fluorescent est effectué par les techniques classiques de conjugaison faisant appel à l'utilisation de 20 groupes réactifs. Les composés donneurs ou accepteurs fluorescents sont généralement commercialisés sous forme « fonctionnalisée », c'est-à-dire qu'ils portent un groupe réactif susceptible de réagir avec un groupe fonctionnel présent sur le composé à marquer, en l'occurrence, le ligand ou l'anticorps. Typiquement, le groupe réactif présent sur le composé fluorescent donneur ou accepteur est 25 un groupe électrophile ou nucléophile qui peut former une liaison covalente lorsqu'il est respectivement mis en présence d'un groupe nucléophile ou électrophile approprié. A titre d'exemples, les couples de groupes électrophiles/nucléophiles et le type de liaison covalente formée lorsqu'ils sont mis en présence sont listés ci-dessous : 3032797 14 GROUPE ELECTROPHILE GROUPE NUCLEOPHILE TYPE DE LIAISON acrylamides thiols thioéthers halogénures d'acyle amines/anilines carboxamides aldéhydes amines/anilines imines aldéhydes ou cétones hydrazines hydrazones aldéhydes ou cétones hydroxyla mines oximes alkyl sulfonates thiols thioéthers anhydrides amines/anilines carboxamides halogénure d'aryle thiols thioéthers halogénure d'aryle amines aryl amines aziridines thiols thioéthers carbodiimides acides carboxyliques N-acylurées ou anhydrides esters activés* amines/anilines carboxamides haloacétamides thiols thioéthers halotriazines amines/anilines aminotriazines imido esters amines/anilines amidines isocyanates amines/anilines urées isothiocyanates amines/anilines thiourées maléimides thiols thioéthers sulfonate esters amines/anilines alkyl amines halogénures de sulfonyle amines/anilines sulfonamides * par ester activé, on entend des groupes de formule COY, ou Y est : - un groupe partant, choisi parmi les groupes succinimidyloxy (-0C4H4NO2), sulfo succinimidyloxy (-0C4H3NO2-S03H) ; 5 ° un groupe aryloxy substitué ou non par au moins un substituant électrophile tel que les groupes nitro, fluoro, chloro, cyano, trifluorométhyle, formant ainsi un aryle ester activé ; O un acide carboxylique activé par un groupe carbodiimide, formant un anhydride - OCORa ou -OCNRaNHRb, dans lesquels Ra et Rb sont identiques ou différents et sont 10 choisis parmi les groupes alkyles en C1-C6, perfluoroalkyles en C1-C6, alkoxy en C1-C6, cyclohexyle ; O le 3-diméthylaminopropyle, ou le N-morpholinoéthyle.
3032797 15 Les composés fluorescents donneurs et accepteurs disponibles dans le commerce comportent généralement une fonction maléimide ou un ester activé, le plus souvent par un groupe NHS (N-hydroxysuccinimidyle), qui réagissent avec les groupes thiol et amines respectivement et peuvent donc être utilisés pour le marquage d'anticorps. Les anticorps marqués sont 5 caractérisés par le rapport molaire final (RMF) qui représente le nombre moyen de molécules de marqueur greffés au ligand. Lorsque le ligand est de nature protéique, il peut être avantageux d'utiliser l'un des groupes fonctionnels naturellement présent dans les protéines : le groupe amino terminal, le groupe carboxylate terminal, les groupes carboxylates des acides aspartique et glutamique, les 10 groupes amines des lysines, les groupes guanidines des arginines, les groupes thiols des cystéines, les groupes phénols des tyrosines, les cycles indoles des tryptophanes, les groupes thioéthers des méthionines, les groupes imidazoles des histidines. Si le ligand ne comporte pas de groupe fonctionnel à l'état naturel, de tels groupes peuvent être introduits. Des méthodes d'introduction de groupes fonctionnels sont notamment 15 décrites dans C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2nd edition, LJ. Kricka (1995), Ed. Academic press Ltd., Londres, p. 66-72. Une autre approche pour le marquage d'un ligand par un composé fluorescent consiste à introduire un groupe réactif dans le ligand, par exemple un groupe NHS ou un groupe maléimide, et de le mettre en présence d'un fluorophore portant un groupe fonctionnel qui 20 réagira avec le groupe réactif pour former une liaison covalente. Il est important de vérifier que le ligand marqué conserve une affinité suffisante pour la protéine d'intérêt ou la protéine de référence ; cela peut être contrôlé de manière simple par des expériences de liaison classiques, permettant de calculer la constante d'affinité du ligand marqué pour la protéine.
