WO2017009587A1 - Methode de quantification des proteines - Google Patents

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WO2017009587A1
WO2017009587A1 PCT/FR2016/051837 FR2016051837W WO2017009587A1 WO 2017009587 A1 WO2017009587 A1 WO 2017009587A1 FR 2016051837 W FR2016051837 W FR 2016051837W WO 2017009587 A1 WO2017009587 A1 WO 2017009587A1
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WO
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antibody
cyclin
donor
acceptor
protein
Prior art date
Application number
PCT/FR2016/051837
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English (en)
Inventor
Frédéric BIENVENU
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Universite De Montpellier
Axlr, Satt Du Languedoc Roussillon
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique, Universite De Montpellier, Axlr, Satt Du Languedoc Roussillon, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/542—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with steric inhibition or signal modification, e.g. fluorescent quenching
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4739—Cyclin; Prad 1

Definitions

  • the present invention relates to a method of quantifying proteins, especially proteins having a short life.
  • the progression in the G1 phase of the cell cycle is either stimulated by mitogens or growth factors or blocked by antiproliferative cytokines.
  • a mitogen must stimulate the expression of D-type cyclins (D1, D2 and D3).
  • D D-type cyclins
  • CDK4 and CDK6 cyclin dependent kinases
  • the activity of the complex influences the cycle only during the critical point of the G1 phase, it persists throughout the first cycle and subsequent cycles if the mitogenic stimulation continues.
  • the enzymatic activity drops rapidly because of the particularly labile nature of the D cyclins and the cells in the G1 phase leave the cycle rapidly.
  • Cyclin D1 is overexpressed in many human cancers as a result of gene amplifications or targeted translocations on the D1 locus (Ccndl) of chromosome 11 q 13 (16). Also, the quantification of its expression can be determinant in the context of a prognosis or diagnosis.
  • Cyclin D1 protein is therefore generally carried out by immunological techniques by labeling with an antibody directed against an epitope of the protein.
  • the low half-life of the protein makes its detection, and even more its quantification very difficult.
  • the invention aims to overcome these disadvantages by providing a method of detecting the amount of Cyclin D1 protein that is reliable and reproducible.
  • Another object of the invention is to provide a kit for the implementation of this detection and is easy to use.
  • Yet another object of the invention is to use this quantification for the prognosis of pathologies.
  • the invention relates to the use of a composition
  • a composition comprising: a. a donor antibody coupled to a first luminescent molecule, and b. at least one acceptor antibody coupled to a second luminescent molecule,
  • said donor and acceptor antibodies each specifically recognizing an epitope determined and different from the protein encoded by the CcndI gene, in particular represented by the sequence SEQ ID NO: 1,
  • said first and second luminescent molecules being such that the emission wavelength of the first luminescent molecule corresponds to the excitation wavelength of the second luminescent molecule, for the implementation of a quantitative detection method in vitro of the protein encoded by the Ccndl gene in a sample comprising proteins, said sample not necessarily exhibiting overexpression of said cyclin D1.
  • the invention relates to the use of a composition
  • a composition comprising
  • said first antibody and at least second antibody each specifically recognizing a specific epitope and different from said cyclin D1 protein
  • said first and second luminescent molecules being such that the emission wavelength of the first luminescent molecule corresponds to the excitation wavelength of the second luminescent molecule
  • the present invention is based on the surprising finding made by the inventors that a detection of the protein encoded by the Ccndl gene, that is to say the cyclin D1 protein, can be carried out quantitatively to the using fluorescent antibodies capable of producing or operating an energy transfer between fluorescent molecules or Förster-type resonance energy transfer (or FRET). Due to its sensitivity, this technique proved, by choosing the right antibodies, particularly suitable for detecting even low levels of cyclin D1.
  • the Ccndl gene is represented by the sequence SEQ ID NO: 1, and corresponds to the human sequence
  • the corresponding Cyclin D1 protein is represented by the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the invention also relates to a method for quantifying, in particular in vitro, the cyclin D1 protein encoded by the Ccndl gene, in particular represented by the sequence SEQ ID NO: 1, in a sample comprising proteins, said method comprising the following steps :
  • a donor antibody coupled to a first luminescent molecule i. a donor antibody coupled to a first luminescent molecule, and ii. at least one acceptor antibody coupled to a second luminescent molecule,
  • said donor and acceptor antibodies each specifically recognizing an epitope (determined and) different from said protein encoded by the Ccndl gene
  • said first and second luminescent molecules being such that the emission wavelength of the first luminescent molecule corresponds to the excitation wavelength of the second luminescent molecule
  • the invention relates to the abovementioned method, comprising, following the contacting step a:
  • the method of the invention uses at least one pair of antibodies (that is to say at least two antibodies) directed against the same Cyclin D1 protein, each of the antibodies being coupled to a luminescent molecule.
  • Luminescence can be defined as a light emission (photons) by a luminescent molecule (fluorophore, enzyme, etc.).
  • photoluminescence fluorescence, phosphorescence
  • chemiluminescence whose light emission is consecutive to a chemical reaction
  • bioluminescence which is triggered by an enzymatic reaction.
  • RET energy transfer
  • the first antibody is called a donor antibody because it carries a first luminescent molecule which, after excitation, will transmit its energy.
  • the second luminescent molecule carried by the antibody which will be called acceptor antibody.
  • said donor and acceptor antibodies each specifically recognize an epitope different from said protein encoded by the Ccndl gene, so that they can concomitantly interact with said protein. Indeed, to obtain FRET (or a transfer of energy) it is necessary that the luminescent molecules are close spatially.
  • the donor and acceptor antibodies are capable of interacting with different epitopes, which are localized on the same protein so that the luminescent molecules they carry are especially close.
  • said first and second luminescent molecules are such that the emission wavelength of the first luminescent molecule corresponds to the excitation wavelength of the second luminescent molecule. ".
  • the donor excitation phenomenon follows the process described above but its de-excitation can, under certain conditions, go through a transfer of energy not radiative on the acceptor (and not by the direct emission of a photon).
  • the de-energizing energy of the donor fluorophore is therefore "absorbed" by the acceptor fluorophore which then goes from a ground state to an excited state.
  • the return towards the ground state of the acceptor can be done by an emission of a photon whose wavelength is greater than that of the photon which would have been emitted by the fluorophore donor in the absence of acceptor.
  • the invention relates to a method as defined above, in which the detection and quantification step consists of
  • the duration of detection of the luminescence emitted by the second luminescent molecule may be of greater duration than the duration of exposure of the first luminescent molecule by the source. bright excitatory.
  • the invention relates to the aforementioned method, wherein the donor and acceptor antibodies are selected from the following antibodies: ab1, ab3, SP4 and SC450.
  • the anti-cyclin D1 antibody clone ab1 marketed by Thermofisher Scientific.
  • This antibody corresponds to a mouse monoclonal antibody of mouse type IgG also called clone DCS-6, obtained by immunization of mice with the cyclin protein.
  • Whole human D1 a mouse monoclonal antibody of mouse type IgG also called clone DCS-6, obtained by immunization of mice with the cyclin protein.
  • the anti-cyclin D1 antibody clone ab3 marketed by Thermofisher Scientific. It is a polyclonal rabbit antibody obtained after immunization with the C-terminal part of human Cyclin D1 protein.
  • the anti-cyclin D1 clone SP4 antibody marketed by Life Technologies which recognizes the C-terminal epitope of the human cyclin D1 protein, and directed against the peptide corresponding to positions 250 to 295 of the sequence SEQ ID NO: 2, the peptide corresponding to the following peptide:
  • the anti-cyclin D1 clone 72-13G antibody marketed by Santa Cruz Biotechnology Inc under the reference sc450.
  • This antibody is a mouse monoclonal antibody directed against a murine cyclin D1 fusion protein.
  • the method according to the invention uses a donor antibody and at least one acceptor antibody. Also, in view of the four advantageous antibodies mentioned above, the method according to the invention covers the following 28 combinations:
  • One of the advantageous combinations according to the invention is the combination SC450 donor and ab1 + ab3 acceptor.
  • the invention relates to the abovementioned method, in which the first luminescent molecule is a rare earth or lanthanide cryptate, in particular europium cryptate or terbium cryptate.
  • the rare earth cryptates are complexes formed of a macrolide (cryptate) forming a cage trapping a lanthanide atom.
  • R1 and R2 are reactive groups which make it possible to graft cryptate on biomolecules, and especially antibodies.
  • An interesting property of cryptates lies in their ability to collect the photon energy of an excitatory light source and transfer it to the lanthanide cation. This phenomenon is called the antenna effect.
  • the cryptates of lanthanides are particularly interesting because their wavelength is in the ultraviolet (280 to 360 nm), while their emission wavelength is in the green-red ( 450 to 800 nm).
  • lanthanide cryptates are their long fluorescence capacity, that is to say that after excitation, they continue to emit for periods ranging from microseconds to milliseconds, whereas conventional fluorophores emit for a few nanoseconds.
  • the invention relates to the method as defined above, in which the second luminescent molecule is chosen from d2 (small organic molecule of about 1 kDa (marketed by Cisbio), DY647, Cy5, Alexa647 (Alexa Fluor® 647 marketed by Thermo Fisher Scientific), fluorescein and GFP fluorescent proteins.
  • d2 small organic molecule of about 1 kDa (marketed by Cisbio)
  • DY647 small organic molecule of about 1 kDa (marketed by Cisbio)
  • Cy5 Alexa647
  • Alexa Fluor® 647 marketed by Thermo Fisher Scientific
  • the second luminescent molecule is advantageously d2, DY647, Cy5, Alexa647, or any other fluorophore emitting in the red when the first luminescent molecule is europium cryptate. Because of its larger emission spectrum, terbium cryptate can be coupled with a second red-absorbing luminescent molecule (d2, DY647, Cy5, Alexa647), but also in green (fluorescein and GFP fluorescent proteins).
  • d2, DY647, Cy5, Alexa647 a second red-absorbing luminescent molecule
  • green fluorescein and GFP fluorescent proteins
  • the molecule d2 is known from the state of the art, and is described in particular in US7091348 B2.
  • the invention relates to the abovementioned method, wherein said emitted luminescence is detected after at least 60 micro seconds ( ⁇ ) after exposure of the sample to the excitatory light source.
  • rare earth cryptates a fluorescent acceptor with a short lifetime
  • d2, fluorescein, etc. a fluorescent acceptor with a short lifetime
  • the use of rare earth cryptates makes it possible to measure the fluorescence emission of the acceptor in time resolved (integration of the signal after a delay of 50 during 400 ⁇ ). This property thus makes it possible to distinguish the fluorescence of the acceptor committed in a FRET (long life), parasitic fluorescence emitted by the molecules present in biological media and whose fluorescence lifetime is of the order of one nanosecond.
  • the invention relates to the abovementioned method in which the sample is brought into contact with
  • acceptor antibodies at least one of the following acceptor antibodies: ab1, ab3 and SP4.
  • the advantageous combination is SC450 (donor) and ab1 + ab3 (acceptor).
  • the pairs used are the following:
  • - SC450 coupled to terbium cryptate and the acceptor antibody (s) are coupled to d2, DY647, Cy5, Alexa647 or any other luminescent molecule that absorbs in red, but also to fluorescein and GFP fluorescent proteins , or any other luminescent absorbent in the green.
  • Example 1 gives, without limitation, information for implementing said method.
  • the invention furthermore relates to a composition
  • a composition comprising:
  • a donor antibody coupled to a first luminescent molecule, and at least one acceptor antibody coupled to a second luminescent molecule
  • said donor and acceptor antibodies each specifically recognizing an epitope (determined and) different from said protein encoded by the CcndI gene, in particular represented by the sequence SEQ ID NO: 1,
  • said first and second luminescent molecules being such that the emission wavelength of the first luminescent molecule corresponds to the excitation wavelength of the second luminescent molecule
  • Cyclin D1 for use in the prognosis of resistance to chemotherapy of a cancerous tumor, or in the prognosis of development of neurodegenerative diseases, heart disease and human infertility.
  • the inventors have indeed shown that the variation in the level of protein expression of Cyclin D1 had an effect on resistance to chemotherapy, when Cyclin D1 is more expressed by at least 30% compared to Cyclin D1 level. in the same non-cancerous tissue.
  • the inventors have further shown that the variation in the level of protein expression of Cyclin D1 has an effect on the development of neurodegenerative diseases, heart disease and human fertility, when Cyclin D1 is less expressed at least 30% relative to the level of Cyclin D1 in the same healthy tissue.
  • the invention relates to the abovementioned composition, in which the donor and acceptor antibodies are chosen from the following antibodies: ab1, ab3, SP4 and SC450.
  • the invention relates to the abovementioned composition for its aforementioned use, wherein the luminescent molecule coupled to the acceptor antibody is selected from d2, DY647, Cy5, Alexa647, fluorescein and GFP fluorescent proteins.
  • the invention relates to the composition for its use as defined above, in which the luminescent molecule coupled to the donor antibody is a rare earth or lanthanide cryptate, especially the europium cryptate or terbium cryptate.
  • the invention relates to the aforementioned composition for its above-mentioned use, in which the sample is brought into contact with
  • acceptor antibodies at least one of the following acceptor antibodies: ab1, ab3 and SP4.
  • FIG. 1 represents a graph showing the TR-FRET signal (in arbitrary units) of MEF cells immortalized by the T antigen and expressing FLAG-HA labeled Cyclin D1.
