FR2978164A1 - Utilisation d'un substrat dans une methode pour mesurer l'activite des enzymes proteolytiques - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne l'utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : Q - Xaa - Xaa - Rhodamine - Q , dans laquelle Xaa et Xaa sont des acides aminés ; et, Q est Xaa - Xaa - Q , ou un acide aminé Xaa , ou un groupement comprenant un groupe aryle, ou H, de manière à pouvoir inhiber, dans un échantillon sanguin contenant un glycosaminoglycane, le pouvoir anticoagulant dudit glycosaminoglycane. L'invention concerne également une méthode de mesure d'une activité enzymatique utilisant un tel substrat et un kit de mise en œuvre.
Description
Utilisation d'un substrat dans une méthode pour mesurer l'activité des enzymes protéolytiques
La présente invention se rapporte à l'utilisation d'un substrat d'enzymes s protéolytiques, notamment dans une méthode de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques dans un échantillon sanguin. L'invention concerne également un kit de mesure, permettant de mettre en oeuvre ladite méthode. Plus particulièrement, la méthode vise à mesurer, dans un échantillon sanguin appartenant à un patient traité avec un anticoagulant, l'activité des enzymes io responsables de l'hémostase. Ce processus physiologique, qui vise à interrompre le saignement, fait intervenir une cascade d'enzymes et de facteurs de coagulation. L'anticoagulant considéré est une molécule de la famille des glycosaminoglycanes et plus particulièrement une héparine. On distinguera les héparines de haut poids moléculaire dites : « héparines non fractionnées » ou ls en abréviation HNF, et les héparines dites : « héparines de bas poids moléculaire » ou en abréviation HBPM. Les différentes héparines sont administrées aux patients selon leur pathologie. Usuellement, les méthodes de mesure visent à contrôler l'activité des enzymes, par exemple la thrombine ou la plasmine. Les substrats d'enzymes 20 mis en oeuvre dans ces méthodes de mesure sont alors formés d'un peptide synthétique constitué de deux ou trois acides aminés présentant une affinité pour l'enzyme et d'un groupe fluorophore lié audit peptide. L'enzyme est alors apte à venir cliver le substrat entre le fluorophore et le peptide, lequel fluorophore change d'état et est alors apte à fournir un signal fluorescent 25 détectable. Aussi, le substrat est également dénommé réactif traceur. On pourra se référer au document EP 1 833 982 lequel décrit par exemple un substrat d'enzyme spécifique de la thrombine présentant un tri-peptide couplé au 7-amino-4-méthylcoumarine communément dénommé AMC en abrégé. Il décrit également un substrat d'enzyme spécifique de la plasmine 30 présentant un bis-di-peptide couplé à la rhodamine'o. Selon les méthodes usuelles de mesure de l'activité des enzymes protéolytiques, on fournit un échantillon sanguin, de sang ou de plasma, que l'on met en contact avec un activateur, par exemple du facteur tissulaire, lequel va permettre d'activer la production de l'enzyme. Ensuite, on fournit le substrat, ou traceur, avec un déclencheur, par exemple du calcium sous forme ionique. On met alors en contact l'échantillon sanguin et l'activateur avec le substrat et le déclencheur dans un même milieu où vont se produire, d'une part les s réactions de la coagulation et d'autre part, la réaction de l'enzyme avec le substrat. Le déclencheur va permettre de déclencher le processus de coagulation, tandis que l'activateur induit la production de l'enzyme. En outre, il est nécessaire de neutraliser les glycosaminoglycanes contenus dans l'échantillon sanguin durant la mesure de l'activité, afin de Io s'affranchir de leur effet sur le processus de coagulation. Pour ce faire, on fournit un polymère synthétique formé de motifs ammonium quaternaire reliés par des chaînons hydrocarbonés de différentes longueurs, par exemple le polybrène ou hexadiméthrine, lequel permet de venir neutraliser les effets des glycosaminoglycanes dans l'échantillon sanguin. ls Ces polymères synthétiques sont introduits soit avec le substrat, soit avec l'activateur dans le milieu. Bien qu'efficaces, ils sont malaisés à solubiliser et requièrent de nombreuses étapes avant d'être dispersés de manière homogène avec le substrat ou l'activateur. La complexité de composition des kits de mesure s'en trouve accrue, et partant, les coûts de développement et de 20 fabrication. En outre, les polymères synthétiques accentuent la turbidité du milieu, de sorte que la mesure optique du signal fluorescent émis par le fluorophore est perturbée. En conséquence, la mesure de l'activité de l'enzyme comporte une imprécision. 