25 Couples de partenaires de FRET Les couples de partenaires de FRET sont de préférence constitués par un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur d'énergie. Le FRET est défini comme un transfert d'énergie non radiatif résultant d'une interaction 30 dipôle-dipôle entre un donneur et un accepteur d'énergie. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre d'émission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre d'absorption de l'accepteur. En accord avec la théorie de Fôrster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur : lorsque ces molécules sont à proximité l'une de 3032797 16 l'autre, et que le composé donneur est excité à une longueur d'onde correspondant à un de ses pics d'absorption, un transfert d'énergie aura lieu, provoquant une diminution de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission du donneur, et une augmentation de la luminescence émise à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur.
5 La sélection des fluorophores donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd edition, Kluwer academic/plenum publishers, NY (1999)), auquel l'homme du métier pourra se référer.
10 Les composés fluorescents donneurs d'énergie à durée de vie longue (> 0,1 ms, de préférence comprise entre 0,5 et 6 ms), en particulier les chélates ou cryptates de terres rares sont avantageux puisqu'ils permettent d'effectuer des mesures en temps résolu, c'est-à-dire de mesurer des signaux de TR-FRET en s'affranchissant du phénomène d'autofluorescence émis par le milieu de mesure. Ils sont pour cette raison et de manière générale préférés pour la 15 mise en oeuvre du procédé selon l'invention. Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont des complexes de terres rares également appropriés aux fins de l'invention, mais les chélates et cryptates d'europium (Eu3+) et de terbium (Tb3+) sont particulièrement préférés.
20 Dans le mode de réalisation du procédé selon l'invention selon lequel le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, ils peuvent être tous deux de préférence soit un chélate ou cryptate d'Europium, soit un chélate ou cryptate de Terbium, ce dernier cas étant particulièrement préféré. Dans le mode de réalisation du procédé selon l'invention selon lequel le premier et le 25 deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation différentes, de préférence l'un est un chélate ou cryptate d'Europium, et l'autre un chélate ou cryptate de Terbium. Dans ce mode de réalisation, le premier et le deuxième composé donneur peuvent être tous deux des chélates ou cryptates d'Europium, sous réserve que les chélates ou cryptates possèdent des structures différentes. Il en est de même lorsque le premier et le deuxième composé donneur 30 sont des chélates ou cryptates de Terbium. Par « bande d'excitation », on entend une plage de longueurs d'onde qui peuvent être utilisées pour faire passer le composé donneur à un état excité. Par composés donneurs ayant des « bandes d'excitation identiques », il faut comprendre que les bandes d'excitation du premier et du deuxième donneur se chevauchent suffisamment pour permettre l'excitation du premier 3032797 17 et deuxième composé donneur à la même longueur d'onde. Par composés donneurs à « bandes d'excitation différentes », il faut comprendre qu'il n'est pas possible d'exciter les deux donneurs de manière satisfaisante avec une seule longueur d'onde, du fait du non-chevauchement de leurs bandes d'excitation.
