DE102012014339A1

DE102012014339A1 - Verwendung eines Substrats in einem Verfahren zur Messung der Aktivität von vorhandenen proteolytischen Enzymen

Info

Publication number: DE102012014339A1
Application number: DE102012014339A
Authority: DE
Inventors: Gérard Quentin; Audrey CARLO; Loise Boulanger
Original assignee: Diagnostica Stago SAS
Current assignee: Diagnostica Stago SAS
Priority date: 2011-07-22
Filing date: 2012-07-19
Publication date: 2013-01-24
Also published as: FR2978163B1; US20130023002A1; FR2978163A1; ITMI20121259A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme mit der allgemeinen Formel Q1-Xaa2-Xaa1-Rhodamin110-Q2, in der Xaa1 und Xaa2 Aminosäuren bedeuten und Q2 eine Gruppe, die eine Alkylgruppe umfasst, bedeutet, um es in einer Blutprobe, die ein Glykosaminoglykan enthält, dem Glykosaminoglykan zu gestatten, die Koagulation der Blutprobe zu hemmen, wodurch die Antikoagulationswirkung des Glykosaminoglykans nicht gestört wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme, insbesondere in einem Verfahren zum Messen der Aktivität von proteolytischen Enzymen in einer Blutprobe. Die Erfindung betrifft auch ein Messkit, mit dem sich dieses Verfahren durchführen lässt. Insbesondere soll mit dem Verfahren in einer Blutprobe, die von einem mit einem Antikoagulans aus der Familie der Glykosaminoglykane behandelten Patienten stammt, die Aktivität von für Hämostase verantwortlichen Enzymen gemessen werden. Dieser physiologische Vorgang, mit dem das Bluten gestillt werden soll, greift in eine Kaskade von Enzymen und Koagulationsfaktoren ein. Bei dem Antikoagulans handelt es sich im Allgemeinen um ein Molekül der Glykosaminoglykanfamilie, insbesondere um ein Heparin. Man unterscheidet zwischen den hochmolekularen Heparinen, den sogenannten ”unfraktionierten Heparinen”, kurz UFH genannt, und den ”niedermolekularen Heparinen”, kurz NMH genannt. Diese verschiedenen Heparine werden den Patienten in Abhängigkeit von deren Pathologie verabreicht.
Üblicherweise soll mit den Messverfahren die Aktivität von Enzymen, zum Beispiel Thrombin oder Plasmin, kontrolliert werden. Nun werden die bei diesen Verfahren eingesetzten Enzymsubstrate aus einem synthetischen Peptid, das aus zwei oder drei Aminosäuren mit Affinität für das Enzym besteht, und einer fluorophoren Gruppe, die an dieses Peptid gebunden ist, gebildet. Das Enzym kann nun das Substrat zwischen dem Fluorophor und dem Peptid spalten, wobei die Zustandsänderung des Fluorophors nun ein nachweisbares Fluoreszenzsignal geben kann. Das Substrat wird auch Tracer-Reagens genannt.
Es sei auf das Dokument EP 1 833 982 Bezug genommen, in dem zum Beispiel ein thrombinspezifisches Enzymsubstrat beschrieben wird, das ein Tripeptid in Kopplung mit 7-Amino-4-methylcumarin, welches üblicherweise kurz AMC genannt wird, aufweist. Ebenfalls beschrieben wird ein plasminspezifisches Enzymsubstrat, das ein mit Rhodamin₁₁₀ gekoppeltes Bisdipeptid aufweist.
Gemäß den üblichen Verfahren zum Messen der Aktivität von proteolytischen Enzymen wird eine Blutprobe, eine Probe von Blut oder von Plasma, bereitgestellt, die mit einem Aktivator, zum Beispiel dem Gewebefaktor, der es ermöglichen wird, die Produktion des Enzyms zu aktivieren, in Kontakt gebracht wird. Dann wird das Substrat oder der Tracer mit einem Initiator, zum Beispiel Calcium in Innenform, versehen. Nun werden die Blutprobe und der Aktivator mit dem Substrat und dem Initiator im selben Medium in Kontakt gebracht, in dem erstens die Koagulationsreaktionen und zweites die Reaktion des Enzyms mit dem Substrat erfolgen werden. Der Initiator wird es ermöglichen, den Koagulationsvorgang zu entkoppeln, während der Aktivator die Produktion des Enzyms induziert.
Der Einsatz eines Tracers, der Rhodamin₁₁₀ enthält, in diesen Messmethoden hat sich als interessant erwiesen, da dieser Fluorophor lange Anregungs- und Emissionswellenlängen aufweist, die im Vergleich zu 7-Amino-4 methylcumarin, das üblicherweise für diese Art von Messung eingesetzt wird, verschoben sind und die sich nicht mit dem gegebenenfalls in der Blutprobe vorhandenen Hämoglobin überlagern.
Gleichwohl fand man bei den verschiedenen Blutproben Unterschiede bei der Messung der Aktivität zwischen den Substraten, die Rhodamin₁₁₀ beinhalten, und den üblichen Substraten, die 7-Amino-4-methylcumarin beinhalten.
Ein weiteres Problem, das sich stellt und das die vorliegende Erfindung lösen soll, ist die Bereitstellung eines Tracer-Substrats für proteolytische Enzyme, das Rhodamin₁₁₀ beinhaltet und das es ermöglicht, zusammenhängende Aktivitätsmessungen bei verschiedenen Blutproben durchzuführen, wenn diese ein Antikoagulationsmittel des Glykosaminoglykantyps enthalten.
