ES2219324T3 - Determinacion de formas biologicamente activas de enzimas proteoliticas. - Google Patents
Determinacion de formas biologicamente activas de enzimas proteoliticas.Info
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Abstract
Procedimiento para la evaluación de una enzima proteolítica activa en la sangre u otra muestra de fluido biológico que comprende posiblemente un complejo de dicha enzima proteolítica y á2- macroglobulina, caracterizado porque dicha muestra establece contacto con un substrato que comprende una molécula que tiene un valor de Mr superior a 10kD acoplado a un substrato-señal, comprendiendo dicho substrato-señal un grupo cedente detectable, en el que dicho substrato es hidrolizado por dicha enzima proteolítica pero no por dicho complejo.
Description
Determinación de formas biológicamente activas de
enzimas proteolíticas.
La presente invención corresponde al campo del
diagnóstico y se refiere más en particular a un método para la
determinación de formas biológicamente activas de enzimas
proteolíticas, tales como trombina, en la sangre y en otros fluidos
corporales.
En el mundo occidental, la trombosis arterial y
venosa, y la arteriosclerosis son conjuntamente responsables en la
actualidad de más del 50% de la mortalidad y morbilidad grave. En
unas pocas décadas ésta será la situación a escala mundial [Murray,
C.J. y A.D. López, Science (1996) 274: 740-743]. La
trombosis es provocada por un exceso de actividad del mecanismo
hemostático que es responsable de interrumpir el sangrado de una
herida. Este sistema hemostático-trombótico (HTS)
es una interacción compleja entre las paredes de los vasos, las
células sanguíneas, especialmente las plaquetas de la sangre y
proteínas del plasma. Ver, por ejemplo, Hemker H.C. Thrombin
generation, an essential step in haemostasis and thrombosis. In:
Heamostasis and thrombosis, A.L. Bloom y otros, eds., Churchill
Livingstone, Edimburgo, (1994) 477-490.
En la sangre hay por lo menos tres series de
cascadas de proenzima-enzima de gran importancia
biológica: el sistema de coagulación de la sangre, el sistema
fibrinolítico y el sistema complementario. En cada uno de estos
sistemas proteolíticos, las proenzimas son activadas y a
continuación inhibidas. En general es importante que la
concentración de una enzima activada en esta cascada pueda ser
medida a efectos de evaluar la función del sistema. A continuación
se indicará una descripción típica del sistema de coagulación con
énfasis en su enzima más importante, la trombina. No obstante, se
debe observar que la presente invención se relaciona también con
otras enzimas de la coagulación y enzimas de la ruta fibrinolítica y
complementaria.
El mecanismo de generación de la trombina se
puede indicar con un cierto detalle a continuación. En el sistema de
coagulación plasmática el factor Xa se forma por la acción del
complejo factor tejido-factor VIIa
(TF-VIIa). El factor Xa se une al inhibidor de la
ruta del factor tejido (TFPI) y el complejo TFPI-Xa
inhibe el complejo TF-VIIa. La trombina activa los
factores V, VIII y XI y, por lo tanto, acelera su propia generación,
pero también se une a la trombomodulina y, por lo tanto, pone en
marcha el mecanismo de la proteína C que fracciona los factores
activados V y VIII, inhibiendo por lo tanto de manera indirecta la
generación adicional de trombina. Una fracción importante
(\approx30%) de toda la trombina formada en el plasma en
coagulación está unida al coágulo de fibrina. La trombina unida al
coágulo retiene sus características trombóticas, puede coagular el
fibrinógeno, puede activar los factores V, VIII y XI, así como las
plaquetas [Béguin, S. y R. Kumar, Thromb. Haemost. (1997) 78:
590-594; Kumar, R., S. Béguin, y H.C. Hernker,
Thromb. Haemost. (1994) 72:713-721, y (1995)
74:962-968]. No es inhibida por la antitrombina.
La acción de la trombina provoca receptores en la
membrana de la plaqueta para unirse con el fibrinógeno, lo cual
provoca la agregación de las plaquetas. La activación de las
plaquetas conduce también a la exposición de fosfolípidos
procoagulantes en una reacción dependiente del factor Von Willebrand
[Béguin S., R. Kumar, I. Keularts, U. Seligsohn, B.C. Coller y H.C.
Hemker, Fibrin-Dependent Platelet Procoagulant
Activity Requires GPIb Receptors and Von Willebrand Factor,
Blood (1999) 93:564-570; Béguin, S. y R. Kumar,
supra (1997)]. Estos fosfolípidos son necesarios para la
activación adecuada del factor X y la protrombina. Recientemente,
esta cuestión se ha complicado por el descubrimiento de que la
fibrina, que anteriormente se había creído que era un producto final
inerte de la coagulación, juega en sí misma un papel activo. Se une
y activa con el factor Von Willebrand, que activa las plaquetas y
provoca la exposición de los fosfolípidos procoagulantes con
intermedio de una ruta alternativa.