  • the black bars correspond to the labeling of the labeled protein, and the white bases correspond to the labeling of the wild-type protein (unlabeled).
  • A. Labeling with anti-FLAG donor antibody and anti-HA acceptor antibody B. Anti-FLAG donor antibody alone, C. Anti-HA donor antibody and anti-FLAG acceptor antibody, and D labeling. .: antibodies anti-HA donor alone. The standard deviation of the measurements is represented (3 experiments per sample).
  • Figures 2A and B compare the FRET and the western blot for the quantification of Cyclin D1.
  • Figure 2B is a western blot corresponding to the same dilutions as Figure 2A. Proteins are labeled with anti Cycline D1 antibody. The arrow represents the labeled Cycline D1, and the two arrowheads represent unlabelled Cyclin D1.
  • Figures 3A and 3B correspond to other examples of dilutions as described in Figures 2.
  • Figure 3B is a western blot corresponding to the same dilutions as Figure 3A. Proteins are labeled with anti Cycline D1 antibody. The arrow represents the labeled Cycline D1, and the two arrowheads represent unlabelled Cyclin D1.
  • FIG. 4 represents a western blot obtained from extracts comprising either C-terminal tagged cyclin D1 or N-terminal labeled cyclin D1, and treated with either an inhibitor of the initiation of the translation (cycloheximide, 1) or with a proteasome inhibitor (MG132; A1 represents labeling with an anti-C-terminal label antibody, A2 represents labeling with an N-terminal label anti-antibody, and B represents an anti-actin labeling used to standardize the deposits.
  • Figures 5A and 5B show the quantitative measurement of cyclin D1 after treatment with cycloheximide.
  • FIG. 5A represents the HTRF signal (arbitrary units) obtained from cells expressing the N-terminal labeled Cyclin D1 protein before treatment (0) and every 15 minutes for 45 min after treatment with cycloheximide.
  • the anti-FLAG antibody is used as a donor and the anti-HA antibody as the acceptor.
  • FIG. 5B represents the signal HTRF (arbitrary units) obtained from cells expressing the C-terminal labeled Cyclin D1 protein before treatment (0) and every 15 minutes for 45 min after treatment with cycloheximide.
  • the anti-FLAG antibody is used as a donor and the anti-HA antibody as the acceptor.
  • Figures 6A and 6B show the quantitative measurement of Cyclin D1 after treatment with MG132.
  • FIG. 6A represents the HTRF signal (arbitrary units) obtained from cells expressing the N-terminal labeled Cyclin D1 protein before treatment (0) and every hour for 3 hours after treatment with MG132.
  • the anti-FLAG antibody is used as a donor and the anti-HA antibody as the acceptor.
  • Figure 6B shows the signal HTRF (arbitrary units) obtained from cells expressing the C-terminal labeled Cyclin D1 protein before treatment (0) and every hour for 3 hours after treatment with MG132.
  • the anti-FLAG antibody is used as a donor and the anti-HA antibody as the acceptor.
  • Figures 7A and 7B show the quantification of cyclin D1 after RNA interference.
  • FIG. 7A is a western blot made from extracts of cells expressing a C-terminal tagged Cyclin D1, untreated (A: non-relevant siRNA), or treated with different siRNAs against Cyclin D1: B: siRNA describes in
  • FIG. 7B represents a graph showing the HTRF signal (arbitrary units) obtained for the same cells as those described in FIG. 7A.
  • Figures 8A and 8B show the application of quantification to Cyclin D1 and Cyclin D1 proteins hyperstable.
  • FIG. 8A is a western blot showing the detection of cyclilin proteins D1: A: Cyclin D1 labeled FLAG-HA and Cyclin D1 T286A; B: Cyclin D1
  • FIG. 8B represents the HTRF signal obtained with the same extracts as in FIG. 8A.
  • FIG. 9 is a graph showing the TR-FRET signal (arbitrary units) obtained with other proteins labeled: A: mCherry FLAG-HA and B: CDK4 V5 -MYC.
  • A the anti-FLAG antibody is used as a donor
  • B the anti V5 antibody is used as a donor.
  • FIG. 10 represents a graph showing the TR-FRET signal (arbitrary units) showing the interaction between Cyclin D1 and CDK4.
  • A Cyclin D1 FLAG-HA and MYC-CDK4-V5
  • B Cyclin D1 unlabeled and MYC-CDK4-V5.
  • a and B the anti FLAG antibody is used as a donor
  • B is the negative control because the donor antibodies have no target (Cyclin D1 without TAG Flag).
  • Figures 11A and 11B show that the HTRF signal can be increased using several acceptors.
  • FIG. 11A is a graph showing the HTRF signal obtained from cells expressing an N-terminal labeled Cyclin D1 for the following different "donor” "acceptor” combinations: A: Anti-FLAG donor + anti-acceptor HA; B: anti-FLAG donor + acceptor ab1; C: Anti-FLAG donor + acceptor ab3; D: anti-FLAG donor + anti-HA and ab1 acceptors; E: anti-FLAG donor + anti-HA and ab3 acceptors; F: anti-FLAG donor + acceptors ab1 and ab3; G: anti-FLAG donor + anti-HA acceptors and ab1 and ab3; H: anti-HA donor + anti-FLAG acceptors; I: anti-HA donor + acceptors ab1; J: anti-HA donor + acceptors ab3; K: anti-HA donor + acceptors anti-FLAG and ab1; L: anti-HA donor + acceptors anti-FLAG and ab3; M: anti-HA donor + acceptors ab1 and ab3, and N
  • FIG. 11B is a graph showing the HTRF signal obtained from cells expressing a C-terminal tagged Cyclin D1 for the following different "donor""acceptor” combinations: A: Anti-FLAG donor + anti-acceptor HA; B: anti-FLAG donor + acceptor ab1; C: Anti-FLAG donor + acceptor ab3; D: anti-FLAG donor + anti-HA and ab1 acceptors; E: anti-FLAG donor + anti-HA and ab3 acceptors; F: anti-FLAG donor + acceptors ab1 and ab3; G: anti-FLAG donor + anti-HA acceptors and ab1 and ab3; H: anti-HA donor + anti-FLAG acceptors; I: anti-HA donor + acceptors ab1; J: anti-HA donor + acceptors ab3; K: anti-HA donor + acceptors anti-FLAG and ab1; L: anti-HA donor + acceptors anti-FLAG and ab3; M: anti-HA donor + acceptors ab1 and ab3, and N
  • FIG. 12A is a western blot measuring the level of expression of A: cyclin D1 labeled in N-terminal or B: labeled in C-terminal.
  • the proteins are derived from MEF Ccndl - / - transfected with the corresponding constructs.
  • the proteins are detected with an anti-HA antibody (1.).
  • the proteins are detected with an anti-actin antibody (2.).
  • FIG. 12B represents the signal HTRF obtained with the same extracts as in FIG. 12A.
  • FIGS. 13A to 13C show the HTRF signals obtained on lines or organs of mice expressing labeled Cyclin D1.
  • FIG. 13A represents the measurement by HTRF of the amount of Cyclin D1 in MEF Ccnd1 + / + lines transformed with RasV12 and a dominant negative of p53, according to successive dilutions of 100% to 10% of Cyclin D1, and according to the following antibody combinations:
  • D anti-HA donor + acceptors anti-FLAG and ab1;
  • E anti-HA donor + acceptors anti-FLAG and ab3;
  • F anti-HA donor + acceptors ab1 and ab3,
  • G anti-HA donor + acceptors anti-FLAG and abi and ab3;
  • FIG. 13B represents the measurement by HTRF of the amount of Cyclin D1 in A: cells in culture, B: the lungs, C: the kidneys, D: the liver, E: the eyes, F: the heart, G: the ovaries, H: the testes, I: the spleen, J: the pancreas, K: the brain.
  • K represents a theoretical regression of the detection as a function of the dilution.
  • the organs are labeled with the combination: anti-FLAG donor and anti-HA acceptor and ab1 and ab3.
  • FIG. 13C corresponds to the comparison of the obtained HTRF (black bars) and theoretical (white bars) measurements on transformed MEF cell lines.
  • the regression is R 2 : 0.9956.
  • FIG. 14 is a western blot showing the expression of wild-type cyclin D1 in mouse organs (A: liver, B: kidneys, C: lungs, D: heart, E: eyes, F: ovaries, G : spleen, H: pancreas and I: brain).
  • the proteins are labeled with an anti-cyclin D1 antibody (1.)
  • the protein load is evaluated with an anti-actin antibody (2) and an anti-tubulin antibody (3).
  • FIG. 16 represents a graph showing the HTRF signals (arbitrary units) of Cyclin D1 in transformed MEF cells, after dilutions indicated on the abscissa.
  • the antibodies used are: SC450 + acceptor ab1 and ab3 donor.
  • the black bars correspond to the measured values, the white bars to the predicted values.
  • FIG. 17 represents a graph showing the HTRF signals (arbitrary units) obtained from mouse testicles Ccnd1 N> a9 / N> a9 14 hours after an intraperitoneal injection of salt (A) or of saline of acid methoxyacetic at 150 mg / kg.
  • the error bars represent the standard deviation on three independent experiments.
  • Figures 18A to 18H correspond to immunofluorescence of Cyclin D1 in the testes.
  • FIG. 18A corresponds to the superposition of the fluorescences obtained by labeling the DNA with DAPI, TRA98 and the HA tag in mouse testes Ccnd1 cta9 / Cta9 .
  • FIG. 18B corresponds to the superposition of the fluorescence obtained by labeling the DNA with DAPI, TRA98 and the HA tag in Ccnd1 + / + mouse testes.
  • FIG. 18C corresponds to the labeling of DNA with DAPI in mouse testes Ccnd1 cta9 / Cta9 .
  • FIG. 18D corresponds to the labeling of DNA with DAPI in Ccnd1 + / + mouse testes.
  • Figure 18E corresponds to the labeling of TRA98 in mouse testes Ccnd1 cta9 / Cta9 .
  • Figure 18F corresponds to the labeling of TRA98 in mouse testes Ccnd1 + / + .
  • FIG. 18G corresponds to the labeling of the HA tag in mouse testes Ccnd1 cta9 / Cta9 .
  • FIG. 19 represents a graph showing the HTRF signals (arbitrary units) obtained from the substantia nigra (B) and the striatum (A) of Ccnd1 Nta9 / Ntae mice 24 hours after an intraperitoneal injection of salt (black bars ) or methamphetamine salt solution (white bars) at 5 mg / kg.
  • the error bars represent the standard deviation on three independent experiments.
  • Figures 20A to 20H correspond to immunofluorescence of cyclin D1 in Substantia nigra pars compacta adult mice.
  • FIG. 20A corresponds to the superposition of the fluorescences obtained by labeling the DNA with DAPI, tyrosine hydroxylase and the HA tag, in the mouse nigra substantia Ccnd1 cta9 / Cta9 .
  • FIG. 20B corresponds to the superposition of the fluorescences obtained by labeling the DNA with DAPI, tyrosine hydroxylase and the HA tag in the mouse nigra substantia Ccnd1 + / + .
  • FIG. 20C corresponds to the labeling of DNA with DAPI in the mouse nigra substantia Ccnd1 cta9 / Cta9 .
  • FIG. 20D corresponds to the labeling of the DNA with DAPI in the mouse nigra substantia Ccnd1 + / + .
  • Figure 20E corresponds to the labeling of tyrosine hydroxylase in the mouse napra Ccnd1 cta9 / Ctae substantia nigra.
  • Figure 20F corresponds to the labeling of tyrosine hydroxylase in mouse substantia nigra Ccnd1 + / + .
  • FIG. 20G corresponds to the labeling of the HA tag, in the mouse nigra substantia Ccnd1 cta9 / Ctae .
  • FIG. 20H corresponds to the labeling of the HA tag in the mouse nigra substantia Ccnd1 + / + .
  • Fig. 21 is a graph showing the amount of Cyclin D1 (arbitrary units) in patients with breast cancer, significantly higher (p ⁇ 0.0001 Student's t-test) in the group consisting of patients who do not respond to chemotherapeutic treatment (A) compared to the lower Cyclin D1 level in the group of patients for whom chemotherapy induced a response to treatment (B).
  • FIG. 22 corresponds to the linear representation of FIG. 21.
  • Example 1 Quantitative detection of cyclin D1.
  • the detection of proteins from tissue samples is generally carried out by Western blotting or immunofluorescence. Although robust, these methods largely depend on the affinity of the antibodies.
  • the Fôrster resonance energy transfer technique in time resolved (HTR-FRET or HTRF) is a powerful technique for studying the spatial proximity of two molecules. This technique is based on the energy transfer of a donor molecule (a lanthanide cryptate, excited at 337 nm) to an acceptor molecule (a fluorophore emitting at 667 nm).
  • the advantage of this technique is to obtain a long-lasting signal which eliminates the background noise corresponding to the autofluorescence of the medium.
  • the inventors came up with the idea that this technique could be transposed no longer to two different proteins capable of interacting together, but to one and the same protein, and in particular to proteins that are poorly expressed and have a very low half-life. .
  • the inventors then became interested in the HTRF technique in the context of the detection of cyclin D1.
  • the inventors took advantage of a murine model expressing at a physiological level in place of the wild-type gene Ccndl, the gene coding for proteins labeled FLAG-HA-CycD1 (Ntag-CycD1) or CycD1.
