EP2817614A1 - Procede de normalisation de la luminescence emise par un milieu de mesure. - Google Patents

Procede de normalisation de la luminescence emise par un milieu de mesure.

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EP2817614A1
EP2817614A1 EP12710984.1A EP12710984A EP2817614A1 EP 2817614 A1 EP2817614 A1 EP 2817614A1 EP 12710984 A EP12710984 A EP 12710984A EP 2817614 A1 EP2817614 A1 EP 2817614A1
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EP
European Patent Office
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fluorescent compound
luminescence
fluorescent
long
excitation
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Withdrawn
Application number
EP12710984.1A
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German (de)
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Inventor
Gérard Mathis
Hervé Bazin
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Cisbio Bioassays SAS
Original Assignee
Cisbio Bioassays SAS
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Publication date
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Definitions

  • step f) if it is present, the luminescence is measured at a wavelength corresponding to a peak emission of the long-lived fluorescent compound.
  • the method according to the invention is implemented on a measuring medium containing a biological sample.
  • biological sample is meant a tissue sample (in particular a tumor sample) or cells derived from a cell culture.
  • an energy accepting compound compatible with the long-lived fluorescent compound is introduced into this middle.
  • the selection of the fluorophore donor / acceptor couple to obtain a FRET signal is within the abilities of those skilled in the art.
  • the excitation spectrum of the acceptor must cover at least part of the emission spectrum of the donor compound, and the transition dipoles of the donor and acceptor compounds must be parallel.
  • Donor-acceptor pairs that can be used to study FRET phenomena are described in particular in Joseph R. Lakowicz's book (Principles of fluorescence spectroscopy, 2 nd edition 338), to which a person skilled in the art can refer.
  • a chelate or a cryptate of terbium or europium that is to say which can be excited between 330 and 350 nm, and which emit after DNA binding either at the wavelengths corresponding to the peaks of emission of these chelates or crypates of terbium or europium, namely in particular around 588 nm and 620 nm (if a chelate or europium cryptate is used) or around 490 nm, 545 nm, 588 nm or 620 nm ( if a terbium chelate or cryptate is employed), or at a wavelength corresponding to a peak emission of the acceptor compound, generally between 450 and 650 nm, most often between 480 and 600 nm.
  • labeling agents are:
  • the invention advantageously takes advantage of the spectroscopic properties of these compounds to discriminate their respective luminescences, even in the case where they are measured at the same wavelength.
  • the luminescence of the long-lived fluorescent compound and that of the labeling agent are indeed measured in different time windows: the inventors have discovered that, unexpectedly, the signal of the fluorescent compound with a duration of long life does not contaminate the signal of the marking agent measured immediately after excitation of the measuring medium.
  • the luminescence of the acceptor compound will be measured at its emission wavelength after a delay of 20 to 200 ps, preferably 40 to 200 ps after excitation of the measuring medium and for a period of 200 to 600 ps, preferably 400 to 600 ps.
  • kits for carrying out the method according to which the luminescence of the marking agent is measured at the same wavelength as that used to measure the luminescence of the acceptor fluorescent compound comprise a set of reagents, including: a fluorescent compound long life;
  • the tumor was excised, the surgical piece thus obtained was frozen immediately by immersing it in liquid nitrogen and then stored at -80 ° C.
  • the metal sample holder of a cryotome was placed on dry ice for 1 min. A few drops of sterile water were then placed on the support and then, without delay, the surgical piece was removed. By freezing, the water fixed the sample on the support.
  • the sample can be included in an OCT gel (Optimal Cutting Temperature Compound) instead of sterile water. Then the frozen sample was cut to the desired thickness with the microtome contained in the cryostat (-25 ° C) and the sections still frozen (cryosections) were collected in eppendorf tubes previously cooled in dry ice.
  • the thickness of the cryosections was generally between 10 m and 50 pm. For the applications below, a thickness of 50 ⁇ was considered optimum in terms of handling convenience.
  • Example 2 Measurement of the Emitting Signal of an Intercalating Agent for Measuring the Quantity of Cells in a Section of a Tissue of Tumor Cells
  • the tube was centrifuged and washed with 3 times 400 ⁇ l of PBS buffer + 0.05% Tween® 20.
  • the pellet formed by the cryosection was taken up in 300 ⁇ l of PBS buffer containing 0.1% BSA and a protease inhibitor ("complete mini" Roche # 1 tablet / 10 ml).
  • the tube was held in ice and sonicated (5s at 20% power with a Branson 450 sonifier with a micro tip probe).
  • H490 represents the signal measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence at 490 nm
  • normalized TRF490 represents the ratio TRF 490 on H490 assigned a suitable multiplier (in this example x 1000) to have an integer of the same order of magnitude as the raw fluorescence levels measured.
  • Table 8
  • TRF time resolved measurements
  • the fluorescence was measured (i) at 490 nm after a delay of 100ps after excitation, and during an integration time of 400 ps; and (ii) at 665 nm after a delay of 60 ⁇ s after excitation, and during an integration time of 400 ⁇ s.
  • fluorescence measurement of Hoechst 33342 in continuous fluorescence the fluorescence was measured at 490 nm without delay after excitation, and during the minimum possible integration time on the apparatus (20 ⁇ s).
  • the TRF signal 545 is representative of the binding of the anti-HER2 antibody (trastuzumab-Lumi4Tb), and therefore of the expression of the R2 receptor.
  • the normalization of this signal by the method according to the invention makes it possible to compare the expression levels of HER2 in different samples: thus, the normalized TRF545 signal appears equivalent in the samples R1 R2 and R2, whereas it was 3 times more important in the sample R2 than in the sample R1 R2 before normalization (TRF545).
  • Example 1 An R1 R2 cryosection prepared in Example 1 was placed in an eppendorf tube in 360 ⁇ l of PBS buffer pH7 containing 0.1% BSA ("protease free” quality) and a protease inhibitor (Roche 1 tablet / 10 ml ) and 40 ⁇ l of a solution of Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 in 2mg / ml DMSO solution) prediluted to 1/100 in pH7 buffer were added. After 10 min of incubation in the dark, the tube was centrifuged and washed with 3 times 400 ⁇ l of PBS buffer + 0.1% BSA.
  • BSA protease inhibitor
  • the fluorescence of the GFP could therefore be measured either at the wavelength of one of the terbium emission lines (490 nm) or at the emission wavelength of the acceptor (520 nm) ( itself excited by FRET from terbium). In both cases the fluorescence emission is proportional to the number of cells (amount of biological material).

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, c) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue, d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, e) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape d), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 ps, cette luminescence correspondant principalement à celle du composé fluorescent à durée de vie longue, f) calcul d'un signal de luminescence normalisé correspondant au ratio : (signal obtenu à l'étape e) / (signal obtenu à l'étape d).

Description

PROCEDE DE NORMALISATION DE LA LUMINESCENCE
EMISE PAR UN MILIEU DE MESURE
Objet de l'invention
L'invention est relative à un procédé amélioré de normalisation de la luminescence émise par un milieu de mesure par rapport à la quantité de cellules contenues dans ce milieu. L'invention concerne également une trousse de réactifs destinée à la mise en œuvre de ce procédé.
Etat de la technique
Les composés fluorescents constituent un outil de choix pour la recherche en biologie dans la mesure où ils permettent, en combinaison avec les équipements capables de détecter leur luminescence, de visualiser les processus biologiques au niveau cellulaire, voire moléculaire, par microscopie ou bien par simple mesure de leur luminescence à l'aide d'un fluorimètre. Ces composés peuvent être utilisés tels quels pour colorer certains compartiments des cellules ou des tissus, ou bien être conjugués à des vecteurs qui vont les transporter vers un site spécifique. De tels vecteurs peuvent être par exemple des anticorps spécifiques d'un composant cellulaire (tel qu'une protéine) que l'on souhaite marquer par un composé fluorescent, ou bien tout composé qui présente une spécificité pour un compartiment ou un composant cellulaire.
Le phénomène de FRET (acronyme de l'expression anglaise « Fluorescence Résonance Energy transfer ») est largement utilisé en biologie, notamment pour étudier des interactions moléculaires. Il est basé sur l'utilisation d'un composé donneur fluorescent (par exemple un complexe ou un cryptate de terre rare) et d'un composé accepteur éventuellement fluorescent, chacun de ces composés étant couplé à une molécule biologique. Lorsqu'un phénomène biologique provoque le rapprochement de ces molécules, et que le composé donneur est excité, un transfert d'énergie a lieu entre le donneur et l'accepteur et va résulter en une variation de la luminescence émise par le milieu réactionnel, notamment une augmentation du signal émis par le composé accepteur et une diminution de la luminescence du donneur. Cette luminescence peut être mesurée par un fluorimètre réglé aux longueurs d'onde d'émission des composés fluorescents, et le signal de FRET ainsi obtenu, le plus souvent constitué du ratio du signal de l'accepteur sur celui du donneur, permet ainsi de suivre l'évolution du phénomène observé. La mise en œuvre de cette technique avec des chélates ou des cryptâtes de terres rares, développée notamment par G. Mathis et al. (« Homogeneous time resolved fluorescence ernergy transfer using rare earth cryptâtes as a tool for probing molecular interactions in biology », Spectroc imica Acta Part A 57 (2001) 2197-2211) présente de nombreux avantages qui ont déjà permis plusieurs applications dans le domaine du diagnostic in vitro et dans celui du criblage à haut débit dans l'industrie pharmaceutique. Plusieurs sociétés commercialisent des réactifs permettant la mise en œuvre de cette approche pour étudier des processus biologiques ; par exemple la Demanderesse fournit différents réactifs, dont des cryptâtes de terre rare, pour l'étude de phénomènes biologiques particuliers (détection d'activité enzymatique, dosage de seconds messagers etc.).
Les chélates ou cryptâtes de terre rare fluorescents, en particulier les cryptâtes ou chélates d'europium ou de terbium, ont une durée de vie de l'ordre de la milliseconde qui autorise la mesure du signal de FRET émis par le milieu de mesure après un délai suivant l'excitation du composé donneur. Cette technique de mesure de FRET en temps résolu (TR-FRET, pour « Time Resolved FRET ») permet de s'affranchir de la luminescence parasite émise par le milieu de mesure immédiatement après son excitation et est donc particulièrement avantageuse lorsque le milieu de mesure comprend du matériel biologique riche en composés, notamment protéiques, susceptibles de produire ce genre d'interférence.
Si la technique de TR-FRET a longtemps été mise en œuvre sur des systèmes biologiques relativement bien contrôlés, tels qu'une enzyme donnée et son substrat, deux protéines interagissant l'une avec l'autre, ou encore le dosage d'un analyte dans du plasma ou du sérum sanguin, elle a récemment été appliquée à des environnements beaucoup plus complexes, et notamment des cellules, des lysats cellulaires ou des explants tissulaires. Un des problèmes des tests in vitro pratiqués sur ce type de matériel réside dans la difficulté de contrôler le nombre de cellules présentes dans le milieu de mesure, rendant la comparaison des résultats obtenus dans différent tests d'autant plus difficile. Ce problème technique est particulièrement critique lorsque l'on souhaite appliquer la technique de TR-FRET à l'analyse clinique d'échantillons de tissus caractérisés par une grande disparité en contenu cellulaire.
Des techniques d'évaluation ou bien de normalisation par rapport à la quantité de cellules présentes dans le milieu de mesure sont disponibles : il est tout d'abord possible d'introduire dans le milieu de mesure un nombre connu de cellules par distribution d'une suspension homogène de cellules. Des techniques de dénombrement des cellules sont également utilisées, mais elles sont relativement fastidieuses et peu adaptées à l'analyse d'un grand nombre d'échantillon (microscopie, FACS). Une autre approche consiste à évaluer la quantité de certaines protéines « ubiquitaires », dont la présence reflète indirectement la quantité de cellules présentes dans le milieu de mesure (GAPDH, actine). Enfin, des méthodes basées sur l'utilisation d'agents fluorescents s'intercalant dans l'ADN sont également utilisées : ces agents ont la particularité d'être luminescents à des longueurs d'onde différentes selon qu'ils sont complexés ou non avec l'ADN; le calcul du ratio des signaux mesurés à ces deux longueurs d'onde permet d'évaluer la quantité d'ADN présent dans le milieu. Des exemples de tels agents intercalant sont les produits Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580 ou DAPI.
Jensen et al (J Biomol Screen. 2010 Oct. 15(9):1071-81) ont par exemple décrit une technique d'étude des potentiels membranaires des mitochondries basée sur l'utilisation de composés fluorescents (DASPEI et TMRM), et incluant une normalisation de la fluorescence de ces composés par celle du produit Hoechst 33258. Les auteurs ont néanmoins dû utiliser pas moins de 6 filtres différents pour exciter et mesurer l'émission des 3 composés fluorescents.
Il n'existe aujourd'hui aucun moyen satisfaisant d'étudier des phénomènes biologiques par !a technique de TR-FRET sur des extraits de tissu, en raison des quantités variables de cellules d'un milieu de mesure à l'autre. Les techniques disponibles sont fastidieuses, introduisent des risques d'erreur et ne sont pas adaptées à l'analyse rapide de plusieurs dizaines ou centaines d'échantillons. II serait donc particulièrement avantageux de pouvoir mesurer par TR-FRET la luminescence émise par un milieu contenant une quantité indéterminée de cellules, et de pouvoir calculer un signal de TR-FRET tenant compte de ce paramètre variable.
Description de l'invention
Les inventeurs ont mis au point un procédé de mesure de la luminescence émise par un milieu de mesure contenant des cellules, dans lequel le signal de luminescence est normalisé, c'est-à- dire qu'il tient compte du nombre de cellules dans le milieu de mesure.
Sous son aspect général, le procédé de l'invention consiste à utiliser un agent de marquage des cellules permettant la correction du signal de luminescence pour tenir compte de la quantité de cellules présentes dans ledit milieu.
L'agent de marquage des cellules peut être
- un agent intercalant capable de marquer les cellules au niveau de l'ADN, ou bien
- un agent capable de marquer les cellules au niveau d'éléments structurels de la cellule dont la quantité est relativement constante d'une cellule à l'autre (par exemple : membranes lipidiques, protéines totales, organites, enzymes ubiquitaires), ou bien
- un agent capable de marquer les cellules au niveau d'une protéine que l'on fait exprimer artificiellement par la cellule (GAPDH, actine, GST...) et exprimée de manière similaire dans toutes les cellules de l'échantillon, ou bien
- une protéine exogène fluorescente exprimée de manière similaire dans toutes les cellules de l'échantillon.
Ce procédé est optimisé pour être mis en œuvre en un nombre réduit d'étapes, ce qui présente l'intérêt de limiter le risque d'erreurs et également d'envisager son utilisation dans une approche de tests de criblage à haut débit. L'invention concerne également une trousse contenant les réactifs essentiels à la mise en œuvre de ce procédé. Le procédé de l'invention consiste en un procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, c) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue,
d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue,
e) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape d), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 ps, cette luminescence correspondant principalement à celle du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) calcul d'un signal de luminescence normalisé correspondant au ratio : (signal obtenu à l'étape e) / (signal obtenu à l'étape d).