La cooperación entre las plaquetas y el sistema
de coagulación, incluyendo la fibrina, es básica para el sistema
hemostático-trombótico. El mecanismo muestra
abundancia de bucles de realimentación positivos y negativos,
frecuentemente anidados. Una subactividad provoca sangrado, un
exceso de actividad provoca trombosis. La trombosis se manifiesta
como infarto coronario, apoplejia, embolias pulmonares y un gran
número de enfermedades menos frecuentes.
Para evaluar la función de dicho sistema, también
a efectos de diagnóstico y para la utilización segura de
medicamentos antitrombóticos, se requiere una sonda para la
situación funcional del sistema
hemostático-trombótico. Una prueba funcional
importante del HTS es la curva de generación de trombina (TGC).
Llevada a cabo en plasma pobre en plaquetas, proporciona información
sobre el funcionamiento del sistema de coagulación plasmática. En el
plasma rico en plaquetas, mide también en función de las mismas.
De acuerdo con la técnica anterior el TGC puede
ser medido por submuestreo o de manera continuada. En el método
antiguo de submuestreo [Biggs, R. y R.G. Macfarlane, Human Blood
Coagulation and its Disorders. 1953, Oxford:Blackwell; Quick,
A.J., Haemorrhagic Diseases. 1957, Filadelfia: Lea &
Febiger], se toman muestras de una mezcla de coagulación y se mide
en cada muestra la concentración de trombina.
La trombina activa sobrevive en el plasma durante
un período limitado de tiempo solamente (el tiempo de vida media es
de 16-17 segundos). Esto es debido a las
antitrombinas circulantes. La mayor parte de la trombina (64%) es
inactivada por antitrombina (AT), una
plasma-proteína de 57 kD, 23% por
\alpha_{2}-macroglobulina (\alpha_{2}M),
una plasma-proteína de 725 kD, y 13% por otros
distintos agentes [Hemker, H.C., G.M. Willems, y S. Béguin, A
computer assisted method to obtain the prothrombin activation
velocity in whole plasma independent of thrombin decay
processes, Thromb. Haemost. (1986) 56:9-17]. El
complejo
\alpha_{2}-macroglobulina-trombina
(\alpha_{2}M-IIa) tiene la peculiaridad de que
es inactivo con respecto a todos los substratos macromoleculares,
pero conserva su actividad contra substratos de pequeño peso
molecular (artificiales). La
\alpha_{2}-macroglobulina es una glicoproteína
de Mr 725.000, que se encuentra presente en el plasma en una
concentración de 2500 mg/L o 3,5 \muM. Es un tetrámero de
subunidades idénticas de 185 kD. La reacción de inactivación de una
proteinasa activa o un factor de coagulación activado con
\alpha_{2}M es un proceso de tres etapas: 1º. Formación de un
complejo libre, 2º. Hidrólisis de un péptido diana en
\alpha_{2}M, provocando 3º. un rápido cambio de conformación que
atrapa físicamente la molécula de la enzima dentro de la molécula
\alpha_{2}M. [Ver como resumen: Travis, J. y G.S. Salvesen,
Human plasma proteinase inhibitors. Ann. Rev. Biochem. (1983)
52: 655-709].
El grupo de Hemker que desarrolló un método
continuo en el que la formación de un producto catalizado por
trombina a partir de substratos adecuados es controlada directamente
[Hemker, H.C., y otros, Continuous regisfration of thrombin
generation in plasma, its use for the detennination of the thrombin
potential. Thromb. Heamost. (1993) 70:617-624]. Las
constantes cinéticas del substrato son tales que, a la concentración
utilizada, la velocidad de formación del producto es proporcional a
la cantidad de enzima presente (trombina o
\alpha_{2}M-IIa). La actividad de la enzima a lo
largo del tiempo en la muestra se puede estimar como primera
derivada de la curva producto-tiempo.
Un inconveniente de este método es que una parte
de la trombina en el plasma se une a la
\alpha_{2}-macroglobulina. La
\alpha_{2}-macroglobulina es el inhibidor no
específico de proteasa más abundante del plasma sanguíneo.
Interrumpe la actividad biológica de las proteasas (factores de
coagulación activados, enzimas fibrinolíticas activadas y factores
complementarios activados) sin ocupar su centro activo, de manera
que existe una actividad residual en los habituales
substratos-señal de oligopéptidos.