  • -FLAG-HA Ctag-CycD1
  • CycD1 under the control of the ccnd1 gene promoter, as described in Bienvenu, F., et al., Nature, 2010. 463 (7279): p. 374-8. Since the tagged Cyclin D1 contains both FLAG and HA tags next to each other, it is possible to carry out FRET with a donor anti-HA antibody and an acceptor anti FLAG antibody and vice versa ( Figure 1).
  • the basal signal of unlabeled controls is similar to background noise obtained using donor antibodies in the absence of acceptor antibodies ( Figure 1).
  • the relative quantification of HTRF labeled Cyclin D1 appears more accurate than a western blot, particularly for low levels of protein expression ( Figures 2A and B and Figures 3A and B).
  • the inventors have confirmed by semi-quantification by the HTRF technique that the half-life of the tagged Cyclin D1 protein was relatively as short as that of the wild-type protein after inhibition of transcription in the presence of cycloheximide (FIGS. 4, 5A). , 5B, 6A and 6B).
  • the inventors have also shown that the translation of tagged Cyclin D1 protein was very dynamic in mouse embryonic fibroblasts (MEFs), as they observed a rapid increase in the amount of protein after inhibition of proteasome degradation with MG132 ( Figures 4, 5A, 5B, 6A and 6B).
  • the inventors show that, thanks to the HTRF technique, the quantification of the decrease of the protein after interference with RNA is more accurate ( Figures 7A and 7B).
  • this antibody ab3 can be used for the HTRF reaction without any non-specific signal interfering with the quantification of cyclin D1 in the transformed MEFs, which results in a background noise of this antibody, identical to the other controls in lysates of cells invalidated for the cyclin D1 gene.
  • the next step was to seek to detect the weakly abundant Cyclin D1 wild-type protein by the HTRF technique.
  • the HTRF technique By western-blotting from organ lysate prepared with the HTRF protocol (see below), the inventors found that the unlabeled wild-type protein was barely detectable ( Figure 14). Unlike the HTRF approach, the western blot does not allow access to a quantification between the different organs.
  • three specific antibodies were labeled with terbium cryptate (Lumi4Tb) (ab1 or ab3 or SC450 used as a donor), or with d2 (ab1 or ab3 or SC450 as an acceptor) and possible mixtures of antibodies were tested (Figure 15).
  • the combination SC450 (donor) + ab1 and ab3 (acceptors) is the most effective combination to detect wild-type cyclin D1 quantitatively ( Figure 16).
  • Cyclin D1 is described as at the heart of the cell cycle.
  • the inventors have therefore treated the cells with different agents in order to verify whether the dynamics of the protein were impaired.
  • the mice received an intraperitoneal injection of methoxyacetic acid (MAA).
  • MAA methoxyacetic acid
  • HTRF methoxyacetic acid
  • the inventors have found that exposure to MAA leads to a drastic decrease in Cyclin D1 in the testes ( Figure 17 and Figures 18A to 18H).
  • methamphetamine which destroys the dopaminergic cells of substantia nigra (a feature of Parkinson's disease)
  • the amount of Cyclin D1 is greatly decreased ( Figure 19 and Figures 20A to 20H).
  • the HTRF method is a very sensitive and semi-quantitative method of detecting scarce proteins by using a very small number of cells in culture or from post-mitotic tissues.
  • the HTRF technique is very specific since it is not likely that the donor and acceptor antibodies are close in space because of nonspecific recognitions. In fine, the HTRF technique is fast and can be carried out in microtiter plates (for example 384 wells), in one hour. The results of the inventors show that this method makes it possible to increase very significantly the study of low abundance proteins, and of short half-life.
  • Ccnd1 Ntag / Ntag and Ccnd1 Ctag / Ctag mice were described previously in Bienvenu, F., et al., Nature, 2010. 463 (7279): p. 374-8.
  • the C57BL / 6J and 129v genetic backgrounds were obtained by at least three crosses of the progenies with each other.
  • the animals were obtained according to approved procedures (Institute of Functional Genomics, agreement A 34-513) and approved by the regional ethics committee (EAEC-LR-12070 agreement).
  • the mice were raised at the Functional Genomics Institute under 12-hour light conditions at a stable temperature of 22 ⁇ 1 ° C under controlled humidity conditions (55 ⁇ 10%).
  • mice Prior to the experiments, the mice were manipulated as previously described in Ares-Santos, S., et al., Neuropsychopharmacology. 2014, 39 (5): p. 1066-1080.
  • the methamphetamine was dissolved in a saline solution at 0.9% (weight / volume) of NaCl, and injected at a rate of 10 ml / kg.
  • Several doses of methamphetamine (3 doses of 5 mg / kg at 3h intervals) were injected intraperitoneally, the first dose being injected at midday.
  • Control mice were treated with saline alone. The mice were sacrificed 24 hours after treatment, for post-mortem analyzes.
  • mice were anesthetized with pentobarbital (500 mg / kg, ip, Sanofi-Aventis, France), and perfused by transcardiac voice with 4% paraformaldehyde (weight / volume) in 0.1 M saline ( PBS, pH 7.5). Brains and testes were post-fixed in the same solution and stored at 4 ° C. [0148] Immunofluorescence of the brains
  • Sections of three micrometers were obtained with a vibratome (Leica, France) and stored at -20 ° C. in a solution containing 30% (vol / vol) of ethylene glycol, 30% (vol / vol) of glycerol and 0.1 M phosphate buffer until used for immunofluorescence.
  • TBS buffer containing 0.3% Triton X-100 After incubation for 30 min in TBS buffer containing 0.3% Triton X-100, the sections were rinsed three times in TBS and blocked for 1 h in TBS comprising 3% bovine serum albumin (BSA). or 3% donkey serum. The sections were incubated in a solution of 1% BSA, 0.15% Triton X-100 in TBS for 12 to 72 hours with different antibodies directed against mouse tyrosine hydroxylase (TH) (1: 1000, Millipore) or against the HA tag (1: 500, 715500, Life Technologies).
  • TH mouse tyrosine hydroxylase
  • testes were included in paraffin and 5 ⁇ thick sections were made. After rehydration, the primary anti-TRA98 antibody (1: 500 supplied by B. Boizet) or HA (715500, Invitrogen) was used, and the secondary antibodies as mentioned above were used. Confocal sections were analyzed by microscopy (LSM780, Gold Axiolmager Z1-Dr, Zeiss).
  • the MEFs were cultured in Dulbecco's medium (DMEM: 41966-029, Gibco) supplemented with 10% beef serum (Life technology) and 1000U / ml penicillin-streptomycin (P / S) (Gibco). . All cell lines were incubated in an incubator at 37 ° C in an atmosphere comprising 5% CO 2 , and maintained under subconfluent conditions. Whatever the conditions, the MEFs were immortalized with T antigen or transformed with a combination RasV12 and a dominant negative of p53.
  • DMEM Dulbecco's medium
  • P / S penicillin-streptomycin
  • the cells were incubated with cycloheximide (50 g / ml, C7698, Sigma), or MG132 (10 ⁇ l, SI9710, Tebu).
  • the plasmid encoding the T antigen was provided by L. Fajas
  • the plasmid encoding RasV12 / dominantly negative p53 was provided by L. LeCam.
  • the human cyclin D1 (cDNA) complementary DNA was obtained by RT-PCR from skin fibroblast transmitted by Jean-Marc Lemaitre.
  • the mutagenesis was performed using the GeneArt® Site-Directed Mutagenesis system (LifeTechnologies) according to the manufacturer's recommendations.
  • the oligonucleotides used are the following:
  • Oligonucleotide sense GGTCTGGCCTGCGCGCCCACCGACGTG (SEQ ID NO: 4)
  • Oligonucleotide sense CACGTCGGTGGGCGCGCAGGCCAGACC (SEQ ID NO: 5) [0165] Generation of stable cell lines
  • Plat-E cells are seeded in boxes of 10 cm to 50% confluency in DMEM (Gibco) supplemented with fetal bovine serum.
  • the murine ecotropic retroviruses were produced by transfection with JetPE1 of Plat-E cells with 3 ⁇ g of pBabe-puro or MSCV-puro vectors, or with a vector not carrying a resistance gene. Forty-eight hours after transfection, the viral supernatant was removed, filtered (0.45 ⁇ ) and supplemented with polybrene (H9268, Sigma) and used to infect the proliferating recipient cells. Seventy-two hours after infection, the recipient cell medium was replaced and the cells were left in culture for several days in the presence of 2 ⁇ g / ml of puromycin or 150 ⁇ g / ml of hygromycin, until cell death. control (which do not express a resistance gene).
  • siRNAs were administered to the cells with Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent (Life Technologies) according to the manufacturer's instructions.
  • the cells to be transfected were sown at 9:00 in the morning, and transfected at 6 pm on the same day. The next day at 9 am, the cells were harvested for biochemical analyzes.
  • siRNAs used are the following:
  • HA tag HA.11 Clone 16B12, Eurogentec, Gold Anti-HA EPITOPE TAG - 600-401-384, Tebu-bio, or Hemagglutinin (HA) Rabbit Polyclonal Antibody, Life Technology - Cyclin D1 (sc-450, Santacruz Biotechnology or MS-210-PABX (AB1), Fisher Scientific or RB-010-PABX (AB3), Fisher Scientific)
  • Tubulin (T9026, Sigma-Aldrich),
  • peroxidase-coupled IgG Cell signaling
  • chemiluminescent detection enhanced chemiluminescence detection, Millipore
  • ChemiDoc TM XRS + System product Biorad
  • mice organs were washed with 1x PBS at 37 ° C and lysed in HTRF buffer (10mM Tris, 1mM EDTA, 0.05% NP-40) using a cell homogenizer. After centrifugation at 16,000 g for 5 min, the samples were normalized by adjusting to the total amount of DNA (nanodrop, Thermo Scientific) at 500 ng / mL.
  • HTRF buffer 10mM Tris, 1mM EDTA, 0.05% NP-40
  • Cyclin D1 by HTRF was carried out with donor and acceptor antibodies according to the manufacturer's instructions (Cisbio - 0.4 nM for the donor except for SC450 antibody (0.2 nM) and 6 nM as an acceptor) in the linear range of HTRF signal ( in the linearity window of the antibodies), in order to avoid a saturation of the signal (hook effect) and a too weak signal close to the background noise.
  • the donor antibodies are labeled with terbium cryptate (Tb), and the acceptor antibodies are labeled with the fluorophore XL665 or d2.
  • the antibodies used are the following:
  • Cisbio custom labeling of the MS-210-PABX (AB1) antibody, Fisher scientific
  • the mixture of the antibodies is adjusted to a volume of 5 ⁇ l in 1 ⁇ PBS and these 5 ⁇ l are added to 5 ⁇ l of sample to be tested, in a 384-well Greiner black plate. After stirring, and centrifugation, the samples are incubated at 4 ° C overnight in the dark (or 1 h at room temperature (19-25 ° C)).
  • TR-FRET ⁇ (ratio 665/620) sample ⁇ x10 4 - ⁇ (ratio 665/620) noise ⁇ x10 4
  • the background noise corresponds to the cells labeled with the donor antibody alone, or a sample not expressing the target protein. For each measurement, the average of several experiments was used. The data of the figures correspond to the average of several independent experiments +/- the standard deviation, unless otherwise indicated.
  • Example 2 Prognosis of resistance to chemotherapy.
  • FIG. 21 An analysis of data on a cohort of 177 patients, shows that a high cyclin D1 level is strongly correlated with a poor prognosis of total response to chemotherapy used in breast cancer.
  • Figures 21 and 22 illustrate the deleterious impact of Cyclin D1 on the survival of cancer cells exposed to chemotherapy. Also, the amount of Cyclin D1 makes it possible to pose a prognosis of resistance to chemotherapeutic treatments.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant au moins deux anticorps couplés à des molécules fluorescentes pour la détection quantitative de la protéine codée par le gène Ccnd1 dans un échantillon.

Description

Méthode de quantification des protéines
[0001] La présente invention concerne une méthode de quantification de protéines, notamment de protéines présentant une durée de vie courte.
[0002] La progression dans la phase G1 du cycle cellulaire est soit stimulée par des mitogènes ou facteurs de croissance soit bloquée par des cytokines antiprolifératives. Pour permettre l'entrée de la cellule dans le cycle cellulaire depuis la phase G0, un mitogène doit stimuler l'expression des cyclines de type D (D1 , D2 et D3). Ces cyclines vont s'assembler, toujours sous stimulation mitogénique, avec des kinases dépendantes des cyclines D (CDK4 et CDK6), pour former un holoenzyme cataboliquement actif dès le milieu de la phase G1 avec un maximum atteint lors de la transition de G1 à S (12). Bien que l'activité du complexe n'influence le cycle que pendant le point critique de la phase G1 , elle persiste tout au long du premier cycle et des cycles suivants si la stimulation mitogénique continue. Par contre, en l'absence de stimulation mitogénique, l'activité enzymatique chute rapidement à cause de la nature particulièrement labile des cyclines D et les cellules en phase G1 sortent rapidement du cycle.
[0003] La Cycline D1 est surexprimée dans beaucoup de cancers humains comme résultat d'amplifications de gènes ou de translocations ciblées sur le locus D1 (Ccndl) du chromosome 11 q 13 (16). Aussi, la quantification de son expression peut être déterminante dans le cadre d'un pronostic ou un diagnostic.
[0004] Toutefois, la demie vie de la Cycline D1 est faible, environ 20 minutes, et sa détection quantitative n'est donc pas aisée.