5 De très nombreux complexes de terres rares ont été décrits et plusieurs sont actuellement commercialisés par les sociétés PerkinElmer, Invitrogen et Cisbio Bioassays. Des exemples de chélates ou cryptates de terres rares appropriés aux fins de l'invention sont : ® Les cryptates de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptates de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, 10 EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96877. Les cryptates de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptates de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptates d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe 15 N H2) : NF-I2 TrisBiPy-Eu 3032797 18 H o N .V.\ NH2 Py-BiPy-Eu TrisBiPy-tetraacide-Eu HOOC NH2 N N .N N- \ HOOC 'COOH HOOC COOH 3032797 Py-BiPy-tetraacide-Eu ® Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481, US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481, US 4 801 722, 5 US 4 794 191, US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer. e Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le 10 tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/10580. 15 ° Les cryptates de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables. ® Le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) : 19 H 0 NI....'7-sH2 N N N EU 3+ N, 3032797 20 et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page 89). 5 - Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays. - Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) : 1 N N '-,,,, ,,,,,./ .N. - CH,- Eu3' N H3C CH3 - NCS H3C 10 - Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(II) tris(2,2'-bipyridine). - Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et 15 dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5 622 821.
3032797 21 CH3 R. ® Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of 5 Luminescence 1997, 75: 149-169) : NCS Tb-W14016 De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent donneur est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de 10 terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les cryptates d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
3032797 22 Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodyme (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont également des complexes de terres rares appropriés aux fins de l'invention. Les composés fluorescents accepteurs doivent posséder un spectre d'absorption qui recouvre 5 le spectre d'émission du donneur (Mathis G, op. cit.) et peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la 10 dénomination « Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron- 15 dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole. Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce. Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » 20 sont commercialisés par la société Atto-tec ; les composés « DY» sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Annersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros. L'invention mettant en oeuvre deux accepteurs, il est essentiel que le premier et le deuxième 25 accepteur possèdent des pics d'émissions différents lorsque l'échantillon biologique est distribué dans un seul contenant et que les mesures de la protéine d'intérêt et de la protéine de référence sont effectuées dans ce même contenant. Les spectres d'émission des accepteurs sont généralement disponibles et s'ils ne le sont pas, ils peuvent être aisément déterminés par des techniques classiques connues de l'homme du métier.
30 Dans le cas où les composés donneurs sont des cryptates de terbium, éventuellement identiques, de préférence, le premier accepteur possède un pic d'émission centré autour de 520 nm et le deuxième accepteur possède un pic d'émission centré autour de 665 nm. Alternativement, le premier accepteur possède un pic d'émission centré autour de 665 nm et le deuxième accepteur possède un pic d'émission centré autour de 520 nm.
3032797 23 Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le premier accepteur est l'Alexa 488 et le deuxième accepteur est le fluorophore d2, le premier et le deuxième donneur sont identiques et sont le cryptate de terbium Lumi4(Tb). Dans un autre mode de réalisation particulièrement préféré, le premier accepteur est la cyanine Cy7, le deuxième accepteur est le 5 fluorophore d2, et le premier et le deuxième donneur sont identiques et sont le cryptate d'europium trisbipyrdine. Le fluorophore d2 est une cyanine dont les propriétés spectroscopiques sont similaires à celles de l'AlexaFluor 647 ou la cyanine Cy5, à savoir un spectre d'absorption en solution aqueuse présentant un maximum d'absorption pour des longueurs d'onde entre 645 nm et 650 nm et une absorbance molaire supérieure à 10 200 000 M-1.cm-1 , un spectre de fluorescence présentant un maximum de fluorescence entre 665 nm et 675 nm et caractérisé par un rendement quantique supérieur à 20%. Mesure du signal de TR-FRET La mesure du signal de TR-FRET est effectuée après excitation du milieu de mesure par une 15 source pulsée dans une bande d'excitation du composé donneur, de préférence après un délai de 1 à 500 microsecondes (us) et pendant une durée de 10 à 2000 us. De manière encore plus préférée, le délai est de 50 us (temps résolu). Le signal de TR-FRET peut être constitué par l'intensité de la luminescence mesurée, soit par sa durée de vie.