Este complejo \alpha_{2}M-IIa
no tiene actividad fisiológica conocida, pero es capaz de fraccionar
substratos cromogénicos. De este modo, la formación de producto
observada es el resultado de las actividades combinadas de la
trombina libre y de la trombina unida a la
\alpha_{2}-macroglobulina. Los datos relevantes,
es decir, la cantidad de producto formado solamente por la trombina
libre, pueden ser extraídos de la formación de producto experimental
por una operación matemática. No obstante, la operación tiene que
ser llevada a cabo en el conjunto de la curva de generación del
producto. Por lo tanto, la formación de producto requiere ser
controlada de manera continuada. Si bien el principio de este método
continuo es aplicable a todos los substratos que proporcionan un
producto que puede ser detectado a lo largo del tiempo, por ejemplo,
por señales fluorescentes, electroquímicas o NMR, su aplicación está
habitualmente restringida a la utilización de substratos
cromogénicos en un medio ópticamente transparente, es decir, plasma
pobre en plaquetas desfibrinado (PPP).
Por lo tanto, existe todavía la necesidad de un
método eficaz para medir la cantidad de (formas activas de) enzimas
proteolíticas, tales como trombina, en la sangre y otros fluidos, lo
cual obvia los inconvenientes de la técnica anterior. La presente
invención da a conocer un método de este tipo.
El documento WO 96/21740 da a conocer un método
para determinar el potencial endógeno de la trombina (ETP) de una
muestra, preferentemente en un ensayo continuo, que comprende el
contacto de una muestra a evaluar con un substrato sintético soluble
en agua que comprende un grupo cedente que genera una señal
detectable en el fraccionamiento. El ETP se define como la
superficie situada por debajo de la curva
trombina-tiempo y se cree por los autores que es el
parámetro que mejor indica la capacidad generadora de trombina de
una muestra de plasma.
El documento
US-A-3985620 da a conocer ciertos
substratos para determinar proteasas en los que una proteína de
substrato está unida por un enlace covalente en distribución fina en
la superficie de un portador sólido o sobre dicha superficie, siendo
teñido con un tinte reactivo. Son substratos preferentes
hemoglobina, fibrinógeno de caseína, colágeno, y productos de
modificación de estas proteínas. No se hace referencia al
fraccionamiento del substrato por una proteasa en complejo.
De acuerdo con la presente invención, se da a
conocer un procedimiento para la evaluación de una enzima
proteolítica en la sangre u otra muestra de fluido biológico,
comprendiendo posiblemente un complejo de dicha enzima proteolítica
y \alpha_{2}-macroglobulina, de manera que dicha
muestra establece contacto con un substrato que comprende una
molécula que tiene un M_{r} superior a 10kD acoplado a un
substrato-señal, comprendiendo dicho
substrato-señal un grupo cedente detectable, en el
que dicho substrato es hidrolizado por dicha enzima proteolítica
pero no por dicho complejo.
La enzima proteolítica activa se selecciona
preferentemente del grupo que consiste en trombina, factor de
coagulación activado, factor fibrinolítico activado, y componente
activado del sistema complementario. De éstos, la trombina es la más
preferente.
Las moléculas de dimensiones suficientes son
seleccionadas preferentemente del grupo que consiste en una proteína
inerte, preferentemente ovalbumina, polisacárido, y polímero
sintético. Preferentemente, estas moléculas inertes son solubles en
agua y tienen dimensiones tales que no encajan en la cavidad de las
moléculas de \alpha_{2}M. Un grupo de moléculas inertes
preferentes tienen unas dimensiones aproximadas de 40 kD y una
solubilidad como mínimo de 40 mg/ml. Las de mayor preferencia son
moléculas inertes con unas dimensiones aproximadas de 20 kD y una
solubilidad mínima de 50 mg/ml.
Estos y otros aspectos de la invención serán
explicados en la descripción siguiente.
La figura 1 representa curvas teóricas de
productos de hidrólisis formados en plasma o sangre en coagulación
por hidrólisis de un pequeño substrato de trombina y un substrato
grande de trombina.
La figura 2 representa las curvas de productos de
hidrólisis del substrato S2288 acoplado con ovalbumina por
hidrólisis con \alpha_{2}M-IIa y trombina,
respectivamente.
La figura 3 representa los modelos de
fluorescencia del substrato fluorescente
Ala-Arg-AMC acoplado con ovalbumina
por hidrólisis con trombina libre y trombina inactivada por
\alpha_{2}M, respectivamente.
La figura 4 muestra los resultados de la
determinación del ETP en plasma con SQ68 y
OA-Phe-Pip-Lys-pNA.
La presente invención se basa en el sorprendente
descubrimiento de que ciertos substratos-señal para
enzimas proteolíticas, especialmente substratos de trombina, son
fraccionados por trombina pero no por el complejo
\alpha_{2}M-IIa. Por lo tanto, estos
substratos-señal son insensibles a la acción de las
enzimas proteolíticas cuando están unidos a
\alpha_{2}-macroglobulina.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "substrato-señal" significa un
substrato que es fraccionado por enzima o enzimas proteolíticas
presentes en el medio, del cual se separa un grupo cedente o grupo
inicial que es detectable por métodos ópticos, NMR u otros. Los
grupos iniciales que son ópticamente detectables son, por ejemplo,
p-nitroanilida y
7-amido-4-metilcoumarina.
