FR2978163A1 - Utilisation d'un substrat dans une methode pour mesurer l'activite des enzymes proteolytiques disponibles - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne l'utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : Q - Xaa - Xaa - Rhodamine - Q , dans laquelle : Xaa et Xaa sont des acides aminés ; et, Q est un groupement comprenant un groupe alkyle ; pour pouvoir autoriser, dans un échantillon sanguin contenant un glycosaminoglycane, ledit glycosaminoglycane à inhiber la coagulation dudit échantillon sanguin, par quoi le pouvoir anticoagulant du glycosaminoglycane n'est pas perturbé.
Description
Utilisation d'un substrat dans une méthode pour mesurer l'activité des enzymes protéolytiques disponibles s La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques, notamment dans une méthode de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques dans un échantillon sanguin. L'invention concerne également un kit de mesure, permettant de mettre en oeuvre ladite méthode. io Plus particulièrement, la méthode vise à mesurer, dans un échantillon sanguin appartenant à un patient traité avec un anticoagulant de la famille des glycosaminoglycanes, l'activité des enzymes responsables de l'hémostase. Ce processus physiologique, qui vise à interrompre le saignement, fait intervenir une cascade d'enzymes et de facteur de coagulation. L'anticoagulant est ls généralement une molécule de la famille des glycosaminoglycanes et plus particulièrement une héparine. On distinguera les héparines de haut poids moléculaire dites : « héparines non fractionnées » ou en abréviation HNF, et les héparines dites : « héparines de bas poids moléculaire » ou en abréviation HBPM. Les différentes héparines sont administrées aux patients selon leur 20 pathologie. Usuellement, les méthodes de mesure visent à contrôler l'activité des enzymes, par exemple la thrombine ou la plasmine. Les substrats d'enzymes mis en oeuvre dans ces méthodes de mesure sont alors formés d'un peptide synthétique constitué de deux ou trois acides aminés présentant une affinité 25 pour l'enzyme et d'un groupe fluorophore lié audit peptide. L'enzyme est alors apte à venir cliver le substrat entre le fluorophore et le peptide, lequel fluorophore change d'état et est alors apte à fournir un signal fluorescent détectable. Aussi, le substrat est également dénommé réactif traceur. On pourra se référer au document EP 1 833 982 lequel décrit par exemple 30 un substrat d'enzyme spécifique de la thrombine présentant un tri-peptide couplé à la 7-amino-4-méthylcoumarine communément dénommé AMC en abrégé. Il décrit également un substrat d'enzyme spécifique de la plasmine présentant un bis-di-peptide couplé à la rhodamineiio.
Selon les méthodes usuelles de mesure de l'activité des enzymes protéolytiques, on fournit un échantillon sanguin, de sang ou de plasma, que l'on met en contact avec un activateur, par exemple du facteur tissulaire, lequel va permettre d'activer la production de l'enzyme. Ensuite, on fournit le substrat, s ou traceur, avec un déclencheur, par exemple du calcium sous forme ionique. On met alors en contact l'échantillon sanguin et l'activateur avec le substrat et le déclencheur dans un même milieu où vont se produire, d'une part les réactions de la coagulation et d'autre part, la réaction de l'enzyme avec le substrat. Le déclencheur va permettre de déclencher le processus de Io coagulation, tandis que l'activateur induit la production de l'enzyme. La mise en oeuvre d'un traceur incluant la rhodamine110 dans ces méthodes de mesure, s'est révélée intéressante, car ce fluorophore présente des longueurs d'onde d'excitation et d'émission, décalées par rapport au 7-amino-4-méthylcoumarine usuellement utilisé pour ce type de mesure, et qui ls n'interfèrent pas avec l'hémoglobine éventuellement présente dans l'échantillon sanguin. Toutefois, des différences de mesure d'activité ont été rencontrées entre les substrats incluant la rhodamine'o et les substrats usuels incluant la 7-amino-4-méthylcoumarine, en fonction de différents échantillons sanguins. 20 Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de fournir un substrat d'enzymes protéolytiques traceur incluant la rhodamine'o et permettant de réaliser des mesures d'activité cohérentes en fonction des différents échantillons sanguins, lorsque ceux-ci contiennent un anticoagulant de type glycosaminoglycane. 25 Dans ce but, la présente invention propose l'utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : Q'-Xaa2-Xaa'-Rhodamine'o-Q2, dans laquelle : Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, Q2 est un groupement comprenant un groupe alkyle ; de manière à pouvoir autoriser, dans un échantillon sanguin contenant un glycosaminoglycane, ledit 30 glycosaminoglycane à inhiber la coagulation dudit échantillon sanguin, et partant, à moduler et en particulier abaisser l'activité de certaines enzymes protéolytiques. Aussi, le pouvoir anticoagulant du glycosaminoglycane n'est pas perturbé.
Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans la mise au jour du pouvoir neutralisant de certains substrats incluant la rhodamineiio et sur l'identification de substrat d'une structure particulière permettant précisément s de ne pas neutraliser les glycosaminoglycanes contenus dans les différents échantillons sanguins. De la sorte, la mesure de l'activité des enzymes protéolytiques peut être effectuée sur des échantillons sanguins de patients traités aux anticoagulants en tenant compte des effets du traitement. Cela permet notamment de les moduler. io On a pu constater en effet que les substrats usuels incluant la 7-amino-4-méthylcoumarine, comme fluorophore, n'avaient aucun effet vis-à-vis des différents glycosaminoglycanes couramment utilisés comme anticoagulants. Par conséquent, il est désormais possible d'utiliser un substrat d'enzymes protéolytiques conforme à l'invention, pour mesurer optiquement l'activité ls enzymatique apparente de l'échantillon sanguin des patients traités aux anticoagulants, dans un domaine de longueur d'onde d'excitation et d'émission avantageux notamment par rapport à l'hémoglobine. Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention particulièrement avantageux, Q' est H ; ou le groupement R'O-(C=O)-CH2-CO dans lequel R' 20 comprend un groupe alkyle ou aryle ; ou le groupement R2-Xaa3 dans lequel Xaa3 est un acide aminé et R2 un groupement protecteur ou H. De la sorte, on obtient un substrat d'enzymes présentant une bonne solubilité et par conséquent un milieu réactif homogène. Les mesures de fluorescence sont ainsi reproductibles. 25 Avantageusement, Xaa' est un acide aminé basique, par exemple l'Arginine. De la sorte, le substrat offre une reconnaissance parfaite de l'enzyme. Selon un mode de réalisation de l'invention particulier, Q' est le groupement R2-Xaa3, Xaa2 et Xaa3 étant respectivement la Glycine, de 30 manière à conférer audit substrat une faible affinité vis-à-vis des enzymes protéolytiques. Le substrat d'une telle structure permet de mesurer plus aisément le suivi de l'apparition d'une activité enzymatique, plus communément appelée « génération ». Car en effet, dans le cas de ce type de mesures, il est important de prendre en compte l'ensemble de la cascade des réactions enzymatiques et de ne pas perturber leur cinétique. Le substrat présentant une moindre affinité vis-à-vis des enzymes, la variation de la concentration en enzymes mobilisées par l'hydrolyse du substrat sera alors négligeable et aura s un très faible impact sur la vitesse des autres réactions enzymatiques de la cascade. Bien que la réaction du substrat objet de l'invention et de l'enzyme considérée présente une constante de vitesse relativement ténue, le signal fluorescent sera néanmoins important et détectable car la rhodamine'o, présente une grande fluorescence. io Selon un autre mode de réalisation particulier, dans lequel Q' est le groupement R1O-(C=0)-CH2-CO, Xaa2 étant la valine et R' le groupe éthyle, il est conféré audit substrat une faible affinité vis-à-vis des enzymes protéolytiques. Partant, on mesure également l'apparition d'une activité enzymatique, sans perturber les cinétiques de la cascade des réactions 15 enzymatiques. Selon une autre variante de réalisation de l'invention Q2 comprend un groupement -(C=O)m-(0)n relié à la Rhodamine1,o, dans lequel n = 0, 1, et m = 0, 1. De la sorte, le substrat est plus aisé à produire. En effet, grâce au groupement -(C=O)m (0)n-, l'accrochage du groupement comprenant le 20 groupe alkyle à la rhodamine'o est facilité. Avantageusement, n = 0 et m = 1, et le groupement est simplement une fonction carbonyle. Par exemple, Q2 est le groupe acétyle ou encore le groupe 3-méthylbutanoyle. Selon un autre objet, la présente invention propose une méthode de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin, ladite 25 méthode étant du type selon laquelle : on fournit un échantillon sanguin contenant des enzymes protéolytiques et susceptible de contenir un glycosaminoglycane ; on fournit un substrat d'enzymes protéolytiques apte à fournir un signal lorsque lesdites enzymes protéolytiques réagissent avec ledit substrat ; on met en contact ledit échantillon sanguin avec ledit substrat 30 d'enzymes protéolytiques, de manière à permettre auxdites enzymes protéolytiques de réagir avec ledit substrat de façon à fournir un signal représentatif de l'activité des enzymes protéolytiques dans ledit échantillon. Selon l'invention, on utilise un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodamine110 - Q2, dans laquelle : Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, Q2 est un groupement comprenant un groupe alkyle, de manière à pouvoir à la fois autoriser le glycosaminoglycane à inhiber la coagulation dudit échantillon sanguin et à mesurer l'activité des enzymes s protéolytiques, par quoi le signal mesuré est représentatif de l'activité des seules enzymes protéolytiques aptes à provoquer la coagulation. Le substrat d'enzymes protéolytique utilisé, inclut bien évidemment toutes les variantes, modes de réalisation et modes de mise en oeuvre précités. Préférentiellement, un fournit en outre un réactif activateur permettant io d'induire la génération d'enzymes protéolytiques, et on met en contact ledit réactif activateur avec ledit échantillon sanguin et ledit substrat d'enzymes protéolytiques. Dès que le réactif activateur vient en contact avec l'échantillon sanguin, il provoque la génération des enzymes protéolytiques. Par exemple, ledit réactif activateur est choisi parmi, du facteur tissulaire, des ls phospholipides, de la thromboplastine, du kaolin, de l'acide ellagique, du collagène, de l'adénosine-di-phosphate, de l'acide arachidonique, d'un peptide d'activation des récepteurs de thrombine, ou une combinaison de ceux-ci. Avantageusement, on choisira un activateur qui est apte à agir très en amont dans la cascade des réactions enzymatiques de la coagulation et de la 20 fibrinolyse, notamment lorsque la mesure vise à suivre l'apparition d'une activité enzymatique. En outre, on fournit un réactif déclencheur pour déclencher les réactions d'enzymes protéolytiques, et on met en contact ledit réactif déclencheur avec ledit échantillon sanguin et ledit substrat d'enzymes protéolytiques. De la sorte, 25 le déclencheur va permettre de déclencher le processus de coagulation, tandis que l'activateur provoque la génération des enzymes. Avantageusement, ledit réactif déclencheur est le calcium, et il est fourni par exemple sous forme de citrate de calcium. Selon un mode de mise en oeuvre de la méthode de mesure conforme à 30 l'invention, on met en contact ledit échantillon sanguin avec ledit substrat d'enzymes protéolytiques à une concentration en substrat comprise entre 50.10-6 et 1000.10-6 mail-1, par exemple entre 300.10-6 et 500.10-6 mail-1. De la sorte, on obtient un signal optique suffisamment important permettant de mesurer l'activité enzymatique. Selon encore un autre objet, la présente invention propose un kit de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin pour la s mise en oeuvre de la méthode de mesure décrite ci-dessus. Selon l'invention, le kit comprend : un réactif activateur permettant d'induire la génération d'enzymes protéolytiques ; un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale Q1-Xaa2-Xaal-Rhodaminello-Q2, dans laquelle : Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, Q2 est un groupement comprenant un groupe alkyle; et io un réactif déclencheur pour déclencher les réactions enzymatiques. Le substrat d'enzymes protéolytique utilisé, inclut toutes les variantes, modes de réalisation et modes de mise en oeuvre précités. Selon une première variante de réalisation du kit, ledit substrat d'enzymes protéolytiques est mélangé avec ledit réactif déclencheur, à l'intérieur d'un ls même réceptacle, tandis que le réactif activateur est contenu dans un autre réceptacle. Le substrat d'enzymes est alors par exemple à une concentration comprise entre 100.10-6 mail-1 et 500.10-6 mail-1, tandis que le réactif déclencheur est à une concentration comprise entre 10.10-3 mail-1 et 20.10-3 mail-1. Le réactif activateur est lui à une concentration comprise par exemple, 20 entre 0,5.10-12 et 2.10-12 mail-1. Selon une seconde variante, ledit réactif activateur est mélangé avec ledit réactif déclencheur dans un même réceptacle, tandis que le substrat d'enzymes est contenu seul dans un autre réceptacle. Cette seconde variante de mise en oeuvre, permet notamment de ne pas perturber la stabilité du 25 substrat. Lorsque le kit objet de l'invention est mis en oeuvre, on fournit par exemple d'une part, 40 µL d'un échantillon sanguin par exemple, et d'autre part 10 µL du substrat d'enzymes, seul ou mélangé avec le réactif déclencheur, et 10 µL du réactif activateur, respectivement mélangé avec le réactif déclencheur 30 ou seul. Ces volumes d'échantillon et de réactifs sont bien évidemment indicatifs, et sont ajustés en fonction des appareils de mesure et aussi, des types de mesures. Ils peuvent tout aussi bien en être des multiples, ou encore d'autres volumes, par exemple 30 µL / 15 µL / 15µL.