Mit dem Ziel, dieses Problem zu lösen, wird in der vorliegenden Erfindung die Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme der allgemeinen Formel Q¹-Xaa²-Xaa¹-Rhodamin₁₁₀-Q² vorgeschlagen, in der Xaa¹ und Xaa² Aminosäuren bedeuten und Q² eine Gruppe, die eine Alkylgruppe umfasst, bedeutet, um es in einer Blutprobe, die ein Glykosaminoglykan enthält, dem Glykosaminoglykan zu gestatten, die Koagulation der Blutprobe zu hemmen und so die Aktivität von bestimmten proteolytischen Enzymen zu modulieren und insbesondere zu erniedrigen. Weiterhin wird die Antikoagulationswirkung des Glykosaminoglykans nicht gestört.
So besteht ein Merkmal der Erfindung in der Bereitstellung der Neutralisationswirksamkeit von bestimmten Substraten, die Rhodamin₁₁₀ beinhalten, in der Identifikation eines Substrats mit einer bestimmten Struktur, mit der es genau nicht möglich ist, die in den verschiedenen Blutproben enthaltenen Glykosaminoglykane zu neutralisieren. So kann man eine Messung der Aktivität von proteolytischen Enzymen an Blutproben von Patienten, die mit Antikoagulationsmitteln behandelt worden sind, durchführen, wobei die Auswirkungen der Behandlung berücksichtigt werden können. Dadurch können jene moduliert werden.
Es konnte nämlich beobachtet werden, dass die üblichen Substrate, die 7-Amino-4-methylcumarin als Fluorphor beinhalten, keinerlei Auswirkung auf die verschiedenen Glykosaminoglykane, die derzeit als Antikoagulationsmittel eingesetzt werden, ausüben.
Es ist daher fortan möglich, ein erfindungsgemäßes Substrat für proteolytische Enzyme einzusetzen, um die scheinbare enzymatische Aktivität einer Blutprobe von Patienten, die mit Antikoagulationsmitteln behandelt wurden, optisch in einen Anregungs- und Emissionswellenlängenbereich, der in Bezug auf das Hämoglobin vorteilhaft ist, zu messen.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung bedeutet Q¹ H; oder die Gruppe R¹O-(C=O)-CH₂-CO, worin R¹ eine Alkyl- oder Arylgruppe umfasst; oder die Gruppe R²-Xaa³, worin Xaa³ eine Aminosäure bedeutet und R² eine Schutzgrupe oder H bedeutet. So erhält man ein Enzymsubstrat mit einer guten Löslichkeit und daher ein homogenes Reaktionsmedium. Die Fluoreszenzmessungen sind daher reproduzierbar.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei Xaa¹ um eine basische Aminosäure, zum Beispiel Arginin. Auf diese Weise wird das Enzym perfekt von dem Substrat erkannt.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung bedeutet Q¹ die Gruppe R²-Xaa³, wobei Xaa² und Xaa³ jeweils Glycin bedeuten, wodurch dem Substrat eine schwache Affinität gegenüber proteolytischen Enzymen verliehen wird. Mit dem Substrat, das solch eine Struktur aufweist, kann der Verlauf des Auftretens einer enzymatischen Aktivität, die allgemeiner ”Produktion” genannt wird, leichter gemessen werden. Bei dieser Art der Messung ist es nämlich wichtig, die Gesamtheit der Kaskade der enzymatischen Reaktionen in Betracht zu ziehen und ihre Kinetik nicht zu stören. Dadurch, dass das Substrat eine geringere Affinität gegenüber Enzymen aufweist, wird die Variation der durch die Hydrolyse des Substrats mobilisierten Enzyme vernachlässigbar klein werden und wird nur eine sehr geringe Auswirkung auf die Geschwindigkeit der anderen enzymatischen Reaktionen der Kaskade haben. Obwohl die Reaktion des erfindungsgemäßen Substrats und des in Betracht gezogenen Enzyms eine relativ niedrige Geschwindigkeitskonstante aufweist, wird das Fluoreszenzsignal trotzdem stark und nachweisbar sein, da Rhodamin₁₁₀ stark fluoresziert.
Gemäß einer weiteren bestimmten Ausführungsform, in der Q¹ die Gruppe R¹O-(C=O)-CH₂-CO bedeutet, Xaa² Valin bedeutet und R¹ die Ethylgruppe bedeutet, wird dem Substrat eine schwache Affinität gegenüber proteolytischen Enzymen verliehen. Daher wird das Auftreten einer enzymatischen Aktivität ebenfalls gemessen, ohne die Kinetik der Kaskade der enzymatischen Reaktionen zu stören.
Gemäß einer weiteren Variante der Durchführung der Erfindung umfasst Q² eine Gruppe -(C=O)_m-(O)_n-, die an das Rhodamin₁₁₀ gebunden ist und in der n = 0, 1 und m = 0, 1. Auf diese Weise kann das Substrat leichter hergestellt werden. Tatsächlich wird aufgrund der Gruppe -(C=O)_m-(O)_n- das Anheften der die Alkylgruppe enthaltenden Gruppe an das Rhodamin₁₁₀ erleichtert. Vorteilhafterweise ist n = 0 und m = 1, und es handelt sich bei der Gruppe einfach um eine Carbonylfunktion. Zum Beispiel handelt es sich bei Q² um die Acetylgruppe oder die 3-Methylbutanoylgruppe.