La p-Nitroanilida absorbe a 405 nm y la
7-amido-4-metilcoumarina
es fluorescente (excitación a 390 nm y emisión a 460 nm). Son
ejemplos de grupos cedentes activos NMR los que contienen ^{31}P,
^{13}C, o cualquier otro átomo que puede ser detectado por NMR o
técnica similar. También se pueden utilizar iones H^{+} como grupo
cedente, que pueden ser detectados midiendo cambios en el pH.
La presente invención tiene la ventaja de que la
actividad enzimática transitoria de la trombina libre en la muestra
de coagulación puede ser evaluada a partir de la cantidad total de
substrato que es convertida, de manera que se puede omitir el
proceso matemático.
La formación de trombina en sangre coagulante o
plasma se origina en la protrombina por una reacción enzimática
controlada que es llamada protrombinasa. Inicialmente esta reacción
es lenta, pero la velocidad aumenta de manera exponencial hasta que
la trombina formada activa los inactivadores de la protrombinasa y
se agota la protrombina.
Los inventores han descubierto que la formación
de trombina puede adaptarse a la siguiente ecuación matemática:
(i)FIIa_{t} \ = \ PT \ .
\ (1 \ - \ e^{-b*t}) \
c
en la que FIIa_{t} es la formación de trombina
a lo largo del tiempo, PT es la cantidad inicial de protrombina, b y
c son constantes y t es el tiempo. Al adaptar una curva de
generación de trombina medida de forma real con esta fórmula, se
observa una adaptación muy satisfactoria con la misma y los datos
cuando b = 0,02 y c =
4.
La trombina formada reaccionará con los
inhibidores plasmáticos, de los cuales AT y \alpha_{2}M son los
más importantes. Las constantes de reacción (constantes de
degradación) de esta reacción son aproximadamente de 20.000
(M.s)^{-1} y 1.500 (M.s)^{-1},
respectivamente.
Si la cantidad de trombina se tiene que medir de
manera continuada, se añade un substrato de trombina a la mezcla de
reacción. Por la acción de la trombina se separa una molécula del
substrato que se puede medir, por ejemplo, en un espectrofotómetro o
un fluorómetro.
Se ha descubierto, después de extensas
investigaciones y experimentos, que como contraste con los
substratos pequeños, cuando se utiliza un substrato de trombina
relativamente voluminoso, la hidrólisis cesa cuando toda la trombina
ha quedado inactivada y la actividad enzimática total de la trombina
se puede medir como ensayo de punto final.
De acuerdo con ello, según un aspecto de la
presente invención se disponen substratos-señal
cromogénicos y fluorogénicos y otros, de grandes dimensiones, en la
medida de que no pueden penetrar en la cavidad de la molécula
\alpha_{2}M y por lo tanto no son hidrolizados por
\alpha_{2}M-IIa. Esto se consigue al acoplar el
substrato-señal a una molécula portadora voluminosa
inerte, lo cual tiene como resultado un "substrato". El
acoplamiento es llevado a cabo preferentemente por vía química, de
forma que es conocida por los técnicos en la materia.
El límite de exclusión de la cavidad de
\alpha_{2}M en la que es atrapada una proteasa activa es
aproximadamente de 10 kD (Barrett, A., Methods in Enzymol,
(1981)70:737-754). Por lo tanto, las
moléculas portadoras inertes adecuadas son mayores de 10 kD e
incluyen, por ejemplo, proteínas, polisacáridos y polímeros
sintéticos. Preferentemente, las moléculas inertes tienen una buena
solubilidad. Un grupo preferente de moléculas inertes tiene
dimensiones tales que las moléculas no caben en la cavidad de la
molécula \alpha_{2}M. Otro grupo de moléculas inertes
preferentes tiene dimensiones aproximadas de 40 kD y una solubilidad
mínima de 40 mg/ml. Son más preferentes las moléculas inertes con
dimensiones aproximadas de 20 kD y una solubilidad mínima de 50
mg/ml.
De manera adecuada y preferente las proteínas son
las disponibles comercialmente, tales como ovoalbúmina (Mr = 45 kD),
albúmina de suero bovino (Mr = 67 kD), albúmina de suero humano (Mr
= 67 kD) y lisozima de clara de huevo de gallina (Mr = 14,4 kD).
Los polisacáridos adecuados tienen un Mr que
puede variar desde unos pocos kD (de manera que no caben en la
cavidad de \alpha_{2}M) hasta más de 500 kD. Un ejemplo de
dichos polisacáridos es el dextrano.