25 Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est non seulement d'utiliser un substrat d'enzymes protéolytiques qui puisse être mis en oeuvre de manière plus aisée et moins coûteuse, mais aussi qui permette de lever cette imprécision sur la mesure de l'activité. Dans le but de résoudre ce problème, et selon un premier objet, la 30 présente invention propose l'utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodaminello - Q2, dans laquelle : Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q', ou un acide aminé Xaa3, ou un groupement comprenant un groupe aryle, ou encore H ; pour pouvoir inhiber, dans un échantillon sanguin contenant un glycosaminoglycane, le pouvoir anticoagulant dudit glycosaminoglycane. Ainsi, grâce à ce substrat d'enzymes protéolytiques, qui permet de mesurer l'activité de l'enzyme par l'intermédiaire de son fluorophore, la s rhodaminello, on neutralise également et de façon simultanée les glycosaminoglycanes contenu dans l'échantillon sanguin. De la sorte, ce substrat d'enzymes protéolytiques est apte à jouer à la fois le rôle de réactif traceur et celui de neutralisant des glycosaminoglycanes. Aussi, on s'affranchit de la mise en oeuvre malaisée des polymères synthétiques visant à neutraliser io les glycosaminoglycanes, et partant, on réduit les coûts de réalisation des kits ou des nécessaires de mesure ainsi qu'on l'expliquera plus en détail ci-après. Au surplus, le substrat d'enzymes protéolytiques objet de l'invention, n'a aucun impact sur la turbidité du milieu. En conséquence, la mesure optique de la fluorescence n'est aucunement perturbée lorsque l'enzyme vient cliver le ls substrat entre la rhodamine et le peptide. On observera que les enzymes protéolytiques visées sont celles de la famille des Sérines-protéases, par exemple la thrombine, la plasmine, le facteur Xa ou encore la protéine C activée. Ces exemples d'enzymes protéolytiques ne sont bien évidemment pas limitatifs. 20 Selon un mode de mise en oeuvre de l'invention particulièrement avantageux, QI est H ; ou le groupement R'O-(C=O)-CH2-CO dans lequel R' comprend un groupe alkyle ou aryle ; ou le groupement R2-Xaa4 dans lequel Xaa4 est un acide aminé et R2 un groupement protecteur ou H. De la sorte, on obtient un substrat d'enzymes présentant une bonne solubilité et par 25 conséquent un milieu réactif homogène. Les mesures de fluorescence sont ainsi reproductibles. Avantageusement, Xaal est un acide aminé basique, par exemple l'Arginine. De la sorte, le substrat offre une reconnaissance parfaite de l'enzyme. 30 Selon un mode de réalisation de l'invention particulier, Q2 est Xaal - Xaa2 - QI, tandis que QI est le groupement R2-Xaa4, Xaa2 et Xaa4 étant respectivement la Glycine, de manière à conférer audit substrat une faible affinité vis-à-vis des enzymes protéolytiques. Le substrat d'une telle structure permet de mesurer plus aisément le suivi de l'apparition d'une activité enzymatique, plus communément appelée « génération ». Car en effet, dans le cas de ce type de mesures, il est important de prendre en compte l'ensemble de la cascade des réactions enzymatiques et de ne pas perturber leur s cinétique. Le substrat présentant une moindre affinité vis-à-vis des enzymes, la variation de la concentration en enzymes mobilisées par l'hydrolyse du substrat sera alors négligeable et aura un très faible impact sur la vitesse des autres réactions enzymatiques de la cascade. Bien que la réaction du substrat objet de l'invention et de l'enzyme considérée présente une constante de vitesse io relativement ténue, le signal fluorescent sera néanmoins important et détectable car la rhodaminello, présente une grande fluorescence. En outre, ce fluorophore présente des longueurs d'onde d'excitation et d'émission décalées par rapport au 7-amino-4-méthylcoumarine usuellement utilisé pour ce type de mesure, et qui n'interfèrent pas avec l'hémoglobine éventuellement présente 15 dans l'échantillon sanguin. Selon un autre mode de réalisation particulier, dans lequel Q2 est Xaal - Xaa2 - QI, tandis que QI est le groupement R'O-(C=O)-CH2-CO, Xaa2 étant la valine et R' le groupe éthyle, il est conféré audit substrat une faible affinité vis-à-vis des enzymes protéolytiques, et partant, on mesure également l'apparition 20 d'une activité enzymatique, sans perturber les cinétiques de la cascade des réactions enzymatiques. Selon une variante de réalisation de l'invention particulièrement avantageuse, l'acide aminé Xaa3 est l'Arginine. De la sorte, et ainsi qu'on l'expliquera plus en détail dans la suite de la description, notamment lorsque 25 Xaal est également l'Arginine, la neutralisation des glycosaminoglycanes, l'héparine, est totale. Selon une autre variante de réalisation de l'invention, lorsque Q2 est un groupement comprenant un groupe aryle, Q2 comprend un groupement --(C=O)m-(0)n relié à la Rhodaminello, dans lequel n = 0, 1, et m = 0, 1. De 30 la sorte, le substrat est plus aisé à produire. En effet, grâce au groupement (C=O)m (0)n- , l'accrochage du groupe aryle à la rhodaminello est facilité. Avantageusement, n = 0 et m = 1, et le groupement est simplement une fonction carbonyle. Par exemple, Q2 est le groupe benzoyle, soit un cycle benzénique relié à la rhodamineiio par la fonction carbonyle, ou encore le groupe 2-phénylbutanoyle. En outre, selon ladite autre variante de réalisation, Q2 comprend avantageusement un hétéroatome, par exemple, un atome d'azote. Le s caractère basique de cet hétéroatome, peut permettre de renforcer la neutralisation de l'héparine. Selon un autre objet, la présente invention propose une méthode de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin, ladite méthode étant du type selon laquelle : on fournit un échantillon sanguin io contenant des enzymes protéolytiques et susceptible de contenir un glycosaminoglycane ; on fournit un substrat d'enzymes protéolytiques apte à fournir un signal lorsque lesdites enzymes protéolytiques réagissent avec ledit substrat ; on met en contact ledit échantillon sanguin avec ledit substrat d'enzymes protéolytiques, tandis qu'on inhibe le pouvoir anticoagulant dudit ls glycosaminoglycane de manière à permettre auxdites enzymes protéolytiques de réagir librement avec ledit substrat de façon à fournir un signal représentatif de l'activité des enzymes protéolytiques dans ledit échantillon ; et selon l'invention, on utilise un substrat d'enzymes protéolytiques selon de formule générale : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodamine110 - Q2, dans laquelle : Xaa' et Xaa2 20 sont des acides aminés ; et, Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q', ou un acide aminé Xaa3, ou un groupement comprenant un groupe aryle, ou H ; de manière à pouvoir à la fois inhiber le pouvoir anticoagulant du glycosaminoglycane et mesurer l'activité des enzymes protéolytiques, avec un seul composé. Le substrat d'enzymes protéolytique utilisé, inclut toutes les variantes, modes de réalisation 25 et modes de mise en oeuvre précités. Préférentiellement, un fournit en outre un réactif activateur permettant d'induire la génération d'enzymes protéolytiques, et on met en contact ledit réactif activateur avec ledit échantillon sanguin et ledit substrat d'enzymes protéolytiques. Dès que le réactif activateur vient en contact avec l'échantillon 30 sanguin, il provoque la génération des enzymes protéolytiques. Par exemple, ledit réactif activateur est choisi parmi, du facteur tissulaire, des phospholipides, de la thromboplastine, du kaolin, de l'acide ellagique, du collagène, de l'adénosine-di-phosphate, de l'acide arachidonique, d'un peptide d'activation des récepteurs de thrombine, ou une combinaison de ceux-ci. Avantageusement, on choisira un activateur qui est apte à agir très en amont dans la cascade des réactions enzymatiques de la coagulation et de la fibrinolyse, notamment lorsque la mesure vise à suivre l'apparition d'une s activité enzymatique. L'utilisation du substrat objet de l'invention est alors avantageux en tant que neutralisant de l'héparine, car cette dernière agit directement ou indirectement sur l'essentiel des enzymes de la cascade enzymatique. En outre, on fournit un réactif déclencheur pour déclencher les réactions io d'enzymes protéolytiques, et on met en contact ledit réactif déclencheur avec ledit échantillon sanguin et ledit substrat d'enzymes protéolytiques. De la sorte, le déclencheur va permettre de déclencher le processus de coagulation, tandis que l'activateur provoque la génération des enzymes. Avantageusement, ledit réactif déclencheur est le calcium, et il est fourni par exemple sous forme de 15 citrate de calcium. Selon un mode de mise en oeuvre de la méthode de mesure conforme à l'invention, on met en contact ledit échantillon sanguin avec ledit substrat d'enzymes protéolytiques à une concentration en substrat comprise entre 50.10-6 et 1000.10-6 mail-1, par exemple entre 300.10-6 et 500.10-6 mail-1. De 20 la sorte, on obtient à la fois une neutralisation efficace des glycosaminoglycanes et un signal optique permettant de mesurer l'activité enzymatique. Selon encore un autre objet, la présente invention propose un kit de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin pour la 25 mise en oeuvre de la méthode de mesure décrite ci-dessus. Selon l'invention, le kit comprend : un réactif activateur permettant d'induire la génération d'enzymes protéolytiques ; un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodamine'o - Q2, dans laquelle : Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q', ou un acide aminé Xaa3, 30 ou un groupement comprenant un groupe aryle, ou H ; et un réactif déclencheur pour déclencher les réactions enzymatiques. Le substrat d'enzymes protéolytique utilisé, inclut toutes les variantes, modes de réalisation et modes de mise en oeuvre précités.