Gemäß einem weiteren Gegenstand wird in der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Messen der Aktivität von proteolytischen Enzymen einer Blutprobe vorgeschlagen, wobei es sich bei dem Verfahren um ein solches handelt, bei dem man eine Blutprobe, die proteolytische Enzyme enthält und die ein Glykosaminoglykan enthalten kann, bereitstellt; ein Substrat für proteolytische Enzyme, das, wenn die proteolytischen Enzyme mit dem Substrat reagieren, ein Signal geben kann, bereitstellt; die Blutprobe mit dem Substrat für proteolytische Enzyme in Kontakt bringt, so dass man es den proteolytischen Enzymen ermöglicht, mit dem Substrat zu reagieren, so dass ein Signal, das die Aktivität von proteolytischen Enzymen in der Probe anzeigt, abgegeben wird. Erfindungsgemäß wird ein Substrat für proteolytische Enzyme der allgemeinen Formel: Q¹-Xaa²-Xaa¹-Rhodamin₁₁₀-Q², worin Xaa¹ und Xaa² Aminosäuren bedeuten und Q² eine Gruppe, die eine Alkylgruppe umfasst, bedeutet, verwendet, so dass man es gleichzeitig dem Glykosaminoglykan gestattet, die Koagulation der Blutprobe zu hemmen und die Aktivität von proteolytischen Enzymen zu messen, wobei das gemessene Signal die Aktivität von nur denjenigen proteolytischen Enzymen, die fähig sind, eine Koagulation hervorzurufen, darstellt. Das verwendete Substrat für proteolytische Enzyme beinhaltet natürlich alle oben genannten Varianten, Ausgestaltungen und Ausführungsformen.
Vorzugweise stellt man weiterhin ein Aktivierungsreagens bereit, mit dem die Produktion von proteolytischen Enzymen induziert werden kann, und man bringt das Aktivierungsreagens mit der Blutprobe und dem Substrat für proteolytische Enzyme in Kontakt. Wenn das Aktivierungsreagens mit der Blutprobe in Kontakt kommt, führt dies zu der Produktion von proteolytischen Enzymen. So zum Beispiel ist das Aktivierungsreagens aus der Reihe Gewebefaktor, Phospholipide, Thromboplastin, Kaolin, Ellaginsäure, Collagen, Adenosindiphosphat, Arachidonsäure, Thrombinrezeptoraktivierungspeptid oder einer Kombination davon ausgewählt. Vorteilhafterweise wird man einen Aktivator wählen, der sehr weit oben in der Koagulations- und Fibrinolyseenzymreaktionskaskade zu wirken vermag, insbesondere dann, wenn bei der Messung das Erscheinen einer enzymatischen Aktivität verfolgt werden soll.
Weiterhin wird ein Initiierungsreagens bereitgestellt, um die Reaktionen der proteolytischen Enzyme zu entkoppeln, und dieses Initiierungsreagens wird mit der Blutprobe und dem Substrat für proteolytische Enzyme in Kontakt gebracht. Auf diese Weise wird es der Initiator ermöglichen, den Koagulationsvorgang zu entkoppeln, während der Aktivator die Produktion von Enzymen hervorruft. Vorteilhafterweise handelt es sich bei dem Initiierungsreagens um Calcium, und dieses wird zum Beispiel in Form von Calciumcitrat bereitgestellt.
Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Messverfahrens bringt man die Blutprobe mit dem Substrat für proteolytische Enzyme in einer Substratkonzentration von zwischen 50.10^–6 und 1000.10^–6 mol.l^–1, zum Beispiel zwischen 300.10^–6 und 500.10^–6 mol.l^–1, in Kontakt. Auf diese Weise gelangt man zu einem optischen Signal, das ausreichend stark ist, um die Enzymaktivität zu messen.
Gemäß einem weiteren Gegenstand wird in der vorliegenden Erfindung ein Kit zum Messen der Aktivität von proteolytischen Enzymen einer Blutprobe zum Durchführen des oben beschriebenen Messverfahrens vorgeschlagen. Erfindungsgemäß umfasst das Kit: ein Aktivatorreagens, das die Induktion der Produktion von proteolytischen Enzymen gestattet; ein Substrat für proteolytische Enzyme der allgemeinen Formel: Q¹-Xaa²-Xaa¹-Rhodamin₁₁₀-Q², worin Xaa¹ und Xaa² Aminosäuren bedeuten und Q² eine Gruppe, die eine Alkylgruppe umfasst, bedeutet; und ein Initiierungsreagens zum Entkoppeln der enzymatischen Reaktionen. Das verwendete Substrat für proteolytische Enzyme beinhaltet alle oben genannten Varianten, Ausgestaltungen und Ausführungsformen.
Gemäß einer ersten Durchführungsvariante des Kits wird das Substrat für proteolytische Enzyme mit dem Initiierungsreagens in ein- und demselben Behältnis vermischt, während sich das Aktivierungsreagens in einem anderen Behältnis befindet. Das Enzymsubstrat liegt nun zum Beispiel in einer Konzentration von zwischen 100.10^–6 mol.l^–1 und 500.10^–6 mol.l^–1 vor, während das Initiierungsreagens in einer Konzentration zwischen 10.10^–3 mol.l^–1 und 20.10^–3 mol.l^–1 vorliegt. Das Aktivierungsreagens wiederum liegt in einer Konzentration von zum Beispiel zwischen 0,5.10^–12 und 2.10^–12 mol.l^–1 vor.