Los polímeros sintéticos adecuados incluyen
polímeros solubles en agua hidrofílicos, con un Mr que varía también
desde unos pocos kD hasta más de 500 kD, tal como ácido
poliacrílico, óxido de polietileno, cloruro de polivinilo,
poli(ácido
1-vinilpirrolidona-co-acrílico),
poli(2-hidroxietilmetacrilato), y
similares.
Son substratos-señal adecuados
para el objetivo de la presente invención compuestos que tienen un
grupo cedente que puede ser detectado fácilmente y que no es
dividido por el complejo
\alpha_{2}-macroglobulina-proteasa.
El grupo cedente preferentemente proporciona una señal de densidad
óptica o una señal fluorescente. Se incluyen entre los ejemplos de
dichos grupos cedentes la p-nitroanilida y
7-amino-4-coumarina,
respectivamente.
Se incluyen entre los substratos adecuados para
los objetivos de la presente invención compuestos obtenidos por
acoplamiento de un substrato-señal con un Mr
relativamente bajo y una molécula inerte de dimensiones suficientes.
Se incluyen entre los ejemplos de substratos adecuados la
ovoalbúmina acoplada a
H-D-isoleucil-L-propil-L-arginina-p-nitroanilida.2HCl
(a la que se hace referencia también como
"OA-S2288"), ovoalbúmina acoplada a
H-alanil-L-arginina-7-amido-4-metil-coumarina
(indicada también como
"OA-Ala-Arg-AMC"),
y ovoalbúmina acoplada a
H-D-fenilalanil-L-prolil-L-lisina-p-nitroanilida.2HCl
(indicada también como
"OA-Phe-Pro-Lis-pNA").
Otro ejemplo adecuado de substrato es la ovoalbúmina acoplada a un
substrato-señal que libera uno o varios iones de
hidrógeno como grupo cedente.
Cuando se utiliza un substrato de este tipo para
medir la curva de generación de trombina (TGC), la trombina temporal
hidrolizará una cierta cantidad de substrato, después de lo cual ya
no tendrá lugar hidrólisis. La cantidad del substrato, así como las
propiedades cinéticas del mismo, se escogen preferentemente de
manera que la cantidad de trombina generada en el plasma (u otro
medio) no consume el substrato de forma completa. El nivel final de
producto de conversión formado se puede medir y es directamente
proporcional a la superficie situada por debajo del TGC, que es el
llamado potencial endógeno de la trombina (ETP).
Los substratos pueden ser utilizados de manera
adecuada para medir la forma biológicamente activa de las enzimas
proteolíticas en la sangre y otros fluidos que contienen
\alpha_{2}-macroglobulina. Una aplicación
importante es la generación y desaparición de trombina en sangre en
coagulación, que es una importante prueba funcional del sistema
hemostático-trombótico (HTS).
Si bien la presente invención se describe de
manera típica y se ejemplifica por la evaluación de la trombina
(generada) en sangre y otros fluidos biológicos, se comprenderá que
el método también es adecuado para la evaluación de otras enzimas
proteolíticas en dichos fluidos biológicos utilizando posibles
variaciones y modificaciones que son evidentes para el técnico en la
materia. Los ejemplos de estas otras enzimas proteolíticas incluyen
factor de coagulación activado, factor fibrinolítico activado y
componente activado del sistema complementario.
La invención queda ilustrada además por los
siguientes ejemplos que no se deben considerar como limitativos de
la invención en ningún aspecto.
Se añade a sangre o plasma substrato de trombina
0,5 mM y la coagulación de la sangre empieza por calcificación y un
iniciador adecuado, en este ejemplo de manera típica tromboplastina.
La figura 1 muestra las curvas teóricas de la formación de productos
de conversión a lo largo del tiempo.
Las curvas (-\bullet- ó -\circ-) muestran la
hidrólisis de un substrato de trombina en plasma en coagulación. Se
supondrá que la formación de trombina tiene lugar en la fórmula (i),
ver la Descripción detallada, con las constantes mencionadas en la
misma. La trombina formada reaccionará tanto con AT como con
\alpha_{2}M. La concentración de AT se dispone en 2,5 \muM y
la concentración de \alpha_{2}M en 3,5 \muM. La constante de
reacción de inactivación de la trombina por AT es de 20.000
(M.s)^{-1}, y la de inactivación de la trombina por
\alpha_{2}M es de 1.450 (M.s)^{-1}. Para designar las
curvas se han utilizado métodos numéricos. Los inventores han
utilizado las etapas de 1 s. Después de 1 s se forma una cantidad de
trombina que queda indicada por la ecuación (i). De 1 a 2 segundos
esta cantidad de trombina reaccionará con AT y \alpha_{2}M a una
velocidad determinada por las constantes anteriormente indicadas.
