DE60009879T2 - Bestimmung von biologisch aktiven formen von proteolytischen enzymen - Google Patents

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Description

  • Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Diagnostika und betrifft insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung von biologisch aktiven Formen von proteolytischen Enzymen, z.B. Thrombin, in Blut und anderen Flüssigkeiten.
  • Stand der Technik
  • In der westlichen Welt sind zurzeit die arterielle und venöse Thrombose und die Atherosklerose zusammen für mehr als 50 % aller Todesfälle und schweren Erkrankungen verantwortlich. In einigen wenigen Jahrzehnten wird dies auch weltweit der Fall sein [Murray, C. J., und A. D. Lopez, Science 274: 740–743 (1996)]. Eine Thrombose wird durch eine Überaktivität des hämostatischen Mechanismus ausgelöst, der dafür verantwortlich ist, dass eine Blutung aus einer Wunde zum Stillstand gebracht wird. Dieses hämostatische-thrombotische System (HTS) stellt eine komplexe Wechselwirkung zwischen Gefäßwand, Blutzellen, insbesondere Blut-Thrombocyten, und Plasmaproteinen dar. Vgl. z.B. Hemker, H. C., „Thrombin Generation, an Essential Step in Haemostasis and Thrombosis"; in: Haemostasis and Thrombosis, A. L. Bloom et al., Hrsg., Churchill Livingstone, Edinburgh, (1994), 477–490.
  • Im Blut gibt es mindestens drei Serien von Proenzym-Enzym-Kaskaden die eine große biologische Bedeutung haben: das Blut-Koagulationssystem, das fibrinolytische System und das Komplementsystem. In jedem dieser Systeme werden proteolytische Enzym aktiviert und anschließend gehemmt. Im Allgemeinen ist es wichtig, dass die Konzentration eines aktivierten Enzyms in einer solchen Kaskade gemessen werden kann, wodurch die Funktion des Systems bestimmt werden kann. Im Folgenden wird eine typischen Beschreibung des Gerinnungssystems dargestellt, wobei die Betonung auf dem wichtigsten Enzym, dem Thrombin, liegt. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die vorliegende Erfindung auch andere Gerinnungsenzyme und Enzyme des fibrinolytischen und Komplement-Stoffwechselwegs betrifft.
  • Der Mechanismus der Thrombin-Erzeugung ist im folgenden ausführlich beschrieben. Im plasmatischen Koagulationssystem wird der Faktor Xa durch die Wirkung des Gewebefaktor-Faktor-VII-a-Komplexes (TF-VIIa) erzeugt. Der Faktor Xa bindet an den Inhibitor des Gewebefaktor-Stoffwechselwegs (TFPI), und der TFPI-Xa-Komplex hemmt den TF-VIIa-Komplex. Thrombin aktiviert die Faktoren V, VIII und XI und beschleunigt auf diese Weise seine eigene Erzeugung, jedoch bindet es auch an Thrombomodulin und startet so den Protein-C-Mechanismus, der die aktivierten Faktoren V und VIII abbaut, so dass indirekt die weitere Erzeugung von Thrombin gehemmt wird. Eine wichtige Fraktion (etwa 30 %) des gesamten, im gerinnenden Plasma gebildeten Thrombins ist an das Fibringerinnsel gebunden. Das Gerinnsel-gebundene Thrombin behält seine thrombotischen Eigenschaften bei, es kann Fibrinogen koagulieren und die Faktoren V, VIII und XI sowie außerdem Thrombocyten aktivieren [Béguin, S., und R. Kumar, Thromb. Haemost. 78: 590–594 (1997); Kumar, R., S. Béguin und H. C. Hemker, Thromb. Haemost. 72: 713–721 (1994), und 74: 962–968 (1995)]. Es wird durch Antithrombin nicht gehemmt.
  • Die Wirkung von Thrombin hat zur Folge, dass Rezeptoren in der Thrombocyten-Membran an Fibrinogen binden, wodurch die Thrombocyten-Aggregation bewirkt wird. Die Aktivierung der Thrombocyten führt außerdem zur Exposition von gerinnungsfördernden Phospholipiden in einer Von-Willebrand-Faktor-abhängigen Reaktion [Béguin, S., R. Kumar, I. Keularts, U. Seligsohn, B. C. Coller und H. C. Hemker, „Fibrin-Dependent Platelet Procoagulant Activity Requires GPlb Receptors and Von Willebrand Factor", Blood 93: 564–570 (1999); Béguin, S., und R. Kumar, vorstehend, (1997)]. Diese Phospholipide sind für die richtige Aktivierung von Faktor X und Prothrombin erforderlich. Kürzlich wurde dieses Bild durch die Entdeckung verkompliziert, dass Fibrin, von dem man früher dachte, dass es das inerte Endprodukt der Koagulation darstellt, selbst eine aktive Rolle spielt. Es bindet und aktiviert den Von-Willebrand-Faktor, der Thrombocyten aktiviert und die Exposition gerinnungsfördernder Phospholipide über einen anderen Stoffwechselweg bewirkt.
  • Das Zusammenwirken zwischen den Thrombocyten und dem Koagulationssystem, das Fibrin umfasst, ist ein zentraler Punkt des hämostatischenthrombotischen Systems. Der Mechanismus zeigt eine Vielzahl von positiven und negativen Feedback-Schleifen, die häufig verschachtelt sind. Eine zu geringe Aktivität verursacht eine Blutung, eine zu hohe Aktivität löst eine Thrombose aus. Die Thrombose kann sich selbst als Koronarinfarkt, Schlaganfall, Lungenembolie und eine große Zahl von weniger häufigen Krankheiten manifestieren.