Selon une première variante de réalisation du kit, ledit substrat d'enzymes protéolytiques est mélangé avec ledit réactif déclencheur, à l'intérieur d'un même réceptacle, tandis que le réactif activateur est contenu dans un autre réceptacle. Le substrat d'enzymes est alors par exemple à une concentration s comprise entre 100.10-6 mail-1 et 500.10-6 mail-1, tandis que le réactif déclencheur est à une concentration comprise entre 10.10-3 mail-1 et 20.10-3 mail-1. Le réactif activateur est lui à une concentration comprise par exemple, entre 0,5.10-12 et 2.10-12 mail-1. Selon une seconde variante, ledit réactif activateur est mélangé avec ledit io réactif déclencheur dans un même réceptacle, tandis que le substrat d'enzymes est contenu seul dans un autre réceptacle. Cette seconde variante de mise en oeuvre, permet notamment de ne pas perturber la stabilité du substrat. Lorsque le kit objet de l'invention est mis en oeuvre, on fournit d'une part, ls 40 µL d'un échantillon sanguin par exemple, et d'autre part 10 µL du substrat d'enzymes, seul ou mélangé avec le réactif déclencheur, et 10 µL du réactif activateur, respectivement mélangé avec le réactif déclencheur ou seul. Ces volumes d'échantillon et de réactifs sont bien évidemment indicatifs, et sont ajustés en fonction des appareils de mesure et aussi, des types de mesures. Ils 20 peuvent tout aussi bien en être des multiples tels que 80 µL / 20 µL / 20 µL, ou encore d'autres volumes et proportions relatives, par exemple 30 µL / 15 µL / 15 µL. D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après de modes de réalisation particuliers de 25 l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la Figure 1 est un graphique montrant des activités enzymatiques en fonction d'une concentration en héparine selon un premier exemple de mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation ; 30 - la Figure 2 est un graphique montrant des activités enzymatiques en fonction d'une concentration en héparine selon un deuxième exemple de mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation; - la Figure 3 est un graphique montrant des activités enzymatiques en fonction d'une concentration en héparine selon un troisième exemple de mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation; - la Figure 4 est un graphique montrant des activités enzymatiques en s fonction d'une concentration en héparine selon un quatrième exemple de mise en oeuvre d'une méthode d'évaluation ; - la Figure 5 est un graphique montrant l'intensité d'un signal fluorescent en fonction du temps selon la méthode de mesure conforme à l'invention, avec une héparine non fractionnée ; io - la Figure 6 est un graphique montrant l'intensité d'un signal fluorescent en fonction du temps selon la méthode de mesure conforme à l'invention, avec une héparine de bas poids moléculaire; et, - la Figure 7 est un graphique montrant l'intensité d'un signal fluorescent en fonction du temps selon la méthode de mesure conforme à l'invention, avec ls un composé n'ayant aucun effet sur l'héparine. Dans une première partie de la description détaillée on expliquera d'une part comment on évalue la neutralisation des glycosaminoglycanes, ou héparines, contenus dans un échantillon sanguin, et d'autre part on donnera des exemples de substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : 0' 20 Xaa2-Xaa'-Rhodamine'o-Q2, permettant précisément de neutraliser ces glycosaminoglycanes. On observera qu'un des mérites de l'invention, a été de mettre en lumière l'effet de neutralisation des glycosaminoglycanes par certains substrats d'enzymes protéolytiques. En outre, on vérifiera ce principe de neutralisation des héparines pour deux types, des héparines non fractionnée, 25 ou HNF, et des héparines de bas poids moléculaire, ou HBPM. Dans une seconde partie de la description, on appliquera certains substrats d'enzymes identifiés dans la première partie, dans une méthode de mesure conforme à l'invention, dans laquelle au surplus de leur effet neutralisant vis-à-vis des héparines, ils permettent de mesurer l'activité des 30 enzymes. Avant de se référer aux diagrammes des Figures, on va décrire la méthode d'évaluation utilisée pour quantifier la neutralisation des glycosaminoglycanes dans un échantillon sanguin, et en particulier un plasma.
Cette méthode permet, tout aussi bien, de mettre en oeuvre des héparines non fractionnée que les héparines de bas poids moléculaire. En outre, la méthode s'attache à contrôler l'activité du facteur Xa, situé au carrefour de deux cascades enzymatiques conduisant à la formation de thrombine. Par ailleurs, s l'antithrombine, inhibiteur naturel de la génération de thrombine, vient contrôler la réaction. Dès son apparition, le facteur Xa se couple à son substrat naturel, la prothrombine, pour former la thrombine. L'héparine contenue dans l'échantillon forme, elle, un complexe avec l'antithrombine, lequel complexe promeut l'inhibition du facteur Xa. io Aussi, on met en oeuvre un substrat chromogène à base de paranitroaniline, que le facteur Xa vient hydrolyser. Et la libération de la paranitroaniline, optiquement mesurable, est alors inversement proportionnelle à la concentration d'héparine présente dans le milieu. On en déduit ainsi une mesure de l'activité anti-Xa. ls On se référera au diagramme de la Figure 1, pour analyser les résultats d'un premier exemple de mise en oeuvre de la méthode d'évaluation précitée. Dans ce premier exemple, l'héparine utilisée est une héparine calcique non fractionnée et commercialisée sous le nom de marque : « Calciparine® ». Selon la méthode d'évaluation, on enregistre l'activité anti-Xa que l'on reporte 20 en ordonnée, en fonction de la concentration en héparine du milieu. Les concentrations en héparine varient