Después de este segundo se forma una cierta cantidad de complejo de
AT-trombina (AT-IIa) y
\alpha_{2}M-II. Estas cantidades son deducidas
de la cantidad presente de trombina, pero se forma nueva trombina en
este segundo según la ecuación (i). Desde 2 a 3 segundos la nueva
cantidad de trombina reaccionará con AT y \alpha_{2}M
(corregidas ambas por los complejos) mientras se forman nuevas
AT-IIa y \alpha_{2}M-IIa y por
lo tanto se inactiva una parte de la trombina. Este proceso es
repetido durante un período de tiempo de 15 minutos. De esta manera,
se observa el aumento de AT-IIa y
\alpha_{2}M-IIa durante el proceso y un
incremento temporal de la trombina, seguido de la inactivación
completa de trombina por AT y \alpha_{2}M.
Por adición de un pequeño substrato de trombina a
esta mezcla se introducen dos nuevas reacciones: S es hidrolizada
por la trombina libre y por \alpha_{2}M-IIa.
Cuando S es un substrato grande será hidrolizado por la trombina
libre, pero no por \alpha_{2}M-IIa. Estas
reacciones seguirán la cinética de Michaelis-Menten:
velocidad de hidrólisis = [Trombina] \cdot
k_{cat}\cdotS/(K_{m} + S).
La cantidad del producto de hidrólisis es
calculada por el proceso numérico descrito anteriormente. En el caso
de la curva -\bullet-, S es un pequeño substrato de trombina y en
el caso de la curva -\circ-, S es un substrato grande de
trombina.
El substrato de trombina (S) es hidrolizado por
trombina con un K_{m} de 500 \muM y un k_{cat} de 1 s^{-1}.
Asimismo \alpha_{2}M-IIa hidroliza S, en caso
de la curva -\bullet- K_{m} es 500 \muM y K_{cat} es 0,5
s^{-1}, y en el caso de la curva -\circ- K_{m} es 1 M y
k_{cat} es cero (es decir, S no se hidroliza).
En este ejemplo se utiliza un substrato modelo
con las cinéticas antes indicadas. En la práctica real se dispone de
substratos con cinéticas próximas a este modelo. Son ejemplos
adecuados y preferentes de estos substratos SQ68,
Msc-Val-Arg-pNA,
DEMZ-Gly-Arg-pNA, y
Petacromo TH/SR.
El procedimiento indicado es aplicado
habitualmente en una versión ligeramente modificada por el hecho de
que el proceso no es controlado de manera continua, pero se toman
muestras cada 30 segundos y el producto de conversión formado
(indicado por los círculos \bullet ó \circ) es medido.
Cuando se utiliza substrato de trombina pequeño,
cuyo procedimiento había sido utilizado rutinariamente antes de la
presente invención, se obtenían curvas mostradas por -\bullet-. A
efectos de determinar la magnitud del producto de conversión formado
por la acción de la trombina libre, la curva fue dividida en dos
partes, formación de producto por trombina libre y
\alpha_{2}M-IIa, respectivamente. La formación
de producto por trombina libre se interrumpirá cuando se haya
inactivado toda la trombina, pero la formación de producto por
\alpha_{2}M-IIa continuará. Esto explica la
formación lineal continuada de producto al final de la curva
-\bullet-. La recogida de datos medidos tenía que ser dividida en
un conjunto para formación de producto por trombina libre y un
conjunto para formación de producto por
\alpha_{2}M-IIa. Para este procedimiento se ha
desarrollado un algoritmo matemático [Hemker, H.C., S. Welders, H.
Kessels and S. Béguin, Continuous registration of thrombin
generation in plasma, its use for the determination of the thrombin
potential ("Registro continuo de generación de trombina en el
plasma, su utilización para la determinación del potencial de
trombina"). Thromb. Haesmost. (1973) 70:617-624].
El principio es el siguiente. A t=0 no hay presencia de trombina ni
de \alpha_{2}M-IIa y la señal se dispone en
cero. A t=0,5 minutos (segundo punto de datos de medición) se mide
una señal incrementada debido a hidrólisis S por trombina y
\alpha_{2}M-IIa. Una fracción de esta señal
(concentración k x \alpha_{2}M-IIa) es debida a
\alpha_{2}M-IIa. A t=1 minuto, la señal se
incrementa debido a hidrólisis S por trombina libre por la cantidad
presente de \alpha_{2}M-IIa. Este procedimiento
se continúa hasta que se alcanza el último punto de datos. Desde la
curva teóricamente derivada y las observaciones reales, se sabe que
al final de la curva toda la trombina libre ha sido inactivada y el
incremento de la señal es debido por completo a la hidrólisis S por
\alpha_{2}M-IIa. Al escoger el valor de k para
el que la última parte de la curva se hace mínima (es decir, la
formación de productos es constante en el tiempo) el conjunto de
datos se puede dividir en una señal debida a hidrólisis S por
trombina libre (-\circ-) y una señal debida al efecto de
\alpha_{2}M-IIa (-\triangledown-).