[0005] La détection de la protéine Cycline D1 est donc généralement réalisée par des techniques immunologiques par marquage à l'aide d'un anticorps dirigé contre un épitope de la protéine. Cependant, comme cela a été mentionné ci-dessus, la faible demie vie de la protéine rend sa détection, et encore plus sa quantification très difficile. En outre, comme il peut ne pas exister de colinéarité entre l'expression génique et la traduction protéique, il n'est pas avantageux de réaliser la mesure de l'expression de la Cycline D1 par biologie moléculaire de l'ADN ou de l'ARN.
[0006] Il existe donc un besoin de fournir un mode de quantification de la protéine Cycline D1.
[0007] Des techniques d'amélioration de la détection de la Cycline D1 ont déjà été proposées. Par exemple Jain et al. (J Clin Pathol. 2002 Dec; 55(12): 940-945) ont mis au point un système de détection de la Cycline D1 par fluorescence dans les désordres lymphoprolifératifs (DLP-B), en utilisant la technologie de la cytométrie de flux. Toutefois, une telle méthode est facilement applicable aux cellules hématopoïétiques, mais difficile à mettre en œuvre sur des tumeurs solides, du fait de la nécessite de dilacérer la tumeur. En outre, la méthode proposée par Jain et al. est facilement applicable à des cellules surexprimant la Cycline D1 , mais ne parait pas appropriée pour mesurer la quantité de cycline D1 dans des cellules saines ou des des cellules où le niveau de surexpression n'est pas encore suffisant.
[0008] Aussi, le problème de la quantification de la Cycline D1 demeure, notamment lorsque celle-ci n'est pas surexprimée.
[0009] L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients en fournissant une méthode de détection de la quantité de protéine Cycline D1 qui soit fiable et reproductible.
[0010] Un autre but de l'invention est de fournir un kit permettant la mise en œuvre de cette détection et qui soit facile d'utilisation.
[001 1] Encore un autre but de l'invention vise à utiliser cette quantification pour le pronostic de pathologies.
[0012] Aussi l'invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant : a. un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et b. au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule luminescente,
lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement un épitope déterminé et différent de la protéine codée par le gène Ccndl, notamment représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ,
lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente, pour la mise en œuvre d'une méthode de détection quantitative in vitro de la protéine codée par le gène Ccndl dans un échantillon comprenant des protéines, ledit échantillon ne présentant pas forcément de surexpression de ladite cycline D1.
[0013] En d'autres termes, l'invention concerne l'utilisation d'une composition comprenant
- un premier anticorps couplé à une première molécule luminescente donneuse, et
- au moins un second anticorps couplé à une deuxième molécule luminescente acceptrice,
lesdits premier anticorps et au moins second anticorps reconnaissant chacun spécifiquement un épitope déterminé et différent de ladite protéine Cycline D1 ,
lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente,
pour la mise en œuvre d'une méthode de détection quantitative in vitro de la protéine Cycline D1 codée par le gène Ccndl dans un échantillon comprenant des protéines.
[0014] La présente invention est basée sur la constatation surprenante faite par les inventeurs qu'une détection de la protéine codée par le gène Ccndl, c'est-à-dire la protéine Cycline D1 , peut être réalisé de manière quantitative à l'aide d'anticorps fluorescents capables de réaliser ou d'opérer un transfert d'énergie entre molécules fluorescentes ou transfert d'énergie par résonance de type Fôrster (ou FRET en anglais). De par sa sensibilité, cette technique s'est avéré, en choisissant les bons anticorps, particulièrement appropriée pour détecter même des taux faibles de cycline D1 .
[0015] En effet, les inventeurs ont montré que si l'on utilise deux anticorps dirigés contre la Cycline D1 et qui sont susceptible de permettre le FRET, il est possible de quantifier la quantité de protéine Cycline D1 de manière fiable, spécifique et reproductible.
[0016] Dans l'invention on parlera uniformément d'anticorps donneur et d'anticorps accepteur couplé à une molécule luminescente ou d'anticorps accepteur couplé à une molécule luminescente pour désigner un anticorps couplé à une molécule luminescente donneuse, et anticorps couplé à une molécule luminescente acceptrice.
[0017] Dans l'invention le gène Ccndl est représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 , et correspond à la séquence humaine, et la protéine Cycline D1 correspondante est représentée par la séquence SEQ ID NO : 2.
[0018] L'invention concerne également une méthode de quantification, notamment in vitro, de la protéine Cycline D1 codée par le gène Ccndl, notamment représentée par la séquence SEQ ID NO : 1 , dans un échantillon comprenant des protéines, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
a. une étape de mise en contact dudit échantillon avec
i. un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et ii. au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule luminescente,
lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement un épitope (déterminé et) différent de ladite protéine codée par le gène Ccndl,
lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente,
et
b. une étape de détection et de quantification de ladite protéine Cycline D1.
[0019] De manière avantageuse, l'invention concerne la méthode susmentionnée, comprenant, à la suite de l'étape a de mise en contact :
- une étape d'exposition à une source lumineuse de longueur d'onde correspondant à la longueur d'onde d'excitation de la première molécule luminescente, et
- une étape de détection et de quantification de de ladite protéine codée par le gène Ccndl en mesurant la luminescence émise par la seconde molécule luminescente.
[0020] Comme indiqué ci-dessus, la méthode de l'invention utilise au moins un couple d'anticorps (c'est-à-dire au moins deux anticorps) dirigés contre la même protéine Cycline D1 , chacun des anticorps étant couplé à une molécule luminescente. La luminescence peut se définir comme une émission de lumière (photons) par une molécule luminescente (fluorophore, enzyme, etc.). Parmi les phénomènes de luminescence, on distingue la photoluminescence (fluorescence, phosphorescence) qui est consécutive à une excitation lumineuse, la chimioluminescence dont l'émission de lumière est consécutive à une réaction chimique et la bioluminescence qui est déclenché par une réaction enzymatique.
[0021] Lorsque deux molécules luminescentes (appelées respectivement le donneur et l'accepteur d'énergie) sont à proximité, il peut se produire un transfert d'énergie (RET) du donneur vers l'accepteur. Ce phénomène se traduit par l'extinction totale de la luminescence (fluorescence, bioluminescence, chimioluminescence) du donneur et par l'apparition d'une émission de fluorescence de l'accepteur. Ce transfert d'énergie s'effectue sans émission de lumière.
[0022] Pour cette raison, et afin de réaliser un transfert d'énergie entre la première molécule luminescente et la seconde molécule luminescente, le premier anticorps est appelé un anticorps donneur car il porte une première molécule luminescente qui, après excitation, transmettra son énergie à la seconde molécule luminescente portée par l'anticorps que l'on appellera anticorps accepteur.
[0023] Il est avantageux dans le cadre de la méthode de l'invention que lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissent chacun spécifiquement un épitope différent de ladite protéine codée par le gène Ccndl, afin qu'ils puissent concomitamment interagir avec ladite protéine. En effet, pour obtenir du FRET (ou un transfert d'énergie) il est nécessaire que les molécules luminescentes soient proches spatialement.
[0024] Aussi, de manière avantageuse, les anticorps donneur et accepteur sont capables d'interagir avec des épitopes différents, qui sont localisés sur la même protéine de sorte que les molécules luminescentes qu'ils portent soient spécialement proches.
[0025] Dans l'invention, il est précisé que « lesdites première et deuxième molécules luminescentes sont telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente ». Cela signifie qu'en présence de deux molécules luminescentes (notamment des fluorophores) donneuse - accepteuse d'énergie, le phénomène d'excitation du donneur suit le processus décrit précédemment mais sa désexcitation peut, sous certaines conditions, passer par un transfert d'énergie non radiatif sur l'accepteur (et non par l'émission directe d'un photon). L'énergie de désexcitation du fluorophore donneur est donc « absorbée » par le fluorophore accepteur qui passe alors d'un état fondamental à un état excité. Le retour vers l'état fondamental de l'accepteur peut se faire par une émission d'un photon dont la longueur d'onde est plus grande que celle du photon qui aurait été émis par le fluorophore donneur en absence d'accepteur.
[0026] Avantageusement, l'invention concerne une méthode telle que définie ci- dessus, dans laquelle l'étape de détection et de quantification consiste en
- une première sous-étape d'exposition de l'échantillon à une source lumineuse excitatrice de longueur d'onde correspondant à la longueur d'onde d'absorption de la molécule fluorescente couplée audit anticorps donneur pendant une durée déterminée, et
- une seconde étape de détection de la luminescence émise après l'extinction de la source lumineuse excitatrice.
[0027] Comme on le verra ci-après, il peut être avantageux que la durée de détection de la luminescence émise par la seconde molécule luminescente soit d'une durée plus importante que la durée d'exposition de la première molécule luminescente par la source lumineuse excitatrice.
[0028] Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne la méthode susmentionnée, dans laquelle les anticorps donneur et accepteur sont choisis parmi les anticorps suivants : ab1 , ab3, SP4 et SC450.
[0029] Les anticorps avantageux de l'invention sont
- l'anticorps anti Cycline D1 clone ab1 , commercialisé par Thermofisher Scientific. Cet anticorps correspond à un anticorps monoclonal de souris de type lgG de souris aussi appelé clone DCS-6, obtenu par immunisation de souris avec la protéine Cycline D1 humaine entière,
- l'anticorps anti Cycline D1 clone ab3, commercialisé par Thermofisher Scientific. Il s'agit d'un anticorps polyclonal de lapin obtenu après immunisation avec la partie C- terminale de la protéine Cycline D1 humaine.
- l'anticorps anti Cycline D1 clone SP4, commercialisé par Life Technologies qui reconnaît l'épitope C-terminal de la protéine Cycline D1 humaine, et dirigé contre le peptide correspondant aux positions 250 à 295 de la séquence SEQ ID NO : 2, le peptide correspondant au peptide suivant :
QIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI (SEQ ID NO : 3), et
- l'anticorps anti Cycline D1 clone 72-13G, commercialisé par Santa Cruz Biotechnology Inc sous la référence sc450. Cet anticorps est anticorps monoclonal de souris dirigé contre une protéine de fusion Cycline D1 murine.
[0030] Comme cela a été mentionné ci-dessus, la méthode selon l'invention utilise un anticorps donneur et au moins un anticorps accepteur. Aussi, au vu des quatre anticorps avantageux susmentionnés, la méthode selon l'invention couvre les différentes 28 combinaisons suivantes :
Figure imgf000007_0001
Donneur Accepteur
ab1
ab3
SP4
ab1
+ab3
sc450 ab1
+SP4
ab3+
SP4
ab1
+ab3
+SP4 [0031] Une des combinaisons avantageuses selon l'invention est la combinaison SC450 donneur et ab1 +ab3 accepteur.
[0032] Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne la méthode susmentionnée, dans laquelle la première molécule luminescente est un cryptate de terre rare ou de lanthanide, notamment le cryptate d'europium ou le cryptate de terbium.
[0033] Dans le cadre du transfert d'énergie entre deux molécules luminescentes, ce qui est important c'est de disposer de molécules dont le spectre d'excitation soit le moins chevauchant avec son spectre d'émission. En d'autres termes, il est important pour une même molécule luminescente que le spectre d'émission et le spectre d'excitation soit le moins chevauchant possible, de sorte que la longueur d'onde d'excitation ne puisse pas correspondre à la longueur d'onde d'excitation d'une seconde molécule luminescente qui devrait être activée par transfert d'énergie Dans le cas de chevauchement, il y aura un manque de spécificité spectrale qui sera à l'origine de bruit de fond important ce qui diminuera largement la sensibilité de la quantification.
[0034] Le développement de molécules luminescentes avec des propriétés singulières a permis d'améliorer considérablement la sélectivité spectrale des couples de fluorophores organiques. Les propriétés de ces fluorophores permettent d'effectuer des mesures de FRET dans des intervalles de temps longs (de plusieurs microsecondes à la milliseconde contre quelques nanosecondes pour des fluorophores classiques). C'est pourquoi on utilise le terme de temps résolu (Time - Resolved, TR) ou sélectivité temporelle pour les techniques de RET utilisant ces molécules.
[0035] Les cryptâtes de terre rare sont des complexes formés d'un macrolide (cryptate) formant une cage piégeant un atome de lanthanide.
[0036 Un exemple de lanthanide est illustré par la formule I suivante :
Figure imgf000008_0001
où R1 et R2 sont des groupements réactifs qui permettent de greffer le cryptate sur des biomolécules, et notamment les anticorps.
[0037] Une propriété intéressant des cryptâtes réside dans leur capacité à collecter l'énergie des photons d'une source lumineuse excitatrice et de la transférer sur le cation lanthanide. Ce phénomène est appelé l'effet antenne.
[0038] En outre, les cryptâtes de lanthanides sont particulièrement intéressant car leur longueur d'onde se trouve dans l'ultraviolet (280 à 360 nm), tandis que leur longueur d'onde d'émission se trouve dans le vert-rouge (450 à 800 nm).
[0039] Encore un autre avantage des cryptâtes de lanthanides est leur capacité de fluorescence longue, c'est-à-dire qu'après excitation, ils continuent d'émettre pendant des durées variant de microsecondes à des millisecondes, alors que les fluorophores classiques émettent pendant quelques nanosecondes.