entre 0 et 1,67 UI/ml et sont relativement proches des concentrations thérapeutiques. La première courbe inclinée 10, correspond à une première série de mesures où on ajoute à l'échantillon sanguin, en surplus du substrat à base de paranitroaniline, du sérum 25 physiologique, tandis que la seconde courbe horizontale 12 correspond à une deuxième série de mesures où on ajoute à l'échantillon sanguin un polymère synthétique neutralisant, le polybrène, destiné à neutraliser les effets anticoagulants de l'héparine. Ce composé est bien connu pour ses effets sur l'héparine et il est usuellement mis en oeuvre dans les méthodes de mesure de 30 l'activité des enzymes protéolytiques pour s'affranchir précisément de l'effet anticoagulant de l'héparine. Ainsi, la première courbe 10 illustre la variation de l'activité anti-Xa en fonction de la concentration en héparine du milieu, et la seconde courbe 12, l'absence de variation de l'activité anti-Xa, lorsqu'au contraire un neutralisant de l'héparine est mis en oeuvre. On détermine ainsi le pourcentage de neutralisation du polymère synthétique, comme étant le rapport de la différence de la variation d'activité s anti-Xa dans le milieu contenant le sérum physiologique et dans le milieu contenant le neutralisant, entre deux concentrations en héparine, et la seule variation d'activité dans le milieu contenant le sérum physiologique, entre les deux mêmes concentrations en héparine, ce rapport étant multiplié par 100 afin d'obtenir le résultat en pourcentage de neutralisation. io Le pourcentage de neutralisation peut s'écrire également de manière plus compacte : 100 x (1- AA1/AA2), où AA1 correspond à la variation d'activité en présence de composé neutralisant et AA2 à la variation en présence de sérum physiologique. Ainsi, la mesure parallèle de la variation en présence de sérum physiologique, permet d'établir dans chaque série de mesures la référence. ls Dans ce premier exemple de mise en oeuvre, la variation d'activité anti-Xa en présence du composé neutralisant étant sensiblement nulle, le pourcentage de neutralisation est voisin de 100 °/O. On se référera à présent au diagramme de la Figure 2, présentant les résultats d'un deuxième exemple de mise en oeuvre de la méthode d'évaluation 20 précitée, dans lequel les deux courbes 14, 16, sont comparable à celles du premier exemple. La première courbe 14 correspond à une première série de mesures réalisées dans des conditions analogues à celles du premier exemple, dans lequel du sérum physiologique est ajouté à l'échantillon sanguin. En revanche, la seconde courbe 16 correspond à une deuxième série de mesures 25 où on ajoute à l'échantillon sanguin, non plus le polymère synthétique neutralisant, mais un substrat d'enzyme protéolytique conforme à l'invention de formule : R2-Xaa4 - Xaa2 - Xaa' - Rhodamine110 - Xaa3, dans laquelle, selon une première variante V(1), Xaa' et Xaa3 sont respectivement l'Arginine et Xaa2 et Xaa4, la Glycine, tandis que R2 est un groupement protecteur. Le substrat 30 objet de cette première variante est écrit de manière synthétique : R2GGR- Rhod110-R.
Ce substrat d'enzymes protéolytiques ne joue bien évidemment ici aucun rôle dans la méthode d'évaluation en tant que traceur. Ce deuxième exemple n'a d'autre but que de montrer le seul effet anti-héparine de ce substrat. L'héparine mise en oeuvre est également la Calciparine®, et on observe, s de manière analogue à celle du premier exemple, que le substrat objet de l'invention, présente un effet neutralisant voisin de 100 °/O. Ainsi qu'on l'expliquera dans la suite de la description, ce substrat d'enzymes est un excellent candidat pour la méthode de mesure selon l'invention, car il permet simultanément de neutraliser l'héparine du milieu et de mesurer l'activité io enzymatique. Le diagramme de la Figure 3, présente les résultats d'un troisième exemple de mise en oeuvre de la méthode d'évaluation, dans lequel deux paires de courbes 18, 20 et 22, 24, respectivement sensiblement confondues, présentent un profil comparable à celui des courbes des exemples précédents. ls La première paires de courbes 18, 20 correspond à deux premières séries de mesures réalisées dans des conditions analogues à celles des exemples précédents, dans lesquels du sérum physiologique est ajouté à l'échantillon sanguin. La seconde paires de courbes 22, 24 correspond à deux deuxièmes séries de mesures où on ajoute à l'échantillon sanguin, un substrat d'enzyme 20 protéolytique conforme à l'invention de formule générale : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodamine110 - Q2, dans laquelle, selon une deuxième variante V(2), Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q', tandis que Q' est le groupement R'O-(C=O)-CH2-CO, Xaa' étant l'Arginine, Xaa2 la Valine et R' le groupe éthyle. Le substrat objet de cette deuxième variante s'écrit de manière synthétique : (EtM-VR)2-Rhod'o. 25 Ce substrat d'enzymes protéolytiques n'interfère pas non plus en tant que traceur dans la méthode d'évaluation. L'héparine mise en oeuvre est également la Calciparine®, et là encore on observe, que le substrat objet de l'invention, présente un effet neutralisant de l'héparine voisin de 100 °/O. On se reportera à présent sur le diagramme de la Figure 4, présentant les 30 résultats d'un quatrième exemple de mise en oeuvre de la méthode d'évaluation. Une première série de mesures est réalisée dans des conditions analogues aux exemples précédents, dans lequel du sérum physiologique est ajouté à l'échantillon sanguin, et on obtient une première courbe 26 correspondant bien aux premières courbes des exemples précédents. On réalise ensuite une seconde série de mesures où on ajoute à l'échantillon sanguin, un substrat d'enzyme protéolytique, non pas