EP2307890A1 - Procédé de mesure du taux de facteur vii activé dans un échantillon - Google Patents

Procédé de mesure du taux de facteur vii activé dans un échantillon

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EP2307890A1
EP2307890A1 EP09772881A EP09772881A EP2307890A1 EP 2307890 A1 EP2307890 A1 EP 2307890A1 EP 09772881 A EP09772881 A EP 09772881A EP 09772881 A EP09772881 A EP 09772881A EP 2307890 A1 EP2307890 A1 EP 2307890A1
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EP
European Patent Office
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fvii
plasma
sample
factor
activated
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP09772881A
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German (de)
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Lysiane Hilbert
Claudine Mazurier
Dominique Grenier
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LFB Biotechnologies SAS
Original Assignee
LFB Biotechnologies SAS
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96447—Factor VII (3.4.21.21)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the level of activated factor VII (FVIIa) in a sample by using a plasma lacking in FVII and at least one other factor selected from the factor
  • Blood coagulation is a mechanism that allows organisms to control blood shedding during vascular lesions and thus prevent bleeding.
  • Blood coagulation occurs in cascading steps involving different proenzymes and procofactors in the blood that are converted, via proteolytic enzymes, into their activated form.
  • steps (or cascade) of coagulation two pathways are distinguished, called the extrinsic pathway of coagulation and the intrinsic pathway of coagulation.
  • prothrombinase consisting of activated factor X (FXa), activated factor V (FVa), phospholipids and calcium. It is prothrombinase that activates prothrombin thrombin allowing the transformation of soluble fibrinogen into insoluble fibrin which forms the clot.
  • FVIIa tissue factor
  • TF tissue factor
  • the FVIIa-FT complex transforms factor X into factor Xa in the presence of calcium ions.
  • the FVIIa-FT complex also transforms FIX into FIXa.
  • Factors IXa and Xa activate FVII in FVIIa.
  • Factor Xa complexed with factor Va and phospholipids (prothrombinase) converts prothrombin to thrombin.
  • Thrombin acts on fibrinogen transforming it into fibrin and also has other activities including activation of factor V in Factor Va and FVIII in FVIIIa.
  • Thrombin also activates factor XIII in factor XIIIa in the presence of calcium, which allows the consolidation of the fibrin clot.
  • FIXa is generated from FIX by the FXIa itself activated by activated factor XII. blood contact with an electronegative surface such as the subendothelium.
  • FVIIa a vitamin K-dependent glycoprotein
  • the FVIIa has the advantage of being able to act locally in the presence of the tissue factor released after tissue damage causing haemorrhages, even in the absence of Factor VIII or IX. This is why FVIIa has been used for many years to correct some bleeding disorders.
  • the first approach was to obtain FVIIa from plasma. But the production of FVIIa from plasma is limited by the availability of the source of supply and this use of plasma presents risks of transmission of pathogens, such as prion and viruses.
  • rFVIIa The main therapeutic indication for rFVIIa (in the USA, EU and Japan) is the treatment of spontaneous or surgical bleeding of hemophiliacs A having developed anti-factor VIII antibodies and hemophiliac B having developed anti-factor IX antibodies. In Europe, it is also indicated for use in patients with congenital deficiency of FVII and in patients with Glanzmann thrombasthenia. In addition, numerous publications report the efficacy of rFVIIa in controlling bleeding during surgical procedures in patients who have neither congenital factor deficiency nor thrombasthenia.
  • the best known methods for detecting FVIIa activity are the measurement of clotting time, PTT (Partial Thromboplastin Time -
  • Partial Thromboplastin Time Partial Thromboplastin Time
  • aPTT activate partial thromboplastin time
  • Activated thromboplastin TEG (thromboelastograph) and TGT (thrombin generation test). These methods make it possible to detect the activity of FVIIa but do not make it possible so far to directly measure the level of activated FVII in a sample.
  • a commercial immunoassay kit of FVIIa is available (IMUBIND Factor VII ELISA kit) but the experimental conditions for the implementation of this technique are difficult to control. Indeed this kit is complex to implement and is characterized by an extremely low dynamic range, a linear range of extremely limited detection and above all requires working at a temperature of + 4 ° C.
  • fluorogenic or chromogenic FXa assay methods generated by FVIIa have also proved unsuitable for measuring the concentration of FVIIa because they do not make it possible to differentiate the effect of FVIIa from that of FVIIa.
  • thromboelastography is sometimes used. This method consists in measuring the physical properties of whole blood by mechanically analyzing clot formation as a function of time. Depending on the parameters extracted from a graph (called thromboelastogram ® ) generated by the thromboelastograph, the clinician can evaluate the coagulation ability of a patient. Although accurate, this method is tedious, unsuitable for a routine and repetitive analysis, and difficult to apply to multisampling because it requires to be performed within one hour after the blood sample. In addition, this method does not measure the level of activated FVII in a sample.
  • the best known method for measuring the level of activated FVII is to independently measure the concentration of FVII + FVIIa and the concentration of FVIIa in order to deduce the level of activated FVII (ratio FVIIa concentration / concentration of FVII + FVIIa ). Despite the fact that the measurement of FVII + FVIIa concentration is accurate, direct measurements of FVIIa concentration remains imprecise and difficult to implement.