D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après d'un mode de réalisation particulier de l'invention, donné à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : s - la Figure 1 est un graphique montrant des activités enzymatiques en fonction d'une concentration en héparine selon un premier exemple de mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation ; - la Figure 2 est un graphique montrant des activités enzymatiques en fonction d'une concentration en héparine selon un deuxième exemple de mise io en oeuvre d'une méthode d'évaluation; - la Figure 3 est un graphique montrant des activités enzymatiques en fonction d'une concentration en héparine selon un troisième exemple de mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation; - la Figure 4 est un graphique montrant des activités enzymatiques en ls fonction d'une concentration en héparine selon un quatrième exemple de mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation ; et, - la Figure 5 est un graphique montrant l'intensité d'un signal fluorescent en fonction du temps selon la méthode de mesure conforme à l'invention, avec une héparine non fractionnée à différentes concentrations. 20 L'objet de l'invention est notamment d'utiliser des substrats d'enzymes protéolytiques permettant de mesurer l'activité des enzymes dans l'échantillon sanguin d'un patient, sans venir perturber le milieu au cours de la mesure et notamment sans interférer avec l'héparine lorsque le patient est sous anticoagulants. 25 Des substrats dont le fluorophore est la 7-amino-4-méthylcoumarine, communément dénommé AMC, sont reconnus comme n'ayant aucun effet neutralisant vis-à-vis des glycosaminoglycanes et notamment de l'héparine. Dans une première partie de la description détaillée on expliquera d'une part comment on évalue la neutralisation de ces glycosaminoglycanes 30 contenus dans un échantillon sanguin, et d'autre part on donnera des exemples de substrat d'enzymes protéolytiques dont le fluorophore est la rhodamine de formule générale : Q'-Xaa2-Xaa'-Rhodamine'o-Q2, et qui n'interfèrent pas avec les glycosaminoglycanes. Ce fluorophore est retenu car il présente des longueurs d'onde d'excitation et d'émission, décalées par rapport à la 7-amino-4-méthylcoumarine qui n'interfèrent pas avec l'hémoglobine de l'échantillon sanguin. On observera qu'un des mérites de l'invention, a été de mettre en lumière s l'effet de certains substrats d'enzymes protéolytiques lorsque leur fluorophore est la rhodamine'o, sur le pouvoir anticoagulant des glycosaminoglycanes. En outre, on vérifiera ce principe d'innocuité des substrats objet de l'invention vis-à-vis des héparines pour deux types, des héparines non fractionnées, ou HNF, et des héparines de bas poids moléculaire, ou HBPM. io Ensuite, dans une seconde partie de la description, on appliquera un substrat d'enzymes identifié dans la première partie, dans une méthode de mesure conforme à l'invention, dans laquelle les héparines sont insensibles à sa présence dans le milieu, et où ils permettent de mesurer l'activité des enzymes. ls Avant de se référer aux diagrammes des Figures, on va décrire la méthode d'évaluation utilisée pour quantifier l'effet neutralisant des substrats d'enzymes protéolytiques vis-à-vis des glycosaminoglycanes dans un échantillon sanguin, et en particulier un plasma. Cette méthode d'évaluation permet, tout aussi bien, la mise en oeuvre d'héparines non fractionnées que 20 d'héparines de bas poids moléculaire. En outre, la méthode s'attache à contrôler l'activité du facteur Xa, situé au carrefour de deux cascades enzymatiques conduisant à la formation de thrombine. Par ailleurs, l'antithrombine, inhibiteur naturel de la génération de thrombine, vient contrôler la réaction. Dès son apparition, le facteur Xa se couple à son substrat naturel, 25 la prothrombine, pour former la thrombine. L'héparine contenue dans l'échantillon forme, elle, un complexe avec l'antithrombine, lequel complexe promeut l'inhibition du facteur Xa. Aussi, on met en oeuvre un substrat chromogène à base de paranitroaniline, que le facteur Xa vient hydrolyser. Et la libération de la 30 paranitroaniline, optiquement mesurable, est alors inversement proportionnelle à la concentration d'héparine présente dans le milieu. On en déduit ainsi une mesure de l'activité anti-Xa.