  • Um die Funktion eines solchen Systems ermitteln zu können, auch für diagnostische Zwecke und für die sichere Verwendung von antithrombotischen Arzneistoffen, ist eine Sonde für den funktionellen Status des hämostatischenthrombostatischen Systems erforderlich. Ein wichtiger Funktionstest des HTS ist die Thrombin-Erzeugungs-Kurve (TGC). Wenn sie in einem Thrombocyten-armen Plasma durchgeführt wird, ergibt sie Informationen über die Funktion des plasmatischen Gerinnungssystems. In einem Thrombocyten-reichen Plasma misst sie auch die Funktion der Thrombocyten.
  • Gemäß dem Stand der Technik kann die TGC durch wiederholte Probenentnahme oder kontinuierlich gemessen werden. In einem früheren Verfahren der wiederholten Probenentnahme [Biggs, R., und R. G. Macfarlane, „Human Blood Coagulation and its Disoders", 1953, Oxford: Blackwell; Quick, A. J., „Haemorrhagic Diseases", 1957, Philadelphia: Lea & Febiger] werden die Proben aus einem Gerinnungsgemisch entnommen und die Konzentration von Thrombin in jeder Probe gemessen.
  • Das aktive Thrombin überlebt im Plasma nur einen begrenzten Zeitraum (die Halbwertszeit beträgt 16 bis 17 s). Dies beruht auf zirkulierenden Antithrombinen. Das meiste Thrombin (64 %) wird durch Antithrombin (AT), ein Plasmaprotein von 57 kD, inaktiviert, 23 % durch das α2-Makroglobulin (α2M), ein 725 kD großes Plasmaprotein, und 13 % durch verschiedene andere Stoffe [Hemker, H. C., G. M. Willems und S. Béguin, „A Computer Assisted Method to Obtain the Prothrombin Activation Velocity in Whole Plasma Independent of Thrombin Decay Processes", Thromb. Haemost. 56: 9–17 (1986)]. Der α2-Makroglobulin-Thrombin-Komplex (α2M-IIA) hat die Besonderheit, dass er gegenüber allen makromolekularen Substraten inaktiv ist, dass jedoch seine Aktivität gegenüber (künstlichen) Substraten mit einem niedrigen Molekulargewicht bestehen bleibt. Das α2-Makroglobulin ist ein Glykoprotein mit einem Mr von 725 000, das im Plasma in einer Konzentration von 2 500 mg/l oder 3,5 μM vorliegt. Es ist ein Tetramer aus identischen Untereinheiten von 185 kD. Die Inaktivierungsreaktion einer aktiven Proteinase oder eines aktivierten Gerinnungsfaktors mit α2M ist ein dreistufiger Prozess: 1.) Erzeugung eines losen Komplexes; 2.) Hydrolyse eines Zielpeptids in α2M, wodurch 3.) eine rasche Konformationsänderung ausgelöst wird, die das Enzymmolekül physikalisch innerhalb des α2M-Moleküls einfängt. [Eine Übersicht findet sich in: Travis, J., und G. S. Salvesen, „Human Plasma Proteinase Inhibitors", Ann. Rev. Biochem. 52: 655–709 (1983)].
  • Anschließend entwickelte die Gruppe von Hemker ein kontinuierliches Verfahren, in dem die Thrombin-katalysierte Erzeugung von Produkten aus geeigneten Substraten direkt überwacht wird [Hemker, H. C., et al., „Continuous Registration of Thrombin Generation in Plasma, its Use for the Determination of the Thrombin Potential", Thromb. Haemost. 70: 617–624 (1993)]. Die kinetischen Konstanten des Substrats sind so, dass bei der verwendeten Konzentration die Rate der Produkterzeugung proportional ist zu der Menge des vorliegenden Enzyms (Thrombin oder α2M-IIa). Der Zeitverlauf der Enzymaktivität in der Probe kann als erste Ableitung der Produkt-Zeit-Kurve bestimmt werden.
  • Der Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass ein Teil des Thrombins im Plasma an α2-Makroglobulin bindet. α2-Makroglobulin ist der am reichlichsten vorhandene unspezifische Protease-Inhibitor des Blutplasmas. Es hebt die biologische Aktivität von Proteasen auf (aktivierten Gerinnungsfaktoren, aktivierten fibrinolytischen Enzymen und aktivierten Komplementfaktoren), ohne ihr aktives Zentrum zu besetzen, so dass auf den üblichen Oligopeptid-Signalsubstraten noch eine Restaktivität vorliegt.
  • Dieser α2M-IIa-Komplex besitzt keine bekannte physiologische Aktivität, er ist jedoch in der Lage, chromogene Substrate zu spalten. Somit ist die festgestellte Produkterzeugung das Ergebnis der kombinierten Aktivitäten des freien Thrombins und des α2-Makroglobulin-gebundenen Thrombins. Dieser wichtige Wert, d.h. die Menge des nur durch das freie Thrombin erzeugten Produkts, kann durch eine mathematische Operation aus der experimentellen Produkterzeugung errechnet werden. Diese Rechenoperation muss jedoch über den ganzen Verlauf der Produkterzeugungs-Kurve durchgeführt werden. Deshalb muss die Produkterzeugung kontinuierlich überwacht werden. Obwohl das Prinzip dieses kontinuierlichen Verfahrens auf alle Substrate angewendet werden kann, die ein Produkt ergeben, welches mit der Zeit z.B. durch fluoreszierende, elektrochemische oder NMR-Signale nachgewiesen werden kann, ist seine Anwendung zurzeit auf die Verwendung chromogener Substrate in einem optisch klaren Medium beschränkt, d.h. einem in defibrinierten Thrombocyten-armen Plasma (PPP).