Dans une mise en œuvre préférée, la luminescence mesurée est celle consécutive à un phénomène de TR-FRET dans le milieu de mesure, c'est-à-dire un transfert d'énergie entre un composé fluorescent donneur et un composé fluorescent accepteur. Dans cette mise en œuvre, le composé fluorescent à durée de vie longue joue le rôle du donneur d'énergie et le procédé précédent comprend alors les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET,
c) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, d) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue, e) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) éventuellement, mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape e), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 ps,
g) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure après un délai de 20 à 200 ps après l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de
200 à 600 ps, à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur,
h) détermination d'un signal de TR-FRET normalisé comprenant le calcul du ratio : (signal obtenu à l'étape g) / [(éventuellement signal obtenu à l'étape f) X (signal obtenu à l'étape e)].
Dans cette mise en œuvre, l'étape f) est donc optionnelle : on peut se passer de la mesure de la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue.
Dans une mise en oeuvre préférée selon laquelle la luminescence mesurée est celle consécutive à un phénomène de TR-FRET dans le milieu de mesure, il est possible de mesurer la luminescence de l'agent de marquage et celle du composé fluorescent accepteur à la même longueur d'onde. Dans ce cas bien sûr, la luminescence de l'agent de marquage et celle du composé fluorescent à durée de vie longue ne sont plus mesurées à la même longueur d'onde, et le procédé est modifié de la façon suivante :
- dans l'étape c), l'agent de marquage est un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur,
- dans l'étape e), la luminescence est mesurée à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent accepteur,
- dans l'étape f) si elle est présente, la luminescence est mesurée à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue.
Dans une mise en œuvre particulière, le procédé selon l'invention comprend en outre une deuxième étape d'excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption dudit composé fluorescent à durée de vie longue, cette deuxième excitation étant effectuée immédiatement avant l'étape de mesure de la luminescence en temps résolu. Dans une autre mise en œuvre particulière et lorsque l'échantillon biologique est constitué de tissu ou de cellules intactes, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de lavage avant la première excitation, c'est à dire entre les étapes b) et c) du procédé ou les étapes c) et d) de sa mise en œuvre préférée.
Milieu de mesure, matériel biologique
Le procédé selon l'invention est mis en œuvre sur un milieu de mesure contenant un échantillon biologique. Par « échantillon biologique », on entend un échantillon de tissu (en particulier un échantillon de tumeur) ou bien des cellules issues d'une culture cellulaire. Un des intérêts de ce procédé réside dans le lait qu'il permet de normaliser le signal de TR-FRET par rapport à la quantité de cellules présentes dans ce milieu de mesure.
Les cellules présentes dans le milieu de mesure peuvent être des cellules isolées, par exemple des cellules obtenues par culture cellulaire. Elles peuvent être en suspension ou bien adhérer au contenant du milieu de mesure. Ces cellules peuvent également être issues d'un extrait de tissu. Dans ce cas, l'échantillon biologique est de préférence constitué de coupes histologiques, en particulier de coupes histologiques congelées. La préparation de coupes histologiques relève des connaissances générales de l'homme du métier : elles sont réalisées par exemple en utilisant un cryotome ou un ultramicrotome sur des tissus inclus dans de la paraffine ou des résines époxy. De préférence, on utilise un cryotome avec des tissus congelés non-fixés, afin d'obtenir des coupes congelées et éviter de dénaturer des protéines.
Le procédé de l'invention est particulièrement avantageux lorsqu'il est mis en œuvre sur un extrait de tissu en raison de la variabilité de la quantité de matériel biologique présent dans ce cas.
Dans tous les cas, les cellules peuvent être intactes, ou encore avoir fait l'objet d'un traitement visant à homogénéiser ledit échantillon sous forme de lysat cellulaire, et cela préalablement ou postérieurement à l'introduction des composés fluorescents dans le milieu de mesure. Un tel traitement peut être mécanique, conduisant à un lysat cellulaire. Cette dernière mise en œuvre est préférée lorsque le procédé est pratiqué sur des extraits de tissu, car elle assure une plus grande fiabilité de la mesure de la luminescence émise, qui doit l'être à partir d'un milieu de mesure le plus homogène possible. Le traitement mécanique en question peut être choisi parmi : l'application d'ultrasons, des cycles de congélation / décongélation, l'utilisation de broyeurs mécaniques, éventuellement conjointement à l'utilisation de tampon de lyse hypotonique ou de tampon de lyse contenant des détergents comme le tampon RIPA. Lorsqu'un tel traitement est pratiqué, et en fonction de l'objet de l'étude de l'homme du métier, ce dernier veillera à utiliser des conditions de traitement ménagées. En particulier, si le procédé est mis en œuvre dans le cadre de l'étude de structures subcellulaires ou encore d'agrégats ou d'oligomères de protéines, un traitement mécanique trop violent pourrait dégrader ces structures ou oligomères.
Un exemple de traitement mécanique ménagé consiste à appliquer au milieu de mesure des ultrasons (sonication) à une fréquence comprise entre 19 800 à 20 500 kHz, à une puissance de 80 W et pendant une durée de 3 à 10 secondes, et de préférence pendant 4 à 6 secondes. Les échantillons sont de préférence maintenus dans un bain de glace pendant le traitement pour limiter leur échauffement. Les inventeurs ont découvert que, de manière surprenante, ce traitement ne perturbe pas significativement les liaisons antigènes-anticorps ou les oligomères de protéines, notamment les dimères présents dans le milieu de mesure.
L'homme du métier peut facilement ajuster ces paramètres de traitement chimique ou mécanique en fonction du matériel étudié.
Composés fluorescents à durée de vie longue
Une des caractéristiques essentielles de l'invention est l'utilisation de composés fluorescents à durée de vie longue. De tels composés sont connus et sont le plus souvent des complexes métalliques fluorescents, ayant une durée de vie supérieure à 1 ps, et de préférence supérieure à 100 ps. De manière générale on entend par complexe métallique fluorescent un composé constitué d'un lanthanide ou de ruthénium et d'un agent complexant polydenté, c'est-à-dire comportant au moins 2, et de préférence entre 2 et 9 hétéroatomes donneurs d'électrons, tels que N, O, S, ces atomes formant des liaisons de coordination avec le lanthanide ou le ruthénium. De manière préférée, le complexe métallique fluorescent comprend un ou plusieurs chromophores constitués de structures aromatiques ; de préférence ces structures aromatiques comprennent 1 , 2 ou 3 hétéroatomes choisis parmi N et O, qui jouent le rôle d'atomes de coordination du lanthanide ou du ruthénium.
Un complexe métallique fluorescent approprié aux fins de l'invention doit être stable en termes d'association/dissociation de l'agent complexant et de la terre rare, et de préférence sa constante de formation (Kf) doit être supérieure à 1010 M"1.
De nombreux agents complexants ont été décrits et sont connus de l'homme du métier : on peut citer à titre d'exemples d'agents complexants les composés suivants : EDTA, DTPA, TTHA, DOTA, NTA, HDTA, DTPP, EDTP, H DTP, NTP, DOTP, D03A, DOTAGA. Des chélates et crypates de terbium et d'europium ont été décrits et plusieurs sont disponibles dans le commerce. Des exemples de composés fluorescents à durée de vie longue sont donnés dans la figure 1 , ainsi que ci-après :
• Les cryptâtes de lanthanides, comportant un ou plusieurs motifs pyridine. De tels cryptâtes de terre rare sont décrits par exemple dans les brevets EP 0 180 492, EP 0 321 353, EP 0 601 113 et dans la demande internationale WO 01/96 877. Les cryptâtes de terbium (Tb3+) et d'europium (Eu3+) sont particulièrement appropriés aux fins de la présente invention. Des cryptâtes de lanthanides sont commercialisés par la société Cisbio Bioassays. On peut citer à titre d'exemple non limitatif les cryptâtes d'europium de formules ci-dessous (qui peuvent être couplés au composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
TrisBiPy-Eu
Py-BiPy-Eu
TrisBiPy-tetraacide-Eu
Py-BiPy-tetraacide-Eu
Les chélates de lanthanides décrits notamment dans les brevets US 4 761 481 , US 5 032 677, US 5 055 578, US 5 106 957, US 5 116 989, US 4 761 481 , US 4 801 722, US 4 794 191 , US 4 637 988, US 4 670 572, US 4 837 169, US 4 859 777. Les brevets EP 0 403 593, US 5 324 825, US 5 202 423, US 5 316 909 décrivent des chélates composés d'un ligand nonadenté tel que la terpyridine. Des chélates de lanthanides sont commercialisés par la société PerkinElmer.
Des complexes de lanthanides constitués d'un agent chélatant, tel que le tétraazacyclododécane, substitué par un chromophore comportant des cycles aromatiques, tels que ceux décrits par Poole R. et al. dans Biomol. Chem, 2005, 3, 1013-1024 "Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitable for usage in cellulo", peuvent également être utilisés. On peut aussi utiliser les complexes décrits dans la demande WO 2009/10580.
Les cryptâtes de lanthanides décrits dans les brevets EP 1 154 991 et EP 1 154 990 sont également utilisables. le cryptate de terbium de formule ci-dessous (qui peut être couplé à un composé à marquer via un groupe réactif, ici par exemple un groupe NH2) :
et dont la synthèse est décrite dans la demande internationale WO 2008/063721 (composé 6a page.89).
Le cryptate de terbium Lumi4-Tb de la société Lumiphore, commercialisé par Cisbio Bioassays.
Le quantum dye de la société Research Organics, de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif, ici NCS) :
Les chélates de ruthénium, en particulier les complexes constitués d'un ion ruthénium et de plusieurs bipyridines comme le ruthénium(ll) tris(2,2'-bipyridine).
Le chélate de terbium DTPA-cs124 Tb, commercialisé par la société Life technologies de formule ci-dessous (qui peut être couplé au composé à marquer via un groupe réactif R) et dont la synthèse est décrite dans le brevet américain US 5,622,821.
Le chélate de terbium de formule ci-dessous et décrit par Latva et al (Journal of Luminescence 75: 149-169) :
Tb-W14016 De manière particulièrement avantageuse, le composé fluorescent à durée de vie longue est un complexe métallique fluorescent, choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; et un quantum dye ; les chélates et les cryptâtes d'europium et de terbium étant particulièrement préférés.
Les complexes de dysprosium (Dy3+), de samarium (Sm3+), de néodymium (Nd3+), d'ytterbium (Yb3+) ou encore d'erbium (Er3+) sont également des complexes de terres rares appropriés aux fins de l'invention. Composés accepteurs
Dans la mise en œuvre particulière de l'invention selon laquelle la luminescence émise par le milieu de mesure résulte d'un phénomène de TR-FRET, un composé accepteur d'énergie compatible avec le composé fluorescent à durée de vie longue est introduit dans ce milieu. La sélection du couple fluorophore donneur / accepteur pour obtenir un signal de FRET est à la portée de l'homme du métier. De manière générale, pour que le FRET ait lieu, le spectre d'excitation de l'accepteur doit recouvrir au moins en partie le spectre d'émission du composé donneur, et les dipôles de transition des composés donneurs et accepteurs doivent être parallèles. Des couples donneur-accepteur utilisables pour étudier les phénomènes de FRET sont notamment décrits dans l'ouvrage de Joseph R. Lakowicz (Principles of fluorescence spectroscopy, 2nd édition 338), auquel l'homme du métier pourra se référer.
Les composés fluorescents accepteurs peuvent être choisis dans le groupe suivant : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (commercialisés sous la dénomination « Bodipy »), les fluorophores connus sous la dénomination « Atto », les fluorophores connus sous la dénomination «DY», les composés connus sous la dénomination « Alexa », le nitrobenzoxadiazole. Avantageusement, les composés fluorescents accepteurs sont choisis parmi les allophycocyanines, les rhodamines, les cyanines, les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène, le nitrobenzoxadiazole.
Les expressions « les cyanines » et « les rhodamines » doivent être respectivement comprises comme « les dérivés de cyanine » et « les dérivés de rhodamine ». L'homme du métier connaît ces différents fluorophores, disponibles dans le commerce.
Les composés « Alexa » sont commercialisés par la société Invitrogen; les composés « Atto » sont commercialisés par la société Attotec ; les composés « »DY» » sont commercialisés par la société Dyomics ; les composés « Cy » sont commercialisés par la société Amersham Biosciences ; les autres composés sont commercialisés par divers fournisseurs de réactifs chimiques, tels que les sociétés Sigma, Aldrich ou Acros.
Les protéines fluorescentes suivantes peuvent également être utilisées en tant que composé fluorescent accepteur : les protéines fluorescentes cyans (AmCyanl , Midori-lshi Cyan, mTFP1), les protéines fluorescentes vertes (EGFP, AcGFP, TurboGFP, Emerald, Azami Green, ZsGreen), les protéines fluorescentes jaunes (EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, YPet, PhiYFP, ZsYellowl , mBanana), les protéines fluorescentes oranges et rouges (Orange kusibari, mOrange, tdtomato, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer, mTangerine, AsRed2, mRFP1 , JRed, mCherry, mStrawberry, HcRedl , mRaspberry, HcRed-Tandem, mPlim, AQ143), les protéines fluorescentes dans le rouge lointain (mKate, m ate2, td atushka2).
Aux fins de l'invention, les dérivés de cyanines sont préférés comme composé fluorescent accepteur.
Les composés fluorescents donneurs et/ou accepteurs sont généralement chacun conjugués à un membre d'un couple de partenaires de liaison, en fonction de l'objet étudié par l'homme du métier, conformément à l'application usuelle de la technique de TR-FRET à l'étude des phénomènes biologiques. En particulier, ces composés peuvent être chacun couplés à un anticorps, un substrat d'enzyme, un peptide, un ligand de récepteur membranaire etc. La nature et la fonction de ces molécules conjuguées aux composés donneurs et accepteurs ne constituent pas des caractéristiques techniques essentielles du procédé selon l'invention : ce sont des paramètres variables que l'homme du métier adaptera en fonction de l'objet de son étude, et qui n'auront pas d'incidence sur le procédé de normalisation du signal de FRET selon l'invention. C'est la raison pour laquelle ces aspects, largement décrits par ailleurs, ne sont pas explicités ici.
Agents de marquage fluorescents : Agent intercalant
Dans une mise en œuvre préférée, l'agent de marquage utilisé dans le procédé selon l'invention est un agent intercalant fluorescent. L'expression « agent intercalant » est ici utilisée au sens large, et désigne notamment un composé organique capable de s'intégrer à la double hélice d'ADN, soit en s'intercalant entre les brins d'ADN, soit en se liant au petit sillon ou au grand sillon de la double hélice d'ADN. Ces agents sont connus et leurs caractéristiques spectroscopiques, en particulier leur spectres d'émission, sont différentes selon qu'ils sont complexés à l'ADN ou pas. Ces produits, disponibles dans le commerce, constituent ainsi l'une des solutions techniques disponibles pour quantifier la quantité de cellules présentes dans un milieu de mesure.