On se référera au diagramme de la Figure 1, pour analyser les résultats d'un premier exemple de référence mettant en oeuvre la méthode d'évaluation précitée. Dans ce premier exemple, l'héparine utilisée est une héparine calcique s non fractionnée et commercialisée sous le nom de marque : « Calciparine® ». Selon la méthode d'évaluation, on enregistre l'activité anti-Xa que l'on reporte en ordonnée, en fonction de la concentration en héparine du milieu. Les concentrations en héparine varient entre 0 et 1,67 UI/ml et sont relativement proches des concentrations thérapeutiques. La première courbe inclinée 10, io correspond à une première série de mesures où on ajoute à l'échantillon sanguin, en surplus du substrat à base de paranitroaniline, du sérum physiologique. La seconde courbe inclinée 12 correspond à une deuxième série de mesures où on ajoute à l'échantillon sanguin un substrat usuel dont le fluorophore est la 7-amino-4-méthylcoumarine, et dont la formule synthétique ls est Z-GGR-AMC, dans laquelle R correspond à l'Arginine, G à la Glycine et où Z est un groupement protecteur. Ce substrat traceur est communément utilisé dans des méthodes de mesure d'activité enzymatique. Ainsi, les courbes 10, 12 illustrent les variations de l'activité anti-Xa en fonction de la concentration en héparine du milieu. 20 Le sérum physiologique n'ayant par nature aucun effet sur le pouvoir anticoagulant de l'héparine et les deux courbes étant sensiblement confondues, on en déduit tout naturellement et qualitativement que le substrat Z-GGR-AMC n'a aucun effet notable vis-à-vis de l'héparine. Plus précisément, on détermine le pourcentage de neutralisation du 25 substrat, comme étant le rapport de la différence de la variation d'activité anti-Xa dans le milieu contenant le sérum physiologique et dans le milieu contenant le substrat, entre deux concentrations en héparine, et la seule variation d'activité dans le milieu contenant le sérum physiologique, entre les deux mêmes concentrations en héparine, ce rapport étant multiplié par 100 afin 30 d'obtenir le résultat en pourcentage de neutralisation. Le pourcentage de neutralisation peut s'écrire également de manière plus compacte : 100 x (1- AA1/AA2), où AA1 correspond à la variation d'activité en présence de substrat et AA2 à la variation en présence de sérum physiologique.
Ainsi, la mesure parallèle de la variation en présence de sérum physiologique, permet d'établir dans chaque série de mesures la référence. Dans ce premier exemple de mise en oeuvre, le pourcentage de neutralisation du substrat de formule synthétique Z-GGR-AMC varie entre 5 °/O s et 20 °/O. L'impact du substrat sur l'effet anti coagulant de l'héparine est alors suffisamment faible pour que la mesure d'activité soit révélatrice comme on l'expliquera ci-après plus en détail. On se référera à présent au diagramme de la Figure 2, présentant les résultats d'un deuxième exemple de mise en oeuvre de la méthode d'évaluation io précitée, dans lequel les deux courbes 14, 16, sont comparables à celles du premier exemple. La première courbe 14 correspond à une première série de mesures réalisées dans des conditions analogues à celles du premier exemple, dans lequel du sérum physiologique est ajouté à l'échantillon sanguin. Quant à la seconde courbe 16, elle correspond à une deuxième série de mesures où on ls ajoute à l'échantillon sanguin, un substrat d'enzyme protéolytique conforme à l'invention de formule : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodamine'o - Q2, dans laquelle, selon une première variante V(1), Q' est le groupement R'O-(C=O)-CH2-CO, Xaa' étant l'Arginine, Xaa2 la Valine et R' le groupe éthyle, tandis que Q2 est le groupe acétyle. Le substrat objet de cette première variante s'écrit de manière 20 synthétique : EtM-VR-Rhod'o-Ac. Ce substrat d'enzymes protéolytiques ne joue bien évidemment ici aucun rôle dans la méthode dévaluation en tant que traceur. Ce deuxième exemple n'a d'autre but que de montrer que ce substrat à très peu d'impact sur l'effet anticoagulant de l'héparine. 