Gemäß einer zweiten Variante wird das Aktivatorreagens mit dem Initiierungsreagens in ein- und demselben Behältnis vermischt, während nur das Enzymsubstrat in einem anderen Behältnis vorliegt. Wird diese zweite Variante eingesetzt, so wird insbesondere nicht die Stabilität des Substrats negativ beeinflusst.
Beim Einsatz des erfindungsgemäßen Kits werden beispielsweise erstes zum Beispiel 40 μl einer Blutprobe und zweitens 10 μl des Enzymsubstrats, und zwar allein oder in Mischung mit dem Initiierungsreagens, sowie 10 μl des Aktivatorreagens, jeweils in Mischung mit dem Initiierungsreagens oder allein, bereitgestellt. Diese Volumenangaben von Probe und Reagentien dienen natürlich nur der Veranschaulichung und werden in Abhängigkeit von den Messgeräten und auch der Art der Messung eingestellt. Es kann sich auch um Mehrfache oder auch um jeweils andere Volumina, zum Beispiel 30 μl/15 μl/15 μl, handeln.
Weitere Besonderheiten und Vorteile der Erfindung werden beim Durchlesen der nun folgenden Beschreibung einer bestimmten Ausführungsform der Erfindung klar werden, die nur der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung dienen und in denen auf die beigelegten Zeichnungen Bezug genommen wird, wobei
in 1 eine graphische Darstellung, die die Enzymaktivitäten in Abhängigkeit von einer Heparinkonzentration gemäß eines ersten Ausführungsbeispiels eines Auswertungsverfahrens zeigt, dargestellt ist;
in 2 eine graphische Darstellung, die die Enzymaktivitäten in Abhängigkeit von einer Heparinkonzentration gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiels eines Auswertungsverfahrens zeigt, dargestellt ist;
in 3 eine graphische Darstellung, die die Enzymaktivitäten in Abhängigkeit von einer Heparinkonzentration gemäß einem dritten Ausführungsbeispiel eines Auswertungsverfahrens zeigt, dargestellt ist;
in 4 eine graphische Darstellung, die die Enzymaktivitäten in Abhängigkeit von einer Heparinkonzentration gemäß einem vierten Ausführungsbeispiel eines Auswertungsverfahrens zeigt, dargestellt ist; und
in 5 eine graphische Darstellung, die die Intensität eines Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Zeit gemäß dem erfindungsgemäßen Messverfahren mit einem unfraktionierten Heparin in verschiedenen Konzentrationen zeigt, dargestellt ist.
Der Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung von Substraten für proteolytische Enzyme, die es gestattet, die Aktivität von Enzymen in der Blutprobe eines Patienten zu messen, ohne das Medium während der Messung zu stören und insbesondere ohne das Heparin zu beeinflussen, wenn der Patient mit Antikoagulationsmitteln behandelt wird.
Von Substraten, bei denen der Fluorophor 7-Amino-4-methylcumarin, allgemein AMC genannt, ist, ist bekannt, dass sie keine neutralisierende Wirkung auf Glykosaminoglykane und insbesondere Heparin ausüben.
In einem ersten Teil der detaillierten Beschreibung wird erstens beschrieben werden, wie man die Neutralisation dieser Glykosaminoglykane, die in einer Blutprobe enthalten sind, auswertet, und zweitens werden. Beispiele für ein Substrat für proteolytische Enzyme, deren Fluorophor Rhodamin ist, der allgemeinen Formel: Q¹-Xaa²-Xaa¹-Rhodamin₁₁₀-Q², die die Glykosaminoglykane nicht stören, gegeben. Dieser Fluorophor wird beibehalten, da er Anregungs- und Emissionswellenlängen aufweist, die im Vergleich zu 7-Amino-4-methylcumarin verschoben sind und die sich nicht mit dem Hämoglobin der Blutprobe überlagern.
Man wird beobachten, dass einer der Vorteile der Erfindung darin bestand, die Auswirkung von bestimmten Substraten für proteolytische Enzyme, wenn es sich bei ihrem Fluorophor um Rhodamin₁₁₀ handelt, auf die Antikoagulationswirksamkeit der Glykosaminoglykane festzustellen. Weiterhin wird dieses Prinzip der Unschädlichkeit der erfindungsgemäßen Substrate in Bezug auf die Heparine bei zwei Typen, nämlich den unfraktionierten Heparinen, auch UFH genannt, und den niedermolekularen Heparinen, auch NMH genannt, überprüft werden.
In einem zweiten Teil der Beschreibung wird man dann ein bestimmtes Enzymsubstrat, das in dem ersten Teil identifiziert wurde, in einem erfindungsgemäßen Messverfahren einsetzen, in dem die Heparine nicht von seiner Gegenwart beeinflusst werden und sie ein Messen der Enzymaktivität gestatten.
Bevor nun auf die Diagramme der Figuren Bezug genommen wird, soll das für die quantitative Bestimmung der Neutralisationswirkung von Substraten für proteolytische Enzyme auf Glykosaminoglykane in einer Blutprobe, insbesondere einem Plasma, eingesetzte Auswertungsverfahren beschrieben werden. Mit diesem Auswertungsverfahren kann man sowohl unfraktionierte Heparine als auch niedermolekulare Heparine einsetzen.