Il est important de souligner que l'utilisation de tels agents intercalants en combinaison avec d'autres fluorophores, notamment des complexes ou chélates de terre terbium qui émettent à la même longueur d'onde, va à rencontre d'un préjugé technique qui veut que lorsque plusieurs composés fluorescents sont utilisés, il est généralement préférable que ces composés émettent à des longueurs d'onde différentes pour éviter que la luminescence de l'un ne vienne contaminer la luminescence de l'autre.
Les inventeurs ont déterminé les conditions expérimentales permettant d'éviter une contamination du signal de l'agent intercalant par celui du composé fluorescent à durée de vie longue. En particulier la concentration de l'agent intercalant dans le milieu de mesure doit être supérieure à celle du composé fluorescent à durée de vie longue, de préférence d'au moins 50 à 150 fois. De manière générale, l'utilisation de l'agent intercalant à une concentration finale avant complexation de 1 et 10 μΜ est ainsi préférée.
De nombreux agents intercalants fluorescents ont été décrits. Le tableau 1 ci-après donne une liste de ces composés, ainsi que des informations relatives à leurs propriétés spectroscopiques. Tableau 1
Excitation / émission
Homodimère d'acridine 431/498
500/526 (DNA)
Acridine orange
460/650 (RNA)
7-AAD (7-amino-actinomycin
546/647
D)
ACMA 419/483
DAPI 358/461
Dihydroéthidium 518/605
Bromure d'éthidium 518/605
homodimère-1 d'éthidium
528/617
(EthD-1)
Homodimère-2 d'éthidium
535/624
(EthD-2)
lodure d'hexidium 518/600
Hoechst 33258 (bis-
352/461
benzimide)
Hoechst 33342 350/461
Hoechst 34580 392/498
Hoechst S769121 355/495
385/emission varies with
Hydroxystilbamidine
nucleic acid
543/712 (DNA)
LDS 751 590/607 (RNA)
Jaune nucléaire 355/495 lodure de propidium (PI) 530/625
OliGreen 485/535
PicoGreen 485/535
RiboGreen 485/535
SybrGreen 1 485/535
YO-YO-1 450/550
YO-PRO-1 450/550
Les agents intercalants fluorescents préférés sont ceux qui peuvent être utilisés selon l'invention avec un chélate ou un cryptate de terbium ou d'europium, c'est-à-dire qui peuvent être excités entre 330 et 350 nm, et qui émettent après liaison à l'ADN soit aux longueurs d'ondes correspondant aux pics d'émission de ces chélates ou crypates de terbium ou d'europium, à savoir notamment autour de 588 nm et 620 nm (si un chélate ou cryptate d'europium est utilisé) ou autour de 490 nm, 545 nm, 588 nm ou 620 nm (si un chélate ou cryptate de terbium est employé), soit à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé accepteur, généralement située entre 450 et 650 nm, le plus souvent entre 480 et 600 nm. De préférence, on choisira un agent intercalant suffisamment lipophile pour pénétrer dans le noyau cellulaire, en particulier lorsque l'on travaille sur des cellules entières et non pas sur un broyât cellulaire. Par ailleurs, certains agents intercalants étant rejetés par les cellules vivantes, il convient lorsqu'ils sont utilisés de les introduire dans le milieu de mesure une fois que les cellules ont été transformées en un lysat cellulaire, par exemple par sonication. Cela n'est néanmoins pas le cas du composé Hoechst 33342 qui peut s'intercaler dans l'ADN de cellules vivantes intactes.
De préférence l'agent intercalant fluorescent est choisi dans le groupe suivant : Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole).
Cette liste n'est pas limitative et l'homme du métier, sur la base des éléments fournis par les inventeurs, sera capable de choisir d'autres agents adaptés à l'invention.
De manière encore plus préférée, l'invention est mise en œuvre avec l'agent intercalant Hoechst 33342, qui est idéal lorsque le composé fluorescent à durée de vie longue est un chélate ou un cryptate de terbium, et qui est également utilisable avec un chélate ou un cryptate d'Europium.
Autres agents de marquage :
Dans le procédé de l'invention, l'agent de marquage n'est pas forcément un agent intercalant : on peut également utiliser un composé fluorescent capable de marquer les cellules, dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, ou encore à celle de l'accepteur lorsqu'il est présent. De préférence, on choisira un agent de marquage suffisamment lipophile pour pénétrer dans les cellules, en particulier lorsque l'on travaille sur des cellules entières et non pas sur un broyât cellulaire Les agents intercalants fluorescents préférés sont ceux qui peuvent être utilisés selon l'invention avec un chélate ou un cryptate de terbium ou d'europium, c'est-à-dire qui peuvent être excités entre 330 et 350 nm, et qui émettent après liaison à l'ADN soit aux longueurs d'ondes correspondant aux pics d'émission de ces chélates ou crypates de terbium ou d'europium, à savoir notamment autour de 588 nm et 620 nm (si un chélate ou cryptate d'europium est utilisé) ou autour de 490 nm, 545 nm, 588 nm ou 620 nm (si un chélate ou cryptate de terbium est employé), soit à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé accepteur, généralement située entre 450 et 650 nm, le plus souvent entre 480 et 600 nm. Des exemples de tels agents de marquage sont :
des protéines fluorescentes comme la protéine verte fluorescente (GFP ou « green fluorescent protein »). Lorsqu'une protéine fluorescente est utilisée comme agent de marquage, les cellules de l'échantillon auront été préalablement transfectées avec un vecteur d'expression codant pour cette protéine fluorescente. Dans ce cas, l'étape de l'invention consistant à introduire l'agent de marquage dans le milieu de mesure correspondra en pratique à l'étape d'introduction de l'échantillon biologique dans ce milieu. Des plasmides d'expression codant pour ces protéines sont disponibles dans le commerce et les techniques de transfection sont connues de l'homme du métier. La luminescence de la protéine fluorescente sera mesurée immédiatement après l'excitation du milieu de mesure, de manière similaire au cas où l'agent de marquage est un agent intercalant.
des composés fluorescents marqueurs des mitochondries, tels que le Mitotracker Orange, le Mitotracker Green, ou encore la rhodamine 123. Ces composés sont disponibles dans le commerce et les protocoles de marquage de cellules avec ces composés sont également connus. Ils peuvent être utilisés selon l'invention avec un protocole similaire au cas où l'agent de marquage est un agent intercalant,
des composés fluorescents, tels que le chlorure de dansyle ou le NBD (nitrobenzoxadiazole) : ces composés, également disponibles dans le commerce, se lient aux fonctions aminés, notamment des protéines. Y.Uratani et al. décrivent un protocole de marquage de cellules avec le chlorure de dansyle (Journal of Bacteriology 1982 p. 523-528). Une fois les cellules marquées, l'invention peut être mise en œuvre avec un protocole similaire au cas où l'agent de marquage est un agent intercalant, des composés fluorescents qui s'accumulent dans les membranes lipidiques, tels que le Filipin : ce composé est disponible dans le commerce et son utilisation pour marquer des cellules est connue. Il peut être utilisé selon l'invention avec un protocole similaire à celui du cas ou l'agent de marquage est un agent intercalant.
des composés fluorescents capables de marquer une protéine que l'on fait artificiellement exprimer par la cellule : dans cette mise en œuvre, les cellules ont été préalablement transfectées avec un plasmide codant pour une protéine de fusion comprenant une enzyme suicide telle que les enzymes commercialisées sous la dénomination Snaptag, Cliptag, ACPtag, MCPtag, ou Halotag. Cette protéine de fusion peut également comprendre la protéine GST, l'actine, la GAPDH ou toute autre protéine facilement exprimée par une cellule. La mise en contact de ces cellules avec un substrat fluorescent de ces enzymes (tel qu'un dérivé benzylguanine-fluorophore, benzylcytosine-fluorophore, ou chloroalcane-fluorophore) va provoquer le marquage de la protéine de fusion. Le signal de la protéine de fusion ainsi marquée peut être mesuré et utilisé selon l'invention avec un protocole similaire à celui utilisé dans le cas où l'agent de marquage est un agent intercalant.
Excitation et mesure de la luminescence
L'invention constitue une amélioration des procédés connus mettant en œuvre un composé fluorescent à durée de vie longue, et de manière optionnelle également un composé fluorescent accepteur, en ce qu'elle comprend l'utilisation d'un agent de marquage fluorescent et qu'elle propose d'optimiser l'excitation de ces composés et la mesure de leur luminescence. La luminescence émise par le milieu de mesure est effectuée de manière classique à l'aide d'un fluorimètre qui permet l'excitation du milieu à une longueur d'onde donnée, et la mesure de la luminescence émise après excitation dans une fenêtre temporelle et à une longueur d'onde choisies par l'utilisateur. Excitation du composé fluorescent à durée de vie longue et de l'agent de marquage.
Une des originalités de l'invention consiste à exciter le milieu de mesure de telle façon que non seulement le composé donneur mais également l'agent de marquage soient excités simultanément, où en tout cas à la même longueur d'onde. Pour cela, l'invention est basée sur l'utilisation de composés fluorescents à durée de vie longue et d'agents de marquage fluorescents dont les spectres d'absorption autorisent une excitation à la même longueur d'onde.
Dans la mesure où les fluorimètres à excitation laser à azote ne permettent qu'une excitation à 337 nm, les composés fluorescents donneurs à durée de vie longue et les agents de marquage dont les spectres d'absorption autorisent une excitation à cette longueur d'onde sont préférés. Cette condition est remplie notamment par les chélates et cryptâtes d'europium ou de terbium, ainsi que par un certain nombre d'agents intercalants fluorescents listés dans le tableau 1. Lorsque des fluorimètres à lampe flash sont utilisés, la longueur d'onde d'excitation peut être modifiée par l'utilisateur en fonction des composés fluorescents à durée de vie longue et des agents de marquage qu'il souhaite utiliser. Néanmoins, lorsque ces fluorimètres sont employés, la longueur d'onde d'excitation sera de préférence choisie entre 320 et 360 nm, et de préférence entre 330 et 350 nm.
Enfin, dans une mise en œuvre particulière, le milieu de mesure est excité deux fois, à la même longueur d'onde : une première fois pour mesurer la fluorescence de l'agent de marquage (fluorescence continue, mesurée sans délai après l'excitation), et une deuxième fois pour mesurer la fluorescence en temps résolu. Cela est particulièrement avantageux lorsque l'on souhaite modifier le gain du fluorimètre, ce qui peut être nécessaire en particulier si le signal de l'agent de marquage sature le canal de mesure.
Mesure de la luminescence émise
A la suite de l'excitation du milieu de mesure, ce dernier va émettre de la luminescence correspondant à l'excitation du composé fluorescent à durée de vie longue et de l'agent de marquage fluorescent. Dans la mise en œuvre selon laquelle le milieu comporte en outre un composé fluorescent accepteur partenaire de FRET du composé fluorescent à durée de vie longue, ce composé accepteur va également émettre. Il est nécessaire de rappeler que la mesure de la luminescence à une longueur d'onde donnée revient en pratique, en raison des contraintes techniques des fluorimètres, à mesurer la luminescence dans une fourchette plus ou moins importante centrée autour de la longueur d'onde d'émission visée. Typiquement, lorsque l'on règle un fluorimètre pour une mesure à une longueur d'onde L, on mesure en pratique la luminescence émise à L nm +1-5, 10 ou 20 nm. L'expression « signal de TR-FRET » parfois utilisée est un abus de langage qui désigne en fait la luminescence émise par le milieu de mesure suite au transfert d'énergie du composé donneur vers le composé accepteur. Ce signal de TR-FRET peut correspondre à la luminescence du composé donneur, dont l'intensité et la durée de vie vont diminuer suite au transfert d'énergie, ou bien à celle du composé accepteur, dont l'intensité va augmenter. Le plus souvent les deux signaux sont mesurés et le signal de TR-FRET est constitué du ratio du signal de l'accepteur sur celui du donneur.
Selon l'une des mises en œuvre de l'invention, la luminescence de l'agent de marquage et celle du composé fluorescent donneur sont mesurées à la même longueur d'onde. Cela permet de réduire encore le temps de mise en œuvre du procédé puisqu'aucun changement de filtre n'est nécessaire pour mesurer le signal de chacun de ces composés, et par ailleurs de limiter le risque d'erreur lié à la modification des conditions de mesure. Cela est encore une fois rendu possible par le choix d'un composé fluorescent à durée de vie longue et d'un agent de marquage fluorescent dont les spectres d'émission autorisent la mesure de luminescence à la même longueur d'onde.
Dans une autre mise en œuvre, la luminescence de l'agent de marquage et celle du composé fluorescent accepteur, lorsqu'il est présent, sont mesurées à la même longueur d'onde. De préférence, le composé fluorescent à durée de vie longue est un cryptate ou un chélate d'europium ou de terbium, l'agent de marquage fluorescent est un agent dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm et émettant une longueur d'onde comprise entre 450 et 650 nm, en particulier entre 490 et 600 nm, et la luminescence du composé fluorescent accepteur et celle de l'agent de marquage fluorescent sont toutes deux mesurées à une longueur d'onde comprise dans ces intervalles.
Dans le mode de réalisation consistant à utiliser des chélates ou des cryptâtes de terbium en tant que composé fluorescent à durée de vie longue, l'agent de marquage sera choisi parmi ceux dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm, et dont les spectres d'émission autorisent la mesure de luminescence à une longueur d'onde proche de celle des maximum des pics d'émission du terbium, à savoir 490 nm, 545 nm, 588 nm, ou 620 nm, notamment aux longueurs d'onde de 490 +/-10 nm, 545 +/-10 nm ou 590 +/-10 nm. Selon cette mise en œuvre, la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue (chélate ou cryptate de terbium) et celle de l'agent de marquage seront ainsi toutes deux mesurée à ces longueurs d'onde. De manière préférée on choisit un agent de marquage dont le spectre d'émission autorise une mesure de luminescence à 490 +/-10 nm, 545 +/-10 nm ou 590 +/-10 nm.
De la même façon, si le composé fluorescent à durée de vie longue est un chélate ou un cryptate d'europium, alors l'agent de marquage sera choisi parmi ceux dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm, et dont les spectres d'émission autorisent la mesure de luminescence à une longueur d'onde proche de celle des maximum des pics d'émission de l'europium, à savoir 580 nm ; 588 nm, 620 nm, 650 nm et 684 nm, notamment aux longueurs d'onde de 588 nm +/- 10 nm ou 620 nm +/- 10 nm ; la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue et celle de l'agent de marquage seront toutes deux mesurées de préférence aux longueurs d'onde de 588 nm +/- 10 nm ou 620 nm +/- 10 nm.
L'invention tire avantageusement partie des propriétés spectroscopiques de ces composés pour discriminer leurs luminescences respectives, et ce même dans le cas où elles sont mesurées à la même longueur d'onde. Selon l'invention, la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue et celle de l'agent de marquage sont en effet mesurées dans des fenêtres temporelles différentes : les inventeurs ont découvert que de manière inattendue, le signal du composé fluorescent à durée de vie longue ne contamine pas le signal de l'agent de marquage mesuré immédiatement après l'excitation du milieu de mesure.