[0040] Avantageusement, l'invention concerne la méthode telle que définie ci- dessus, dans laquelle la deuxième molécule luminescente est choisie parmi d2 (petite molécule organique d'environ 1 kDa (commercialisée par Cisbio), DY647, le Cy5, l'Alexa647 (Alexa Fluor® 647 commercialisé par Thermo Fisher Scientific), la fluorescéine et les protéines fluorescentes GFP.
[0041] Plus particulièrement, la seconde molécule luminescente est avantageusement d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647, ou tout autre fluorophore émettant dans le rouge lorsque la première molécule luminescente est le cryptate d'europium. Du fait de son spectre d'émission plus étendu, le cryptate de terbium peut être couplé avec une seconde molécule luminescente absorbant dans le rouge (d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647), mais également dans le vert (la fluorescéine et les protéines fluorescentes GFP). Ces listes ne sont pas limitatives, et l'homme du métier peut, avec ses connaissances générales, déterminer les différentes première et deuxième molécules luminescentes à combiner pour obtenir un transfert d'énergie.
[0042] La molécule d2 est connue de l'état de la technique, et est notamment décrite dans le brevet US7091348 B2.
[0043] Avantageusement, l'invention concerne la méthode susmentionnée, dans laquelle ladite luminescence émise est détectée après au moins 60 micro secondes (μβ) après l'exposition de l'échantillon à la source lumineuse excitatrice.
[0044] Lors d'un transfert d'énergie entre un donneur possédant une durée de vie de fluorescence longue (cryptâtes de terres rares) et un accepteur fluorescent avec une durée de vie courte (d2, fluorescéine, etc.), ce dernier émettra un signal de fluorescence présentant une durée de vie apparente similaire à celle du donneur. Ainsi, l'utilisation des cryptâtes de terres rares permet de mesurer l'émission de fluorescence de l'accepteur en temps résolu (intégration du signal après un délai de 50 pendant 400 μβ). Cette propriété permet ainsi de distinguer la fluorescence de l'accepteur engagé dans un FRET (durée de vie longue), des fluorescences parasites émises par les molécules présentes dans les milieux biologiques et dont la durée de vie de fluorescence est de l'ordre de la nanoseconde.
[0045] De manière avantageuse, l'invention concerne la méthode susmentionnée dans laquelle l'échantillon est mis en contact avec
- l'anticorps donneur SC450, et
- l'un au moins des anticorps accepteurs suivants : ab1 , ab3 et SP4.
[0046] Comme mentionné ci-dessus, la combinaison avantageuse est SC450 (donneur) et ab1 +ab3 (accepteur).
[0047] De manière avantageuse, les couples utilisés sont les suivants :
- SC450 couplé au cryptate d'europium, et le ou les anticorps accepteurs sont couplés au d2, au DY647, au Cy5, à l'Alexa647 ou à toute autre molécule luminescente absorbant dans le rouge,
- SC450 couplé au cryptate de terbium, et le ou les anticorps accepteurs sont couplés au d2, au DY647, au Cy5, à l'Alexa647 ou à toute autre molécule luminescente absorbant dans le rouge, mais aussi à la fluorescéine et aux protéines fluorescentes GFP, ou à toute autre luminescente absorbant dans le vert.
[0048] Les conditions expérimentales pour réaliser la méthode de l'invention, c'est-à-dire : la quantité d'anticorps utilisés, les marquages, l'exposition à la lumière excitatrice, les temps de détection, etc .. sont à la portée de l'homme du métier car il s'agit d'expériences de routines. L'exemple 1 ci-après donne, sans être limitatif, des informations pour mettre en œuvre ladite méthode.
[0049] L'invention concerne en outre une composition comprenant :
- un anticorps donneur couplé à une première molécule luminescente, et au moins un anticorps accepteur couplé à une deuxième molécule luminescente,
lesdits anticorps donneur et accepteur reconnaissant chacun spécifiquement un épitope (déterminé et) différent de ladite protéine codée par le gène Ccndl, notamment représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 ,
lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente,
pour son utilisation dans le cadre du pronostic de résistance à une chimiothérapie d'une tumeur cancéreuse, ou dans le cadre du pronostic de développement de maladies neurodégénératives, les cardiopathies et l'infertilité humaine. [0050] Les inventeurs ont effectivement montré que la variation du niveau d'expression protéique de la Cycline D1 avait un effet sur la résistance aux chimiothérapies, lorsque la Cycline D1 est plus exprimée d'au moins 30% par rapport au niveau de Cycline D1 dans le même tissu non cancéreux.
[0051] Les inventeurs ont en outre montré que la variation du niveau d'expression protéique de la Cycline D1 avait un effet sur de développement de maladies neurodégénératives, les cardiopathies et la fertilité humaine, lorsque la Cycline D1 est moins exprimée d'au moins 30% par rapport au niveau de Cycline D1 dans le même tissu sain.
[0052] Avantageusement, l'invention concerne la composition susmentionnée, dans laquelle les anticorps donneur et accepteur sont choisis parmi les anticorps suivants : ab1 , ab3, SP4 et SC450.
[0053] Avantageusement, l'invention concerne la composition susmentionnée pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle la molécule luminescente couplée à l'anticorps accepteur est choisie parmi d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647, la fluorescéine et les protéines fluorescentes GFP.
[0054] Dans un autre mode de réalisation avantageux, l'invention concerne la composition pour son utilisation telle que définie ci-dessus, dans laquelle la molécule luminescente couplée à l'anticorps donneur est un cryptate de terre rare ou de lanthanide, notamment le cryptate d'europium ou le cryptate de terbium.
[0055] De manière avantageuse, l'invention concerne la composition susmentionnée pour son utilisation susmentionnée, dans laquelle l'échantillon est mis en contact avec
l'anticorps donneur SC450, et
- l'un au moins des anticorps accepteur suivants : ab1 , ab3 et SP4.
[0056] Les combinaisons et définition susmentionnées s'appliquent mutatis mutandis à la méthode de pronostic.
[0057] L'invention sera mieux comprise à la lecture des figures annexées, et de l'exemple qui ne présentent aucun caractère limitatif.
[0058] Légende des Figures.
[0059] La figure 1 représente un graphique montrant le signal TR-FRET (en unités arbitraires) de cellules MEF immortalisées par l'antigène T et exprimant la Cycline D1 étiquetée FLAG-HA. Les barres noires correspondent au marquage de la protéine étiquetée, et les bases blanches correspondent au marquage de la protéine sauvage (non étiquetée)). A. : marquage avec l'anticorps donneur anti-FLAG et anticorps accepteur anti-HA, B. : anticorps donneur anti-FLAG seul, C. : marquage avec l'anticorps donneur anti-HA et anticorps accepteur anti-FLAG, et D. : anticorps donneur anti-HA seul. L'écart-type des mesures est représenté (3 expériences par échantillon).
[0060] Les figures 2 A et B comparent le FRET et le western blot pour la quantification de la Cycline D1.
[0061] La figure 2A est un graphique représentant le signal TR-FRET (en unités arbitraires) obtenu à partir de dilutions en séries d'un échantillon comprenant de la Cycline D1 étiquetée. Les anticorps donneurs et accepteurs sont dirigés contre les étiquettes. Dans l'expérience, la quantité de Cycline D1 étiquetée « perdue lors de la dilution » est remplacée par de la Cycline D1 non étiquetée. La quantité de Cycline D1 reste donc constante. La courbe de régression linéaire est indiquée (R2=0,9979). Les chiffres en abscisse représentent la quantité de Cycline D1 étiquetée en % dans l'échantillon.
[0062] La figure 2B est un western blot correspondant aux mêmes dilutions que la figure 2A. Les protéines sont marquées avec un anticorps anti Cycline D1 . La flèche représente la Cycline D1 étiquetée, et les deux têtes de flèche représentent la Cycline D1 non étiquetée.
[0063] Les figures 3A et 3B correspondent à d'autres exemples de dilutions tels que décrits aux figures 2.
[0064] La figure 3A est un graphique représentant le signal TR-FRET (en unités arbitraires) obtenu à partir de dilutions en séries d'un échantillon comprenant de la Cycline D1 étiquetée. Les anticorps donneurs et accepteurs sont dirigés contre les étiquettes. Dans l'expérience, la quantité de Cycline D1 étiquetée « perdue lors de la dilution » est remplacée par de la Cycline D1 non étiquetée. La quantité de Cycline D1 reste donc constante. La courbe de régression linéaire est indiquée (R2=0,9979). Les chiffres en abscisse représentent la quantité de Cycline D1 étiquetée en % dans l'échantillon.
[0065] La figure 3B est un western blot correspondant aux mêmes dilutions que la figure 3A. Les protéines sont marquées avec un anticorps anti Cycline D1 . La flèche représente la Cycline D1 étiquetée, et les deux têtes de flèche représentent la Cycline D1 non étiquetée.
[0066] La figure 4 représente un western blot obtenu à partir d'extraits comprenant soit de la Cycline D1 étiquetée en C-terminal soit de la Cycline D1 étiquetée en N-terminal, et traité soit avec un inhibiteur de l'initiation de la traduction (cyclohéximide ; 1 .) soit avec un inhibiteur du protéasome (MG132 ; 2.). A1 représente un marquage avec un anticorps anti étiquette C-terminale, A2 représente un marquage avec un anticorps anti étiquette N-terminale, et B représente un marquage anti actine utilisé pour normaliser les dépôts. [0067] Les figures 5A et 5B montrent la mesure quantitative de la Cycline D1 après traitement au cyclohéximide.
[0068] La figure 5A représente le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu à partir de cellules exprimant la protéine Cycline D1 étiquetée en N-terminal avant traitement (0) et toutes les 15 min pendant 45 min après traitement à la cyclohéximide. L'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur et l'anticorps anti HA comme accepteur.
[0069] La figure 5B représente le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu à partir de cellules exprimant la protéine Cycline D1 étiquetée en C-terminal avant traitement (0) et toutes les 15 min pendant 45 min après traitement à la cyclohéximide. L'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur et l'anticorps anti HA comme accepteur.
[0070] Les figures 6A et 6B montrent la mesure quantitative de la Cycline D1 après traitement au MG132.
[0071] La figure 6A représente le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu à partir de cellules exprimant la protéine Cycline D1 étiquetée en N-terminal avant traitement (0) et toutes les heures pendant 3 heures après traitement au MG132. L'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur et l'anticorps anti HA comme accepteur.
[0072] La figure 6B représente le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu à partir de cellules exprimant la protéine Cycline D1 étiquetée en C-terminal avant traitement (0) et toutes les heures pendant 3 heures après traitement au MG132. L'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur et l'anticorps anti HA comme accepteur.
[0073] Les figures 7A et 7B montrent la quantification de la Cycline D1 après interférence à ARN.
[0074] La figure 7A est un western blot réalisé à partir d'extraits de cellules exprimant une Cycline D1 étiquetée en C-terminale, non traitées (A : siRNA non relevant), ou traités avec différents siRNA contre la Cycline D1 : B : siRNA décrit dans
Bienvenu Nature, 2010. 463(7279): p. 374-8, C : SiRNA Life et D : siRNA Qiagen. 1 . représente le marquage avec un anticorps anti Cycline D1 à faible temps d'exposition, et 1.+ le même marquage à un temps d'exposition plus important. 2. Représente le marquage à l'actine, comme contrôle de charge.
[0075] La figure 7B représente un graph montrant le signal HTRF (unités arbitraires) obtenu pour les mêmes cellules que celles décrites dans la figure 7A.
[0076] Les figures 8A et 8B montrent l'application de la quantification à des protéines Cycline D1 et Cycline D1 hyperstable.
[0077] La figure 8 A est un western blot montrant la détection de protéines cyclilnes D1 : A : Cycline D1 étiquetée FLAG-HA et Cycline D1 T286A ; B : Cycline D1
T286A étiquetée FLAG-HA et Cycline D1 ; C : Cycline D1 étiquetée T286A FLAG-HA ;
D : Cycline D1 étiquetée FLAG-HA ; E : cellules sans Cycline D1 (Ccndl-/-). Les extraits sont exposés à un anticorps anti Cycline D1 (1 .) ou avec un anticorps anti actine (2.) en contrôle.
[0078] La figure 8B représente le signal HTRF obtenu avec les mêmes extraits que dans la figure 8A.
[0079] La figure 9 est un graphique montrant le signal TR-FRET (unités arbitraires) obtenu avec d'autres protéines étiquetées : A : mCherry FLAG-HA et B : CDK4 V5 -MYC. En A l'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur, et en B l'anticorps anti V5 est utilisé comme donneur.
[0080] La figure 10 représente un graphique montrant le signal TR-FRET (unités arbitraires) montrant l'interaction entre la Cycline D1 et CDK4. A : Cycline D1 FLAG-HA et MYC-CDK4-V5, et B : Cycline D1 non étiquetée et MYC-CDK4-V5. En A et B l'anticorps anti FLAG est utilisé comme donneur, B correspond au contrôle négatif, car les anticorps donneurs n'ont pas de cible (Cycline D1 sans TAG Flag).
[0081] Les figures 11A et 11 B montrent que le signal HTRF peut être augmenté en utilisant plusieurs accepteurs.