25 L'héparine mise en oeuvre est également la Calciparine®, et on observe que le pourcentage de neutralisation obtenu selon la formule donnée ci-dessus : 100 x (1- AA1/AA2), varie entre 150/0 et 300/0 en fonction des concentrations en héparine. Ainsi qu'on l'expliquera dans la suite de la description, ce substrat d'enzymes est un bon candidat pour la méthode de 30 mesure selon l'invention, car il permet de mesurer l'activité enzymatique, sans affecter le pouvoir anticoagulant de l'héparine. On se référera au diagramme de la Figure 3, illustrant les résultats d'un troisième exemple de mise en oeuvre de la méthode d'évaluation. Une première courbe 18 correspondant à une première série de mesures est réalisée dans des conditions analogues aux exemples précédents, dans lequel du sérum physiologique est ajouté à l'échantillon sanguin. On réalise ensuite une seconde série de mesures où on ajoute à s l'échantillon sanguin, un substrat d'enzyme protéolytique, non pas conforme à l'invention, mais de formule synthétique R2-GGR-Rhodllo-R, dans laquelle, R est l'Arginine et G la Glycine, tandis que R2 est un groupement protecteur. Ainsi qu'on peut l'observer, la courbe 20 est sensiblement horizontale et le pourcentage de neutralisation des héparines de ce substrat, obtenu selon la io formule 100 x (1- AA1/AA2), est voisin de 100 °/O. Dans ces conditions, le substrat en question n'est pas un bon candidat pour la méthode de mesure que l'on décrira ci-après. Ce troisième exemple est bien évidemment un contre-exemple. On se référera à présent au diagramme de la Figure 4, présentant les ls résultats d'un quatrième exemple de mise en oeuvre de la méthode d'évaluation précitée, dans lequel les deux courbes 24, 26, sont comparables à celles des premier et deuxième exemples. La première courbe 24 correspond à une première série de mesures réalisées dans des conditions analogues à celles du premier exemple, dans lequel du sérum physiologique est ajouté à l'échantillon 20 sanguin. Quant à la seconde courbe 26, elle correspond à une deuxième série de mesures où on ajoute à l'échantillon sanguin, un substrat d'enzyme protéolytique conforme à l'invention, selon une deuxième variante V(2) de formule synthétique R2-GGR-Rhod1103-méthylbutanoyle, dans laquelle, R est l'Arginine et G la Glycine, tandis que R2 est un groupement protecteur. On 25 observera que ce substrat ne diffère que de celui du troisième exemple par le substituant -3-méthylbutanoyle. Ce substrat d'enzymes protéolytiques ne joue aucun rôle non plus dans la méthode dévaluation en tant que traceur. Ce quatrième exemple montre également que ce substrat à très peu d'impact sur l'effet anticoagulant de 30 l'héparine. L'héparine mise en oeuvre est également la Calciparine®, et on observe que le pourcentage de neutralisation obtenu selon la formule donnée ci-dessus : 100 x (1- AA1/AA2), varie entre 200/0 et 250/0 en fonction des 20 concentrations en héparine. Ainsi qu'on l'expliquera dans la suite de la description, ce substrat d'enzymes est également un bon candidat pour la méthode de mesure selon l'invention, car il permet de mesurer l'activité enzymatique, sans affecter le pouvoir anticoagulant de l'héparine.
Selon une troisième variante de réalisation, non illustrée, toujours selon le même protocole que celui des exemples ci-dessus, le substrat est de formule synthétique R2-GGR-Rhod110-Ac dans laquelle, R est l'Arginine et G la Glycine, tandis que R2 est un groupement protecteur. Il ne diffère du précédent que par le substituant acétyle. Le pourcentage de neutralisation varie alors entre 12 °/O io et 18 °/O. Ce substrat et ainsi un excellent candidat pour la méthode de mesure selon l'invention. Toujours dans cette première partie de description, la méthode d'évaluation précitée a été mise en oeuvre avec une héparine de bas poids moléculaire, la Fragmine®. 15 On a reporté les résultats du pourcentage de neutralisation de cette héparine pour les trois variantes de substrat décrites ci-dessus, V(1), V(2) et V(3) dans le tableau ci-dessous. Tableau I [ UI/ml] V(1) V(2) V(3) 0, 42 10 °/O 5 °/O 1 % 0, 83 12 °/O 11 °/O 5 °/O 1, 25 13 % 8 °/O 7 °/O 1, 67 15 % 4 °/O 7 °/O 25 Ce tableau 1 montre, que le substrat d'enzymes conforme à l'invention, selon les trois variantes de réalisation précédemment décrites, présente un très faible pouvoir neutralisant avec une héparine de bas poids moléculaire. Aussi, la présente invention concerne également une méthode de mesure 30 de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin, faisant appel à un substrat d'enzymes de formule générale : Q'-Xaa2-Xaa'-Rhodamine110-Q2, dans laquelle : Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, Q2 est un groupement comprenant un groupe alkyle. Grâce à ce substrat d'enzymes on mesure l'activité d'une enzyme sans inhiber le pouvoir anticoagulant des héparines dans un échantillon sanguin. Et c'est d'ailleurs