  • Deshalb besteht immer noch ein Bedarf für ein wirksames Verfahren zum Messen der Menge von (aktiven Formen von) proteolytischen Enzymen, z.B. Thrombin, im Blut und in anderen Flüssigkeiten, das die Nachteile des Standes der Technik umgeht. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren bereit.
  • WO 96/21740 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des endogenen Thrombin-Potentials (ETP) einer Probe, vorzugsweise in einem kontinuierlichen Test, der das Inkontaktbringen der Probe, die getestet werden soll, mit einem wasserlöslichen synthetischen Substrat umfasst, das eine Abgangsgruppe enthält, die bei der Spaltung ein nachweisbares Signal erzeugt. ETP ist als die Fläche unter der Thrombin-Zeit-Kurve definiert und stellt nach Meinung der Autoren den Parameter dar, der die Kapazität einer Plasmaprobe zur Thrombin-Erzeugung am besten wiedergibt.
  • US-A-3985620 beschreibt bestimmte Substrate zur Bestimmung von Proteasen, wobei ein Substratprotein durch eine kovalente Bindung in einer feinen Verteilung in oder an der Oberfläche eines Feststoff-Trägers gebunden und mit einem reaktiven Farbstoff gefärbt ist. Bevorzugte Substrate sind Hämoglobin, Casein-Fibrinogen, Collagen und modifizierte Produkte dieser Proteine. Die Spaltung des Substrats durch eine komplexierte Protease wird nicht angesprochen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung eines aktiven proteolytischen Enzyms in einer Blutprobe oder einer anderen biologischen Flüssigkeitsprobe bereitgestellt, die möglicherweise einen Komplex aus dem proteolytischen Enzym und dem α2-Makroglobulin enthält, wobei die Probe mit einem Substrat in Kontakt gebracht wird, das ein Molekül mit einem Mr von größer als 10 kD umfasst, gekoppelt an ein Signalsubstrat, wobei das Signalsubstrat eine nachweisbare Abgangsgruppe umfasst, wobei das Substrat durch das proteolytische Enzym hydrolysiert wird, jedoch nicht durch den Komplex.
  • Das aktive proteolytische Enzym ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus Thrombin, aktiviertem Gerinnungsfaktor, aktiviertem fibrinolytischem Faktor und einem aktivierten Bestandteil des Komplementsystems besteht. Von diesen ist Thrombin am stärksten bevorzugt.
  • Die Moleküle ausreichender Größe sind vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem inerten Protein, vorzugsweise Ovalbumin, Polysaccharid und synthetischen Polymer besteht. Vorzugsweise sind diese inerten Moleküle wasserlöslich und haben eine Größe, dass sie gerade nicht in die Höhlung der α2M-Moleküle passen. Eine Gruppe von bevorzugten inerten Molekülen hat eine Größe von etwa 40 kD und eine Löslichkeit von mindestens 40 mg/ml. Am stärksten bevorzugt sind inerte Moleküle mit einer Größe von etwa 20 kD und einer Löslichkeit von mindestens 50 mg/ml.
  • Diese und andere Aspekte der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung noch weiter erläutert.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 stellt theoretische Kurven von Hydrolyseprodukten dar, die in gerinnendem Plasma oder Blut durch Hydrolyse eines kleinen Thrombin-Substrats und eines großen Thrombin-Substrats erzeugt werden.
  • 2 stellt die Kurven von Hydrolyseprodukten des Substrats S2288, gekoppelt mit Ovalbumin, durch Hydrolyse mit α2M-IIA bzw. Thrombin dar.
  • 3 stellt die Fluoreszenzmuster des fluoreszierenden Substrats Ala-Arg-AMC, gekoppelt mit Ovalbumin, durch Hydrolyse mit dem freien Thrombin bzw. mit dem durch α2M inaktivierten Thrombin dar.
  • 4 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung des ETP im Plasma mit SQ68 und OA-Phe-Pip-Lys-pNA.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der erstaunlichen Entdeckung, dass bestimmte Signalsubstrate für proteolytische Enzyme, insbesondere Thrombin-Substrate, durch Thrombin, nicht jedoch durch den α2M-IIa-Komplex gespalten werden. Somit sind diese Signalsubstrate unempfindlich gegenüber der Wirkung proteolytischer Enzyme, wenn diese an α2-Makroglobulin gebunden sind.
  • Der hier verwendete Begriff „Signalsubstrat" bedeutet ein Substrat, das durch ein proteolytisches Enzym (proteolytische Enzyme), das (die) im Medium vorliegt (vorliegen), gespalten wird, wobei hiervon eine Abgangsgruppe abgespalten wird, die durch optische, NMR- oder andere Verfahren nachgewiesen werden kann. Abgangsgruppen, die optisch nachgewiesen werden können, sind z.B. p-Nitroanilid und 7-Amido-4-methyl-cumarin. p-Nitroanilid absorbiert bei 405 nm, und 7-Amido-4-methyl-cumarin ist eine fluoreszierende Substanz (Anregung bei 390 nm und Emission bei 460 nm). Beispiele von NMR-aktiven Abgangsgruppen sind solche, die 31P, C13 oder ein anderes Atom enthalten, das mit NMR oder einer ähnlichen Technik nachgewiesen werden kann. Auch H+-Ionen können als Abgangsgruppen eingesetzt werden, die dann durch Messen von Änderungen im pH-Wert nachgewiesen werden können.