Ainsi, et c'est l'une des caractéristiques les plus importantes de l'invention, la luminescence de l'agent de marquage est mesurée immédiatement après l'excitation du milieu de mesure, alors que les signaux du composé fluorescent à durée de vie longue et/ou de l'accepteur lorsqu'il est présent sont mesurés après un délai suivant cette excitation, et pendant une durée donnée (également appelée « temps d'intégration »), ces deux paramètres étant réglables sur les fluorimètres disponibles dans le commerce.
Selon la présente invention, on entend par « mesure immédiatement après l'excitation du milieu de mesure » une mesure immédiate, c'est-à-dire sans délai ou après un laps de temps très court ne dépassant pas 30 ps.
En particulier, la luminescence de l'agent de marquage est mesurée immédiatement après l'excitation du milieu de mesure, et pendant la durée la plus faible possible sur le fluorimètre. Lorsque l'excitation est effectuée par un laser, le signal peut être mesuré dans une fenêtre de 5 ns à 8 ps. Sur certains appareils à excitation laser, il est conseillé d'effectuer la mesure dans un des intervalles suivants : 0-8 ps, 2-8 ps, 2-6 ps et 2-4 ps. Lorsque l'excitation est effectuée à l'aide d'une lampe flash, le signal est de préférence mesuré un peu plus longtemps, à savoir pendant une durée de 5 ps à 45 ps, de préférence de 5 ps à 20 ps.
La luminescence émise par le milieu de mesure et correspondant au signal du composé donneur est mesurée postérieurement à celle de l'agent de marquage, après un délai de 20 à 200 ps, et de préférence de 40 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure, et pendant une durée de 200 à 1000 ps, de préférence de 400 à 1000 ps. Les fenêtres temporelles suivantes, individuellement, sont des fenêtres préférées : 50-550 ps, 100-500 ps, 100-300 ps, 200-1200 ps.
On entend par « fenêtre temporelle » la période de temps qui commence lorsque la luminescence est mesurée après un délai suivant l'excitation lumineuse du milieu de mesure et se termine à la fin du temps d'intégration. Par exemple, une fenêtre temporelle « 100-500 ps » signifie que la luminescence est mesurée au bout d'un délai de 100 ps après l'excitation lumineuse du milieu de mesure, pendant une durée (temps d'intégration) de 400 ps. Enfin, la luminescence du composé accepteur, lorsqu'il est présent, est mesurée à sa longueur d'onde d'émission, soit dans la même fenêtre temporelle que celle utilisée pour la mesure du signal du composé fluorescent à durée de vie longue, soit dans une fenêtre différente. Dans ce dernier cas, la luminescence du composé accepteur sera mesurée à sa longueur d'onde d'émission après un délai de 20 à 200 ps, de préférence de 40 à 200 ps après excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 600 ps, de préférence de 400 à 600 ps.
Dans le cas où le milieu de mesure contient un composé accepteur et qu'un signal de TR-FRET est mesuré, son évolution permettra à l'homme du métier de mieux comprendre le système biologique qu'il étudie puisque ce signal dépend de la proximité des composés fluorescents donneur et accepteur qu'il a introduit dans le milieu de mesure. L'invention n'est pas relative aux différentes applications en tant que telle de la technique de TR-FRET à l'étude des systèmes biologiques qui ont été décrites par ailleurs, mais elle permet néanmoins de les améliorer. Comme indiqué plus haut, lorsqu'un transfert d'énergie a lieu entre un composé donneur et un composé accepteur, la luminescence du donneur va diminuer lorsque le transfert d'énergie va augmenter, et celle de l'accepteur augmenter. Ainsi, le signal de TR-FRET représentatif d'une évolution du système biologique observé peut être soit celui du donneur, soit celui de l'accepteur. Il est néanmoins extrêmement courant de mesurer les deux signaux et de diviser le signal du composé accepteur par celui du composé donneur. Les fluorimètres incluent généralement un mode permettant ce type de lecture.
Dans tous les cas, que le signal de TR-FRET soit celui du donneur, de l'accepteur ou bien encore un ratio des signaux accepteurs/donneur, ce signal sera en outre et selon l'invention, corrigé par celui de l'agent de marquage fluorescent, cette correction permettant de normaliser le signal de TR-FRET par le contenu en ADN du milieu de mesure, et donc par la quantité de cellules. De manière préférée, cette correction est automatique et est opérée par le logiciel qui analyse les signaux mesurés. Ce logiciel peut être intégré au fluorimètre ou bien opérer sur un ordinateur qui en est séparé et auquel sont soumis les résultats de la mesure de fluorescence.
Dans le cas où l'on est dans un format TR-FRET, il est recommandé de déterminer la contribution du composé fluorescent à durée de vie longue à la luminescence émise en temps résolu à la longueur d'onde d'émission du composé fluorescent accepteur, en établissant une gamme étalon qui va permettre de déterminer la relation entre d'une part le signal du composé à durée de vie longue émis, en temps résolu, à la longueur d'onde d'émission de ce composé, et d'autre part le signal émis par ce même composé en temps résolu mais à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur, et cela en l'absence de FRET - ou en l'absence d'accepteur. Cette gamme étalon permet de déterminer les coefficients de la fonction linéaire qui relie ces deux signaux, et qui permet de calculer la contribution parasite. Cette méthode est illustrée dans l'exemple 5.3.2. Enfin, la méthode selon l'invention peut être encore affinée pour tenir compte du fait que le composé à durée de vie longue peut contribuer, de façon minoritaire, au signal mesuré immédiatement après excitation (signal correspondant majoritairement à celui de l'agent de marquage). Il est possible de calculer cette contribution parasite en établissant une gamme étalon qui va permettre de déterminer la relation entre le signal du composé à durée de vie longue mesuré en temps résolu et celui mesuré en fluorescence continue (sans délai). Pour cela, on va mesurer le signal émis par un milieu de mesure contenant le composé fluorescent à durée de vie longue mais pas d'agent de marquage, à des concentrations croissantes de composé fluorescent à durée de vie longue, d'une part en fluorescence continue et d'autre part en fluorescence en temps résolu. La relation entre les deux signaux est une fonction linéaire qui permet de calculer la contribution du composé fluorescent à durée de vie longue au signal émis en fluorescence continue, à partir de la valeur mesurée en temps résolu.
Séquence de mise en contact des composés fluorescent avec le milieu de mesure, lavage et transfert de ce milieu d'un contenant à l'autre.
Le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre de différentes façons, notamment en fonction de la nature du matériel biologique présent dans le milieu de mesure. Lorsque le procédé selon l'invention comprend une étape additionnelle de traitement mécanique, telle qu'une étape de sonication du matériel biologique, cette étape peut être effectuée soit avant soit après la mise en contact de l'échantillon de matériel biologique avec les composés fluorescents donneur, accepteur et l'agent de marquage, et bien sûr toujours de manière préalable à la mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure.
Une première possibilité, dans le cas où l'on travaille sur un extrait de tissu auquel on fait subir un traitement par sonication, consiste à mettre le tissu en contact avec les composés fluorescents avant la sonication de l'échantillon, selon les étapes suivantes :
a) Mise en contact des composés fluorescents (donneur, accepteur, agent de marquage) avec un échantillon de tissu,
b) Lavage,
c) Sonication, d) Transfert dans une microplaque (si le tissu ne se trouvait pas déjà dans une micropiaque),
e) Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent de marquage).
Cette mise en œuvre offre l'avantage de comporter une étape de lavage qui va limiter le bruit de fond et ainsi augmenter la sensibilité de la mesure. Elle est préférée lorsque le système biologique étudié ne permet pas de mesurer des variations importantes de signal de TR-FRET. Ce protocole a été mis en œuvre dans les exemples 3.2, 5.3 et 6.3.
Une seconde possibilité, dans le cas où l'on travaille sur un extrait de tissu auquel on fait subir un traitement par sonication, consiste à mettre le tissu en contact avec les composés fluorescent après avoir réalisé la sonication de l'échantillon, selon les étapes suivantes :
a) Sonication de l'échantillon de tissu,
b) Transfert dans une microplaque (si le tissu ne se trouvait pas déjà dans une microplaque),
c) Ajout au milieu de mesure des composés fluorescents (donneur, accepteur, agent de marquage),
d) Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent de marquage).
Cette mise en œuvre ne comporte pas d'étape de lavage et les mesures de luminescence seront donc moins sensibles que celle de la première mise en œuvre. En revanche, elle est plus facile à mettre en œuvre puisqu'elle ne comporte qu'un nombre limité d'étapes. Par ailleurs et comme indiqué plus haut et dans la partie expérimentale, les inventeurs ont vérifié qu'une sonication modérée ne perturbait pas les liaisons antigènes-anticorps éventuellement présents dans le milieu de mesure (en particulier lorsque les composés fluorescents donneurs et / ou accepteurs sont conjugués à des anticorps).
Une troisième possibilité, dans le cas où l'on travaille sur des cellules isolées issues d'une culture cellulaire, est la séquence d'étapes suivantes :
a) Distribution des cellules dans la microplaque,
b) Ajout au milieu de mesure des composés fluorescents (donneur, accepteur, agent de marquage),
c) Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent de marquage).
Cette mise en œuvre ne requiert pas de sonication dans la mesure où les cellules sont réparties de manière homogène dans le milieu de mesure, mais nécessite l'utilisation d'un agent de marquage qui n'est pas rejeté par les cellules vivantes, tel que le Hoechst 33342. Une quatrième possibilité, est la séquence d'étapes suivantes :
a) Mise en contact de l'agent de marquage avec des cellules ou un échantillon de tissu, b) Lavage,
c) Sonication,
d) Transfert dans microplaque (si le tissu ou les cellules ne se trouvaient pas déjà dans une microplaque),
e) Ajout au milieu de mesure des composés fluorescents (donneur, accepteur), f) Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent de marquage).
Ce protocole est préféré lorsque l'on travaille avec des cellules adhérentes, par exemple dans le contexte de tests destinés à découvrir de nouveaux médicaments. Ce protocole a été utilisé dans l'exemple 7. Trousses de réactifs
L'invention concerne enfin des trousses de réactifs adaptées à la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Les trousses pour la mise en œuvre du procédé selon laquelle la luminescence de l'agent de marquage est mesurée à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue comportent un ensemble de réactifs, dont :
un composé fluorescent à durée de vie longue ;
un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue ;
optionnellement, un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET.
Une trousse de réactifs préférée est une trousse dans laquelle :
le composé fluorescent à durée de vie longue est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ;
- l'agent de marquage fluorescent a un spectre d'absorption permettant son excitation entre 330 et 350 nm et un spectre d'émission autorisant la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue. Les trousses pour la mise en œuvre du procédé selon laquelle la luminescence de l'agent de marquage est mesurée à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur comportent un ensemble de réactifs, dont : un composé fluorescent à durée de vie longue ;
- un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET ;
un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur. Une autre trousse de réactifs préférée est ainsi une trousse dans laquelle :
le composé fluorescent à durée de vie longue est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium
l'agent de marquage fluorescent a un spectre d'absorption permettant son excitation entre 330 et 350 nm et un spectre d'émission autorisant la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur.
Selon une mise en œuvre de l'invention, l'agent de marquage fluorescent est choisi parmi les composés suivants : un agent intercalant fluorescent, une protéine fluorescente, un composé fluorescent marqueur des mitochondries, un composé fluorescent se liant aux fonctions aminés des protéines, un composé fluorescent qui s'accumule dans les membranes lipidiques. Des exemples de tels agents de marquage adaptés à une utilisation selon l'invention sont : le composé Hoechst 33258 ; le composé Hoechst 33342; le composé Hoechst 34580 ; DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole) ; la protéine fluorescente verte (GFP), le Mitotracker Orange, le Mitotracker Green, la rhodamine 123, le chlorure de dansyle, le nitrobenzoxadiazole, le filipin.
L'invention est illustrée par les exemples suivants, donnés à titre purement indicatif.
Exemple 1. Obtention de cryosections de tissus tumoral
La méthode selon l'invention a été mise en œuvre sur des cryosections obtenues à partir de tumeurs de souris, induites par xenogreffe de cellules NIH-3T3 surexprimant soit le récepteur HER1 (EGFR), soit le récepteur HER2 (ErbB2), soit à la fois HER1 et HER2. Ces cellules ont été obtenues par transduction à l'aide d'un vecteur rétroviral portant la séquence nucléique codant pour les protéines en question. Ce matériel constitue un modèle proche d'une biopsie de tissu tumoral humain. Pour obtenir la construction rétrovirale portant le gène HER1 , la séquence de l'EGFR a été extraite du vecteur pCMV-XL4-EGFR (Origene - CliniSciences, Montrouge, France) par coupure à l'aide de l'enzyme de restriction Not I (associée à l'enzyme Pvu I pour découper le vecteur en fragments de taille différente de celle de la séquence d'intérêt) (Fermentas, Saint- Rémy-lès-Chevreuse, France). La séquence d'intérêt a été traitée à la T4 DNA polymérase (Roche Diagnostics, Meylan, France) afin d'obtenir des bout francs et être ensuite insérée dans le vecteur rétroviral MSCV (Clontech - Ozyme) contenant la séquence de résistance à la puromycine (p SCV-puro) et préalablement digéré par l'enzyme de restriction Hpa I puis déphosphorylé à la CIAP "calf intestinal alcaline phosphatase" (Fermentas). Avant d'être liguées avec de la T4 DNA ligase (Roche), les séquences (insert et plasmide digéré) ont été déposées sur gel d'agarose 1%, et après électrophorèse, récupérées d'après leur taille et purifiées à l'aide du kit Nucleo Spin Extract II (Machery-Nagel, Hoerdt). Des bactéries compétentes de type E.coli DH5a ont ensuite été transformées avec le produit de ligation puis étalées sur boîte de Pétri en milieu LB agar. Les colonies obtenues ont alors été placées en milieu LB liquide pour faire des mini-préparations de plasmides à l'aide du kit Nucleo Spin Plasmid Quick Pure (Machery-Nagel). Le sens d'insertion de l'insert dans le vecteur a été vérifié par analyse de restriction utilisant l'enzyme Bgl II (Fermentas). De la même façon pour obtenir la construction rétrovirale portant le gène HER2, la séquence de l'HER2 a été extraite à partir du vecteur pCMV-XL4-HER2 (Origene - CliniSciences, Montrouge, France) puis insérée dans le plasmide du vecteur rétroviral MSCV (Clontech - Ozyme) contenant la séquence de résistance à l'hygromycine (pMSCV-hygro). Dans ce cas, le sens d'insertion de l'insert dans le vecteur a été vérifié par analyse de restriction utilisant les enzymes Xho I et Bel I (Fermentas). Finalement, les plasmides pMSCV-puro-HER1 et pMSCV-hygro-HER2 ont été envoyés à séquencer pour vérification de l'absence de mutations dans la séquence codante d'HERI ou HER2 à la société Millegen (Labege, France). Les vecteurs pMSCV-puro-HER1 ou pMSCV- hygro-HER2 ont été transfectés dans une lignée d'empaquetage AmphoPack-293 (Clontech) pendant 24h, permettant la multiplication du virus modifié de façon à produire des particules virales encapsidées. Le surnageant contenant les particules virales a été collecté, centrifugé et filtré sur un filtre 0,45μηη.