[0082] La figure 11 A représente un graphique montrant le signal HTRF obtenus à partir de cellules exprimant une Cycline D1 étiquetée en N-terminal pour les différentes combinaisons « donneur » « accepteur » suivantes : A : Donneur anti-FLAG + accepteur anti-HA ; B : donneur anti-FLAG + accepteur ab1 ; C : Donneur anti-FLAG + accepteur ab3 ; D : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 ; E : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab3 ; F : donneur anti-FLAG + accepteurs ab1 et ab3 ; G : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 et ab3 ; H : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG ; I : donneur anti-HA + accepteurs ab1 ; J : donneur anti-HA + accepteurs ab3 ; K : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 ; L : donneur anti- HA + accepteurs anti-FLAG et ab3 ; M : donneur anti-HA + accepteurs ab1 et ab3, et N : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 et ab3.
[0083] La figure 11 B représente un graphique montrant le signal HTRF obtenu à partir de cellules exprimant une Cycline D1 étiquetée en C-terminal pour les différentes combinaisons « donneur » « accepteur » suivantes : A : Donneur anti-FLAG + accepteur anti-HA ; B : donneur anti-FLAG + accepteur ab1 ; C : Donneur anti-FLAG + accepteur ab3 ; D : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 ; E : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab3 ; F : donneur anti-FLAG + accepteurs ab1 et ab3 ; G : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 et ab3 ; H : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG ; I : donneur anti-HA + accepteurs ab1 ; J : donneur anti-HA + accepteurs ab3 ; K : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 ; L : donneur anti- HA + accepteurs anti-FLAG et ab3 ; M : donneur anti-HA + accepteurs ab1 et ab3, et N : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 et ab3. [0084] Les figures 12A et 12B comparent la détection par HTRF des cyclines D1 étiquetées en N-terminal ou en C-terminal.
[0085] La figure 12A est un western blot mesurant le niveau d'expression de A : Cycline D1 étiquetée en N-terminal ou B : étiquetée en C-terminal. Les protéines sont issues de MEF Ccndl-/- transfectées avec les constructions correspondantes. Les protéines sont détectées avec un anticorps anti-HA (1.). EN contrôle de charge, les protéines sont détectées avec un anticorps anti-actine (2.).
[0086] La figure 12B représente le signal HTRF obtenu avec les mêmes extraits que dans la figure 12A.
[0087] Les figures 13A à 13C représentent les signaux HTRF obtenus sur des lignées ou des organes de souris exprimant la Cycline D1 étiquetée.
[0088] La figure 13A représente la mesure par HTRF de la quantité de Cycline D1 dans des lignées MEF Ccnd1+/+ transformées avec RasV12 et un dominant négatif de p53, selon des dilutions successives de 100% à 10% de Cycline D1 , et selon les combinaisons d'anticorps suivantes : A : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG ; B : donneur anti-HA + accepteurs ab1 ; C : donneur anti-HA + accepteurs ab3 ; D : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab1 ; E : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et ab3 ; F : donneur anti-HA + accepteurs ab1 et ab3, G : donneur anti-HA + accepteurs anti-FLAG et abi et ab3 ; H : Donneur anti-FLAG + accepteur anti-HA ; I : donneur anti- FLAG + accepteur ab1 ; J : Donneur anti-FLAG + accepteur ab3 ; K : donneur anti- FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 ; L : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab3 ; M : donneur anti-FLAG + accepteurs ab1 et ab3 ; N : donneur anti-FLAG + accepteurs anti-HA et ab1 et ab3.
[0089] La figure 13B représente la mesure par HTRF de la quantité de Cycline D1 dans A : des cellules en culture, B : les poumons, C : les reins, D : le foie, E : les yeux, F : le cœur, G : les ovaires, H : les testicules, I : la rate, J : le pancréas, K : le cerveau. K représente une régression théorique de la détection en fonction de la dilution. Les organes sont marqués avec la combinaison : donneur anti-FLAG et accepteur anti-HA et ab1 et ab3.
[0090] La figure 13 C correspond à la comparaison des mesures HTRF obtenues (barres noires) et théorique (barres blanches) sur des lignées cellules MEF transformées. La régression est de R2 : 0.9956.
[0091] La figure 14 est un western blot montrant l'expression de la Cycline D1 sauvage dans des organes de souris (A : foie, B : reins, C : poumons, D : cœur, E : yeux, F : ovaires, G : rate, H : pancréas et I : cerveau). Les protéines sont marquées avec un anticorps anti-Cycline D1 (1 .) et la charge protéique est évaluée avec un anticorps anti actine (2.) et un anticorps anti tubuline (3.). [0092] La figure 15 représente un graphique montrant les signaux HTRF (unités arbitraires) de la Cycline D1 dans des extraits de cellules MEF Ccnd1+/+ transformées avec les combinaisons d'anticorps suivants : A : donneur ab1 + accepteur ab3, B : donneur Ab1 + accepteur SC450, C : donneur ab1 + accepteur ab 3 et SC450, D : donneur ab3 + accepter ab1 , E : donneur ab3 + accepteur SC450, F : donneur ab3 + accepteur ab1 et SC450, G : donneur SC450 + accepteur ab1 , H : donneur SC450 + accepteur ab3 et I : donneur SC450 et accepteur ab1 et ab3.
[0093] La figure 16 représente un graphique montrant les signaux HTRF (unités arbitraires) de la Cycline D1 dans des cellules MEF transformées, après dilutions indiquées en abscisses. Les anticorps utilisés sont : donneur SC450 + accepteur ab1 et ab3. Les barres noires correspondent aux valeurs mesurées, les barres blanches aux valeurs prédites. La régression est : R2= 0.9943.
[0094] La figure 17 représente un graphique montrant les signaux HTRF (unités arbitraires) obtenus à partir de testicules de souris Ccnd1N>a9/N>a9 14 heures après une injection intrapéritonéale de sel (A) ou de solution saline d'acide méthoxyacétique à 150 mg/kg. Les barres d'erreur représentent l'écart type sur trois expériences indépendantes.
[0095] Les figures 18A à 18H correspondent à des immunofluorescence de la Cycline D1 dans les testicules.
[0096] La figure 18A correspond à la superposition des fluorescences obtenues par marquage de l'ADN au DAPI, de TRA98 et de l'étiquette HA, dans des testicules de souris Ccnd1cta9/Cta9.
[0097] La figure 18B correspond à la superposition des fluorescence obtenues par marquage de l'ADN au DAPI, de TRA98 et de l'étiquette HA, dans des testicules de souris Ccnd1+/+.
[0098] La figure 18C correspond au marquage de l'ADN au DAPI dans des testicules de souris Ccnd1cta9/Cta9.
[0099] La figure 18D correspond au marquage de l'ADN au DAPI dans des testicules de souris Ccnd1+/+.
[0100] La figure 18E correspond au marquage de TRA98 dans des testicules de souris Ccnd1cta9/Cta9.
[0101] La figure 18F correspond au marquage de TRA98 dans des testicules de souris Ccnd1+/+.
[0102] La figure 18G correspond au marquage de l'étiquette HA, dans des testicules de souris Ccnd1cta9/Cta9.
[0103] La figure 18H correspond au marquage de l'étiquette HA, dans des testicules de souris Ccnd1+/+. [0104] La figure 19 représente un graphique montrant les signaux HTRF (unités arbitraires) obtenus à partir de la substantia nigra (B) et du striatum (A) de souris Ccnd1Nta9/Ntae 24 heures après une injection intrapéritonéale de sel (barres noires) ou de solution saline de méthamphétamine (barres blanches) à 5 mg/kg. Les barres d'erreur représentent l'écart type sur trois expériences indépendantes.
[0105] Les figures 20A à 20H correspondent à des immunofluorescence de la Cycline D1 dans Substantia nigra pars compacta de souris adultes.
[0106] La figure 20A correspond à la superposition des fluorescences obtenues par marquage de l'ADN au DAPI, de la tyrosine hydroxylase et de l'étiquette HA, dans la substantia nigra de souris Ccnd1cta9/Cta9.
[0107] La figure 20B correspond à la superposition des fluorescences obtenues par marquage de l'ADN au DAPI, de la tyrosine hydroxylase et de l'étiquette HA, dans la substantia nigra de souris Ccnd1+/+.
[0108] La figure 20C correspond au marquage de l'ADN au DAPI dans la substantia nigra de souris Ccnd1cta9/Cta9.
[0109] La figure 20D correspond au marquage de l'ADN au DAPI dans la substantia nigra de souris Ccnd1+/+.
[01 10] La figure 20E correspond au marquage de la tyrosine hydroxylase dans la substantia nigra de souris Ccnd1cta9/Ctae.
[01 1 1] La figure 20F correspond au marquage de la tyrosine hydroxylase dans la substantia nigra de souris Ccnd1+/+.
[01 12] La figure 20G correspond au marquage de l'étiquette HA, dans la substantia nigra de souris Ccnd1cta9/Ctae.
[01 13] La figure 20H correspond au marquage de l'étiquette HA, dans la substantia nigra de souris Ccnd1+/+.
[01 14] La figure 21 est un graphique montrant la quantité de Cycline D1 (unités arbitraires) chez des patientes atteintes de cancer du sein, significativement plus élevé (p<0,0001 test t de Student) dans le groupe composé des patientes qui ne répondent pas au traitement chimiothérapeutique (A) par rapport au niveau de Cycline D1 plus faible dans le groupe composé des patientes pour lesquelles la chimiothérapie à induit une réponse au traitement (B).
[01 15] La figure 22 correspond à la représentation linéaire de la figure 21.
[01 16] EXEMPLES
[01 17] Exemple 1 : détection quantitative de la Cycline D1.
[01 18] La détection de protéines à partir d'échantillons de tissus est généralement réalisée par western-blot ou par immunofluorescence. Bien que robustes, ces méthodes dépendent largement de l'affinité des anticorps. [01 19] La technique de transfert d'énergie par résonance de type Fôrster en temps résolu (HTR-FRET ou HTRF) est une technique puissante permettant d'étudier la proximité spatiale de deux molécules. Cette technique est basée sur le transfert d'énergie d'une molécule donneuse (un cryptate de lanthanide, excité à 337 nm) vers une molécule acceptrice (un fluorophore émettant à 667 nm).
[0120] L'avantage de cette technique est d'obtenir un signal de longue durée ce qui permet de s'affranchir du bruit de fond correspondant à Γ autofluorescence du milieu.
[0121] Les inventeurs ont eu l'idée que cette technique pourrait être transposée non plus à deux protéines différentes susceptibles d'interagir ensemble, mais à une seule et même protéine, et en particulier aux protéines faiblement exprimées et ayant une demie vie très faible.
[0122] Les inventeurs se sont alors intéressés à la technique HTRF dans le cadre de la détection de la Cycline D1 .
[0123] Résultats
[0124] Dans une première étape, les inventeurs ont tiré avantage d'un modèle murin exprimant à un niveau physiologique à la place du gène sauvage Ccndl , le gène codant pour des protéines étiquetées FLAG-HA-CycD1 (Ntag-CycD1 ) ou CycD1-FLAG- HA (Ctag-CycD1 ), sous contrôle du promoteur du gène ccndl , comme décrit dans Bienvenu, F., et al., Nature, 2010. 463(7279): p. 374-8. Puisque la Cycline D1 étiquetée contient à la fois des étiquettes FLAG et HA l'une à côté de l'autre, il est possible de réaliser du FRET avec un anticorps anti HA donneur et un anticorps anti FLAG accepteur et inversement (Figure 1 ).
[0125] En utilisant les étiquettes, le signal basai des contrôles non étiquetés est similaire au bruit de fond obtenu en utilisant les anticorps donneurs en l'absence d'anticorps accepteur (Figure 1 ). La quantification relative de Cycline D1 étiquetée par HTRF apparaît plus précise qu'un western-blot, en particulier pour les faibles niveaux d'expression de protéines (Figures 2A et B et Figures 3A et B). En conséquence, les inventeurs ont confirmé par semi-quantification par la technique HTRF que la demi-vie de la protéine Cycline D1 étiquetée était relativement aussi courte que celle de la protéine sauvage après inhibition de la transcription en présence de cycloheximide (Figures 4, 5A, 5B, 6A et 6B). Les inventeurs ont également montré que la traduction de la protéine Cycline D1 étiquetée était très dynamique dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), car ils ont observé une rapide augmentation de la quantité de protéine après inhibition de la dégradation par le protéasome avec du MG132 (Figures 4, 5A, 5B, 6A et 6B).
[0126] Dans un autre exemple, les inventeurs montrent que grâce à la technique HTRF, la quantification de la diminution de la protéine après interférence à ARN est plus précise (Figures 7A et 7B).
[0127] Dans les MEF, en utilisant une mutation T286A connue pour stabiliser la Cycline D1 , les inventeurs ont clairement observé une augmentation de la quantité de protéine par HTRF (Figures 8A et 8B). Aussi, les inventeurs concluent que la technique HTRF est une technique de quantification convaincante et fiable comparée au western-blot. Cette technique est applicable avec des étiquettes HA et FLAG, mais également avec des étiquettes V5 et MYC (Figure 9). Si les étiquettes peuvent parfois altérer les interactions avec des partenaires protéiques, ce n'est pas le cas de l'association entre la Cycline D1 et CDK4, associations qui peut elle-même être détectée par HTRF (Figure 10).
[0128] Afin d'accroître la détection de Cycline D1 étiquetée, en augmentant le signal au-dessus du bruit de fond, les inventeurs ont décidé de tester plusieurs anticorps accepteurs (ab1 , ab3) dirigés contre la protéine Cycline D1 elle-même et non plus dirigés contre des étiquettes. Des combinaisons FLAG donneur + ab1 ou ab3 ou HA accepteur ont été utilisées (Figures 11 A et B). Toutefois, selon la position de l'étiquette, les signaux obtenus varient (Figures 12A et 12B). Malgré cela, toutes les combinaisons d'anticorps permettent une détection quantitative, comme cela est montré avec des dilutions en série de lysats d'organes ou de lignées cellulaires (Figures 13A à 13C).