  • Die vorliegende Erfindung hat den Vorteil, dass die gesamte transiente Enzymaktivität des freien Thrombins in der Gerinnungsprobe aus der Gesamtmenge des Substrats, das umgewandelt wird, bestimmt werden kann, so dass das mathematische Verfahren entbehrlich ist.
  • Das Thrombin entsteht im gerinnenden Blut oder Plasma aus Prothrombin durch eine enzymatisch gesteuerte Umsetzung, die Prothrombinase genannt wird. Anfangs läuft diese Umsetzung langsam ab, jedoch nimmt die Geschwindigkeit exponentiell zu, bis das erzeugte Thrombin die Inaktivatoren der Prothrombinase aktiviert und das Prothrombin aufgebraucht ist.
  • Wir fanden, dass die Erzeugung von Thrombin durch die folgende mathematische Gleichung erfasst werden kann: FIIat = PT·(1–e–b×t)c (i)in der FIIa, die Erzeugung von Thrombin in der Zeit darstellt, PT die anfängliche Menge von Prothrombin ist, b und c Konstanten darstellen und t die Zeit ist. Beim Vergleich einer tatsächlich gemessenen Kurve der Thrombin-Erzeugung mit dieser Formel findet man eine sehr gute Übereinstimmung zwischen den gemessenen und den errechneten Werten, wenn b = 0,02 und c = 4.
  • Das erzeugte Thrombin reagiert dann mit den plasmatischen Inhibitoren, von denen AT und α2M die wichtigsten sind. Die Reaktionskonstanten (Zerfallskonstanten) dieser Reaktion betragen etwa 20000 (M·s)–1 bzw. 1500 (M·s)–1.
  • Wenn die Menge des Thrombins kontinuierlich gemessen werden soll, wird ein Thrombin-Substrat zu dem Reaktionsgemisch zugegeben. Durch Wirkung des Thrombins wird ein Molekül vom Substrat abgespalten, das z.B. in einem Spektrophotometer oder Fluorometer gemessen werden kann.
  • Nun wurde nach intensivem Forschen und Experimentieren gefunden, dass, im Gegensatz zu kleinen Substraten, bei Verwendung eines relativ umfangreichen Thrombin-Substrats die Hydrolyse endet, wenn alles Thrombin inaktiviert wurde, und dass die gesamte Enzymaktivität von Thrombin als ein Endpunkt-Test gemessen werden kann.
  • Demgemäß werden in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung große chromogene und fluorogene und andere Signalsubstrate bereitgestellt, die so groß sind, dass sie nicht in die Höhlung des α2M-Moleküls eindringen können und somit nicht durch α2M-IIa hydrolysiert werden. Dies wird erreicht, indem das Signalsubstrat an ein inertes umfangreiches Trägermolekül gekoppelt wird, wodurch ein „Substrat" zustande kommt. Die Kopplung erfolgt vorzugsweise durch ein chemisches Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist.
  • Die Ausschlussgrenze der Höhlung von α2M, in der eine aktive Protease eingefangen ist, beträgt etwa 10 kD [Barrett, A., Methods in Enzymol. 80: 737-754 (1981)]. Somit sind geeignete inerte Trägermoleküle größer als 10 kD und umfassen z.B. Proteine, Polysaccharide, synthetische Polymere. Vorzugsweise weisen die inerten Moleküle eine gute Löslichkeit auf. Eine bevorzugte Gruppe von inerten Molekülen hat eine Größe, dass die Moleküle gerade nicht in die Höhlung des α2M-Moleküls passen. Eine weitere Gruppe von bevorzugten inerten Molekülen hat eine Größe von etwa 40 kD und eine Löslichkeit von mindestens 40 mg/ml. Am stärksten bevorzugt sind inerte Moleküle mit einer Größe von etwa 20 kD und einer Löslichkeit von mindestens 50 mg/ml.
  • Geeignete und bevorzugte Proteine sind diejenigen, die im Handel verfügbar sind, z.B. Ovalbumin (Mr = 45 kD), Rinderserumalbumin (Mr = 67 kD), menschliches Serumalbumin (Mr = 67 kD) und Hühnereiweiß-Lysozym (Mr = 14,4 kD).
  • Geeignete Polysaccharide haben ein Mr, das von einigen wenigen kD (so dass sie nicht in die Höhlung von α2M passen) bis zu mehr als 500 kD variieren kann. Ein Beispiel eines solchen Polysaccharids ist Dextran.
  • Geeignete synthetische Polymere umfassen hydrophile wasserlösliche Polymere mit einem Mr, das auch von einigen wenigen kD bis zu mehr als 500 kD variieren kann, z.B. Polyacrylsäure, Polyethylenoxid, Polyvinylchlorid, Poly(1-vinylpyrrolidon-co-Acrylsäure), Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) und dergleichen.
  • Geeignete Signalsubstrate für den Zweck der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen mit einer Abgangsgruppe, die einfach nachgewiesen werden kann und die nicht durch den α2-Makroglobulin-Protease-Komplex abgespalten wird. Die Abgangsgruppe ergibt vorzugsweise ein Signal optischer Dichte oder ein Fluoreszenzsignal. Beispiele solcher Abgangsgruppen umfassen p-Nitroanilid bzw. 7-Amino-4-cumarin.