conforme à s l'invention, mais de formule : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodamineiio - Q2, dans laquelle, Q2 est un groupe acétyle, tandis que Q' est le groupement R'O-(C=O)-CH2-CO, Xaa' étant l'Arginine, Xaa2 la Valine et R' le groupe éthyle. Ce substrat écrit de manière synthétique EtM-VR-Rhod'o-Ac, présente, d'un côté de la rhodamineiio un chaînon peptidique identique à celui de l'exemple Io précédent, et de l'autre côté, un groupe acétyle. Une seconde courbe 28 correspondant à une seconde série de mesure est tracée et elle est non plus sensiblement horizontale, mais sensiblement parallèle à la première courbe 26. On observe ainsi que ce substrat d'enzyme, neutralise très peu l'héparine. Le pourcentage de neutralisation obtenu selon la formule 100 x (1- AA1/AA2), ls varie entre 15% et 30% en fonction des concentrations en héparine. Aussi, ce substrat est un mauvais candidat pour réaliser un substrat d'enzymes protéolytiques formant à la fois un réactif traceur et un composé permettant de neutraliser les héparines. Les résultats, affichés en pourcentage de neutralisation de la 20 Calciparine® de trois autres variantes de réalisation du substrat d'enzymes conforme à l'invention sont reportés dans le tableau 1 ci-dessous, et ce pour quatre concentrations différentes d'héparine entre 0,42 UI/m1 et 1,67 UI/m1. Selon une troisième variante V(3), Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q' et, Xaa' est 1'Arginine et Xaa2 et Xaa4 sont respectivement la Glycine, tandis que R2 est un 25 groupement protecteur. Le substrat objet de cette troisième variante s'écrit de manière synthétique : (R2GGR)2-Rhod11o. Selon une quatrième variante V(4), Q2 est l'hydrogène H, Xaa' est 1'Arginine et Xaa2 et Xaa4 sont respectivement la Glycine, tandis que R2 est un groupement protecteur, soit de manière synthétique R2GGR-Rhod110-H. 30 Selon une cinquième variante V(5), Q2 est le groupe benzoïque, Xaa' est 1'Arginine et, Xaa2 et Xaa4 sont respectivement la Glycine, tandis que R2 est un groupement protecteur, soit R2GGR-Rhod'o-Benzoïque. 15 Tableau 1 [UI/ml] V(3) V(4) V(5) 0,42 90 °/O 96 °/O 100 °/O 0,83 93 °/O 90 °/O 97 0/0 1,25 94 °/O 89 °/O 98 0/0 1,67 96 °/O 80 °/O 98 0/0 On observe ainsi que les substrats d'enzymes objet des variantes V(3), s V(4) et V(5), présentent un très bon effet neutralisant vis-à-vis d'une héparine non fractionnée, la Calciparine®. Toujours dans cette première partie de description, la méthode d'évaluation précitée a été mise en oeuvre avec une héparine de bas poids moléculaire, la Fragmine®. io On a reporté les résultats du pourcentage de neutralisation de cette héparine pour les cinq variantes de substrat décrites ci-dessus, V(1), V(2), V(3), V(4) et V(5).
Tableau II [UI/ml] V(1) V(2) V(3) V(4) V(5) 0, 42 64 °/O 71 °/O 88 °/O 83 °/O 77 °/O 0, 83 65 °/O 78 °/O 90 °/O 83 °/O 75 °/O 1, 25 64 °/O 79 °/O 91 °/O 72 °/O 75 °/O 1, 67 72 °/O 78 °/O 91 °/O 64 °/O 74 °/O Ce tableau II montre, que l'effet neutralisant de substrat d'enzymes conformes à l'invention, selon les cinq variantes de réalisation précédemment décrites, est conservé avec une héparine de bas poids moléculaire. On 20 observera que les résultats obtenus avec cette héparine fragmentée de bas poids moléculaire sont sensiblement inférieurs à ceux obtenus avec l'héparine non fractionnée. Toutefois, cela ne compromet en rien la mise en oeuvre de ces substrats dans une méthode de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques 13 que l'on décrira ci-dessous et grâce à laquelle on s'affranchit de la présence des héparines qu'elles soient non fractionnée ou de bas poids moléculaire. Aussi, la présente invention concerne également une méthode de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin, faisant appel à s un substrat d'enzymes de formule générale : Q1 - Xaa2 - Xaa' - Rhodaminello - Q2 dans laquelle Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q1, ou un acide aminé Xaa3, ou un groupement comprenant un groupe aryle, ou encore H. Grâce à ce substrat d'enzymes, on peut non seulement inhiber le pouvoir anticoagulant des héparines dans un échantillon sanguin io mais aussi, et simultanément, mesurer l'activité d'une enzyme. Et c'est d'ailleurs l'intérêt de l'utilisation des substrats objet de l'invention. Selon un mode de mise en oeuvre de la méthode de mesure, l'activité enzymatique suivie est celle de la génération de thrombine. Le principe réside dans le suivi de la mesure d'un signal fluorescent après que le substrat ls d'enzymes a été mis en contact avec un échantillon sanguin contenant de l'héparine, et que les conditions de réaction permettent à la thrombine de venir cliver le substrat entre la partie peptidique et le fluorophore, en l'espèce la rhodaminello. Afin de mettre en oeuvre la méthode, on introduit tout d'abord un 20 échantillon sanguin de 40 µL contenant de l'héparine, à l'intérieur d'une micro-cuvette. On y ajoute d'une part 10 µL du substrat d'enzymes conforme à l'invention mélangé avec un réactif déclencheur, et 10 µL de réactif activateur. Le réactif déclencheur est le citrate de calcium et il présente une concentration de 16,7.10-3 mail-1. Le réactif activateur est du facteur tissulaire à une 25 concentration de 10-12 mol.L-1. Ensuite, on émet un signal d'excitation d'une longueur d'onde déterminée à travers la micro-cuvette et on enregistre optiquement dans le temps, la réponse au signal d'excitation. La réponse du signal est ainsi d'autant plus importante que la quantité de thrombine générée est forte. 30 Selon un mode particulier de réalisation, on choisit comme substrat d'enzymes celui correspondant à la variante de réalisation V(3) de la première partie de la description détaillée, et de formule synthétique (R2GGR)2-Rhodllo.