l'intérêt de l'utilisation des substrats objet de l'invention. Selon un mode de mise en oeuvre de la méthode de mesure, l'activité s enzymatique suivie est celle de la génération de thrombine. Le principe réside dans le suivi de la mesure d'un signal fluorescent après que le substrat d'enzymes a été mis en contact avec un échantillon sanguin contenant de l'héparine, et que les conditions de réaction permettent à la thrombine de venir cliver le substrat entre la partie peptidique et le fluorophore, en l'espèce la io rhodaminello. Afin de mettre en oeuvre la méthode, on introduit tout d'abord un échantillon sanguin de 40 µL contenant de l'héparine, à l'intérieur d'une micro-cuvette. On y ajoute d'une part 10 µL du substrat d'enzymes conforme à l'invention mélangé avec un réactif déclencheur, et 10 µL de réactif activateur. ls Le réactif déclencheur est le citrate de calcium et il présente une concentration de 16,7.10-3 mail-1. Le réactif activateur est du facteur tissulaire à une concentration de 10-12 mol.L-1. Ensuite, on émet un signal d'excitation d'une longueur d'onde déterminée à travers la micro-cuvette et on enregistre optiquement dans le temps, la 20 réponse au signal d'excitation. La réponse du signal est ainsi d'autant plus importante que la quantité de thrombine générée est forte. Selon un mode particulier de réalisation, on choisit comme substrat d'enzymes celui correspondant à la variante de réalisation V(3) de la première partie de la description détaillée, et de formule synthétique substrat est de 25 formule synthétique R2-GGR-Rhodllo-Ac dans laquelle, R est l'Arginine et G la Glycine, tandis que R2 est un groupement protecteur Ac le groupe acétyle. En outre, la méthode est ici mise en oeuvre avec une héparine non fractionnée. Elle pourrait très bien l'être avec une héparine de bas poids moléculaire, compte tenu des résultats d'évaluation ci-dessus. 30 Les résultats sont reportés dans le graphique de la Figure 5. Il illustre une série d'expériences mettant en oeuvre une héparine non fractionnée à des concentrations croissantes de 0,42 UI/mI, 0,83 UI/mI, 1,25 UI/mI et 1,67 UI/mI.
L'intensité de la réponse du signal d'excitation est reportée en ordonnée, tandis que l'échelle de temps Figure sur l'axe des abscisses. Ainsi, on observe que la courbe supérieure 28 correspond à la concentration en héparine de 0,42 UI/ml, que la courbe inférieure correspond à s la concentration en héparine de 1,67 UI/ml, et que les deux courbes intermédiaires, 32, 34 correspondent respectivement aux concentrations en héparine de 0,83 UI/ml, 1,25 UI/ml. De la sorte il est clairement démontré que le substrat choisi n'interfère par avec l'effet anticoagulant de l'héparine, puisque la quantité de thrombine io détectée diminue sensiblement linéairement avec l'augmentation des concentrations en héparine. Ainsi, grâce au substrat retenu il est possible de mesurer l'activité de la thrombine dans l'échantillon sanguin d'un patient traité aux anticoagulants, sans que ce substrat n'interfère avec l'effet de cet anticoagulant sur l'activité des enzymes protéolytiques. ls La présente invention concerne également un kit de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin pour la mise en oeuvre de la méthode de mesure décrite ci-dessus. Selon l'invention, le kit comprend un substrat selon l'une des variantes vo) à V(3). Bien évidemment, il pourrait comprendre un substrat selon une 20 autre variante définie par la formule générale précitée. Le substrat d'enzymes protéolytiques, à une concentration de 300.10-6 mail-1 est alors mélangé avec du citrate de calcium à une concentration de 16,7.10-3 mail-1, à l'intérieur d'un premier réceptacle. Ce mélange forme un premier réactif. Du facteur tissulaire a une concentration de 10-12 mail-1 est contenu dans un autre réceptacle et 25 constitue le second réactif. Ces deux réactifs sont alors aptes à être mis en oeuvre à l'intérieur d'une micro-cuvette, avec l'échantillon sanguin, au moment de la mesure de l'activité enzymatique. 30
Claims (19)
- REVENDICATIONS1. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodamine'o - Q2, dans laquelle : s - Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, - Q2 est un groupement comprenant un groupe alkyle ; pour pouvoir autoriser, dans un échantillon sanguin contenant un glycosaminoglycane, ledit glycosaminoglycane à inhiber la coagulation dudit échantillon sanguin, par quoi le pouvoir anticoagulant du glycosaminoglycane Io n'est pas perturbé.