  • Geeignete Substrate für den Zweck der vorliegenden Erfindung umfassen Verbindungen, die durch Kopplung eines Signalsubstrats mit einem relativ niedrigen Mr an ein inertes Molekül ausreichender Größe erhalten werden. Beispiele geeigneter Substrate umfassen Ovalbumin gekoppelt an H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilid · 2HCl (auch als „OA-S2288" bezeichnet), Ovalbumin gekoppelt an H-Alanyl-L-arginin-7-amido-4-methyl-cumarin (auch als „OA-Ala-Arg-AMC" bezeichnet) und Ovalbumin gekoppelt an H-D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-lysin-p-nitroanilid·2HCl (auch als „OA-Phe-Pro-Lys-pNA" bezeichnet). Ein weiteres Beispiel eines geeigneten Substrats ist Ovalbumin gekoppelt an ein Signalsubstrat, das ein oder mehrere Wasserstoffionen als Abgangsgruppe freisetzt.
  • Wenn ein solches Substrat verwendet wird, um die Kurve der Thrombin-Erzeugung („thrombin generation curve", TGC) zu messen, hydrolysiert das temporäre Thrombin eine bestimmte Menge des Substrats, und danach findet keine weitere Hydrolyse mehr statt. Die Menge des Substrats, und auch die kinetischen Eigenschaften davon, werden vorzugsweise so gewählt, dass die Menge des erzeugten Thrombins im Plasma (oder in einem anderen Medium) das Substrat nicht vollständig aufbraucht. Der Endstand des erzeugten Umwandlungsprodukts kann gemessen werden und ist direkt proportional zu der Fläche unterhalb der TGC, die das endogene Thrombin-Potential (ETP) genannt wird.
  • Die Substrate können gut eingesetzt werden, um die biologisch aktive Form von proteolytischen Enzymen im Blut und in anderen Flüssigkeiten, die α2-Makroglobulin enthalten, zu messen. Eine wichtige Anwendung ist die Erzeugung und das Verschwinden von Thrombin in gerinnendem Blut, wobei es sich um einen wichtigen Funktionstest des hämostatischen-thrombotischen Systems (HTS) handelt.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung typischerweise für die Bestimmung von (erzeugtem) Thrombin im Blut oder in anderen biologischen Flüssigkeiten beschrieben und beispielhaft dargestellt ist, ist es so zu verstehen, dass das Verfahren auch für die Bestimmung anderer proteolytischer Enzyme in solchen biologischen Flüssigkeiten geeignet ist, wobei mögliche Variationen und Modifikationen eingesetzt werden können, die für den Fachmann ersichtlich sind.
  • Beispiele solcher anderer proteolytischer Enzyme umfassen einen aktivierten Gerinnungsfaktor, aktivierten fibrinolytischen Faktor und eine aktivierte Komponente des Komplementsystems.
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, die jedoch in keiner Weise die Erfindung einschränken sollen.
  • Beispiel 1
  • Hydrolyse eines Thrombin-Substrats in gerinnendem Blut und Plasma
  • Zu Blut oder Plasma werden 0,5 mM Thrombin-Substrat zugegeben und die Blutkoagulation durch Kalzifikation und ein geeignetes Startreagens, in diesem Beispiel typischerweise Thromoboplastin, gestartet. 1 zeigt die theoretischen Kurven der Erzeugung der Umwandlungsprodukte in der Zeit.
  • Die Kurven (-•- oder -∘-) zeigen die Hydrolyse eines Thrombin-Substrats in gerinnendem Plasma. Wir gehen davon aus, dass die Thrombin-Erzeugung nach der Formel (i), vgl. Genaue Beschreibung, mit den dort angegebenen Konstanten erfolgt. Das erzeugte Thrombin reagiert dann sowohl mit AT als auch mit α2M. Die AT-Konzentration ist auf 2,5 μM gesetzt und die α2M-Konzentration auf 3,5 μM. Die Reaktionskonstante der Inaktivierung von Thrombin durch AT beträgt 20 000 (M.s)–1, und die der Inaktivierung von Thrombin durch α2M beträgt 1 450 (M.s)–1. Zum Erstellen der Kurven wurden numerische Verfahren verwendet. Wir verwendeten Schritte von 1 s. Nach 1 Sekunde ist eine Menge von Thrombin erzeugt, wie durch die Gleichung (i) angegeben. Von der Sekunde 1 bis zur Sekunde 2 wird diese Menge von Thrombin mit AT und α2M mit einer Rate reagieren, die durch die vorstehend angegebene Konstanten bestimmt wird. Nach dieser Sekunde ist eine gewisse Menge des AT-Thrombin-Komplexes (AT-IIa) und von α2M-IIa erzeugt. Diese Mengen werden von der vorliegenden Thrombin-Menge abgezogen, wobei jedoch in dieser Sekunde neues Thrombin gemäß der Gleichung (i) erzeugt wird. Von der Sekunde 2 bis zur Sekunde 3 reagiert dann die neue Thrombin-Menge mit AT und α2M (beide korrigiert für die Komplexe), so dass neue Mengen von AT-IIa und α2M-IIa erzeugt werden und somit eine gewisse Menge von Thrombin inaktiviert wird. Dieser Prozess wird während der Zeitspanne von 15 Minuten wiederholt. So sehen wir während des Prozesses das Entstehen von AT-IIa und α2M-IIa und eine temporäre Zunahme von Thrombin, gefolgt von einer vollständigen Inaktivierung von Thrombin durch AT und α2M.