Les cellules NIH/3T3 ont été cultivées (2x106 cellules dans une boite de 150-mm) pendant 8h, puis exposées pendant 16h en présence d'un quart du volume de surnageant contenant les virus dans du milieu DMEM contenant 10% de sérum de veau fétal et du polybrene (8 μg ml, Sigma-AIdrich). Après 24h les cellules ont été lavées puis sélectionnées par ajout de l'antibiotique (400 μg/ml d'hygromycine ou 10 μg/ml de puromycine suivant le cas) et incubation pendant deux jours. Après sélection et multiplication, les cellules (5 x 106) surexprimant soit HER1 soit HER2 soit à la fois HER1 et HER2 ont été administrées par injection sous cutanée à des souris femelles athymiques sur leur flanc droit. Dans ce qui suit, les lignées, ainsi que les xénogreffes correspondantes, n'exprimant que HER1 seront dénommées R1 , les lignées (et xénogreffes) n'exprimant que HER2 seront dénommées R2 et les lignées (et xénogreffes) exprimant à la fois HER1 et HER2 seront dénommées R1 R2. Les souris portant des tumeurs ont été sacrifiées quand les tumeurs atteignaient un volume supérieur à 1500 mm3. Préparation des cryosections de xénogreffes
Après sacrifice de l'animal, la tumeur a été excisée, la pièce chirurgicale ainsi obtenue a été congelée immédiatement en la plongeant dans de l'azote liquide, puis conservée à -80°C.
Pour la réalisation des cryosections, le support métallique porte-échantillon d'un cryotome a été placé sur de la carboglace pendant 1 min. On a ensuite déposé quelques gouttes d'eau stérile sur le support, puis, sans attendre, déposé la pièce chirurgicale. En se congelant, l'eau a fixé l'échantillon sur le support. Alternativement l'échantillon peut être inclus dans un gel de type OCT (Optimal Cutting Température compound) à la place de l'eau stérile. Ensuite l'échantillon congelé a été coupé à l'épaisseur désirée avec le microtome contenu dans le cryostat (-25°C) et les sections encore congelées (cryosections) ont été collectées dans des tubes eppendorf préalablement refroidis dans de la carboglace. L'épaisseur des cryosections était généralement comprise entre 10 m et 50 pm. Pour les applications ci-dessous, une épaisseur de 50 μητι a été considérée comme optimum en termes de praticité de manipulation. Exemple 2. Mesure du signal d'émission d'un agent intercalant permettant la mesure de la quantité de cellules dans une section d'un tissu de cellules tumorales
Une cryosection issue de tumeur de souris ayant subi une xénogreffe de cellules R1 R2, préparée selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 1 , et dénommée cryosection R1 R2, a été placée dans un tube eppendorf dans 180μΙ de tampon PBS, auxquels ont été ajoutés 20 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H 1399 en solution 2mg/ml DMSO) prédiluée au 1/100 dans du tampon PBS pH 7 (soit une concentration de Hoechst 33342 de 3,25μΜ). Après 10 min d'incubation à l'obscurité on a centrifugé et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,05 % Tween® 20. On a finalement repris le culot formé par la cryosection dans 300μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA (albumine sérique bovine) et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10 ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 5 μΙ, 20 μΙ et 100 μΙ de la suspension homogène obtenue ont été alors déposés dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyren »), et complétés à 100 μΙ par le même tampon que celui utilisé pour l'étape de sonification décrite plus loin.
La microplaque a ensuite été placée dans un fluorimètre TECAN Saphir2. Après excitation des puits à 340 nm, la fluorescence de l'intercalant Hoechst 33342 a été mesurée aux trois longueurs d'onde 490 nm, 545 nm et 590 nm (H490, H545 et H590), correspondant aux principaux pics d'émission du terbium, la longueur d'onde 490 nm correspondant également à un des pics d'émission de l'europium. La fluorescence a été ici mesurée en mode fluorescence continue, c'est-à-dire immédiatement après l'excitation, et pendant le temps le plus court autorisé par l'appareil (20 ps). Les résultats sont présentés dans le tableau 2.
Tableau 2
Ces résultats montrent que l'intensité de fluorescence en fonction des volumes de suspension de cellules évolue de manière linéaire, et est donc proportionnelle à la quantité de cellules présentes dans le puits. Cet exemple démontre que la fluorescence émise par le complexe Hoechst 33342 - ADN peut être mesurée à 490, 545 ou 590 nm, en plus de l'être aux longueurs d'onde classiquement utilisées (excitation à 330-380 nm et mesure de l'émission à 430-530 nm).
Exemple 3. Normalisation du signal d'émission du terbium permettant la mesure de l'expression d'un récepteur dans une section d'un tissu de cellules tumorales
3.1. Marquage d'un anticorps anti-HER2 par un cryptate de terbium
L'anticorps FRP5 (fournit par l'Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, IRCM) (150 μΙ à 1 ,2 mg/ml) a été dessalé sur une colonne NAP5 (G25) équilibrée dans un tampon phosphate 50 mM pH8. La fraction exclue a été recueillie sous forme d'un éluat de 400 pl à 0,45 mg/ml (soit 1 ,2 nmol) en tampon phosphate pH8. A cette fraction ont été ajoutées 12 nmol (soit 10 eq.) de Lumi4Tb-NHS (cryptate de terbium, Cisbio Bioassays) en solution dans 1 ,4 μΙ de DMSO. Après 1 h d'incubation à 20°C l'anticorps marqué a été purifié sur colonne NAP5 (G25) équilibrée dans du tampon phosphate 100 mM pH7. On collecte la fraction exclue (400 μΙ) et on obtient ainsi l'anticorps FRP5 marqué à un taux de 5,3 cryptâtes par anticorps. La solution a été congelée en présence de 0,1% de BSA jusqu'à son utilisation.
3.2. Mesure de l'expression de HER2 (ErbB2) par mesure de fluorescence en temps résolu de l'émission du terbium à 490 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée également à 490nm en mode fluorescence continue
Une cryosection R1 R2 préparée dans l'exemple 1 a été placée dans un tube eppendorf dans 180 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 4% de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml). L'anticorps FRP5-Lumi4Tb préparé à l'exemple 3.1 a été ajouté de façon à obtenir une concentration finale en anticorps de 50 nM dans le tube eppendorf. Après incubation pendant une nuit à 30°C, 20 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 en solution 2 mg/ml DMSO) prédiluée au 1/100 dans du tampon pH7 ont été ajoutés. Après 10 min d'incubation à l'obscurité, le tube a été centrifugé et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,05 % Tween® 20. Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300 μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10 ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 5 μΙ, 20 μΙ et 100 μΙ de la suspension homogène obtenue ont été déposés dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyrène ») et complétés à 100 μΙ par le même tampon que celui utilisé pour l'étape de sonification.
La plaque a ensuite été placée sur un appareil TECAN Saphir2 pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un filtre 337 nm à l'excitation.
La fluorescence en mode continu, correspondant à celle du Hoechst 33342 a été mesurée à 490 nm, sans délai après excitation, et pendant un temps d'intégration de 20 ps. La fluorescence en mode temps-résolu (TRF pour « time-resolved fluorescence » en langue anglaise), correspondant au signal émis par le cryptate de terbium, l'a été également à 490 nm mais après un délai de 100 ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps.
Après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul on obtient les valeurs présentées dans le tableau 3, dans lequel :
TRF490 représente la mesure du signal du cryptate de terbium en temps résolu à 490 nm,
H490 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 490 nm, et TRF490 normalisé représente le rapport TRF 490 sur H490 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 1000) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés.
Tableau 3
On observe que la valeur TRF490 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 490 normalisée est globalement constante -en moyenne 14 800 ufa (unité de fluorescence arbitraire)- et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER2 exprimé par les cellules R1 R2.
La même expérience réalisée sur des coupes obtenues à partir de la lignée cellulaire R1 surexprimant HER1 seul (témoin négatif) et ne surexprimant pas HER2 permet d'estimer la spécificité et le bruit de fond de la détection de cette surexpression par la technique décrite ci- dessus. Après dépôt dans des puits sur la même plaque et lecture dans les mêmes conditions on observe les valeurs suivantes, reportées dans le tableau 4. Tableau 4
On observe ici une valeur de TRF 490 normalisée dont la moyenne est de 180 ufa pour ce témoin négatif ce qui représente un rapport signal / bruit de l'ordre de 80.
Cet exemple démontre que la méthode selon l'invention permet de normaliser le signal émis par un cryptate de terbium par la quantité de cellules présentes dans le milieu, et cela en mesurant la fluorescence émise par ce cryptate et le Hoechst 33342 à la même longueur d'onde (490 nm), mais dans des fenêtres temporelles différentes.
3.3. Mesure de l'expression de HER2 (ErbB2) par mesure de fluorescence en temps résolu de l'émission du terbium à 545 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée à 545 nm en mode fluorescence continue
Une cryosection R1 R2 préparée dans l'exemple 1 a été traitée comme dans l'exemple 3.2.
La lecture du signal a été effectuée en mode fluorescence continue à 545 nm et en mode TRF à 545 nm sur un appareil TECAN Saphir2 pourvu d'une excitation par lampe flash dont le monochromateur a été réglé à 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation et à 545 nm (bande passante 10 nm) pour l'émission. La mesure en temps résolu a été effectuée après un délai de 100 ps suivant l'excitation et pendant un temps d'intégration de 500 ps ; celle en fluorescence continue a été effectuée sans délai et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps). Après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul on obtient les valeurs présentées dans le tableau 5, dans lequel :
TRF545 représente la mesure du signal du terbium en temps résolu à 545 nm,
H545 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 545 nm, et TRF545 normalisé représente le rapport TRF 545 sur H545 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 10000) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés. Tableau 5
On observe que la valeur H545 est proportionnelle au volume de suspension cellulaire ajoutée. On observe également que la valeur TRF545 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 545 normalisée est globalement constante, en moyenne 1 250 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER2 exprimé par les cellules R1 R2. Cet exemple démontre que la méthode selon l'invention permet de normaliser le signal émis par un cryptate de terbium par la quantité de cellules présentes dans le milieu, et cela en mesurant la fluorescence émise par ce cryptate et le Hoechst 33342 à la même longueur d'onde (545 nm), mais dans des fenêtres temporelles différentes. 3.4. Mesure de l'expression de HER2 (ErbB2) par mesure de fluorescence en temps résolu de émission du terbium à 590 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée à 590 nm en mode fluorescence continue
L'exemple 3.3 a été reproduit mais cette fois la luminescence du cryptate de terbium et de l'Hoechst 33342 a été mesurée à 590 nm. Les valeurs obtenues sont présentées dans le tableau 6, dans laquelle:
TRF590 représente la mesure du signal du terbium en temps résolu à 590 nm,
H590 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 590 nm, et TRF590 normalisé représente le rapport TRF 590 sur H590 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 1000) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés.
Tableau 6
Là encore, la valeur TRF590 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 590 normalisée est globalement constante, en moyenne 1 450 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER2 exprimé par les cellules R1 R2. Cet exemple démontre que la méthode selon l'invention permet de normaliser le signal émis par un cryptate de terbium par la quantité de cellules présentes dans le milieu, et cela en mesurant la fluorescence émise par ce cryptate et le Hoechst 33342 à la même longueur d'onde (590 nm), mais dans des fenêtres temporelles différentes.
Exemple 4. Normalisation du signal d'émission de l'europium permettant la mesure de l'expression d'un récepteur dans une section d'un tissu de cellules tumorales
4.1. Marquage d'un anticorps anti-HER2 par un cryptate d'europium
A un anticorps FRP5 (IRCM / Montpellier) (150 μΙ à 1 ,2 mg/ml dans PBS pH 7), ont été ajoutés 10 μΙ d'une solution de NaHP04 à 0,1 M (pH9) puis 40 μΙ d'une solution de P04 à 0,1 M (pH8), pour obtenir une solution contenant 1 ,3 nmol de FRP5 dans 200 μΙ soit une concentration finale de 6,5 μΜ dans un tampon pH8. 13,5 nmol de EuTBP-NHS (soit 10 eq. de cryptate d'europium, Cisbio Bioassays) ont été ajoutés à cette solution. Après 1 h d'incubation à 20°C, cette solution a été purifiée sur colonne NAP5 (G25) équilibrée dans du tampon phosphate 100 mM pH7. La fraction exclue (300 μΙ) a été collectée pour obtenir une solution contenant l'anticorps FRP5- TBPEu marqué à un taux de 3,4 cryptâtes par anticorps. Cette solution a été congelée en présence de 0,1% de BSA jusqu'à son utilisation.
4.2. Mesure de l'expression de HER2 par mesure de fluorescence en temps résolu de l'émission de l'europium à 585 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée également à 585 nm en mode fluorescence continue
L'exemple 3.2 a été reproduit avec l'anticorps préparé dans l'exemple 4.1. La fluorescence est mesurée à la longueur d'onde de 585 nm à l'aide d'un fluorimètre Rubystar (BMG), pourvu d'une excitation à 337 nm par un laser à azote.
La mesure en temps résolu, correspondant au signal du cryptate d'Europium a été effectuée après un délai de 100 ps suivant l'excitation et pendant un temps d'intégration de 400 ps. La mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue est effectuée sans délai après excitation et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (10 ps).
Après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul on obtient les valeurs présentées dans le tableau 7, dans lequel :
TRF585 représente la mesure du signal du cryptate d'europium en temps résolu à 585 nm, H585 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 585 nm, et TRF585 normalisé représente le rapport TRF 585 sur H585 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 200) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés. Tableau 7
On observe que la valeur TRF585 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 585 normalisée est globalement constante, en moyenne 13 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER2 exprimé par les cellules R1 R2.
Cet exemple démontre que la méthode selon l'invention permet de normaliser le signal émis par un cryptate d'europium par la quantité de cellules présentes dans le milieu, et cela en mesurant la fluorescence émise par ce cryptate et le Hoechst 33342 à la même longueur d'onde (585 nm), mais dans des fenêtres temporelles différentes.
Exemple 5. Normalisation du signal d'émission du terbium permettant la mesure de l'expression d'un récepteur par TR-FRET dans une section d'un tissu de cellules tumorales
5.1. Marquage d'un anticorps anti-HER1 par un cryptate de terbium
Un anticorps anti-HER1 REGF01 (Cisbio Bioassays) (92 μΙ à 5,4 mg/ml) a été dessalé sur une colonne NAP5 (G25) équilibrée dans un tampon phosphate 50 mM pH8. La fraction exclue a été recueillie sous forme d'un éluat de 400μΙ à 1 mg/ml (soit 3 nmol) en tampon phosphate pH8. A cette fraction ont été ajoutées 20 nmol (soit 7 eq.) de Lumi4Tb-NHS (cryptate de terbium, Cisbio Bioassays) en solution dans 2,3 μΙ de DMSO. Après 1 h d'incubation à 20°C l'anticorps marqué a été purifié sur colonne NAP5 (G25) équilibrée dans du tampon phosphate 100 mM pH7. La fraction exclue (400 μΙ) a été collectée pour obtenir ainsi l'anticorps REGF01 marqué à un taux de 4,4 cryptâtes par anticorps. La solution a été congelée en présence de 0,1% de BSA jusqu'à son utilisation.