20 EXEMPLE 1 Dans cet exemple, la protéine EGFR a été mesurée de manière quantitative sur les lignées cellulaires suivantes: SKBR3 : une lignée qui exprime très faiblement la protéine EGFR, 25 A431 : une lignée qui exprime fortement la protéine EGFR (environ plus d'1 million de protéines d'EGFR par cellule d'après la littérature). Le conjugué donneur AC74- Lumi4(Tb) et le conjugué accepteur AC40-d2 ont été utilisés pour la quantification par TR-FRET de l'actine contenue dans des lysats cellulaires. Le conjugué donneur Anti-EGFR(A)-lumi4(Tb) et le conjugué accepteur Anti-EGFR(B)- Alexa488 30 ont été utilisés pour la quantification d'EGFR. Préparation des ligands marqués (conjugués donneurs et conjugués accepteurs) Marquage d'un anticorps monoclonal anti-beta-Actine (« a-Actine ») clone AC74 par un cryptate de terbium: 3032797 24 L'anticorps commercial AC74 (2,5 mg/mL) a été dialysé contre du tampon phosphate 100mM pH8 et dilué dans le même tampon de façon à obtenir une concentration de 1 mg/mL. A 67 'IL d'anticorps (0,41 nmol) ont été ajoutés 9 éq. de Lumi4(Tb)-NHS (0,27 pl de cryptate Lumi4(Tb) activé sous forme ester de NHS 13,6 mM dans le DMSO anhydre, Cisbio HTRF® Lumi4®-Tb-NHS 5 « cryptate labeling kits »). Après 1h d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate 100 mM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué AC74-Lumi4(Tb) ([Ac] = 1,04 gM ; taux de marquage moyen = 6,4 cryptates par anticorps). Marquage par un accepteur (d2) d'un anticorps monoclonal anti-actine, l'anticorps 10 commercial AC-40 (référence Sigma # A 3853) A 67 pl. d'anticorps (0,41 nmol) ont été ajoutés 5 éq. de d2-NHS (0,24 pL de d2 activé sous forme ester de NHS 8,6 mM dans le DMSO anhydre, Cisbio HTRF® d2 « dye labeling kits »). Après 1h d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate 100mM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué AC40-d2 15 ([Ac] = 1,26 gM ; taux de marquage moyen = 2 molécules de d2 par anticorps). Marquage par un accepteur Alexa-488 de l'anticorps monoclonal Anti-Actine, Clone AC-40 (référence Sigma # A 3853) A 74 pL d'anticorps 1mg/mL (0,5 nmol) dans du tampon 100 mM phosphate pH8, ont été ajoutés 17 éq. d'Alexa-488 activé sous forme ester de NHS (8,5 nmol , 5pL de A488-NHS 1,7 20 mM dans le DMSO). Après 1h d'incubation à 20°C le mélange a été purifié sur une colonne NAP5 équilibrée dans le tampon phosphate 100mM pH7. La fraction exclue contenait l'anticorps marqué AC40-A488 ([Ac] = 1,25 p.M ; taux de marquage moyen = 3 molécules d'Alexa-488 par anticorps). Marquage des anticorps anti-EGFR : 25 Les anticorps anti-EGFR suivants sont disponibles dans le commerce : Ab15(EGFR) (clone H9B4 / Mouse mAb/ NeoMarkers #MS-665), CST#2646 (clone C74B9/ Rabbit mAb / Cell Signaling technology), CST#4267 (clone D38B1 / Rabbit mAb/ Cell Signaling technology), anti-EGFR (clone REGF01 / Mouse mAb / Cisbio).
30 Deux de ces anticorps ont été marqués selon un protocole similaire à celui utilisé pour les anticorps anti-actine, pour obtenir un conjugué donneur Anti-EGFR(A)-lumi4(Tb) et un conjugué accepteur Anti-EGFR(B)-Alexa488. Ces deux conjugués ont été utilisés pour la détection d'EGFR. Les deux anticorps ont été choisis pour leur capacité à générer un signal de TR-FRET en présence d'EGFR recombinant.