  • Durch Zugabe eines kleinen Thrombin-Substrats zu diesem Gemisch werden zwei neue Reaktionen eingeführt: S wird durch das freie Thrombin und durch α2M-IIa hydrolysiert. Wenn S dagegen ein großes Substrat ist, wird es durch das freie Thrombin hydrolysiert, nicht jedoch durch α2M-IIa. Diese Reaktionen folgen den Michaelis-Menten-Kinetiken: Hydrolyserate = [Thrombin]·kcat·S/(Km + S).
  • Die Menge des Hydrolyseprodukts wird mit dem vorstehend beschriebenen numerischen Verfahren berechnet. Im Fall der Kurve -•- ist S ein kleines Thrombin-Substrat, und im Fall der Kurve -∘- ist S ein großes Thrombin-Substrat.
  • Das Thrombin-Substrat (S) wird durch Thrombin mit einer Km von 500 μM und einer kcat von 1 s–1 hydrolysiert. Auch α2M-IIa hydrolysiert S, im Fall der Kurve -•- ist Km 500 μM und kcat 0,5 s–1, und im Fall der Kurve -∘- ist Km 1 M und kcat Null (d.h. S wird nicht hydrolysiert).
  • In diesem Beispiel wird ein Modellsubstrat mit den vorstehend angegebenen Kinetiken verwendet. In der tatsächlichen Praxis sind Substrate mit Kinetiken verfügbar, die diesem Modell sehr nahe kommen. Geeignete und bevorzugte Beispiele solcher Substrate sind SQ68, Msc-Val-Arg-pNA, DEMZ-Gly-Arg-pNA und Petachrome TH/SR.
  • Das vorstehende Verfahren wird üblicherweise in etwas modifizierter Form angewendet, wobei das Verfahren nicht kontinuierlich überwacht wird, sondern alle 30 Sekunden Proben genommen werden und das erzeugte Umwandlungsprodukt gemessen wird (wie durch die Kreise • oder ∘ angegeben).
  • Wenn man ein kleines Thrombin-Substrat verwendete, wobei es sich um das Verfahren handelt, das routinemäßig eingesetzt wurde, bevor die vorliegende Erfindung erfunden wurde, wurden Kurven erhalten, wie sie durch -•- dargestellt sind. Um die Menge des Umwandlungsproduktes zu bestimmen, das durch die Wirkung des freien Thrombins erzeugt wird, wurde die Kurve in zwei Teile aufgeteilt, Produkterzeugung durch freies Thrombin bzw. durch α2M-IIa. Die Produkterzeugung durch freies Thrombin endet, wenn alles Thrombin inaktiviert wurde, dagegen läuft die Produkterzeugung durch α2M-IIa weiter. Dies erklärt die anhaltende lineare Produkterzeugung am Ende der Kurve -•-. Die Sammlung der gemessenen Werte sollte in einen Satz für die Produkterzeugung durch das freie Thrombin und einen Satz für die Produkterzeugung durch α2M-IIa aufgeteilt werden. Für dieses Verfahren wurde ein mathematischer Algorithmus entwickelt [Hemker, H. C., S. Wielders, H. Kessels und S. Béguin, „Continuous Registration of Thrombin Generation in Plasma, its Use for the Determination of the Thrombin Potential", Thromb. Haemost. 70: 617-624 (1973)]. Das Prinzip ist wie folgt. Bei t = 0 liegt kein Thrombin und kein α2M-IIa vor und das Signal wird auf Null gesetzt. Bei t = 0,5 Min. (der zweite Messpunkt) wird ein erhöhtes Signal gemessen, das auf der S-Hydrolyse durch Thrombin und α2M-IIa beruht. Eine Fraktion dieses Signals (k×α2M-IIa-Konzentration) beruht auf α2M-IIa. Bei t = 1 Min. ist das auf der S-Hydrolyse durch freies Thrombin beruhende Signal durch die vorliegende Menge von α2M-IIa erhöht. Dieses Verfahren wird so lange fortgesetzt, bis der letzte Messpunkt erreicht ist. Aus der theoretisch hergeleiteten Kurve und den tatsächlichen Beobachtungen wissen wir, dass am Ende der Kurve das ganze freie Thrombin inaktiviert wurde und der Anstieg des Signals vollständig auf der S-Hydrolyse durch α2M-IIa beruht. Indem ein k-Wert gewählt wird, bei dem der letzte Teil der Kurve möglichst klein wird (d.h. die Erzeugung des Produkts ist mit der Zeit konstant), kann der Satz von Messwerten in ein Signal, das auf der S-Hydrolyse durch freies Thrombin beruht (-∘-), und ein Signal, das auf der Wirkung von α2M-IIa beruht (-∇-), aufgeteilt werden.
  • Es wird darauf hingewiesen, dass das durch das freie Thrombin verursachte Signal ein Plateau erreicht, das unabhängig vom verwendeten Verfahren gleich bleibt. Wenn ein kleines Thrombin-Substrat verwendet wird, muss diese Obergrenze mit einem mathematischen Algorithmus bestimmt werden. Wenn jedoch ein großes Thrombin-Substrat gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann das Plateau einfach durch Ablesen des Signal-Endpunkts bestimmt werden.