- 2. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 1, caractérisée en ce que Q' est : - H;ou, - le groupement R'O-(C=O)-CH2-CO dans lequel R' comprend un 15 groupe alkyle ou aryle ; ou, - le groupement R2-Xaa3 dans lequel Xaa3 est un acide aminé et R2 un groupement protecteur ou H.
- 3. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que Xaa' est un acide aminé basique. 20
- 4. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 3, caractérisée en ce que Xaa' est l'Arginine.
- 5. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon les revendications 2, 3 et 4, caractérisée en ce que Q' est le groupement R2-Xaa3, Xaa2 et Xaa3 étant respectivement la Glycine, de manière à conférer audit 25 substrat une faible affinité vis-à-vis des enzymes protéolytiques.
- 6. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon les revendications 2, 3 et 4, caractérisée en ce que Q' est le groupement R'O-(C=0)-CH2-CO, Xaa2 étant la valine et R' le groupe éthyle, de manière à conférer audit substrat une faible affinité vis-à-vis des enzymes protéolytiques. 30
- 7. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que Q2 comprend un groupement -(C=O)m-(0)n relié à la Rhodamine'o, dans lequel n = 0, 1, et m=0, 1.
- 8. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 7, caractérisée en ce que n = 0 et m = 1.
- 9. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que Q2 est le groupe acétyle. s
- 10. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que Q2 est le groupe 3-méthylbutanoyle.
- 11. Méthode de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin, ladite méthode étant du type selon laquelle : io - on fournit un échantillon sanguin contenant des enzymes protéolytiques et susceptible de contenir un glycosaminoglycane ; - on fournit un substrat d'enzymes protéolytiques apte à fournir un signal lorsque lesdites enzymes protéolytiques réagissent avec ledit substrat ; - on met en contact ledit échantillon sanguin avec ledit substrat d'enzymes ls protéolytiques, de manière à permettre auxdites enzymes protéolytiques de réagir avec ledit substrat de façon à fournir un signal représentatif de l'activité des enzymes protéolytiques dans ledit échantillon ; caractérisée en ce qu'on utilise un substrat d'enzymes protéolytiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, de manière à pouvoir à la 20 fois autoriser le glycosaminoglycane à inhiber la coagulation dudit échantillon sanguin et à mesurer l'activité des enzymes protéolytiques, par quoi le signal mesuré est représentatif de l'activité des seules enzymes protéolytiques aptes à provoquer la coagulation.
- 12. Méthode de mesure selon la revendication 11, caractérisée en ce 25 qu'on fournit en outre un réactif activateur permettant d'induire la génération d'enzymes protéolytiques, et en ce qu'on met en contact ledit réactif activateur avec ledit échantillon sanguin et ledit substrat d'enzymes protéolytiques.
- 13. Méthode de mesure selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit réactif activateur est choisi parmi, du facteur tissulaire, des 30 phospholipides, de la thromboplastine, du kaolin, de l'acide ellagique, du collagène, de l'adénosine-di-phosphate, de l'acide arachidonique, d'un peptide d'activation des récepteurs de thrombine, ou une combinaison de ceux-ci.
- 14. Méthode de mesure selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en ce qu'on fournit en outre un réactif déclencheur pour déclencher les réactions d'enzymes protéolytiques, et en ce qu'on met en contact ledit réactif déclencheur avec ledit échantillon sanguin et ledit substrat s d'enzymes protéolytiques.
- 15. Méthode de mesure selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit réactif déclencheur est le calcium.
- 16. Méthode de mesure selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisée en ce qu'on met en contact ledit échantillon sanguin avec ledit Io substrat d'enzymes protéolytiques à une concentration en substrat comprise entre 50.10-6 et 1000.10-6 mol.L-1.
- 17. Kit de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend : ls - un réactif activateur permettant d'induire la génération d'enzymes protéolytiques ; - un substrat d'enzymes protéolytiques apte à être utilisé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 ; et - un réactif déclencheur pour déclencher les réactions enzymatiques. 20
- 18. Kit de mesure selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit substrat d'enzymes protéolytiques est mélangé avec ledit réactif déclencheur.
- 19. Kit de mesure selon la revendication 17, caractérisé en ce que ledit réactif activateur est mélangé avec ledit réactif déclencheur.
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