3032797 25 Incubation et mesure du signal Les cellules (SKBR3 ou A431) provenant de culture (environ 17 à 20 x 106 cellules à confluence dans un flacon de culture T175) ont été lavées au PBS puis dissociées, transférées dans un tube 5 (50 mL) pour centrifugeuse et centrifugées (400 g / 3 min). Après avoir éliminé le surnageant, le culot obtenu a été lysé dans 3 mL de « Cellular kinase lysis buffer #3 » (Cisbio réf 64KL3FDF) pendant 30 min à 20°C (agitation) puis après transfert en tube eppendorf et centrifugation (15 min à 14 000 g à 4°C) le surnageant (lysat) a été collecté et conservé congelé à -80°C. Une partie du lysat de cellule SKBR3 a été dilué au 1/8 ème en ajoutant de I'EGFR recombinant de 10 façon à obtenir une concentration finale en EGFR de 2nM en mélangeant 200pL d'EGFR 4 nM (prédilué dans du tampon de lyse LB3), 1500_ de LB3 et 50pL de lysat de SKBR3 obtenu comme décrit ci-dessus. La solution d'EGFR recombinant a été préparée à partir d'EGFR OriGene # TP710011 (concentration 0,185 µg/µl). En considérant une masse moléculaire de 134 KDa on a obtenu [EGFR] = 1380 nM pour la solution mère ; on a dilué 2,9 pi de cette solution (qsp 1000 15 pL de LB3) pour obtenir une solution 4 nM. Le lysat résultant a été nommé « SKBR3 + 2nM EGFR ». Chacun des lysats SKBR3, SKBR3 + 2nM EGFR et A431 a été dilué en série au demi dans le tampon de lyse LB3 et 16 pl ont été déposés dans les puits d'une microplaque 384w F-bottom, SV, Hibase, White (GREINER#784075). Des puits « blancs réactifs » ont également été préparés 20 en déposant uniquement le tampon de lyse LB3 dans des puits contigus. Les solutions filles d'anticorps suivantes ont été préparées dans du tampon de détection (Cisbio ref 62SDBRDF). : - Anti-EGFR(A)-lumi4(Tb) 10 nM, - Anti-EGFR(B)- Alexa488 50nM, 25 - Anti-Actine(A)-lumi4(Tb) 15 nM, Anti-Actine(B)- d2 200 nM. A partir de ces solutions filles, les solutions suivantes ont également été préparées : - Mix a-EGFR : Anti-EGFR(A)-lumi4(Tb) 5 nM / Anti-EGFR(B)- Alexa488 25 nM par dilution au demi dans du tampon de détection, 30 - Mix a-Actine : Anti-Actine(A)-lumi4(Tb) 7,5 nM / Anti-Actine(B)-d2 100 nM, - Mix a-Actine/a-EGFR pour test "multiplex" : Anti-Actine(A)-lumi4(Tb) 7,5 nM / AntiEGFR(A)-lumi4(Tb) 5 nM / Anti-Actine(B)-d2 100 nM / anti-EGFR(B)-Alexa488 50nM.
3032797 26 Aux 16 pi (tampon ou dilutions de lysats) déjà distribués dans les puits ont été ajoutés 411L d'un mélange d'anticorps choisi parmi : Mix a-EGFR dans les puits dans lesquels EGFR seul a été mesuré, - Mix a-Actine dans les puits dans lesquels l'actine seule a été mesurée, 5 - Mix a-Actine/a-EGFR dans les puits dans lesquels à la fois EGFR et l'actine ont été mesurés. La fluorescence en mode temps-résolu (TRF) a été mesurée sur un appareil ENVISION (Perkin Elmer). Les paramètres suivants ont été rentrés sur la machine: « Hauteur de mesure » = 12 mm ; 10 Paramètres de réglage des longueurs d'onde d'excitation et d'émission ainsi que du délai et de la fenêtre de mesure : 340 665 620 60_400(1) et 340 cache-520 60-400(1) ; Filtres nécessaires : filtre excitation = UV (TRF) 340 [#101]; filtre émission = APC 665 [#205], filtre émission = Cy5 620[#118] ; 2nd filtre émission = Emission 520 [#226]; Réglages des paramètres temporels d'excitation ( nombre de flashes = 100 ) et d'émission 15 (délai 60gs ; durée de la mesure après délai = 400 ps). La luminescence émise par chaque puits a été mesurée et corrigée en soustrayant la valeur du signal mesuré dans le puits « blanc réactifs » (lysat de cellule remplacé par tampon). Une valeur supérieure à zéro indique l'existence de TR-FRET entre le donneur (cryptate lumi4(Tb)) et l'accepteur (d2 ou Alexa 488) et est représentative de la quantité de la protéine mesurée 20 Le signal mesuré à 520nm, qui correspond à un pic d'émission de l'Alexa 488, est représentatif de la quantité d'EGFR et celui mesuré à 665 (pic d'émission de d2) est représentatif de la quantité d'actine. Les expériences ont été effectuées en doublet, et les mesures ont été faites après 3 heures d'incubation ; les signaux obtenus sont présentés dans la table 1 ci-après.