  • Beispiel 2
  • Hydrolyse des Ovalbumin-Substrats OA-S2288 durch α2M-IIa und Thrombin
  • In diesem Beispiel wird gezeigt, dass das Substrat durch Kopplung von Ovalbumin an S2288 seine Fähigkeit verliert, durch α2M-IIa hydrolysiert zu werden, nicht jedoch durch Thrombin. Dieses Substrat (OA-S2288) wurde folgendermaßen hergestellt. Ein Reaktionsgemisch wurde hergestellt, das 1 mM S2288, 50 mM Natriumcarbonat (pH 10,2), 20 mg/ml Ovalbumin und 3,6 mg/ml Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3) enthielt. Dieses Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, danach wurden 50 mM Tris (pH 8,2) zugegeben und das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Das Gemisch wurde auf eine Sephadex G25-Säule (16 × 1,6 cm3) aufgetragen und mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Min. eluiert. Der Elutionspuffer war 50 mM HEPES, 100 mM NaCl (pH 7,35). Der erste Peak, der aus der Säule eluiert wurde, enthielt das an das S2288 gekoppelte Ovalbumin (OA-S2288).
  • Die amidolytische Aktivität des menschlichen Thrombins und menschlichen α2M-IIa gegenüber OA-S2288 wurde gemessen. Die Reaktionsgemische enthielten 22 μM OA-S2288, 50 nM Thrombin oder α2M-IIa und 175 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 2 mg/ml Ovalbumin (pH 7,9).
  • In 2 ist die Menge des erzeugten freien p-Nitroanilid (pNA), ausgedrückt als Milli-optische-Dichte bei 405 nm, gegen die Zeit aufgetragen. Die Reaktionstemperatur war 37°C. Die grauen Kurven stellen die gemessenen Werte dar, wohingegen die schwarze Linie durch Berechnen erhalten wird, wenn man voraussetzt, dass die Produkterzeugung gemäß den Michaelis-Menten-Kinetiken erfolgt.
  • Die Produkterzeugung über die Zeit kann wie folgt beschrieben werden: E∙kcat·St/(Km + St), wobei St die Substratkonzentration in der Zeit (d.h. die ursprünglich vorliegende Substratkonzentration (S0) minus das erzeugte Produkt oder gespaltenen Substrat), und E das Enzym ist, welches das Substrat spaltet, entweder Thrombin oder α2M-IIa.
  • Die folgenden Konstanten wurden gefunden: S0 = 22 μM, Km = 1,47 μM und kcat = 0,31 s–1 , wenn E Thrombin ist, und 0,002 S–1, wenn E α2M-IIa ist.
  • Beispiel 3
  • Hydrolyse des Ovalbumin-Substrats OA-Ala-Arg-AMC durch das freie Thrombin und das durch α2M inaktivierte Thrombin
  • Dieses Beispiel zeigt, dass das Substrat durch Kopplung von Ovalbumin mit dem fluoreszierenden Substrat Ala-Arg-AMC nicht mehr durch Thrombin gespalten wird, das in der Höhlung von α2M eingefangen ist. 3 zeigt, dass freies Thrombin die fluoreszierende Gruppe (AMC) abspaltet, dass jedoch das durch α2M inaktivierte Thrombin dies nicht kann.
  • Die Kopplung von Ovalbumin an Ala-Arg-AMC wurde wie folgt durchgeführt. Zu 1 ml von 1 mg/ml Ovalbumin in PBS (10 mM Kaliumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4) wurden 6 μl 50 mM BS3 in 100 % Dimethylsulfoxid zugegeben. Das Gemisch wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und zweimal gegen 2 l PBS dialysiert (jeweils zwei Stunden). Danach wurden 5 μl 100 mM Ala-Arg-AMC zugefügt und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde die Probe wie vorher dialysiert (zweimal gegen 2 l PBS).
  • 3 zeigt die Ergebnisse der Fluoreszenzmessungen in einem Fluoroskan Ascent, ausgestattet mit einem Heizblock, einem 390-nM-Anregungs- und 460-nm-Emissionsfilter. Der Test wurde bei 25°C in Microfluor W Mikrotiterplatten mit „U"-Boden und 96 Vertiefungen (Dynex, London, UK) in 10 mM HEPES, 5 mM CaCl2, 0,02 % Natriumazid, pH 8,0, durchgeführt. Im Fall von -∘- enthielt das Gefäß 5,5 μM OA-AR-AMC (Ala-Arg-AMC, gekoppelt an Ovalbumin) und 85 nM menschliches Thrombin, und im Fall von -∇- 5,5 μM OA-AR-AMC und 65 μM menschliches α2M-IIa. Die schwarzen Symbole (-•- und -∇-) wurden durch Berechnen erhalten, wobei davon ausgegangen wurde, dass das Substrat durch Thrombin gemäß Michaelis-Menten-Kinetiken hydrolysiert wird. Aus der Berechnung wurden die folgenden Konstanten für die Hydrolyse durch Thrombin gefunden: Substratkonzentration So = 5,5 μM, Km = 1,2 μM und kcat = 3,3 s–1 Für die Hydrolyse durch α2M-IIa wurden die bereits hergeleiteten S0 und Km sowie kcat = 0,008 s–1 gefunden.
  • Beispiel 4
  • Bestimmung des ETP im Plasma mit SQ68 und OA-Phe-Pip-Lys-pNA
  • Vgl. 4. Die Thrombin-Erzeugung wurde wie früher beschrieben gemessen [Hemker, H. C., Wielders, S., Kessels, H., Béguin, S., „Continuous Registration of Thrombin Generation in Plasma, its Use for the Determination of the Thrombin Potential", Thromb. Haemost. 70: 617–624 (1993); und Hemker, H. C., und Béguin, S., „Thrombin Generation in Plasma: Its Assessment via the Endogenous Thrombin Potential", Thromb. Haemost. 74: 134–138 (1995)].