Weiterhin wird mit diesem Verfahren eine Kontrolle der Aktivität des Faktors Xa, der sich dort befindet, wo sich die beiden Enzymkaskaden, die zu der Bildung von Thrombin führen, kreuzen, angestrebt. Außerdem wird die Reaktion von Antithrombin, einem natürlichen Hemmer der Thrombinproduktion, kontrolliert. Bei seinem Auftreten koppelt sich der Faktor Xa an sein natürliches Substrat, das Prothrombin, unter Bildung von Thrombin. Das in der Probe enthaltene Heparin wiederum bildet mit dem Antithrombin einen Komplex, der die Hemmung des Faktors Xa fördert.
Weiterhin wird ein chromogenes Substrat auf para-Nitroanilinbasis, das vom Faktor Xa hydrolysiert wird, eingesetzt und die Freisetzung des para-Nitroanilins, die optisch messbar ist, ist nun zu der in dem Medium vorhandenen Heparinkonzentration umgekehrt proportional. Auf diese Weise leitet man ein Maß für die Anti-Xa-Aktivität ab.
Es soll nun auf das Diagramm von 1 Bezug genommen werden, um die Ergebnisse eines ersten Referenzbeispiels für die Durchführung des oben genannten Auswertungsverfahrens zu analysieren.
In diesem ersten Beispiel handelt es sich bei dem verwendeten Heparin um ein unter der Markenbezeichnung ”Calciparine^®” vertriebenes unfraktioniertes Calciumheparin. Gemäß dem Auswertungsverfahren wird die Anti-Xa-Aktivität aufgezeichnet und als Funktion der Heparinkonzentration des Mediums auf die Ordinate übertragen. Die Heparinkonzentrationen schwanken zwischen 0 und 1,67 IE/ml und liegen relativ nahe zu den therapeutischen Konzentrationen. Die erste, schräge Kurve 10 entspricht einer ersten Messreihe, bei der man zusätzlich zu dem Substrat auf para-Nitroanilinbasis noch physiologisches Serum zu der Blutprobe zugibt. Die zweite, schräge Kurve 12 entspricht einer zweiten Messreihe, bei der man ein übliches Substrat zu der Blutprobe zugibt, bei dem es sich bei dem Fluorophor um 7-Amino-4-methylcumarin handelt und dessen zusammenfassende Formel Z-GGR-AMC lautet, worin R Arginin entspricht, G Glycin entspricht und wo Z eine Schutzgruppe bedeutet. Dieses Tracer-Substrat wird allgemein in Methoden zur Messung der Enzymaktivität eingesetzt.
So zeigen die Kurven 10, 12 die Variationen der Anti-Xa-Aktivität in Abhängigkeit von der Heparinkonzentration des Mediums.
Da das physiologische Serum von Natur aus keinerlei Auswirkung auf die Antikoagulationswirkung des Heparins ausübt und die beiden Kurven im Wesentlichen verschmolzen sind, schließt man hieraus ganz natürlich und qualitativ, dass das Substrat Z-GGR-AMC keine nachweisbare Wirkung gegenüber Heparin aufweist.
Genauer gesagt wird der Prozentsatz. der Neutralisation des Substrats als das Verhältnis des Unterschieds zwischen der Variation der Anti-Xa-Wirksamkeit in dem Medium, das das physiologische Serum enthält, und in dem Medium, das das Substrat enthält, zwischen zwei Heparinkonzentrationen und nur der Variation der Wirksamkeit in dem Medium, das das physiologische Serum enthält; zwischen denselben beiden Heparinkonzentrationen bestimmt, wobei dieses Verhältnis mit 100 multipliziert wird, so dass man das Ergebnis als Neutralisationsprozentsatz erhält.
Der Neutralisationsprozentsatz lässt sich auch kompakter formulieren: 100×(1-ΔA₁/ΔA₂), wobei ΔA₁ der Variation der Aktivität in Gegenwart des Substrats und ΔA₂ der Variation in Gegenwart des physiologischen Serums entspricht. Mit einer parallelen Messung der Variation in Gegenwart von physiologischem Serum kann man daher den Referenzwert in jeder Messreihe festlegen.
In diesem ersten Ausführungsbeispiel schwankt der Neutralisationsprozentsatz des Substrats mit der zusammenfassenden Formel Z-GGR-AMC zwischen 5% und 20%. Die Auswirkung des Substrats auf die Antikoagulationswirkung des Heparins ist daher so schwach, dass die Aktivitätsmessung aussagekräftig ist, wie dies im Folgenden genauer erklärt werden wird.
Es soll nun auf das Diagramm von 2 Bezug genommen werden, das die Ergebnisse eines zweiten Ausführungsbeispiels des oben genannten Auswertungsverfahrens zeigt, in dem die zwei Kurven 14, 16 mit denjenigen des ersten Beispiels vergleichbar sind. Die erste Kurve 14 entspricht einer ersten Reihe von Messungen, die unter Bedingungen, die denjenigen des ersten Beispiels analog sind, durchgeführt wurden, wobei physiologisches Serum zu. der Blutprobe gegeben wird. Die zweite Kurve 16 wiederum entspricht einer zweiten Reihe von Messungen, bei denen man die Blutprobe mit einem erfindungsgemäßen Substrat für proteolytische Enzyme der Formel: Q¹-Xaa²-Xaa¹-Rhodamin₁₁₀-Q² versetzt, worin gemäß einer ersten Variante V(1) Q¹ die Gruppe R¹-(O)-(C=O)-CH₂-CO bedeutet, wobei Xaa¹ Arginin bedeutet, Xaa² Valin bedeutet und R¹ die Ethylgruppe bedeutet, wobei Q² die Acetylgruppe bedeutet. Das Substrat, das den Gegenstand dieser ersten Variante bildet, wird zusammenfassend EtM-VR-Rhod₁₁₀-Ac geschrieben.