25 Table 1 Mesure EGFR et Actine Mesure EGFR et Actine dans des puits séparés dans le même puit Dilution Signal 520 Signal EGFR/Actine Signal 520 Signal EGFR/Actine Lysat nm (EGFR)* 665nm nm (EGFR)* 665nm (actine)* (actine)* Lysat 1/64 -83 13023 0,00 -757,5 12851 0,00 SKBR3 1/32 -14 22307 0,00 -838,5 21999 0,00 Moyenne 0,00 Moyenne 0,00 Lysat 1/128 1927 9230,5 0,21 1210,5 8512 0,14 SKBR3 + 2 nM EGFR 1/64 3376,5 12703 0,27 3339,5 12853 0,26 Moyenne 0,24 Moyenne 0,20 Lysat 1/128 8484 12775 0,66 7845,5 13331 0,59 A431 1/64 15915 26126 0,61 15268,5 25347,5 0,60 Moyenne 0,64 Moyenne 0,60 *experiences en doublets, la valeur présentée est la moyenne des signaux mesurés, en unité arbitraire de fluorescence.
3032797 28 On observe que - Les ratios EGFR/Actine sont constants (aux incertitudes de mesure près) à différentes dilutions pour un lysat donné ; - Les ratios EGFR/Actine sont identiques (aux incertitudes de mesure près), que les 5 protéines soient mesurées dans des puits différents ou dans le même puits ; - Le ratio EGFR/Actine calculé pour le lysat SKBR3 est nul, ce qui est normal dans la mesure où ces cellules n'expriment pas l'EGFR ; lorsque 2nM d'EGFR ont été ajoutés au lysat, le ratio EGFR/Actine augmente, et cela que les protéines soient mesurées dans des puits différents ou dans le même puits. Le ratio EGFR/actine est encore plus 10 élevé dans le lysat A431; - Les rapports des ratios EGFR/Actine sont identiques (aux incertitudes de mesure près 0,64/0,24=2,7 et 0,60/0,20=3) entre deux lysats donnés. Ces résultats montrent que le procédé selon l'invention permet d'obtenir un signal représentatif de la quantité de protéine d'intérêt (ici EGFR), normalisé par une protéine de 15 référence (ici l'actine), et cela en utilisant une seule longueur d'onde d'excitation et deux longueurs d'onde d'émission. EXEMPLE 2 : Quantification EGFR sur tissu Le procédé selon l'invention a été mis en oeuvre sur des cryosections obtenues à partir de 20 tumeurs de souris, induites par xénogreffe de cellules surexprimant le récepteur EGFR (par exemple Xenogreffe A431 (2 500 000 EGFR/cellule), Heimbrook et al. PNAS 1990 87(12):4697701, ou encore Xenogreffes LS-174T (colorectal, 360 000 EGFR/cellule), SKOV3 (ovaire, 220 000 EGFR/cellule), et HT-29 (colorectal, 44 000 EGFR/cellule) : Milenic et al. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 2008, 23(5): 619-632).