[0129] Pour détecter la Cycline D1 étiquetée, le mélange optimal FLAG (donneur)+ha+ab1 +ab3 (tous trois accepteurs) s'est montré le plus efficace comparé à un western-blot utilisant ab3, qui peut dans certaines conditions présenter dans les cellules invalidées pour le gène de la Cycline D1 , un signal proche de celui attendu pour la Cycline D1 .
[0130] Cependant, du fait de la nécessité de proximité entre le donneur et l'accepteur, cet anticorps ab3 peut être utilisé pour la réaction de HTRF sans qu'aucun signal non-spécifique n'interfère avec la quantification de la Cycline D1 dans les MEF transformées et qui se traduit par un bruit de fond de cet anticorps, identique aux autres contrôles dans des lysats de cellules invalidées pour le gène de la Cycline D1 .
[0131] En ce qui concerne l'anticorps ab1 , et l'anticorps anti FLAG M2, malgré leur faible capacité à détecter par western-blot la protéine Cycline D1 étiquetée en N- terminus, comparé à l'anticorps anti HA et l'anticorps ab3, ils restent capables de détecter de manière significative et quantitative la Cycline D1 . Ces résultats montrent que les anticorps de faible affinité, ou faiblement spécifiques peuvent tout de même être utilisés pour effectuer une quantification par HTRF.
[0132] Ainsi, par HTRF les inventeurs ont obtenu une mesure précise du niveau d'expression de la Cycline D1 étiquetée dans les organes de souris adultes et ont montré que cette technique est plus quantitative que le western-blot. Après normalisation basée sur le contenu en ADN, les inventeurs ont montré que la quantité relative de Cycline D1 étiquetée par cellule murine adulte varie selon les tissus, selon le sexe et éventuellement selon le contexte génétique En outre, les inventeurs ont confirmé que les souris hétérozygotes pour la protéine étiquetée avaient un niveau moins élevé que les souris homozygotes.
[0133] L'étape suivante consistait à rechercher à détecter la protéine sauvage Cycline D1 faiblement abondante par la technique de HTRF. Par western-blot à partir de lysat d'organes préparés avec le protocole HTRF (voir ci-après), les inventeurs ont trouvé que la protéine non étiquetée sauvage était à peine détectable (Figure 14). Contrairement à l'approche HTRF, le western-blot ne permet pas d'accéder à une quantification entre les différents organes. Pour quantifier la Cycline D1 sauvage par HTRF, trois anticorps spécifiques ont été marqués avec un cryptate de terbium (Lumi4Tb) (ab1 ou ab3 ou SC450 utilisés comme donneur), ou avec du d2 (ab1 ou ab3 ou SC450 en tant qu'accepteur), et les mélanges possibles d'anticorps ont été testés (Figure 15). La combinaison SC450 (donneur) + ab1 et ab3 (accepteurs) est la combinaison la plus efficace pour détecter la Cycline D1 sauvage de manière quantitative (Figure 16).
[0134] Grâce à la HTRF, les inventeurs ont pu observer une expression ubiquitaire de la Cycline D1 dans la plupart des organes adultes testés, à des niveaux différents selon les organes En outre il a été confirmé que les souris Ccnd1 +/- avaient un niveau de protéine Cycline D1 inférieur aux souris sauvages.
[0135] La Cycline D1 est décrite comme au cœur du cycle cellulaire. Les inventeurs ont donc traité les cellules à différents agents afin de vérifier si la dynamique de la protéine était altérée. Dans un premier temps, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale d'acide méthoxyacétique (MAA). Par HTRF, les inventeurs ont trouvé que l'exposition au MAA conduit à une diminution drastique de la Cycline D1 dans les testicules (Figure 17 et Figures 18A à 18H). En outre, après traitement à la méthamphétamine, qui détruit les cellules dopaminergiques de la substantia nigra (une des caractéristiques de la maladie de Parkinson), la quantité de Cycline D1 est largement diminuée (Figure 19 et Figures 20A à 20H).
[0136] Conclusion.
[0137] La méthode HTRF est une méthode très sensible et semi-quantitative de détection de protéines peu abondantes en utilisant un très faible nombre de cellules en culture ou à partir de tissus post mitotiques. La technique HTRF est très spécifique puisqu'il n'est pas probable que les anticorps donneurs et accepteurs soient proches dans l'espace du fait de reconnaissances non spécifiques. In fine, la technique HTRF est rapide et peut être mise en œuvre dans des plaques de microtitration (par exemple 384 puits), en une heure. Les résultats des inventeurs montrent que cette méthode permet d'augmenter très significativement l'étude des protéines faiblement abondantes, et de demi-vie courte
[0138] De manière surprenante, la découverte de la présence de Cycline D1 dans les tissus sains par la technique susmentionnée, selon l'invention, suggère une fonction inattendue de cette protéine dans l'homéostasie des organes adultes.
[0139] Matériels et Méthodes
[0140] Souris
[0141] Les souris Ccnd1 Ntag/Ntag et Ccnd1 Ctag/Ctag ont été décrites précédemment dans Bienvenu, F., et al., Nature, 2010. 463(7279): p. 374-8. Les fonds génétiques C57BL/6J et 129v ont été obtenus par au moins trois croisement des descendances entre elles. Les animaux ont été obtenus selon des procédures agréées (Institut de génomique fonctionnelle ; accord A 34-513) et approuvé par le comité régional d'éthique (accord CEEA-LR-12070). Les souris ont été élevées à l'institut de Génomique fonctionnel dans des conditions de luminosité de 12 heures par jour, à température stable de 22 ± 1 °C, dans des conditions d'humidité contrôlées (55 ± 10%).
[0142] Traitement des souris
[0143] Avant les expériences, les souris ont été manipulées comme décrit précédemment dans Ares-Santos, S., et al., Neuropsychopharmacology. 2014, 39(5): p. 1066-80.
[0144] La méthamphétamine a été dissoute dans une solution saline à 0,9% (poids/volume) de NaCI, et injecte à raison de 10mL/Kg. Plusieurs doses de méthamphétamine (3 doses de 5 mg/kg à 3h d'intervalle) ont été injectées par voie intrapéritonéale, la première dose étant injectée le midi. Les souris témoin ont été traitées avec la solution saline seule. Les souris ont été sacrifiées 24h après traitement, pour les analyses post-mortem.
[0145] L'acide méthoxy-acétique 98% (194557-50G, Sigma-AIdrich) a été dissout dans une solution saline à 0,9% (poids/volume) de NaCI, et une simple injection intrapéritonéale (150mg/kg) a été injectée aux mâles. Les souris contrôles ont été traitées avec la solution saline seule. Les souris ont été sacrifiées 14h après traitement, pour les analyses post-mortem.
[0146] Préparation pour l'immunohistochimie
[0147] Les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital (500 mg/kg, i.p., Sanofi-Aventis, France), et perfusées par voix transcardiaque avec 4% de paraformaldéhyde (poids/volume) dans 0,1 M de solution saline (PBS, ph 7,5). Les cerveaux et les testicules ont été post-fixés dans la même solution et stockés à 4°C. [0148] Immunofluorescence des cerveaux
[0149] Des coupes de trois micromètres ont été obtenues avec un vibratome (Leica, France) et stockées à -20°C dans une solution contenant 30% (vol/vol) d'éthylène glycol, 30% (vol/vol) de glycérol et 0, 1 M de tampon phosphate jusqu'à leur utilisation pour l'immunofluorescence. Le coupes ont été traitées comme suit: Jour 1 : Les coupes ont été rincées avec une solution saline TBS (TBS; 0,25 M Tris et 0,5 M NaCI, pH=7.5). Puis les coupes ont été incubées à 80°C dans un tampon citrate à pH 6 content 0,02% de Tween, pendant 30 min et rincées trois fois avec la solution TBS. Après incubation pendant 30 min dans un tampon TBS contant 0,3% de Triton X-100, les coupes ont été rincées trois fois dans du TBS et bloquées pendant 1 h dans du TBS comprenant 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) ou 3% de sérum d'âne. Les coupes ont été incubées dans une solution de 1 % BSA, 0, 15% Triton X-100 dans du TBS pendant 12 à 72 heures avec différents anticorps dirigés contre la tyrosine hydroxylase (TH) de souris (1 :1000, Millipore) ou contre l'étiquette HA (1 :500, 715500, Life technologies). Jour 2 : Les coupes ont été rincées trois fois pendant 10 min dans du TBS et les anticorps secondaires d'âne anti lapin marqués à l'Alexa Fluor® 594 (1 :500, A-21207 Molecular Probes) ou d'âne anti souris marqués à l'Alexa Fluor® 488 ont été incubés pendant 45 min. Les noyaux ont été marqués au 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; 1 :5000). Les coupes ont été rincées deux fois pendant 10 min avec du TBS et deux fois avec un tampon Tris (0.25 M Tris, pH=7.5), avant d'être montées sur lame avec du FluorSave™ (345789, Merck Millipore).
[0150] Les tests d'immunofluorescence des testicules ont été décrits dans Malki, S., et al. EMBO J, 2005. 24(10): p. 1798-809.
[0151] Brièvement, les testicules ont été inclus dans de la paraffine et des coupes de 5 μηη d'épaisseur ont été réalisées. Après réhydratation, l'anticorps primaire anti TRA98 (1 :500 fourni pas B. Boizet) ou HA (715500, Invitrogen) a été utilisé, et les anticorps secondaires comme mentionné ci-dessus ont été utilisés. Les coupes confocales ont été analysées par microscopie (LSM780, or Axiolmager Z1-Dr, Zeiss).
[0152] Cellules
[0153] Cellules de fibroblastes embryonnaires murins (MEF)
[0154] Les MEF Ccndl-/- ont été gracieusement données par Piotr Sicinski.
[0155] Les MEF ont été cultivées dans du milieu de Dulbecco (DMEM ; 41966- 029, Gibco) complété avec 10% de sérum de bœuf (Life technology) et 1000U/mL de pénicilline-streptomycine (P/S) (Gibco). Toutes les lignées cellulaires ont été incubées dans un incubateur à 37°C dans une atmosphère comprenant 5% de C02, et maintenues dans des conditions sub-confluentes. Quelles que soient les conditions, les MEF ont été immortalisées avec l'antigène T ou transformées avec une combinaison RasV12 et un dominant négatif de p53.
[0156] Lorsque cela est indiqué, les cellules ont été incubées avec de le cycloheximide (50 g/mL ; C7698, Sigma), ou du MG132 (10 μΜ ; SI9710, Tebu).
[0157] Constructions rétrovirales
[0158] Plasmides:
[0159] Le plasmide codant l'antigène T a été fourni par L. Fajas, le plasmide codant RasV12/dominant négatif de p53 a été fourni par L. LeCam.
[0160] Toutes les constructions Cycline D1 ont été insérées entre les sites de restriction BamH1-EcoR1 du vecteur rétroviral MSCV transmis par O. Ayrault.
[0161] Toutes les constructions rétrovirales ont été manipulées selon les mesures de sécurité approuvées par l'institut de Génomique fonctionnelle.
[0162] L'ADN complémentaire (cDNA) Cycline D1 humain a été obtenu par RT- PCR à partir de fibroblaste de peau transmis par Jean-Marc Lemaitre.
[0163] Mutagenèse T286A
[0164] La mutagenèse a été réalisée en utilisant le système GeneArt® Site- Directed Mutagenesis (LifeTechnologies) selon les recommandations du fabriquant. Les oligonucléotides utilisés sont les suivants :
Oligonucléotide sens: GGTCTGGCCTGCGCGCCCACCGACGTG (SEQ ID NO : 4)
Oligonucléotide sens: CACGTCGGTGGGCGCGCAGGCCAGACC (SEQ ID NO : 5) [0165] Génération de lignées cellulaires stables
[0166] Les cellules obtenues par infection rétrovirale ont été décrites dans Bienvenu et al., Nature, 2010. 463(7279): p. 374-8. Brièvement, le jour avant l'infection, les cellules Plat-E sont ensemencées dans des boites de 10 cm à 50% de confluence dans du DMEM (Gibco) additionné de sérum fœtal de bovin.
[0167] Les rétrovirus écotropes murins ont été produits par transfection au jetPEl de cellules Plat-E avec 3μg de vecteurs pBabe-puro ou MSCV-puro, ou avec un vecteur ne portant pas de gène de résistance. Quarante-huit heures après la transfection, le surnagent viral a été prélevé, filtré (0,45 μηη) et additionné de polybrene (H9268, Sigma) et utilisé pour infecter les cellules receveuses en prolifération. Soixante-douze heures après l'infection, le milieu de cellules receveuses a été remplacé et les cellules sont laissées en culture pendant plusieurs jours en présence de 2μg/mL de puromycine ou 150μg/mL d'hygromycine, jusqu'à la mort des cellules contrôle (qui n'expriment pas de gène de résistance).
[0168] Transfection des siRNA
[0169] Les siRNA ont été administrés aux cellules avec de la Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent (Life Technologies) selon les instructions du fabriquant. Les cellules à transfecter ont été ensemencées à 9 h le matin, et transfectées à 6 h du soir le même jour. Le jour d'après à 9 h du matin, les cellules ont été récoltées pour les analyses biochimiques.