5.2. Marquage d'un anticorps anti-HER1 par un accepteur de FRET
Un anticorps anti-HER1 REGF08 (Cisbio Bioassays) (200 μΙ à 1 ,6 mg/ml) a été dialysé contre un tampon phosphate 50 m M pH8 (une nuit à 4°C). Après dialyse la fraction recueillie en tampon phosphate pH8 contient l'anticorps à 0,93 mg/ml. A 130 μΙ de cette fraction (soit 0,8 nmol) ont été ajoutées 4 nmol (soit 5 eq.) de fluorophore accepteur activé (d2-NHS ; Cisbio Bioassays) en solution dans 3 μΙ de DMSO. Après 1 h d'incubation à 20°C cette solution a été purifiée sur colonne NAP5 (G25) équilibrée dans du tampon phosphate 100 mM pH7. La fraction exclue (400 μΙ) a été collectée pour obtenir ainsi l'anticorps REGF08 marqué à un taux de 3,3 fluorophores par anticorps. La solution a été congelée en présence de 0,1% de BSA jusqu'à son utilisation. 5.3. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de l'émission du terbium à 490 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée également à 490 nm en mode fluorescence continue
5.3.1. Une cryosectïon R1 R2 préparée dans l'exemple 1 a été placée dans un tube eppendorf dans 180 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 4% de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10ml). Les anticorps REGF01 -Lumi4Tb et REGF08- d2 préparés dans les exemples 5.1 et 5.2 ont été ajoutés de façon à obtenir une concentration finale de 50 nM de chaque anticorps dans le tube. Après incubation pendant une nuit à 30°C, 20 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H 1399 en solution 2mg/ml DMSO) prédiluée 1/100 dans du tampon pH7 ont été ajoutés. Après 10 min d'incubation à l'obscurité, le tube a été centrifugé et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,05 % Tween® 20. Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 10 μΙ, 20 μΙ, 40 μΙ et 100 μΙ de la suspension homogène obtenue ont été déposés dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyrène ») et complétés à 100 μΙ par le même tampon que celui utilisé pour l'étape de sonification. La plaque a ensuite été placée sur un appareil TECAN Saphir2 pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un monochromateur réglé à 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation. Pour les mesures en temps résolu (TRF), la fluorescence a été mesurée à 490 nm après un délai de 100ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400ps ; pour la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue, la fluorescence a été mesurée à 490 nm sans délai après excitation, et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 με).
Après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul on obtient les valeurs présentées dans le tableau 8, dans lequel :
TRF490 représente la mesure du signai du terbium en temps résolu à 490 nm,
H490 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 490 nm, et TRF490 normalisé représente le rapport TRF 490 sur H490 affecté d'un coefficient multiplicateur adéquat (dans cet exemple x 1000) pour avoir un chiffre entier du même ordre de grandeur que les niveaux de fluorescence bruts mesurés. Tableau 8
On observe que la valeur TRF490 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 490 normalisée est globalement constante, en moyenne 11 180 ufa, et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER1 exprimé par les cellules R1 R2.
5.3.2. Evaluation de la contribution du cryptate de terbium au signal mesuré à 665 nm : détermination du « blanc réactif » B665
Pour mesurer l'expression du récepteur HER1 par TR-FRET on peut mesurer l'augmentation d'émission de l'accepteur à 665 nm. Néanmoins la fluorescence mesurée à 665 nm ne correspond pas seulement à la luminescence de l'accepteur puisque le cryptate de terbium est encore faiblement fluorescent à cette longueur d'onde. Ainsi, il est nécessaire de corriger le signal mesuré à 665 nm. Pour cela, on met en présence différentes concentrations d'anticorps REGF08-d2 et d'anticorps REGF0-Lumi4Tb (0,2 nM, 1 nM, 5 nM), en l'absence de Hoechst 33342 et de cellules (mélange ci-après nommé « blanc réactif »), et l'on mesure en temps résolu les signaux émis à 490 et à 665 nm. On obtient les résultats présentés dans le tableau 9, dans lequel :
TRF490 représente le signal mesuré en temps résolu à 490 nm, correspondant essentiellement à l'émission du cryptate de terbium, et
B665 représente le signal mesuré en temps résolu à 665 nm, correspondant essentiellement à l'émission résiduelle du cryptate de terbium à cette longueur d'onde.
Tableau 9
Ces résultats permettent de déterminer la relation entre la luminescence du cryptate de terbium à 490 nm et celle à 665 nm. Cette relation est une fonction linéaire qui permet de calculer, dans les expériences ci-après, et à partir de la valeur de TRF490 mesurée sur l'échantillon, celle de B665 dans cet échantillon. 5.3.3. On reproduit l'exemple 5.3.1 , mais cette fois en mesurant en plus le signal en temps résolu à 665 nm (TRF665), correspondant essentiellement à l'émission du composé accepteur d2 suite au transfert d'énergie entre l'anticorps anti-HER1-Lumi4Tb et l'anticorps anti-HER1-d2. Les résultats sont présentés dans le tableau 10.
Tableau 10
On observe que la valeur Delta F 665 augmente proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de Delta F 665 normalisée est globalement constante, en moyenne 3 920 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER1 exprimé par les cellules R1 R2 et mesurée au travers du processus de TR- FRET. On notera que cette mesure de l'expression utilisant deux anticorps est moins sujette à des phénomènes parasites tels que des interactions non-spécifiques éventuelles entre anticorps et protéines cibles, la mesure étant ici basée sur une double spécificité apportée par le fait d'utiliser deux anticorps. 5.3.4. La même plaque a été placée sur un appareil à filtre de type EnVision pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un monochromateur réglé à 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation. Pour les mesures en temps résolu (TRF), la fluorescence a été mesurée (i) à 490 nm après un délai de 100ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps ; et (ii) à 665 nm après un délai de 60 ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps. Pour la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue, la fluorescence a été mesurée à 490 nm sans délai après excitation, et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps).
Les résultats sont présentés dans le tableau 11. Tableau 11
Ces résultats sont similaires à ceux obtenus avec le fluorimètre TECAN saphir2 dans l'exemple 5.3.3, et cela bien que la limite de sensibilité puisse être très différente entre un appareil à monochromateur comme le TECAN saphir2 et un appareil à filtres comme l'EnVision.
5.5. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de l'émission du terbium à 545 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée également à 545 nm en mode fluorescence continue
L'exemple 5.3.2 a été reproduit, mais cette fois la luminescence du cryptate de terbium et du Hoechst 33342 a été mesurée sur un appareil TECAN Saphir2 pourvu d'une excitation par lampe flash dont le monochromateur a été réglé à 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation et le monochromateur à 545 nm (bande passante 10 nm) pour l'émission. La fluorescence en temps résolu a été mesurée après un délai de 100 ps suivant l'excitation et pendant un temps d'intégration de 500 ps, et la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue a été effectuée sans délai après l'excitation et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps). L'émission résiduelle du cryptate de terbium à 665 nm en l'absence FRET (B665) a été déterminée comme dans l'exemple 5.3.2. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 12, dans laquelle :
TRF545 représente la mesure du signal du terbium en temps résolu à 545 nm, et
H545 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 545 nm.
Tableau 12
Cellules R1 R2 (μΙ) 10 20 40 100
TRF545 3 250 9 330 16 350 51 240
B665 227 355 500 1 240
TRF665 1 380 4 180 7 100 24 780
Delta F665 = 1 150 3 820 6 600 23 540 TRF665 - B665
H545 3 420 9 920 18 500 51 150
Delta F665 3 370 3 850 3 570 4 600 normalisé On observe des résultats similaires à ceux obtenus précédemment, à savoir une augmentation de la valeur TRF665 proportionnellement au volume de suspension cellulaire ajouté dans les puits alors que la valeur de TRF 665 normalisée est globalement constante, en moyenne de 3 850 ufa et représente une mesure du niveau d'expression du récepteur HER1 exprimé par les cellules R1 R2.
Cet exemple montre que l'invention peut être mise en œuvre en détectant les signaux du cryptate de terbium et de l'agent intercalant à 545 nm. 5.6. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de l'émission du terbium à 590 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée à 590 nm en mode fluorescence continue
L'exemple 5.5 a été reproduit, mais cette fois la luminescence du cryptate de terbium et celle du produit Hoechst 33342 ont été mesurées à 590 nm. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 13, dans lequel :
TRF590 représente la mesure du signal du terbium en temps résolu à 590 nm, et
H590 représente la mesure du signal du Hoechst 33342 en fluorescence continue à 590 nm.
Tableau 13
Ces résultats sont similaires à ceux obtenus précédemment et montrent que l'invention peut être mise en œuvre en mesurant la luminescence du cryptate de terbium et de l'Hoechst 33342 à 590 nm. Exemple 6. Normalisation du signal d'émission TR-FRET permettant la mesure de la dimérisation d'un récepteur dans une section d'un tissu de cellules tumorales
6.1. Marquage d'un anticorps anti-HER2 par un cryptate de terbium
L'anticorps anti-HER2 trastuzumab (nom commercial, « Herceptine ») a été marqué par le cryptate de terbium Lumi4Tb, comme décrit dans l'exemple 5.1.
6.2. Marquage d'un anticorps anti-HER1 par un accepteur de FRET
L'anticorps anti-HER1 cetuximab (nom commercial « Erbitux ») a été marqué par un accepteur de FRET, le « d2 », comme décrit dans l'exemple 5.2. 6.3. Mesure de l'hétérodimérisation de récepteurs HER1-HER2 par mesure TR-FRET de l'émission du terbium à 545 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par la fluorescence d'un intercalant mesurée à 545 nm en mode fluorescence continue
Dans cet exempte, le signal émis à 665 nm résulte d'un transfert d'énergie entre les deux anticorps marqués, lorsqu'ils se lient à un dimère HER1 -HER2.
Deux cryosections R1 , ou bien R2, ou bien R1 R2, préparées dans l'exemple 1 et de 50 μιη d'épaisseur ont été placées dans un tube eppendorf dans 180 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 10% de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml). Les anticorps trastuzumab-Lumi4Tb et cetuximab-d2 préparés dans les exemples 6.1 et 6.2 ont été ajoutés de façon à obtenir une concentration finale de 50 nM de chaque anticorps. Après incubation pendant une nuit à 37°C, 20 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 en solution 2 m g/ml DMSO) prédiluée au 1/100 dans du tampon pH7 ont été ajoutés. Après 5 min d'incubation à l'obscurité le tube a été centrifugé 2 min à 12 000 tr/min et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,1 % de BSA.
Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300 μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10 ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 100 μΙ de la suspension homogène obtenu ont été déposés (en doublet) dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyrène »).
La plaque a ensuite été placée sur un appareil TECAN Infinité F500 pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un filtre 340 nm (bande passante 20 nm) à l'excitation. On effectue la lecture en mode fluorescence continue avec un filtre 544 nm (bande passante 25 nm) et en mode TRF à 544 nm (bande passante 25 nm) (compte-tenu de la largeur de bande, équivalent à une mesure à 545 nm) et 665 nm (bande passante 5 nm). La mesure en temps résolu a été effectuée après un délai de 100 ss suivant l'excitation et pendant un temps d'intégration de 400 μβ, et la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue a été effectuée sans délai après l'excitation et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps).
La contribution du cryptate de terbium à 665 nm a été calculée pour chaque mesure comme dans l'exemple 5.3.2. Les résultats obtenus après soustraction du bruit de fond mesuré sur du tampon seul sont présentés dans le tableau 14. Tableau 14
Le signal TRF 545 est représentatif de la fixation de l'anticorps anti-HER2 (trastuzumab- Lumi4Tb), et donc de l'expression du récepteur R2. La normalisation de ce signal par la méthode selon l'invention permet de comparer les niveaux d'expression de HER2 dans différents échantillons : ainsi, le signal TRF545 normalisé apparaît équivalent dans les échantillons R1 R2 et R2, alors qu'il était 3 fois plus important dans l'échantillon R2 que dans l'échantillon R1 R2 avant normalisation (TRF545).
Le signal Delta F665 Normalisé est représentatif de la présence d'hétérodimères entre récepteurs HER1 et HER2 : les valeurs de delta F665 normalisés confirme la présence d'hétérodimères dans l'échantillon R1 R2 et leur absence dans les échantillons R1 et R2. 6.4. Mesure de l'hétérodimérisation de récepteurs HER1-HER2 par mesure TR-FRET de l'émission du terbium à 490 nm et de l'accepteur à 665 nm et normalisation par la fluorescence d'un intercalant mesurée à 490 nm en mode fluorescence continue
La même plaque a été placée sur un appareil à filtre de type Pherastar FS pourvu d'une excitation par lampe flash et de filtres disponibles sous forme de modules optiques ; pour obtenir les valeurs de fluorescence à 665 nm il faut faire une mesure indépendante en changeant le module optique. Pour les mesures en temps résolu (TRF), la fluorescence a été mesurée (i) à 490 nm après un délai de 100ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps ; et (ii) à 665 nm après un délai de 100 ps suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 ps. Pour la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 en fluorescence continue, la fluorescence a été mesurée à 490 nm sans délai après excitation, et pendant le temps d'intégration minimum possible sur l'appareil (20 ps).
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 5. Tableau 15
Ces résultats sont similaires à ceux de l'exemple 6.3.
Exemple 7. Immunodosage TR-FRET subséquent au marquage normalisateur
Dans cet exemple, le protocole utilisé varie de celui des exemples précédents : il comprend les étapes suivantes : Mise en contact de l'agent intercalant avec des cellules ou un échantillon de tissu, Lavage, Sonication, Transfert dans microplaque, Ajout au milieu de mesure des composés fluorescents (donneur, accepteur), Lecture de la microplaque avec un fluorimètre (signal donneur, signal accepteur, signal agent intercalant).
Une cryosection R1 R2 de 50 μιη d'épaisseur, préparée dans l'exemple 1 , a été placée dans un tube eppendorf dans 270 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 0,1 % de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml). 30 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 en solution 2 mg/ml DMSO) prédiluée au 1/100 dans du tampon pH7 ont ensuite été ajoutés. Après 10 min d'incubation à l'obscurité le tube a été centrifugé pendant 2 min à 12 000 tr/min et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,1 % de BSA. Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300 μΙ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip ») et l'homogénat obtenu a été dilué trois fois. 20 μΙ, 40 μΙ et 80 μΙ de cette suspension ont été déposés (en doublet) dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyrène ») et complétés avec du tampon de façon à obtenir un volume total de 80 μΙ par puits (nommés respectivement H20, H40 et H80). Des puits B20, B40 et B80 ont été préparés selon la même procédure mais en omettant l'Hoechst 33342, pour constituer un signal « blanc ».