25 Après culture à partir de lignées cellulaires surexprimant EGFR à des niveaux connus et mesurés par FACS quantitatif (Quifikit), les cellules (5 x 106) ont été administrées par injection sous cutanée à des souris femelles athymiques sur leur flanc droit. Les souris portant des tumeurs ont été sacrifiées quand les tumeurs atteignaient un volume supérieur à 1500 mm3. Après sacrifice de l'animal, la tumeur a été excisée, la pièce chirurgicale ainsi obtenue a été 30 congelée immédiatement en la plongeant dans de l'azote liquide, puis conservée à -80°C. Pour la réalisation des cryosections, le support métallique porte-échantillon d'un cryotome a été placé sur de la carboglace pendant 1 min. On a ensuite déposé quelques gouttes d'eau stérile sur le support, puis, sans attendre, déposé la pièce chirurgicale. En se congelant, l'eau a fixé l'échantillon sur le support.
3032797 29 Ensuite l'échantillon congelé a été coupé à l'épaisseur désirée avec le microtome contenu dans le cryostat (-25°C) et les sections encore congelées (cryosections) ont été collectées dans des tubes eppendorf préalablement refroidis dans de la carboglace. L'épaisseur des cryosections était généralement comprise entre 10 p.m et 50 lm. Pour les applications ci-dessous, une 5 épaisseur de 25 pm a été considérée comme optimum en termes de praticité de manipulation. Les cryosections ont été conservées à -80°C jusqu'à l'étape de lyse. Les cryosections de tumeurs xenogreffes (2 coupes de 25 iim) collectées dans un tube eppendorf ont été lysées dans du tampon « Cellular kinase lysis buffer #3 » (Cisbio ref 64KL3FDF) pendant 30 min à 4°C (sous agitation) puis les tubes ont été soumis à une 10 sonication (Sonicateur Branson 5s à 20% de puissance / 4°C) après centrifugation (15 min 4°C à 14 000 g), et les surnageants (lysat) ont été collectés et conservés congelés à -80°C. De manière similaire à l'exemple 1, les lysats ont été dilués en série au 1/8 , 1/16 et 1/32 dans du tampon de lyse et distribués (16 IL) dans les puits d'une plaque de microtitration (384 x 20 pl..) et 4µL d'une solution d'un mélange d'anticorps anti-EGFR-Lumi4(Tb), d'un anticorps anti- 15 actine-Lumi4(Tb) d'un anticorps anti-EGFR-Alexa488 et d'un anti-Actine-d2 ont été ajoutés aux lysats ainsi qu'à des puits servant de négatifs ne contenant que du tampon de lyse. Les anticorps ont été pré-dilués dans du tampon de détection (Cisbio réf 62SDBRDF) de façon à obtenir une concentration finale dans le puits de 0,5 nM de chacun des anticorps-Lumi4(Tb) et de 5 nM de chacun des anticorps-accepteur (Alexa488 et d2). Après 3h d'incubation à 20°C une 20 lecture de fluorescence en mode TRF a été effectuée (vide supra). Le ratio E520/E665 a été mesuré pour les puits correspondant aux lysats de diverses lignées ; il a été observé que le ratio E520/E665 était globalement constant pour des dilutions différentes de la même lignée, et que le rapport des ratios E520/E665 correspondant à des lignées exprimant des niveaux différents d'EGFR était dans des proportions semblables au rapport des expressions. 25
Claims (23)
- REVENDICATIONS1. Procédé de quantification d'une protéine d'intérêt présente dans un échantillon biologique contenant des cellules et une protéine de référence, ledit échantillon étant lui- même contenu dans un milieu de mesure, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) homogénéisation de l'échantillon sous forme de lysat cellulaire ; b) distribution du lysat cellulaire dans un seul contenant ou bien dans deux contenants différents ; c) introduction dans le milieu de mesure d'un premier et d'un deuxième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à la protéine d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués par un premier composé donneur et un premier composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ; d) introduction dans le milieu de mesure d'un troisième et d'un quatrième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique de la protéine de référence, ces ligands étant respectivement marqués par un deuxième composé donneur et un deuxième composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET ; e) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du premier composé donneur ; f) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant au pic d'émission du premier composé accepteur ; g) excitation du milieu de mesure dans une bande d'excitation du deuxième composé donneur ; h) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure à la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième composé accepteur; i) calcul du ratio des signaux mesurés aux étapes f) et h), ce ratio étant représentatif de la quantité de protéine d'intérêt présente dans l'échantillon, normalisée par la quantité de protéine de référence; sous réserve que : lorsque l'échantillon est distribué dans un seul contenant, la longueur d'onde correspondant au pic d'émission du deuxième accepteur est différente de celle correspondant au pic d'émission du premier accepteur, et que 3032797 FR 15 51191 lorsque l'échantillon est distribué dans deux contenants, les étapes c), e) et f) sont mises en oeuvre dans le premier contenant, et les étapes d), g) et h) sont mises en oeuvre dans le deuxième contenant. 5
- 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation différentes.