[0170] Les siRNA utilisés sont les suivants :
siRNA décrit dans Bienvenu Nature, 2010. 463(7279): p. 374-8 5'- CCACAGATGTGAAGTTCATTT-3' ; SEQ ID NO : 6
[0172] les siRNA commercialisés par Life Technologies sous le numéro de référence # 4390771
[0173] Qiagen (5'- CACCAGCUCCUGUGCUGCGTTCGCAGCACAGGAGCUGGUGUU-3' SEQ ID NO : 7
[0174] Western blot et anticorps pour la technique HTRF
[0175] Les western blots ont été réalisés comme décrit dans Bienvenu, F., et al., Nature, 2010. 463(7279): p. 374-8. Les anticorps utilisés sont :
- étiquette HA : HA.11 Clone 16B12, Eurogentec, or Anti-HA EPITOPE TAG - 600-401- 384, Tebu-bio, ou Hemagglutinin (HA) Rabbit Polyclonal Antibody, Life technologie - Cycline D1 (sc-450, Santacruz Biotechnology ou MS-210-PABX (AB1 ), Fisher scientific ou RB-010-PABX (AB3), Fisher scientific)
- Actine (ab6276, Abcam),
- Tubuline (T9026, Sigma-AIdrich),
- Etiquette Flag (F7425, Sigma-AIdrich)
[0176] Comme anticorps secondaires, des IgG couplés à la péroxydase (Cell signaling) ont été utilisés, suivi par une détection chimioluminescente (enhanced chemiluminescence détection ; Millipore) et révélé avec le produit ChemiDoc™ XRS+ System (Biorad).
[0177] HTRF
[0178] Les organes de souris ont été lavés avec du PBS 1 x à 37°C et lysés dans du tampon HTRF (Tris 10mM, EDTA 1 mM, 0.05% NP-40) en utilisant un homogéniseur de cellules. Après centrifugation à 16 000 g pendant 5 min, les échantillons ont été normalisés en ajustant à la quantité totale d'ADN (nanodrop, Thermo Scientific) à 500 ng/mL.
[0179] Grâce à une quantification selon Bradford, le contenu total de protéines a été vérifié pour réaliser une équivalence entre des organes similaires ou les échantillons a tester (par exemple reins Ccnd1 +/+ et reins Ccnd1 +/-). Des échantillons délétés pour les deux allèles de la Cycline D1 ont été testés comme contrôles négatifs et évaluation du bruit de fond (contrôle 1 ). De plus, des échantillons incubés avec l'anticorps donneur seul ont été testés en parallèle (contrôle 2). La comparaison des deux contrôles pour chaque mesure donne des résultats identiques de bruit de fond.
[0180] La détection de la Cycline D1 par HTRF (étiquetée ou non) a été réalisée avec des anticorps donneurs et accepteurs selon les instructions du fabriquant (Cisbio - 0,4 nM pour le donneur sauf pour l'anticorps SC450 (0,2 nM) et 6 nM en tant qu'accepteur) dans la gamme linéaire de signal HTRF (dans la fenêtre de linéarité des anticorps), afin d'éviter une saturation du signal (effet crochet) et un trop faible signal proche du bruit de fond. Les anticorps donneurs sont marqués au cryptate de terbium (Tb), et les anticorps accepteurs sont marqués avec le fluorophore XL665 ou le d2.
[0181] Les anticorps utilisés sont les suivants :
[0182] Anticorps donneurs :
- HA-Tb, 610HATAB, Cisbio
- Flag-Tb, 61 FG2TLB, Cisbio
- HA-XL, 610HAXLB, Cisbio
- AB3-Tb 64CUSTAYE, Cisbio (marquage à façon de l'anticorps RB-010-PABX (AB3), Fisher scientific)
- AB1 -Tb 64CUSTAYE, Cisbio (marquage à façon de l'anticorps MS-210-PABX (AB1 ), Fisher scientific)
- SC-450-Tb 64CUSTAZE, Cisbio (marquage à façon de l'anticorps SC-450, Santa Cruz)
[0183] Anticorps accepteurs :
- Flag-XL, 61 FG2XLB, Cisbio
- AB3-d2 64CUSDAZE, Cisbio (marquage à façon de l'anticorps RB-010-PABX (AB3), Fisher scientific)
- AB1-d2 64CUSDAZE, Cisbio (marquage à façon de l'anticorps MS-210-PABX (AB1 ), Fisher scientific)
- SC-450-d2 64CUSDAZE, Cisbio (marquage à façon de l'anticorps SC-450, Santa Cruz).
[0184] Pour les mesures HTRF, le mélange des anticorps est ajusté à un volume de 5 μΙ dans du PBS 1 x et ces 5 μί sont ajoutés à 5 μί d'échantillon à tester, dans une plaque noire 384 puits Greiner. Après agitation, et centrifugation, les échantillons sont incubés à 4°C toute la nuit à l'abri de la lumière (ou 1 h à température ambiante (de 19 à 25 °C)).
[0185] Le lendemain matin, l'expérience est réalisée à l'aide d'un lecteur de microplaques PHERAstar FS (BMG Labtech) : après excitation avec un laser 337 nm (40 flashs par puits), les émissions de fluorescence sont mesurées à la fois à 620 nm (émission du cryptate de terbium) et a 665 nm (émission de XL665 et de d2). Les fluorescences émises sont collectées pendant 400 μβ (micro secondes) après un temps de latente de 60 s suite aux flashs, afin d'enlever le bruit de fond provenant du milieu, du signal mesuré. [0186] L'intensité de TR-FRET est calculée comme suit
TR-FRET = {(ratio 665/620)échantillon}x104 - {(ratio 665/620)bruit}x104
[0187] Le bruit de fond correspond aux cellules marquées avec l'anticorps donneur seul, ou un échantillon n'exprimant pas la protéine cible. Pour chaque mesure, la moyenne de plusieurs expériences a été utilisée. Les données des figures correspondent à la moyenne de plusieurs expériences indépendantes +/- l'écart type, sauf indications contraires.
[0188] Analyses statistiques
[0189] Les moyennes de deux groupes ont été comparées en utilisant un test t de Student bilatéral.
[0190] Exemple 2 : pronostic de la résistance aux chimiothérapies.
[0191] Une analyse de données sur une cohorte de 177 patientes, montre qu'un taux de Cycline D1 élevé est fortement corrélé avec un mauvais pronostic de réponse totale aux chimiothérapies utilisées dans le cancer du sein. Les figures 21 et 22 illustrent l'impact délétère de la Cycline D1 sur la survie des cellules cancéreuses exposées aux chimiothérapies. Aussi, la quantité de Cycline D1 permet de poser un pronostic de résistance aux traitements chimiothérapeutiques.
[0192] L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier.

Claims

REVENDICATIONS
Utilisation d'une composition comprenant
- un premier anticorps couplé à une première molécule luminescente donneuse, et
- au moins un second anticorps couplé à une deuxième molécule luminescente acceptrice,
lesdits premier anticorps et au moins second anticorps reconnaissant chacun spécifiquement un épitope déterminé et différent de ladite protéine Cycline D1 ,
lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente,
pour la mise en œuvre d'une méthode de détection quantitative in vitro de la protéine Cycline D1 codée par le gène Ccndl dans un échantillon comprenant des protéines.
Méthode de quantification in vitro de la protéine Cycline D1 , notamment représentée par la séquence SEQ ID NO : 1 , dans un échantillon comprenant des protéines, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :
- une étape de mise en contact dudit échantillon avec
- un premier anticorps couplé à une première molécule luminescente donneuse, et
- au moins un second anticorps couplé à une deuxième molécule luminescente acceptrice,
lesdits premier anticorps et au moins second anticorps reconnaissant chacun spécifiquement un épitope déterminé et différent de ladite protéine Cycline D1 ,
lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente,
et
- une étape de détection et de quantification de ladite protéine Cycline D1 , en mesurant la luminescence émise par la deuxième molécule luminescente acceptrice. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle l'étape de détection et de quantification consiste en
- une première sous étape d'exposition de l'échantillon à une source lumineuse excitatrice de longueur d'onde correspondant à la longueur d'onde d'absorption de la molécule fluorescente couplée audit anticorps donneur pendant une durée déterminée, et
- une seconde étape de détection de la luminescence émise après l'extinction de la source lumineuse excitatrice.
Méthode selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle les anticorps donneur et accepteur sont choisis parmi les anticorps suivants :
- ab1 anticorps monoclonal de souris de type lgG2a/K de souris aussi appelé clone DCS-6, obtenu par immunisation de souris avec la protéine Cycline D1 humaine entière,
- ab3 anticorps polyclonal de lapin obtenu après immunisation avec la partie
C-terminale de la protéine Cycline D1 humaine,
- SP4 anticorps reconnaissant le peptide correspondant aux positions 250 à
295 de la séquence SEQ ID NO : 2, et
- SC450 anticorps monoclonal de souris dirigé contre une protéine de fusion
Cycline D1 murine.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, dans laquelle la première molécule luminescente est un cryptate de terre rare ou de lanthanide, notamment le cryptate d'europium ou le cryptate de terbium.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans laquelle la deuxième molécule luminescente est d2, DY647, le Cy5, l'Alexa647, la fluorescéine et les protéines fluorescentes GFP. 7. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, dans laquelle l'échantillon est mis en contact avec l'une quelconques combinaison suivantes : Donneur Accepteur Donneur Accepteur Donneur Accepteur ab3 ab1 ab1
SP4 SP4 ab3
SC450 SC450 SC450 ab3 ab1 ab1 +SP4 +SP4 +ab3 ab1 ab3 ab3 ab1 SP4 ab1
+SC450 +SC450 +SC450
SP4 SP4 ab3 +SC450 +SC450 +SC450 ab3 ab1 ab1
+SP4 +SP4 +ab3
+SC450 +SC450 +SC450
Figure imgf000029_0001
Composition comprenant :
- un premier anticorps couplé à une première molécule luminescente donneuse, et
- au moins un second anticorps couplé à une deuxième molécule luminescente acceptrice,
lesdits premier anticorps et au moins un second anticorps reconnaissant chacun spécifiquement un épitope déterminé et différent de ladite protéine Cycline D1 ,
lesdites première et deuxième molécules luminescentes étant telles que la longueur d'onde d'émission de la première molécule luminescente correspond à la longueur d'onde d'excitation de la deuxième molécule luminescente,
pour son utilisation dans le cadre du pronostic de résistance à une chimiothérapie d'une tumeur cancéreuse, ou dans le cadre du pronostic de développement de maladies neurodégénératives, les cardiopathies et la fertilité humaine.
9. Composition selon la revendication 8, dans laquelle les anticorps donneur et accepteur sont choisis parmi les anticorps suivants : ab1 , ab3, SP4 et SC450.
10. Composition selon la revendication 8 ou 9, ladite composition comprenant l'une quelconque des combinaisons d'anticorps suivantes :
Figure imgf000030_0001
Donneur Accepteur
ab1
ab3
SP4
ab1
+ab3
sc450 ab1
+SP4
ab3+
SP4
ab1
+ab3
+SP4
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1382965A1 (fr) * 2001-04-23 2004-01-21 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Methode d'analyse faisant intervenir une interaction intermoleculaire par rapporteur (marqueur)
US20140242611A1 (en) * 2011-07-06 2014-08-28 Cisbio Bioassays Method for detecting and/or quantifying an analyte at the surface of a cell

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1382965A1 (fr) * 2001-04-23 2004-01-21 Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha Methode d'analyse faisant intervenir une interaction intermoleculaire par rapporteur (marqueur)
US20140242611A1 (en) * 2011-07-06 2014-08-28 Cisbio Bioassays Method for detecting and/or quantifying an analyte at the surface of a cell

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALEXANDRE ZAMPIERI ET AL: "Hyper sensitive protein detection by Tandem-HTRF reveals Cyclin D1 dynamics in adult mouse", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 5, 27 October 2015 (2015-10-27), pages 15739, XP055262841, DOI: 10.1038/srep15739 *
DEGORCE ET AL: "HTRF: A Technology Tailored for Drug Discovery -A Review of Theoretical Aspects and Recent Applications", CURR CHEM GENOMICS, vol. 3, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 22 - 32, XP055128395 *
GAILLARD O ET AL: "[Time-resolved fluorometry: principles and applications in clinical biology].", ANNALES DE BIOLOGIE CLINIQUE 1994, vol. 52, no. 11, 1994, pages 751 - 755, XP008179760, ISSN: 0003-3898 *
MATHIS G ET AL: "HOMOGENEOUS IMMUNOASSAYS USING RARE EARTH CRYPTATES AND TIME RESOLVED FLUORESCENCE : PRINCIPLES AND SPECIFIC ADVANTAGES FOR TUMOR MARKERS", ANTICANCER RESEARCH - INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER RESEARCH AND TREATMENT, INTERNATIONAL INSTITUTE OF ANTICANCER RESEARCH, GR, vol. 17, no. 4B, 1 January 1997 (1997-01-01), pages 3011 - 3014, XP009052489, ISSN: 0250-7005 *
P JAIN ET AL: "Detection of cyclin D1 in B cell lymphoproliferative disorders by flow cytometry", JOURNAL OF CLINICAL PATHOLOGY, vol. 55, no. 12, 1 December 2002 (2002-12-01), GB, pages 940 - 945, XP055263111, ISSN: 0021-9746, DOI: 10.1136/jcp.55.12.940 *

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