En outre, la méthode est mise en oeuvre avec une héparine non fractionnée et une héparine de bas poids moléculaire. Les résultats sont reportés dans les graphiques des Figures 5 et 6. La Figure 5 illustre une première expérience mettant en oeuvre une héparine non s fractionnée, tandis que la Figure 6 illustre une seconde expérience mettant en oeuvre une héparine de bas poids moléculaire. L'intensité de la réponse du signal d'excitation est reportée en ordonnée, tandis que l'échelle de temps Figure sur l'axe des abscisses. Sur le graphique de la Figure 5 la première courbe supérieure 30, io correspond à une série de mesures réalisées avec un premier échantillon sanguin ne contenant pas d'héparine, tandis que la seconde courbe inférieure 32 est réalisée avec un second échantillon sanguin présentant une concentration en héparine de 1,5 UI/ml. Les deux courbes 30, 32 sont sensiblement parallèles et on en déduit tout ls naturellement que l'héparine à une très faible incidence sur le résultat de la mesure de l'activité de la thrombine. Sur le graphique de la Figure 6, illustrant une deuxième expérience, et de manière analogue à celui de la Figure 5, la première courbe supérieure 34 correspond à une série de mesures réalisées avec un premier échantillon 20 sanguin ne contenant pas d'héparine, tandis que la seconde courbe inférieure 36 est réalisée avec un second échantillon sanguin présentant une concentration en héparine de 1,5 UI/ml. Là également, les deux courbes 34, 36 sont sensiblement parallèles et on s'affranchit de la présence de l'héparine pour appréhender l'activité de la 25 thrombine. Ainsi, on comprend que le substrat d'enzymes correspondant à la variante de réalisation V(3), et comme l'avait révélé la méthode d'évaluation décrite dans la première partie, neutralise les effets de l'héparine, et au surplus ici, permet de mesurer l'activité de la thrombine.
30 On a représenté sur la Figure 7, un graphique montrant les résultats d'une troisième expérience où le substrat mis en oeuvre selon la méthode de mesure précité, est le substrat d'enzymes EtM-VR-Rhod'o-Ac, non conforme à l'invention. La méthode d'évaluation ci-dessus avait permis d'écarter ce substrat car il neutralise faiblement les héparines. La première courbe 38 du graphique de la Figure 7, correspond à une série de mesures réalisées avec un premier échantillon sanguin ne contenant s pas d'héparine, et la seconde courbe 40 à une série de mesures avec un échantillon sanguin contenant 1,5 UI/ml d'héparine. La seconde courbe 40 est sensiblement horizontale, et l'intensité du signal correspondant à l'activité de la thrombine correspond au bout de 30 minutes, à sensiblement 3 °/O de l'intensité du signal de la série de mesures io réalisées sans héparine. Ainsi, l'héparine du milieu n'est pas neutralisée et il n'y a pas de production de thrombine. Avec ce type de substrat il est impossible de mesurer l'activité d'une enzyme et en l'espèce de la thrombine sans subir l'impact de l'héparine. Par ailleurs, on obtient avec les substrats selon les quatre autres ls variantes, des résultats analogues à ceux obtenus avec le substrat d'enzymes correspondant à la variante de réalisation V(3). La présente invention concerne également un kit de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin pour la mise en oeuvre de la méthode de mesure décrite ci-dessus.
20 Selon l'invention, le kit comprend un substrat selon l'une des variantes vo) à V(5). Bien évidemment, il pourrait comprendre un substrat selon une autre variante définie par la formule générale précitée. Le substrat d'enzymes protéolytiques, à une concentration de 300.10-6 mail-1 est alors mélangé avec du citrate de calcium à une concentration de 16,7.10-3 mail-1, à l'intérieur d'un 25 premier réceptacle. Ce mélange forme un premier réactif. Du facteur tissulaire à une concentration de 10-12 mail-1 est contenu dans un autre réceptacle et constitue le second réactif. Ces deux réactifs sont alors aptes à être mis en oeuvre à l'intérieur d'une micro-cuvette, avec l'échantillon sanguin, au moment de la mesure de l'activité 30 enzymatique.