On a ajouté dans tous les puits une solution d'un mélange de deux anticorps marqués, le cetuximab-Lumi4Tb (anticorps anti-HER1 marqué à un taux de 7,5 cryptâtes de terbium Lumi4Tb par anticorps selon le protocole décrit dans l'exemple 5.1) et l'anticorps Ab10-d2 (anticorps anti-HER1 Ab10 ThermoFisher marqué à un taux de 2,1 accepteurs de FRET « d2 »par anticorps selon un protocole décrit dans l'exemple 5.2) de façon à obtenir une concentration finale dans les puits de 1 nM en cetuximab-Lumi4Tb et 2 nM en Ab10-d2. La fluorescence du composé Hoechst 33342 a été ensuite mesurée avec un filtre 490 nm (10 nm) à l'émission et un filtre 337 nm (20nm) à l'excitation sur un appareil Pherastar FS, équipé d'une lampe flash, en utilisant le mode « TRF avancé » et un découpage en délais de 5ps.
Après exportation des données dans un logiciel de type « tableur » on retraite les données en calculant les intensités de fluorescence mesurées à 490 nm correspondant à des fenêtre temporelles 30-45 ps (signal H490) et en faisant la somme des chiffres obtenus dans chaque intervalle élémentaire de 5 ps.
Ces mesures ont en effet montré que sur cet appareil particulier, il est nécessaire de mesurer la fluorescence du Hoechst 33342 sur la fenêtre temporelle 30-45 ps, et d'éviter de mesurer le signal immédiat (0-30 ps) qui provoque une saturation du lecteur. Il aurait également été possible de mesurer directement la fluorescence du Hoechst 33342 avec un délai de 30 ps et un temps d'intégration de 15 ps. La fluorescence en temps résolu à 490 nm (TRF490, correspondant essentiellement au signal du cryptate de terbium) et celle à 665 nm (TRF665, fluorescence de l'accepteur) ont été mesurées comme dans l'exemple 6.3 mais avec un délai de 60 ps et un temps d'intégration de 340 ps. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 16.
Tableau 16
On observe une augmentation à la fois du signal de Hoechst (H490) et du signal de FRET et ces signaux sont proportionnels à la quantité de lysat ajouté, comme observé dans les exemples précédents. Le signal de TR-FRET à 665 nm normalisé par le signal H490 donne une valeur moyenne d'environ 11 000 ufa représentant la quantité de récepteur HER1 exprimée par les cellules de type R1 R2. Exemple 8. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de émission du terbium à 490 nm et d'un accepteur de FRET, compatible avec le terbium et émettant vers 520 nm et normalisation par fluorescence d'un intercalant mesurée à 490 nm ou 520 nm en mode fluorescence continue
8.1. Marquage d'un anticorps par de l'Alexa-488 comme accepteur de FRET
L'anticorps REGF01 (33 pl à 3 mg/ml dans du PBS soit 100 a été dilué par 66 μΙ de tampon carbonate 0,1 M pH 8.5 et 6 μΙ d'une solution d'Alexa-488 (InVitroGen) 1 ,2 mM dans le DMSO ont été ajoutés. Après une heure d'incubation à température ambiante le mélange réactionnel a été purifié sur une colonne NAP-5 équilibrée dans du tampon phosphate 100mM pH7. Un spectre UV de la fraction exclue (300 μΙ) montre que l'anticorps est marqué à un taux de 2 molécules d'Alexa-488 par molécule d'anticorps.
8.2.1. Une cryosection R1 R2 préparée dans l'exemple 1 a été placée dans un tube eppendorf dans 360 μΙ de tampon PBS pH7 contenant 0,1 % de BSA (qualité « protease free ») et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml) et 40 μΙ d'une solution de Hoechst 33342 (InVitroGen # H1399 en solution 2mg/ml DMSO) prédiluée à 1/100 dans du tampon pH7 ont été ajoutés. Après 10 min d'incubation à l'obscurité, le tube a été centrifugé et lavé par 3 fois 400 μΙ de tampon PBS + 0,1 % BSA. Le culot formé par la cryosection a été repris dans 300 μΐ de tampon PBS contenant 0,1 % de BSA et un inhibiteur de protéase (« complète mini » Roche # 04 693 124 001 ; 1 comprimé / 10 ml). Le tube a été maintenu dans la glace et soumis à une sonification (5 s à 20% de la puissance avec un sonificateur Branson 450 pourvu d'une sonde « micro tip »). 10 μΙ, 20 μΙ et 40 μΙ de la suspension homogène obtenue ont été déposés dans des puits d'une microplaque (Costar # 3694 96 « well half area flat bottom black polystyren ») puis complétés à 80 μΙ par le même tampon que celui utilisé pour l'étape de sonification et on a déposé dans plusieurs puits 80 μΙ du même tampon pour constituer des « blancs tampon » (BT).
Les anticorps REGF08-Lumi4Tb et REGF01 -Alexa488 préparés en suivant les exemples 5.1 et 8.1 ont été ajoutés de façon à obtenir une concentration finale de 1 nM de l'anticorps REGF08- Lumi4Tb et 2nM de l'anticorps REGF01-Alexa488 dans les puits, on a également ajouté 20 μΙ du mélange d'anticorps à 80 μΙ de tampon de façon a obtenir un « blanc réactif » (BR) (ici on a utilisé une seule concentration d'anticorps pour calculer la contribution à 520 nm du donneur dans les puits « essai »).
8.2.2. La plaque a ensuite été placée sur un appareil PHERAstar FS pourvu d'une excitation par lampe flash et d'un monochromateur réglé à 340 nm (20 nm) à l'excitation. Pour les mesures en temps résolu (TRF), la fluorescence a été mesurée à 490 nm après un délai de 60 μβ suivant l'excitation, et pendant un temps d'intégration de 400 με ; pour la mesure de fluorescence du Hoechst en fluorescence continue, la fluorescence a été mesurée à 490 nm sans délai après excitation en utilisant le protocole « Fluorescence » prévu dans le logiciel de l'appareil. μΙ de suspension cellulaire 0 10 20 40
H490 (Fluorescence 490 nm après ajout Ac) 8 880 21 200 31 500 49230
On observe que l'intensité de fluorescence mesurée à 490 nm en mode continu est proportionnelle à la quantité de suspension cellulaire déposée dans les puits. μΙ de suspension cellulaire 0 10 20 40
H520 (Fluorescence 520 nm après ajout Ac) 1 115 12 418 22 840 40 120
La fluorescence a été mesurée à 520 nm en utilisant la même plaque sur le même appareil PHERAstar FS sans délai après excitation en utilisant le protocole « Fluorescence » prévu dans le logiciel de l'appareil. On observe que l'intensité de fluorescence mesurée à 520 nm en mode continu est aussi proportionnelle à la quantité de suspension cellulaire déposée dans les puits. La mesure de fluorescence du complexe Hoechst-DNA peut être mesurée indifféremment à la longueur d'onde prévue pour la mesure de fluorescence du donneur ou de l'accepteur.
La même plaque a ensuite été mesurée en mode TRF (délai de 60 ps suivant l'excitation, et temps d'intégration de 400 ps). Dans ce cas du fait du fort transfert on observe que la normalisation met en évidence un effet crochet. Dans ce cas la variation de fluorescence à 520 nm a tendance à diminuer avec la quantité de suspension cellulaire ajoutée, alors que la fluorescence H490 augmente bien avec la quantité de suspension cellulaire ajoutée. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 17.
Tableau 17
Exemple 9. Mesure de l'expression des récepteurs HER1 (EGFR) par mesure de TR-FRET de l'émission du terbium à 490 nm et d'un accepteur de FRET compatible avec le terbium et normalisation par la fluorescence d'une protéine fluorescente (GFP) mesurée à 490 nm, 545 nm ou 590 nm en mode fluorescence continue
9.1. Obtention d'une lignée cellulaire polyclonale exprimant de façon stable des récepteurs HER1 (EGFR) et transfection transitoire d'une protéine fluorescente (GFP):
Des cellules HEK (fond HEK ATCC) ont été transfectées en présence de Lipofectamine 2000 en utilisant un plasmide codant pour le récepteur HER1 (EGFR), ce plasmide comportant également un gène de résistance à la Généticine. Apres transfection les cellules ont été soumises à une sélection par ajout de Généticine (0,6 mg/ml) dans le milieu de culture de façon à sélectionner la population de cellules résistantes ayant intégrées le plasmide de façon stable. Les cellules (population polyclonale) ainsi obtenues sont nommées HEK-EGFR.
Transfection transitoire de la lignée polyclonale HEK-EGFR avec GFP (Cellules HEK-EGFR- GFP) :
Aux cellules HEK-EGFR en flasque T175 (cellules à environ 70% de confluence soit ~ 20 millions de cellules) a été ajouté un mélange composé de 8 ml de milieu optiMEM + 60 μΙ Lipofectamine 2000 + 20 pg de plasmide pmaxGFP (contrôle positif du kit Amaxa Nucléofection) préalablement incubé pendant 20 min à température ambiante, puis on a ajouté sur les cellules 12 ml de milieu complet + Généticine 0,6 mg/ml.
Après 24h d'incubation dans l'incubateur (37°C + C02) les cellules sont lavées (PBS), décollées avec 5 ml de « Cell Dissociation Buffer » (Sigma) ; la suspension de cellules a été ensuite centrifugée et le culot repris dans du tampon KREBS. Après comptage des cellules sur le compteur ViaCell la suspension a été diluée par du tampon KREBS de façon à ajuster la concentration, puis les suspensions diluées ont été distribuées dans les puits d'une plaque de microtitration noire Cellstar 96 puits (prétraitées à la Poly-Ornithine) de façon à avoir une densité cellulaire connue par exemple de 25K (= 25 000 cellules), 50K et 200K cellules HEK- EGFR-GFP dans un volume de 100 μΙ par puits.
On constitue également des « blancs tampon» en ajoutant 100 μΙ de tampon Krebs dans des puits adjacents.
9.2. Mesures de fluorescence en mode « fluorescence continue » sur des cellules HEK-EGFR- GFP :
Les spectres d'émission de fluorescence (mode continu) des puits d'une plaque comportant des séries de puits contenants respectivement 25K, 50Ket 200K cellules ont été enregistrés sur un appareil TECAN Saphir 2 avec les paramètres suivants en utilisant la longueur d'onde préférée pour l'excitation de la GFP située dans le proche ultra-violet. La GFP sauvage (wild type : wGFP) a deux maxima d'excitation, à 395 nm (lumière UV) et à 475 nm (lumière bleue) (extinction coefficient respectifs de 30,000 M"1 cm"1 et 7,000 M"1 cm"1) :
Excitation 395 nm (20 nm)
Emission (5 nm)
Délai 0 ps
Intégration 20 ps
Gain 171
Le spectre obtenu montre un maximum d'émission vers 500 nm (Figure 2). Les spectres d'émission de fluorescence (mode continu) des puits de la même plaque ont été enregistrés sur l'appareil TECAN Saphir 2 avec les paramètres suivants en utilisant une longueur d'onde d'excitation de 340 nm habituellement utilisée pour l'excitation des complexes de lanthanides sans changer les autres paramètres :
Excitation 340 nm (20 nm)
Emission (5 nm)
Délai 0 ps
Intégration 20 ps
Gain 171
Le spectre obtenu montre un maximum d'émission vers 500 nm dont l'intensité est environ moitié de celle observé en excitant à 395 nm (Figure 3).
Les intensités de fluorescence des puits de la même plaque ont été mesurées sur l'appareil TECAN Saphir 2 :
a) Soit en utilisant la longueur d'onde habituellement préférée pour mesurer la fluorescence de la GFP :
Excitation 395 nm (20 nm)
Emission 509 (10 nm)
Délai 0 ps
Intégration 20 ps
Gain 150
b) Soit une longueur d'onde d'excitation de 340 nm habituellement utilisée pour l'excitation des complexes de lanthanides :
Excitation 340 nm (20 nm)
Et en mesurant les intensités de fluorescence aux longueurs d'onde correspondant aux principales lignes d'émission du terbium (490 nm et 545 nm) ainsi qu'à 509 nm la longueur d'onde habituellement utilisée pour mesurer la fluorescence de la GFP. Emission 490 (10 nm), Emission 509 (10nm), Emission 545 (10 nm)
Délai 0 ps
Intégration 20 ps
Gain 150
Les résultats (moyenne de 10 mesures) ont été regroupés dans le tableau 18. Tableau 18
Cet exemple montre que la GFP peut être excitée à la longueur d'onde de 340 nm à la place de la longueur d'onde de 395 nm habituellement utilisée. De même la fluorescence peut être mesurée préférentiellement à 490 nm et à 545 nm, c'est aussi possible à 590 nm mais il faut dans ce cas, et avec les cellules utilisées dans cet exemple, un minimum de 50K cellules pour avoir un rapport signal/bruit correct.
Il a été observé que de façon inattendue le coefficient de corrélation correspondant à une régression linéaire indique une meilleure linéarité pour les conditions correspondant à une excitation à 340 nm et plus particulièrement pour la mesure utilisant le couple [Ex 340 nm ; Em 490 nm] correspondant aux conditions d'excitation utilisées pour les mesures d'intensités sur des complexes de terbium. 9.3. Mesures de l'expression du récepteur EGFR par TR-FRET et normalisation par mesure en en mode « fluorescence continue » de l'émission de la GFP sur des cellules HEK-EGFR-GFP : A la plaque précédente on a ajouté 10 μΙ d'une solution contenant de l'anticorps REGF-08- Lumi4 Tb (25nM) et de l'anticorps REGF01 -Alexa488 (25nM) dans du tampon (PBS + 0,1 % BSA) dans les puits contenant des quantités connues de cellules HEK-EGFR-GFP ainsi que dans un des puits contenant du tampon Krebs de façon à constituer un « blanc réactif » (BR). Le « blanc réactif » permet de calculer la contribution du terbium dans le canal « accepteur » 520 nm et de pouvoir calculer la variation de fluorescence à 520 nm provenant du FRET et ainsi de pouvoir doser l'expression du récepteur EGFR.
La mesure en mode fluorescence continue donne les valeurs suivantes, la variation d'émission de l'accepteur à 520 nm est calculé comme dans l'exemple 8 en calculant la contribution de l'émission du terbium dans le canal 520 nm (B520) en se servant comme calibrateurs de puits ne contenant que des anticorps marqués dans du tampon. Delta 520 = E520 - B520 cette valeur représente le signal de FRET correspondant à la mesure de l'expression du récepteur EGFR. La valeur Delta 520N = (Delta 520 / F 490) x 10 000 correspond à la valeur de l'expression du récepteur EGFR normalisé de la mesure de fluorescence F490c (signal de la GFP).
La plaque a été lue sur un appareil PHERAstar FS avec excitation par lampe flash en mode fluorescence avec un filtre 340 nm à l'excitation et des filtres 490 et 520 à l'émission. cellules 25K 50K 200K
E490 15 880 23 900 49 780 cellules 25K 50K 200K
F520 54 000 62 190 88 170
La fluorescence de la GFP a pu donc être mesurée soit à la longueur d'onde d'une des raies d'émission du terbium (490 nm) soit à la longueur d'onde d'émission de l'accepteur (520 nm) (lui-même excité par FRET à partir du terbium). Dans les deux cas l'émission de fluorescence est proportionnelle au nombre de cellules (quantité de matière biologique).
Les mesures en mode TRF a été effectuée avec les paramètres suivants :
Module optique : 337, 520, 490
Excitation : 337 nm
Délai : 60 με
Intégration : 400 ps Les résultats sont regroupés dans le tableau 19.