Se observará que la señal provocada por la
trombina libre alcanza un valor plataforma que sigue siendo el
mismo, independientemente del método utilizado. Cuando se aplica un
pequeño substrato de trombina, este techo tiene que ser determinado
con un algoritmo matemático. No obstante, cuando se utiliza un
substrato de trombina grande, de acuerdo con la presente invención,
esta plataforma se puede determinar fácilmente por lectura del nivel
final de la señal.
En este ejemplo se demuestra que al acoplar
ovoalbúmina a S2288, el substrato pierde su capacidad de ser
hidrolizado por \alpha_{2}M-IIa, pero no por
trombina. Este substrato (OA-S2288) fue preparado de
la manera siguiente. Se preparó una mezcla de reacción conteniendo 1
mM S2288, 50 mM de carbonato sódico (pH 10,2), 20 mg/ml de
ovoalbúmina y 3,6 mg/ml
bis(sulfosuccinimidil)suberato(BS^{3}). Esta
mezcla fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente, a
continuación se añadió 50 mM Tris (pH 8,2) y la mezcla se mantuvo a
temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla fue aplicada en
la columna de Sephadex G25 (16 x 1,6 cm^{3}) y fue eluida a una
velocidad de 3 ml/minuto. El tampón de elución era 50 mM HEPES, 100
mM NaCl (pH 7,35). El primer pico eluido de la columna contenía la
ovoalbúmina acoplada a S2288 (OA-S2288).
La actividad amidolítica de la trombina humana y
de la \alpha_{2}M-IIa humana con respecto a
OA-S2288 fue objeto de medición. Las mezclas de
reacción contenían 22 \muM OA-S2288, 50 nM de
trombina o \alpha_{2}M-IIa y 175 mM NaCl, 50 mM
Tris-HCl, 2 mg/ml de ovoalbúmina (pH 7,9).
En la figura 2 la cantidad formada de
p-nitroanilida (pNA) libre, expresada como densidad
milióptica a 405 nm, se ha indicado con respecto al tiempo. La
temperatura de reacción era de 37ºC. Las curvas grises son los datos
medidos, mientras que la línea negra se obtiene por acoplamiento,
suponiendo que tiene lugar formación de producto de acuerdo con la
cinética de Michaelis-Menten.
La formación de producto a lo largo del tiempo
puede ser descrita con la fórmula siguiente: E . k_{cat} .
S_{t}/ (K_{m} + S_{t}), en la que S_{1} es la concentración
de substrato en el tiempo (es decir, la concentración de substrato
originalmente presente (S_{0}) menos el producto formado o
substrato dividido, y E es la enzima que divide el substrato,
trombina o \alpha_{2}M-IIa.
Se encontraron las siguientes constantes: S_{0}
= 22 \muM, K_{m} = 1,47 \muM y k_{cat} = 0,31 s^{-1}
cuando E es trombina y 0,002 s^{-1} cuando E es
\alpha_{2}M-IIa.
Este ejemplo muestra que al acoplar ovoalbúmina
al substrato fluorescente de
Ala-Arg-AMC, el substrato ya no se
dividirá adicionalmente por trombina atrapada en la cavidad de
\alpha2M. La figura 3 muestra que la trombina libre se separa del
grupo fluorescente (AMC), pero que la trombina inactivada por
\alpha2M no puede hacerlo.
El acoplamiento de la ovoalbúmina a
Ala-Arg-AMC fue llevado a cabo del
modo siguiente. A 1 ml de 1 mg/ml de ovoalbúmina en PBS (= 10 mM
fosfato potásico, 150 mM NaCl, pH 7,4) se añadieron 6 \mul de 50
mM BS^{3} en 100% de dimetilsulfóxido. La mezcla fue incubada a
temperatura ambiente durante 60 minutos y dializada dos veces contra
2 L PBS (2 horas en cada caso). A continuación, se añadieron 5
\mul de 100 mM Ala-Arg-AMC y se
incubó a temperatura ambiente durante 60 minutos. Finalmente, la
muestra fue dializada igual que antes (dos veces contra 2 L
PBS).