Claims (21)
- REVENDICATIONS1. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques de formule générale : Q' - Xaa2 - Xaa' - Rhodamine'o - Q2, dans laquelle : s - Xaa' et Xaa2 sont des acides aminés ; et, - Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q', ou un acide aminé Xaa3, ou un groupement comprenant un groupe aryle, ou H ; pour pouvoir inhiber, dans un échantillon sanguin contenant un glycosaminoglycane, le pouvoir anticoagulant dudit glycosaminoglycane. io
- 2. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 1, caractérisée en ce que Q' est : - H;ou, - le groupement R'O-(C=O)-CH2-CO dans lequel R' comprend un groupe alkyle ou aryle ; ou, ls - le groupement R2-Xaa4 dans lequel Xaa4 est un acide aminé et R2 un groupement protecteur ou H.
- 3. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que Xaa' est un acide aminé basique.
- 4. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la 20 revendication 3, caractérisée en ce que Xaa' est l'Arginine.
- 5. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon les revendications 2, 3 et 4, caractérisée en ce que Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q', tandis que Q' est le groupement R2-Xaa4, Xaa2 et Xaa4 étant respectivement la Glycine, de manière à conférer audit substrat une faible affinité vis-à-vis des 25 enzymes protéolytiques.
- 6. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon les revendications 2, 3 et 4, caractérisée en ce que Q2 est Xaa' - Xaa2 - Q', tandis que Q' est le groupement R'O-(C=0)-CH2-CO, Xaa2 étant la valine et R' le groupe éthyle, de manière à conférer audit substrat une faible affinité vis-à- 30 vis des enzymes protéolytiques.
- 7. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que Xaa3 est l'Arginine.
- 8. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que, lorsque Q2 est un groupement comprenant un groupe aryle, Q2 comprend un groupement --(C=O)m-(0)n relié à la Rhodamine'o, dans lequel n = 0, 1, et m = 0, 1. s
- 9. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 8, caractérisée en ce que n = 0 et m = 1.
- 10. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 9, caractérisée en ce que Q2 est le groupe benzoyle.
- 11. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la io revendication 9, caractérisée en ce que Q2 est le groupe 2-phénylbutanoyle.
- 12. Utilisation d'un substrat d'enzymes protéolytiques selon la revendication 8 ou 9, caractérisée en ce que Q2 comprend en outre un hétéroatome.
- 13. Méthode de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un ls échantillon sanguin, ladite méthode étant du type selon laquelle : - on fournit un échantillon sanguin contenant des enzymes protéolytiques et susceptible de contenir un glycosaminoglycane ; - on fournit un substrat d'enzymes protéolytiques apte à fournir un signal lorsque lesdites enzymes protéolytiques réagissent avec ledit substrat ; 20 - on met en contact ledit échantillon sanguin avec ledit substrat d'enzymes protéolytiques, tandis qu'on inhibe le pouvoir anticoagulant dudit glycosaminoglycane de manière à permettre auxdites enzymes protéolytiques de réagir librement avec ledit substrat de façon à fournir un signal représentatif de l'activité des enzymes protéolytiques dans ledit échantillon ; 25 caractérisée en ce qu'on utilise un substrat d'enzymes protéolytiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, de manière à pouvoir à la fois inhiber le pouvoir anticoagulant du glycosaminoglycane et mesurer l'activité des enzymes protéolytiques, avec un seul composé.
- 14. Méthode de mesure selon la revendication 13, caractérisée en ce 30 qu'on fournit en outre un réactif activateur permettant d'induire la génération d'enzymes protéolytiques, et en ce qu'on met en contact ledit réactif activateur avec ledit échantillon sanguin et ledit substrat d'enzymes protéolytiques.
- 15. Méthode de mesure selon la revendication 14, caractérisée en ce que ledit réactif activateur est choisi parmi, du facteur tissulaire, des phospholipides, de la thromboplastine, du kaolin, de l'acide ellagique, du collagène, de l'adénosine-di-phosphate, de l'acide arachidonique, d'un peptide s d'activation des récepteurs de thrombine, ou une combinaison de ceux-ci.
- 16. Méthode de mesure selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce qu'on fournit en outre un réactif déclencheur pour déclencher les réactions d'enzymes protéolytiques, et en ce qu'on met en contact ledit réactif déclencheur avec ledit échantillon sanguin et ledit substrat io d'enzymes protéolytiques.
- 17. Méthode de mesure selon la revendication 16, caractérisée en ce que ledit réactif déclencheur est le calcium.
- 18. Méthode de mesure selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce qu'on met en contact ledit échantillon sanguin avec ledit ls substrat d'enzymes protéolytiques à une concentration en substrat comprise entre 50.10-6 et 1000.10-6 mol.L-1.
- 19. Kit de mesure de l'activité d'enzymes protéolytiques d'un échantillon sanguin pour la mise en oeuvre de la méthode selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisé en ce qu'il comprend :
- 20 - un réactif activateur permettant d'induire la génération d'enzymes protéolytiques ; - un substrat d'enzymes protéolytiques apte à être utilisé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 ; et - un réactif déclencheur pour déclencher les réactions enzymatiques. 25 20. Kit de mesure selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit substrat d'enzymes protéolytiques est mélangé avec ledit réactif déclencheur.
- 21. Kit de mesure selon la revendication 19, caractérisé en ce que ledit réactif activateur est mélangé avec ledit réactif déclencheur. 30
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