Dieses Substrat für proteolytische Enzyme spielt hier als Tracer in dem Auswertungsverfahren natürlich keine Rolle. Dieses zweite Beispiel hat lediglich das Ziel, zu zeigen, dass dieses Substrat nur eine sehr kleine Auswirkung auf die Antikoagulationswirkung des Heparins ausgeübt hat.
Bei dem eingesetzten Heparin handelt es sich ebenfalls um Calciparine^®, und es wird beobachtet, dass der gemäß der folgenden Formel: 100×(1 – ΔA₁/ΔA₂) erhaltene Neutralisationsprozentsatz in Abhängigkeit von den Heparinkonzentrationen zwischen 15% und 30% schwankt. So ist, wie dies im folgenden Teil der Beschreibung erklärt werden wird, dieses Enzymsubstrat ein guter Kandidat für das erfindungsgemäße Messverfahren, da man mit ihm die enzymatische Aktivität messen kann, ohne die Antikoagulationswirksamkeit des Heparins zu beeinflussen.
Es soll nun auf das Diagramm von 3 Bezug genommen werden, das die Ergebnisse eines dritten Ausführungsbeispiels des Auswertungsverfahrens darstellt. Es wird eine einer ersten Messreihe entsprechende Kurve 18 unter Bedingungen, die zu denjenigen der vorhergehenden Beispiele analog sind, durchgeführt, wobei physiologisches Serum zu der Blutprobe gegeben wird.
Nun wird eine zweite Messreihe durchgeführt, wobei man die Blutprobe mit einem Substrat für ein proteolytisches Enzym versetzt, das nicht erfindungsgemäß ist, sondern die zusammenfassende Formel R^2-GGR-Rhod₁₁₀-R aufweist, worin R Arginin bedeutet und G Glycin bedeutet, während R² eine Schutzgruppe bedeutet. So kann beobachtet werden, dass die Kurve 20 im Wesentlichen horizontal ist und dass der Prozentsatz der Neutralisation von Heparinen von diesem Substrat, erhalten nach der Formel 100×(1 – ΔA₁/ΔA₂), um 100% beträgt. Unter diesen Bedingungen ist das betreffende Substrat kein guter Kandidat für das Messverfahren, das im Folgenden beschrieben werden wird. Dieses dritte Beispiel ist natürlich ein Gegenbeispiel.
Es soll nun auf das Diagramm von 4 Bezug genommen werden, das die Ergebnisse eines vierten Ausführungsbeispiels des oben genannten Auswertungsverfahrens darstellt, worin die zwei Kurven 24, 26 mit denjenigen des ersten und des zweiten Beispiels vergleichbar sind. Die erste Kurve 24 entspricht einer ersten Messreihe, die unter Bedingungen durchgeführt wurden, die zu denjenigen des ersten Beispiels analog sind, worin physiologisches Serum zu der Blutprobe zugegeben wird. Die zweite Kurve 26 entspricht einer zweiten Messreihe, wo zu der Blutprobe ein erfindungsgemäßen Substrat für proteolytische Enzyme gemäß einer zweiten Variante V(2) der zusammenfassenden Formel R^2-GGR-Rhod₁₁₀3-methylbutanoyl, in der R Arginin bedeutet und G Glycin bedeutet, während R² eine Schutzgruppe bedeutet, zugegeben wird. Man wird beobachten, dass sich dieses Substrat von demjenigen des dritten Beispiels lediglich durch den Substituenten -3-Methylbutanoyl unterscheidet.
Dieses Substrat für proteolytische Enzyme spielt als Tracer bei dem Auswertungsverfahren ebenfalls keine Rolle. Dieses vierte Beispiel zeigt ebenfalls, dass dieses Substrat nur eine sehr geringe Auswirkung auf die Antikoagulationswirksamkeit des Heparins ausübt.
Bei dem eingesetzten Heparin handelt es sich ebenfalls um Calciparine^®, und es wird beobachtet, dass der gemäß der im Folgenden angegebenen Formel: 100×(1 – ΔA₁/ΔA₂) erhaltene Neutralisationsprozentsatz in Abhängigkeit von den Heparinkonzentrationen zwischen 20% und 25% schwankt. Wie dies im Folgenden der Beschreibung erklärt werden wird, ist dieses Enzymsubstrat ebenfalls ein guter Kandidat für das erfindungsgemäße Messverfahren, da mit ihm die enzymatische Aktivität gemessen werden kann, ohne die Antikoagulationswirksamkeit des Heparins zu beeinflussen.
Gemäß einer dritten, nicht dargestellten Durchführungsvariante, die noch immer nach demselben Protokoll wie diejenige der oben genannten Beispiele durchgeführt wird, weist das Substrat die zusammenfassende Formel R^2-GGR-Rhod₁₁₀-Ac auf, in der R Arginin bedeutet und G Glycin bedeutet, während R² eine Schutzgruppe bedeutet. Sie unterscheidet sich von der vorhergehenden nur durch den Acetylsubstituenten. Der Neutralisationsprozentsatz schwankt nun zwischen 12% und 18%. Dieses Substrat ist daher ein ausgezeichneter Kandidat für das erfindungsgemäße Messverfahren.
Noch immer in diesem ersten Teil der Erfindung wurde das oben genannte Auswertungsverfahren mit einem niedermolekularen Heparin, nämlich Fragmine^®, durchgeführt.