  • Erzeugung von pNA in gerinnendem Plasma, zu dem SQ68 (-•-) oder OA-Phe-Pip-Lys-pNA (-∇-) zugegeben wurde; wobei Pip Pipecolyl darstellt. Die pNA-Erzeugung wurde durch Messung der optischen Dichte bei 405 nm überwacht. Die Substratkonzentration betrug in beiden Fällen 0,5 mM. Der mit SQ68 erhaltene Satz von Werten wurde analysiert und aufgeteilt in pNA, erzeugt durch freies Thrombin (-⊗-), und pNA, erzeugt durch α2M-IIa (-∇-), wobei der in Beispiel 1 beschriebenen Algorithmus verwendet wurde.
  • Es ist deutlich zu sehen, dass bei Verwendung eines Substrats gemäß der vorliegenden Erfindung die Versuchsmessdaten in sehr effizienter Weise erhalten werden, die direkt die gleiche biologische Aktivität ergeben (d.h. die Menge des Substrats, das durch das freie Thrombin gespalten wird), wie bei einer komplexen mathematischen Zerlegung der Kurve aus einem herkömmlichen Substrat.

Claims (13)

  1. Verfahren zur Bestimmung eines aktiven proteolytischen Enzyms in einer Blutprobe oder in einer anderen biologischen Flüssigkeitsprobe, die möglicherweise einen Komplex aus dem proteolytischen Enzym und α2-Makroglobulin umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einem Substrat in Kontakt gebracht wird, das ein Molekül mit einer Mr von größer als 10kD, gekoppelt an ein Signalsubstrat, umfasst, wobei das Signalsubstrat eine nachweisbare Abgangsgruppe umfasst, und wobei das Substrat durch das proteolytische Enzym nicht aber durch den Komplex hydrolysiert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das aktive proteolytische Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thrombin, aktiviertem Gerinnungsfaktor, aktiviertem fibrinolytischen Faktor und einer aktivierten Komponente des Komplementsystems.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das aktivierte proteolytische Enzym Thrombin ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Molekül mit einer Mr größer als 10kD ein inertes Molekül ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Protein, vorzugsweise Ovalbumin, Polysaccharid und synthetischem Polymer.
  5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Molekül mit einer Mr größer als 10kD wasserlöslich ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Molekül mit einer Mr größer als 10kD eine Mr von etwa 40kD und eine Löslichkeit von mindestens 40mg/ml aufweist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Molekül mit einer Mr größer als 10kD eine Mr von etwa 20kD und eine Löslichkeit von mindestens 50mg/ml ausweist.
  8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Abgangsgruppe ein optische Dichte-Signal oder ein Fluoreszenzsignal ergibt.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Abgangsgruppe p-Nitroanilid oder 7-Amino-4-methyl-cumarin ist.
  10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ovalbumin gekoppelt an N-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilid·2HCl, Ovalbumin gekoppelt an H-Alanyl-L-arginin-7-amid-4-methyl-cumarin und Ovalbumin gekoppelt an H-D-Phenylalanyl-L-prolyl-L-lysin-p-nitroanilid·2HCl.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Substrat eine Abgangsgruppe von einem oder mehreren Wasserstoffionen umfasst.
  12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Menge und die kinetischen Eigenschaften des Substrats so ausgewählt sind, dass die Menge des proteolytischen Enzyms, das in der Probe erzeugt wird, das Substrat nicht vollständig aufbraucht.
  13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Menge des hydrolysierten Substrats direkt proportional zur Fläche unterhalb der Kurve der Erzeugung des protoelytischen Enzyms ist.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040241782A1 (en) 2001-01-26 2004-12-02 Eloisa Lopez-Calle Methods and means for detecting enzymatic cleavage and linkage reactions
JP4718833B2 (ja) * 2002-05-01 2011-07-06 シナプス ベスローテン フェンノートシャップ 複合生物媒体における、一時的なタンパク質分解活性の濃度を決定するための診断試験
DE102005008066A1 (de) 2005-02-22 2006-08-24 Haemosys Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Gesamtgerinnungsaktivität einer Blut- oder Plasmaprobe
DE102006035899A1 (de) * 2006-07-31 2008-02-07 Dade Behring Marburg Gmbh Polysacharid-Peptid-Konjugate zur Verwendung als Thrombinsubstrate
CA2668356A1 (en) * 2006-11-02 2008-05-08 Thrombinoscope B.V. Method for measuring the concentration of transient proteolytic activity in composite biological media containing cells
EP2206063A1 (de) 2007-10-16 2010-07-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Schätzung von diagnostischen markern
RU2518247C2 (ru) * 2011-07-26 2014-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "ГемаКор Лабс" (ООО "ГемаКор Лабс") Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе
EP3363912B1 (de) 2017-02-17 2020-10-28 Synapse B.V. Selbstkalibrierter assay zur bestimmung der erzeugung von proteolytischem enzym, dedizierte mittel und verwendungen davon

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2363854C3 (de) * 1973-12-21 1980-01-03 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Substrat zur Proteinasebestimmung sowie dessen Herstellung
US4897444A (en) * 1985-05-31 1990-01-30 The Research Foundation Of The State University Of New York Immobilized fluorogenic substrates for enzymes; and processes for their preparation
US5073487A (en) * 1989-01-30 1991-12-17 Athens Research And Technology, Inc. Rapid assay for functional human α1 -proteinase inhibitor
AU4634896A (en) * 1995-01-10 1996-07-31 Hendrik Coenraad Hemker Methods of determining endogenous thrombin potential (etp) and thrombin substrates for use in said methods

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