La figura 3 muestra los resultados de las
mediciones de fluorescencia en un aparato Fluoroskan Acsent dotado
de bloque termostático, un filtro de excitación a 390 nm y emisión a
460 nm. El ensayo fue llevado a cabo a 25ºC en microplacas con
fondo en "U" Microfluor W de 96 pocillos (Dynex, Londres,
Inglaterra) en 10 mM HEPES, 5 mM CaCl_{2}, 0,02% de acida de
sodio, pH 8,0). En el caso -\circ- el recipiente contenía 5,5
\muM OA-AR-AMC
(Ala-Arg-AMC acoplado a ovoalbúmina)
y 85 nM de trombina humana y en el caso de
-\triangledown-5,5 \muM
OA-AR-AMC y 65 \muM humano
\alpha_{2}M-IIa. Los símbolos en negro
(-\bullet- y -\blacktriangledown-) fueron obtenidos por
acoplamiento suponiendo que el substrato es hidrolizado por
trombina de acuerdo con la cinética
Michaelis-Menten. Del acoplamiento se encontraron
las siguientes constantes para hidrólisis por trombina:
concentración de substrato S_{0} = 5,5 \muM, k_{m} = 1,2
\muM y k_{cat} = 3,3 s^{-1}. Para hidrólisis por
\alpha_{2}M-IIa se encontraron los S_{0} y
K_{m} ya calculados y k_{cat} = 0,008 s^{-1}.
Ver figura 4. Se midió la generación de trombina
tal como se ha descrito anteriormente [Hemker, H.C., Wielders, S.,
Kessels, H., Béguin, S. Continuous Registration of Thrombin
Generation in Plasma, its Use for the Determination of the Thrombin
Potential ("Registro continuo de generación de trombina en el
plasma, su utilización para determinación del potencial de
trombina"). Thromb. Haemost. (1993) 70:617-624,
and Hemker, H.C. and Béguin S. Thrombin generation in plasma: its
assessment via the endogenous thrombin potential ("Generación
de trombina en el plasma: su evaluación a través del potencial
endógena de trombina"). Thromb. Haemost. (1995)
74:134-138].
La formación de pNA en plasma en coagulación al
que se añadió SQ68 (\bullet) o
OA-Phe-Pip-Lys-pNA
(\blacktriangledown); Pip significa pipecolilo. La formación de
pNA fue controlada por medición de la densidad óptica a 405 nm. La
concentración del substrato fue de 0,5 mM en ambos casos. El
conjunto de datos obtenidos con SQ68 fueron analizados y divididos
en pNA formados por trombina libre (\otimes) y pNA formados por
\alpha_{2}M-IIa (\triangledown), utilizando el
algoritmo descrito en el Ejemplo 1.
Se puede observar claramente que cuando se
utiliza un substrato de acuerdo con la presente invención, se
obtienen datos experimentales de manera muy eficaz que representan
directamente la misma actividad biológica (es decir, la cantidad de
substrato separada por trombina libre) que aquellos obtenidos de la
disección matemática compleja de la curva a partir de un substrato
convencional.
Claims (13)
1. Procedimiento para la evaluación de una enzima
proteolítica activa en la sangre u otra muestra de fluido biológico
que comprende posiblemente un complejo de dicha enzima proteolítica
y \alpha_{2}-macroglobulina,
caracterizado porque dicha muestra establece contacto con un
substrato que comprende una molécula que tiene un valor de M_{r}
superior a 10kD acoplado a un substrato-señal,
comprendiendo dicho substrato-señal un grupo cedente
detectable, en el que dicho substrato es hidrolizado por dicha
enzima proteolítica pero no por dicho complejo.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que la enzima proteolítica activa es seleccionada del grupo que
consiste en trombina, factor de coagulación activado, factor
fibrinolítico activado, y componente activado del sistema
complementario.
3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en
el que la enzima proteolítica activada es trombina.
4. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la molécula que tiene M_{r}
superior a 10kD es una molécula inerte seleccionada del grupo que
consiste en una proteína, preferentemente ovoalbúmina, polisacárido,
y un polímero sintético.
5. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la molécula que tiene un
M_{r} superior a 10kD es soluble en agua.
6. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la molécula que tiene un M_{r}
superior a 10kD tiene un M_{r} de 40kD aproximadamente y una
solubilidad mínima de 40 mg/ml.
7. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la molécula que tiene un M_{r}
superior a 10kD tiene un M_{r} de 20 kD aproximadamente y una
solubilidad mínima de 50 mg/ml.
8. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el grupo cedente proporciona
una señal de densidad óptica o una señal fluorescente.
9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en
el que el grupo cedente es p-nitroanilida o
7-amino-4-metil-coumarina.
10. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el substrato es seleccionado
del grupo que consiste en ovoalbúmina acoplada a
H-D-isoteucil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilida.2HCl,
ovoalbúmina acoplada a
H-alanil-L-arginina-7-amido-4-metil-coumarina,
y ovoalbúmina acoplada a
H-D-fenilalanil-L-prolil-L-lisina-p-nitroanilida.2HCl.
11. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el substrato comprende un grupo
cedente con uno o varios iones hidrógeno.
12. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de
características cinéticas del substrato se seleccionan de manera tal
que la cantidad de enzima proteolítica generada en la muestra no
consuma el substrato por completo.
13. Procedimiento, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de substrato
hidrolizado es directamente proporcional al área situada por debajo
de la curva de generación de la enzima proteolítica.
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