Tableau 19
On a observé que le signal Delta 520 mesuré en mode temps résolu augmente proportionnellement au nombre de cellules contenu dans chaque puits, mais que le Delta 520N représentant l'expression du récepteur (normalisée par la mesure de fluorescence mesurée à 490 nm en mode fluorescence continu) est constante, en moyenne 2 040 ufa. Ainsi il est possible d'utiliser la fluorescence d'une protéine comme la GFP pour normaliser un signal de TR-FRET.
Exemple 10. Marquage des cellules au chlorure de dansyle
Des cellules polyclonales exprimant de façon stable l'EGFR (voir exemple 9) ont été utilisées. Environ 2 000 K cellules (2 x 106 cellules) en suspension dans 1 ml de tampon Krebs dans un eppendorf de 1 ,5 ml ont été centrifugées 10 min à une force centrifuge relative (RCF) de 8 000 puis lavées par 3 fois 300 μΙ de tampon NaHC03 0,1 M pH 9 et ensuite remise en suspension dans 150 pl de tampon NaHC03. On a préparé une solution de chlorure de dansyle 5 mM dans un mélange (3/2) de dioxane et de tampon NaHC03 0,1 M, puis on a ajouté 3 μΙ de cette solution à la suspension de cellules. Après 30 min d'incubation sous agitation mécanique le tube a été centrifugé 10 min à une RCF de 8 000, le surnageant éliminé, puis le culot a été remis en suspension dans 300 μΙ de tampon carbonate, puis centrifugé 10 min ; cette opération a été répétée encore une fois avec 300 μΙ de tampon carbonate puis une fois avec 300 μΙ de PBS.
Le culot a été remis en suspension dans 500μΙ de tampon PBS contenant 0,2% de BSA et un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10 ml). Le tube est refroidi dans la glace et soumis à une sonication (5 s à 20% de la puissance) puis la suspension est déposée dans les puits d'une microplaque 10, 20, 40 et 80 μΙ en complétant à 80 μΙ avec le même tampon.
La préparation des cellules marquées par le groupe dansyle a été inspirée de la publication d'Y.Uratani Journal of Bacteriology 1982 (p. 523-528).
Un spectre d'émission enregistré sur un appareil TECAN Saphir II avec les paramètres suivants a montré (Figure 4) un maximum d'émission de fluorescence vers 500 nm correspondant aux données de fluorescence connus pour les dérivés de dansyle (Excitation 330 nm, Emission 510 nm).
Excitation 340 nm (20 nm)
Bande passante d'émission : 5 nm
Gain : 158
Intégration : 20 ps
Délai : 0 ps
La fluorescence (mode continu) a été également mesurée à des longueurs d'ondes fixes correspondant à des lignes d'émission du terbium ou de l'europium (490 nm, 545 nm, 590 nm, 620 nm) ainsi qu'à 520 nm correspondant à la longueur d'onde d'émission d'un accepteur tel que l'Alexa-488 ou la fluorescéine en utilisant les paramètres suivants :
Excitation : 340 nm (bande passante : 20 nm)
Bande passante d'émission : 10 nm
Délai : 0 ps
Intégration : 20 ps
Les résultats sont regroupés dans le tableau 20. Tableau 20
On a observé qu'aux diverses longueurs d'onde d'émission testées, la fluorescence est proportionnelle à la quantité de matériel biologique, marqué par du chlorure de dansyle, présent dans les puits.
Mesure de l'expression des récepteurs REGF par HTRF sur lysat cellulaire après marquage au chlorure de dansyle
Dans les puits d'une microplaque contenant 10 μΙ, 20 μΙ et 40 μΙ de lysat cellulaire obtenu après marquage au chlorure de dansyle ont été ajoutés les anticorps anti-REGF marqués, REGF08- Lumi4Tb et REGF01 -d2 préparés en suivant l'exemple 5.1 , de façon à obtenir une concentration finale dans les puits respectivement de 2,7 nM (REGF08-Lumi4Tb) et 7,3 nM (REGF01-d2). Un puits ne contenant que les anticorps marqués (« Blanc Réactif ») a été utilisé pour mesurer la contribution du cryptate de terbium à 665 nm (B 665) qui a servi pour le calcul de la variation du signal TRF 665 (Delta 665) dû au FRET. Une lecture de fluorescence a été effectuée sur un appareil PHERAStar FS avec excitation par lampe flash et en utilisant les paramètres suivants :
Mode fluorescence (continue):
Excitation 337 nm
Emission 490 nm
Mode TRF :
Excitation 337 nm
Emission A 665 nm
Emission B 490 nm
Intégration 60 με
Intégration 400 ps
Lampe flash
Les résultats sont regroupés dans le tableau 21. Tableau 21
On a observé que variation de fluorescence en mode temps résolu (Delta 665) augmente avec la quantité de matériel biologique introduit dans les puits. Le Delta 665 normalisé par la mesure de fluorescence à 490 nm (delta 665N) représente l'expression du récepteur cette valeur en moyenne 750 ufa est indépendante de la quantité de matériel cellulaire.
Exemple 11. Comparaison entre le signal du Hoechst 33342 mesuré selon l'invention et celui obtenu par une méthode de référence de quantification des protéines (kit Quantipro™ Sigma)
Des cryosections de tissus (tumeur) de 50μητι d'épaisseur dans 200μί de tampon PBS (sans ajout de BSA) contenant un inhibiteur de protéase (Roche 1 comprimé / 10ml) ont été marquées au Hoechst 33342 (20μί d'une solution 100 μg/mL PBS). Après 10 min d'incubation le tube a été centrifugé (3 min à 2 000 tr/min) et le culot lavé par 2 fois 200 μΙ de tampon PBS (sans ajout de BSA) contenant un inhibiteur de protéase; le culot repris par 300μί de même tampon a été refroidi dans la glace puis soumis à une sonification, dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 7. Un volume de 90 μΙ de chaque homogénat a été dilué de moitié dans du tampon PBS puis la concentration en protéines totales a été mesurée à l'aide du kit Quantipro™ BCA Sigma, au format microplaque 96 puits en suivant le protocole du kit. Les valeurs d'absorbance ont été converties en concentration de protéines totales exprimées en μg/ml en utilisant une droite de calibration obtenue à l'aide d'une gamme de concentration en BSA. Les concentrations en protéines totales mesurées sont reportées dans le tableau 22.
En parallèle, 50μί de chaque homogénat ont été déposés (doublets) dans les puits d'une plaque de microtitration (Corning® « black 96 well half-area ») et la lecture de fluorescence a été effectuée sur un appareil à de type Pherastar FS pourvu d'une excitation par lampe flash, d'un filtre d'excitation à 337 nm et d'un filtre d'émission à 490nm (modules optiques HTRF). Les mesures en temps résolu (TRF) ont été effectuées en mode « decay curve » permettant l'acquisition de la fluorescence par « pas » de 2 με. Pour la mesure de fluorescence du Hoechst 33342 la fluorescence a été mesurée à 490 nm dans un intervalle de 38 à 42 μβ par sommation de la fluorescence des pas 38 à 42 (Raw Data 490 B obtenues sous forme de tableau Excel par le logiciel MARS permettant l'exportation des données obtenues sur l'appareil Pherastar). Ces mesures de fluorescence (F490 {38-42} sont reportées dans le tableau 22.
Tableau 22
Le signal du Hoechst mesuré dans les conditions de l'invention est bien corrélé avec celui obtenu par une méthode classique de quantification des protéines (R2 = 0.847). Les deux méthodes peuvent donc être utilisées de manière satisfaisante pour estimer la quantité de matériel biologique présent dans un échantillon, mais la normalisation selon l'invention présente l'intérêt supplémentaire de ne pas être destructive de l'échantillon, alors que le kit Quantipro® nécessite la destruction d'un tiers de cet échantillon.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, c) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue,
d) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue,
e) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape d), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 ps, cette luminescence correspondant principalement à celle du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) calcul d'un signal de luminescence normalisé correspondant au ratio : (signal obtenu à l'étape e) / (signal obtenu à l'étape d).
2. Procédé de mesure de la luminescence d'un composé fluorescent à durée de vie longue présent dans un milieu de mesure, ledit milieu contenant un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent à durée de vie longue, b) introduction dans le milieu de mesure d'un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET,
c) introduction dans le milieu de mesure d'un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue, d) excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption du composé fluorescent à durée de vie longue,
e) mesure de la luminescence émise par le milieu de mesure immédiatement après l'excitation dudit milieu, correspondant principalement à la luminescence de l'agent de marquage, et pendant une durée de 5 ns à 45 ps, à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue,
f) optionnellement, mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure à la même longueur d'onde que celle utilisée à l'étape e), après un délai de 20 à 200 ps suivant l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 1000 g) mesure en temps résolu de la luminescence émise par le milieu de mesure après un délai de 20 à 200 ps après l'excitation du milieu de mesure et pendant une durée de 200 à 600 ps, à la longueur d'onde d'émission du composé accepteur,
h) détermination d'un signal de TR-FRET normalisé comprenant le calcul du ratio : (signal obtenu à l'étape g) / [(optionnellement signal obtenu à l'étape f)) X (signal obtenu à l'étape e)].
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que :
- le composé fluorescent à durée de vie longue est un cryptate ou un chélate d'europium ; - l'agent de marquage fluorescent est un agent dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm et émettant notamment aux longueurs d'onde de 588 nm +/-10 nm ou 620 nm +/-10 nm ;
- la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue et celle de l'agent de marquage fluorescent sont toutes deux mesurées à la longueur d'onde de 588 nm +/-10 nm ou 620 nm +/-10 nm.
4. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que :
- le composé fluorescent à durée de vie longue est un cryptate ou un chélate de terbium ;
- l'agent de marquage fluorescent est un agent dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm et émettant notamment aux longueurs d'onde de 490 nm +/-10 nm, 545 nm +/-10 nm ou 590 +/-10 nm ;
- la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue et celle l'agent de marquage fluorescent sont toutes deux mesurées à la longueur d'onde de 490 nm +/-10 nm, 545 nm +/-10 nm ou 590 +/-10 nm.
5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que :
- dans l'étape c), l'agent de marquage est un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur,
- dans l'étape e), la luminescence est mesurée à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent accepteur
- dans l'étape f) si elle est présente, la luminescence est mesurée à une longueur d'onde correspondant à un pic d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que :
- le composé fluorescent à durée de vie longue est un cryptate ou un chélate d'europium ou de terbium,
- l'agent de marquage fluorescent est un agent dont le spectre d'absorption permet une excitation à une longueur d'onde comprise entre 330 et 350 nm et émettant une longueur d'onde comprise entre 450 et 650 nm, en particulier entre 490 et 600 nm, et
-la luminescence du composé fluorescent accepteur et celle de l'agent de marquage fluorescent sont toutes deux mesurées à une longueur d'onde comprise dans ces intervalles.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une deuxième étape d'excitation du milieu de mesure à une longueur d'onde correspondant à un pic d'absorption dudit composé fluorescent à durée de vie longue, cette deuxième excitation étant effectuée immédiatement avant la première étape de mesure de la luminescence en temps résolu.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi : un extrait de tissu, en particulier une coupe histologique ; un échantillon de tumeur ; des cellules issues d'une culture cellulaire.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que l'échantillon biologique a fait l'objet d'un traitement visant à homogénéiser ledit échantillon sous forme de lysat cellulaire, et cela préalablement à l'introduction des composés fluorescents dans le milieu de mesure.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'échantillon biologique a fait l'objet d'un traitement visant à homogénéiser ledit échantillon sous forme de lysat cellulaire, et cela postérieurement à l'introduction des composés fluorescents dans le milieu de mesure.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le composé fluorescent à durée de vie longue est un complexe métallique fluorescent, choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; un chélate de ruthénium ; un quantum dye.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que l'agent de marquage est choisi parmi : un agent intercalant fluorescent, une protéine fluorescente, un composé fluorescent marqueur des mitochondries, un composé fluorescent se liant aux fonctions aminés des protéines, un composé fluorescent qui s'accumule dans les membranes lipidiques.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que l'agent de marquage est un agent intercalant fluorescent.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'agent intercalant fluorescent est choisi parmi les composé suivants : Hoechst 33258 ; Hoechst 33342; Hoechst 34580 ; DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole).
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que le composé fluorescent accepteur, lorsqu'il est présent, est choisi parmi : les allophycocyanines, en particulier celles connues sous la dénomination commerciale XL665 ; les molécules organiques luminescentes, telles que les rhodamines, les cyanines (comme par exemple Cy5), les squaraines, les coumarines, les proflavines, les acridines, les fluorescéines, les dérivés du boron-dipyrrométhène (en particulier ceux connus sous la dénomination « Bodipy ») ; les fluorophores connus sous la dénomination « Atto » ;, les fluorophores connus sous la dénomination «DY» ; les composés connus sous la dénomination « Alexa » ; le nitrobenzoxadiazole ; les protéines fluorescentes.
16. Trousse de réactifs comprenant :
un composé fluorescent à durée de vie longue ;
un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue ;
optionnellement, un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET.
17. Trousse de réactifs selon la revendication 16, caractérisée en ce que :
le composé fluorescent à durée de vie longue est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ; l'agent de marquage fluorescent a un spectre d'absorption permettant son excitation entre 330 et 350 nm et spectre d'émission autorisant la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent à durée de vie longue.
18. Trousse de réactifs comprenant :
un composé fluorescent à durée de vie longue ;
un composé fluorescent accepteur dont le spectre d'absorption est compatible avec le spectre d'émission du composé fluorescent à durée de vie longue, le composé fluorescent à durée de vie longue et le composé fluorescent accepteur étant partenaires de FRET ;
un agent de marquage fluorescent dont le spectre d'absorption permet son excitation à la même longueur d'onde que celle utilisée pour exciter le composé fluorescent à durée de vie longue, et le spectre d'émission permet la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur.
19. Trousse de réactifs selon la revendication 18, caractérisée en ce que :
le composé fluorescent à durée de vie longue est choisi parmi : un cryptate d'europium; un chélate d'europium ; un chélate de terbium ; un cryptate de terbium ;
l'agent de marquage fluorescent a un spectre d'absorption permettant son excitation entre 330 et 350 nm et une spectre d'émission autorisant la mesure de sa luminescence à la même longueur d'onde que celle utilisée pour mesurer la luminescence du composé fluorescent accepteur.
20. Trousse selon l'une quelconque des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que l'agent de marquage est choisi parmi : un agent intercalant fluorescent, une protéine fluorescente, un composé fluorescent marqueur des mitochondries, un composé fluorescent se liant aux fonctions aminés des protéines, un composé fluorescent qui s'accumule dans les membranes lipidiques.
21. Trousse selon l'une des revendications 16 à 19, caractérisée en ce que l'agent de marquage est un agent intercalant fluorescent.
22. Trousse selon la revendication 21 , caractérisée en ce que l'agent intercalant fluorescent est choisi parmi les composés suivants : Hoechst 33258 ; Hoechst 33342; Hoechst 34580 ; DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole).
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