Die Ergebnisse des Prozentsatzes der Neutralisation dieses Heparins wurden für die drei oben beschriebenen Substratvarianten, nämlich V(1), V(2) und V(3), in der untenstehenden Tabelle angegeben. Tabelle I

[IE/ml] V(1) V(2) V(3)

0,42 10% 5% 1%

0,83 12% 11% 5%

1,25 13% 8% 7%

1,67 15% 4% 7%
Diese Tabelle I zeigt, dass die Neutralisationswirkung des erfindungsgemäßen Enzymsubstrats gemäß den zuvor beschriebenen drei Ausführungsvarianten bei einem niedermolekularen Heparin sehr gering ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch noch ein Verfahren zum Messen der Aktivität von proteolytischen Enzymen einer Blutprobe unter Einsatz eines Enzymsubstrats der allgemeinen Formel Q¹-Xaa²-Xaa¹-Rhodamin₁₁₀-Q², in der Xaa¹ und Xaa² Aminosäuren bedeuten und Q² eine Gruppe, die eine Alkylgruppe umfasst, bedeutet. Mit diesem Enzymsubstrat wird, ohne die Antikoagulationswirksamkeit von Heparinen in einer Blutprobe zu hemmen, die Aktivität eines Enzyms gemessen. Und dies ist weiterhin der Vorteil der Verwendung der Substrate, die den Gegenstand der Erfindung bilden.
Gemäß einer Durchführungsform des Messverfahrens handelt es sich bei der verfolgten Enzymaktivität um diejenige der Thrombinproduktion. Das Prinzip besteht darin, dass man die Messung eines Fluoreszenzsignals nach dem Inkontaktbringen des Enzymsubstrats mit einer Blutprobe, die Heparin enthält, und nachdem es die Reaktionsbedingungen dem Thrombin ermöglicht haben, das Substrat zwischen dem Peptidteil und dem Fluorophor, hier Rhodamin₁₁₀, zu spalten, verfolgt.
Um dieses Verfahren durchzuführen wird zuerst eine Blutprobe von 40 μl, die Heparin enthält, in eine Mikroküvette gegeben. Man versetzt erstens mit 10 μl des erfindungsgemäßen Enzymsubstrats in Abmischung mit einem Initiierungsreagens sowie mit 10 μl Aktivierungsreagens. Bei dem Initiierungsreagens handelt es sich um Calciumcitrat, und es weist eine Konzentration von 16,7.10^–3 mol.l^–1 auf. Bei dem Aktivierungsreagens handelt es sich um Gewebefaktor in einer Konzentration von 10^–12 mol.1^–1.
Anschließend wird ein Anregungssignal mit einer bestimmten Wellenlänge durch die Mikroküvette emittiert, und die Reaktion auf das Anregungssignal wird optisch im zeitlichen Verlauf aufgezeichnet. Je größer die Menge an produziertem Thrombin, desto stärker ist also die Signalreaktion.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform wird als Enzymsubstrat entsprechend der Durchführungsvariante V(3) des ersten Teils der genauen Beschreibung eines gewählt, das der zusammenfassenden Formel R^2-GGR-Rhod₁₁₀-Ac entspricht, in der R Arginin bedeutet und G Glycin bedeutet, während R² eine Acetylgruppen-Ac-Schutzgruppe bedeutet. Weiterhin wird das Verfahren hier mit einem unfraktionierten Heparin durchgeführt. Es könnte sich hierbei angesichts der obigen Auswertungsergebnisse durchaus um ein niedermolekulares Heparin handeln.
Die Ergebnisse sind in der graphischen Darstellung der 5 dargestellt. 5 beschreibt eine Reihe von Versuchen, bei denen ein unfraktioniertes Heparin mit steigenden Konzentrationen von 0,42 IE/ml, 0,83 IE/ml, 1,25 IE/ml und 1,67 IE/ml eingesetzt wird. Die Intensität der Reaktion des Anregungssignals wird auf die Ordinate aufgetragen, während der Zeitverlauf auf der Abszissenachse dargestellt ist.
Es wird beobachtet, dass die obere Kurve 28 einer Heparinkonzentration von 0,42 IE/ml entspricht, während die zweite untere Kurve einer Heparinkonzentration von 1,67 IE/ml entspricht, und dass die beiden Zwischenkurven 32, 34 Heparinkonzentrationen von 0,83 IE/ml bzw. 1,25 IE/ml entsprechen.
So wird deutlich gezeigt, dass das gewählte Substrat nicht die Antikoagulationswirkung des Heparins beeinflusst, da sich die nachgewiesene Thrombinmenge im Wesentlichen linear mit ansteigenden Heparinkonzentrationen verringert. So lässt sich mit dem gewählten Substrat die Aktivität von Thrombin in der Blutprobe eines Patienten, der mit Antikoagulationsmitteln behandelt wird, messen, ohne dass dieses Substrat die Wirkung dieses Antikoagulationsmittels auf die Aktivität der proteolytischen Enzyme stört.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zum Messen der Aktivität von proteolytischen Enzymen einer Blutprobe zur Durchführung des oben beschriebenen Messverfahrens.
Erfindungsgemäß umfasst das Kit ein Substrat gemäß einer der Varianten V(1) bis V(3). Natürlich könnte es ein Substrat nach einer anderen, durch die oben genannte allgemeine Formel definierte Variante umfassen. Das Substrat für proteolytische Enzyme wird dann in einem ersten Behältnis in einer Konzentration von 300.10^–6 mol.l^–1 mit Calciumcitrat in einer Konzentration von 16,7.10^–3 mol.l^–1 vermischt. Diese Mischung bildet ein erstes Reagens. Gewebefaktor in einer Konzentration von 10^–12 mol.l^–1 befindet sich in einem anderen Behältnis und stellt das zweite Reagens dar.