- 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques. 10
- 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, et en ce que l'échantillon est distribué dans deux contenants différents. 15
- 5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur ont des bandes d'excitation identiques, en ce que l'échantillon est distribué dans un seul contenant, et en ce qu'il ne comprend pas d'étape g).
- 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les étapes f) et h) sont mises en 20 oeuvre simultanément.
- 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur sont identiques. 25
- 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la protéine de référence est une protéine de ménage.
- 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la protéine de ménage est choisie parmi 3-active, GAPDH, HSP70, HSP90, la sous-unité alpha de la NaK-ATPase, TERT, 30 une histone et en particulier l'histone H6,
- 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine de référence est une protéine caractéristique d'un état physiopathologique donné. 3032797 FR 15 51191
- 11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine de référence est une protéine caractéristique des cellules cancéreuses.
- 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que 5 l'échantillon biologique est un échantillon de tissu.
- 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé-en ce que l'échantillon biologique est un échantillon de tissu solide ayant été prélevé dans le cadre d'une biopsie et sous forme de coupes FFPE ou de cryosections. 10
- 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est constitué de cellules issues de cultures cellulaires.
- 15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que 15 les premier, deuxième, troisième et quatrième ligands sont cles anticorps.
- 16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés donneurs sont choisis parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye. 20
- 17. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur sont identiques, et en ce qu'ils sont choisis parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium un chélate de terbium ; un cryptate de terbium. 25
- 18. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le premier et le deuxième composé donneur sont différents, et en ce que soit l'un est un chélate ou cryptate d'Europium, et l'autre un chélate ou cryptate de Terbium, soit le premier et le deuxième composé donneur sont des chélates ou cryptates d'Europium, soit le premier et le deuxième composé donneur sont des chélates ou cryptates de Terbium. 30
- 19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les composés accepteurs sont choisis parmi : les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole. 3032797 FR 15 51191
- 20. Procédé selon la revendication 3, caractérisée en ce que le premier et le deuxième donneur sont des cryptates de terbium, en ce que le premier accepteur possède un pic d'émission centré autour de 520 nm et le deuxième accepteur possède un pic d'émission centré autour de 665 nm.
- 21. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le premier accepteur est l'Alexa488, le deuxième accepteur est le fluorophore d2, et le premier et le deuxième donneur sont identiques et sont le cryptate de Terbium Lumi4Tb. 10
- 22. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le premier accepteur est la cyanine Cy7, le deuxième accepteur est le fluorophore d2, et le premier et le deuxième donneur sont identiques et sont le cryptate d'europium trisbipyrdine. 15
- 23. Trousse de réactifs pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un premier et un deuxième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à une protéine d'intérêt, et ces ligands étant respectivement marqués par un premier composé donneur et un premier composé accepteur, 20 tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET; un troisième et d'un quatrième ligand, chacun de ces ligands comportant un domaine de liaison spécifique à une protéine de référence, ces ligands étant respectivement marqués par un deuxième composé donneur et un deuxième composé accepteur, tous deux formant un couple de partenaires de TR-FRET, la 25 longueur d'onde correspondant au pic d'émission de ce deuxième accepteur étant différente de celle correspondant au pic d'émission du premier accepteur ; éventuellement, un composé fluorescent possédant une durée de vie courte et se liant à l'ADN ou aux protéines cellulaires ; éventuellement, des instructions pour normaliser le signal de la protéine d'intérêt 30 par la protéine de référence.
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