Diese zwei Reagentien können dann mit der Blutprobe zum Zeitpunkt der Messung der Enzymaktivität in einer Mikroküvette verwendet werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1833982 [0003]

Claims

Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme mit der allgemeinen Formel: Q¹-Xaa²-Xaa¹-Rhodamin₁₁₀-Q², worin: – Xaa¹ und Xaa² Aminosäuren bedeuten; und – Q² eine Gruppe, die eine Alkylgruppe umfasst, bedeutet; um es in einer Blutprobe, die ein Glykosaminoglykan enthält, dem Glykosaminoglykan zu ermöglichen, die Koagulation der Blutprobe zu hemmen, wodurch die Antikoagulationswirkung des Glykosaminoglykans nicht gestört wird.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Q¹ – H bedeutet; oder – die Gruppe R¹O-(C=O)-CH₂-CO, in der R¹ eine Alkyl- oder Arylgruppe umfasst, bedeutet; oder – die Gruppe R²-Xaa³, in der Xaa³ eine Aminosäure und R² eine Schutzgruppe oder H darstellen, bedeutet.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Xaa¹ eine basische Aminosäure bedeutet.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Xaa¹ Arginin bedeutet.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach den Ansprüchen 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass Q¹ die Gruppe R²-Xaa³ bedeutet und Xaa² und Xaa³ jeweils Glycin bedeuten, um dem Substrat eine schwache Affinität gegenüber proteolytischen Enzymen zu verleihen.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach den Ansprüchen 2, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, dass Q¹ die Gruppe R¹O-(C=0)-CH₂-CO bedeutet, wobei Xaa² Valin bedeutet und R¹ die Ethylgruppe bedeutet, um dem Substrat eine schwache Affinität gegenüber proteolytischen Enzymen zu verleihen.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Q² eine an das Rhodamin₁₁₀ gebundene Gruppe -(C=O)m-(O)n-, in der n = 0, 1 und m = 0, 1, umfasst.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass n = 0 und m = 1.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass Q² die Acetylgruppe bedeutet.
Verwendung eines Substrats für proteolytische Enzyme nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass Q² die 3-Methylbutanoylgruppe bedeutet.
Verfahren zum Messen der Aktivität von proteolytischen Enzymen in einer Blutprobe, wobei das Verfahren zu dem Typ zählt, bei dem man – eine Blutprobe, die proteolytische Enzyme enthält und ein Glykosaminoglykan enthalten kann, bereitstellt; – ein Substrat für proteolytische Enzyme, das dazu geeignet ist, wenn die proteolytischen Enzyme mit dem Substrat reagieren, ein Signal zu geben, bereitstellt; – die Blutprobe mit dem Substrat für proteolytische Enzyme in Kontakt bringt, um es den proteolytischen Enzymen zu ermöglichen, mit dem Substrat zu reagieren, wodurch ein Signal, das die Aktivität der proteolytischen Enzyme in der Probe darstellt, bereitgestellt wird; dadurch gekennzeichnet, dass man ein Substrat für proteolytische Enzyme nach einem der Ansprüche 1 bis 10 verwendet, so dass man es gleichzeitig dem Glykosaminoglykan gestatten kann, die Koagulation der Blutprobe zu hemmen und die Aktivität von proteolytischen Enzymen zu messen, wobei das gemessene Signal die Aktivität von nur denjenigen proteolytischen Enzymen, die dazu geeignet sind, Koagulation hervorzurufen, angibt.
Messverfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man weiterhin ein Aktivatorreagens, das die Induktion der Produktion von proteolytischen Enzymen gestattet, bereitstellt, und dass man das Aktivatorreagens mit der Blutprobe und dem Substrat für proteolytische Enzyme in Kontakt bringt.
Messverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Aktivatorreagens aus der Reihe Gewebefaktor, Phospholipide, Thromboplastin, Kaolin, Ellaginsäure, Collagen, Adenosindiphosphat, Arachidonsäure, Thrombinrezeptoraktivierungspeptid oder einer Kombination davon ausgewählt ist.
Messverfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass man weiterhin ein Initiierungsreagens zum Initiieren der Reaktionen von proteolytischen Enzymen bereitstellt und dass man das Initiierungsreagens mit der Blutprobe und dem Substrat für proteolytische Enzyme in Kontakt bringt.
Messverfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Initiierungsreagens um Calcium handelt.
Messverfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man die Blutprobe mit dem Substrat für proteolytische Enzyme in einer Substratkonzentration zwischen 50.10^–6 und 1000.10^–6 mol.1^–1 in Kontakt bringt.
Kit zum Messen der Aktivität von proteolytischen Enzymen einer Blutprobe zum Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 11 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit Folgendes umfasst: – ein Aktivatorreagens, das die Induktion der Produktion von proteolytischen Enzymen gestattet; – ein Substrat für proteolytische Enzyme, das geeignet ist, nach einem der Ansprüche 1 bis 10 verwendet zu werden; und – ein Initiierungsreagens zum Entkoppeln der enzymatischen Reaktionen.
Messkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat für proteolytische Enzyme mit dem Initiierungsreagens vermischt wird.
Messkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Aktivierungsreagens mit dem Initiierungsreagens vermischt wird.