  • the Applicant has surprisingly found that the use of a plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI makes it possible to measure the level of activated FVII in a sample in a reliable manner. , reproducible and easy to implement, especially when the sample contains non-activated factor VII and activated factor VII.
  • the experimental conditions used in the method of the invention thus make it possible to establish a correlation between the level of activated FVII in a sample and certain characteristic parameters of a thrombin generation test (TGT) and the resulting thrombinogram. .
  • TGT thrombin generation test
  • Such a correlation makes it possible to determine the level of activated FVII in a sample to be tested, by comparing the thrombinogram parameters of said sample with those of "standard" thrombograms obtained from compositions comprising known levels of activated FVII.
  • the present invention therefore relates to a method for measuring the level of activated factor VII in a test sample, comprising the steps of: a) mixing said test sample with a factor VII-deficient plasma (FVII) and lacking in at least one another factor selected from factor VIII (FVIII), factor IX (FIX) and factor XI (FXI), the sample-test + plasma mixture having a final concentration of FVI1 + FVlla ranging from 10 ⁇ M to 80 ⁇ M, - b ) add initiator components of the thrombin generation reaction; c) obtaining a thrombinogram by performing a thrombin generation test (TGT) on the mixture of step b); d) comparing at least one of the thrombinogram parameters of step c) with a homologous parameter of standard thrombograms established on the basis of standard samples whose activated Factor VII level is known and varies between each standard sample ; e) deducing from step d) a measurement of the activated Factor
  • the method of the present invention optionally comprises an additional step f) of calculating the concentration of activated factor VII in said test sample from the rate determined in step e).
  • the standard thrombograms are obtained by performing a thrombin generation test on a mixture containing (i) a standard sample whose level of activated factor VII is known, (ii) a plasma devoid of FVII and lacking in at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI, the final concentration of the sample-standard + plasma mixture devoid of FVII and lacking in at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI being substantially identical to that of the sample-test + plasma mixture lacking in FVII and devoid of at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI, and (iii) initiator components of the FVIII reaction. thrombin generation.
  • the compared thrombinogram parameter is chosen from latency time, peak time and velocity when said plasma is devoid of FVII and FIX, or devoid of FVII and FXI; and among the lag time and the peak time when said plasma is devoid of FVII and FVIII.
  • sample-test + plasma and standard-sample + plasma mixtures are made using the same plasma lacking in FVII and lacking in at least one other factor chosen from FVIII, FIX and FXI.
  • the initiator components of the thrombin generation comprise a tissue factor (TF), phospholipids, and Ca 2+ , the final concentration of said tissue factor in the sample + plasma mixture + initiator components being in the range of 1 at 10 ⁇ M, the final concentration of said phospholipids in the sample + plasma mixture + initiator components being in the range of 0.1 to 5 ⁇ M and the final concentration of Ca 2+ in the mixture sample + plasma + initiator components being in the range of 14 to 18 mM.
  • TF tissue factor
  • phospholipids phospholipids
  • Ca 2+ the final concentration of said tissue factor in the sample + plasma mixture + initiator components
  • the activated factor FVII whose rate is measured is of plasmatic origin (pFVIIa), of recombinant origin (rFVIIa) or of transgenic origin (TgFVIIa).
  • test sample is a sample of transgenic mammalian milk or a serum-free cell culture medium.
  • the present invention also relates to the use of a FVII-deficient plasma and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI for measuring the level of activated FVII in a test sample.
  • Fractor VII or “FVII” is meant the non-activated factor VII corresponding to the single-chain proenzyme which can not trigger coagulation.
  • activated Factor VII or “activated FVII”, or FVIIa is meant the double-stranded protein (enzyme), comprising a heavy chain and a light chain linked together by a disulfide bridge, resulting from the cleavage of FVII (proenzyme), and which is able to trigger blood clotting.
  • FVII + FVIIa means the sum of the concentrations or the sum of the amounts of FVII and FVIIa present in a sample of interest. The sum of the amounts or concentrations of FVII and FVIIa can be measured, for example, by immunoassay using commercially available kits such as ASSERACHROM® VII: Ag from Diagnostica Stago (Reference 00241).
  • Activated Factor VII Level or “FVIIa Level” means the ratio of the amount or concentration of Activated Factor VII (FVIIa) in a sample of interest, and the sum of the amounts or concentrations, respectively, Factor VII and activated Factor VII (FVII + FVIIa) in this same sample of interest.
  • the activated FVII level will be equal to 1 (ie 100%) for a sample containing only FVIIa but not containing FVII, this rate will be equal to 0.5 (i.e. 50%) for a sample containing both FVIIa and FVII, and it will be 0 (ie, 0%) for a sample containing only FVII (not containing FVIIa).
  • Test sample means a sample containing FVII, activated FVII or a mixture thereof, but the level of activated FVII is not known.
  • the test sample is purified from blood or plasma or comes from a body fluid, purified or not, such as, for example, the milk of a mammal, a culture medium or a cell homogenate.
  • the test sample is a sample of mammalian milk, particularly a sample of transgenic mammalian milk producing FVII and / or FVIIa in its milk.
  • test sample is a serum-free cell culture medium.
  • the sample to be tested is a therapeutic sample or not containing plasma FVIIa (pFVIIa), recombinant (rFVIIa) or transgene (TgFVIIa), and FVII, or a mixture thereof in liquid or freeze-dried form.
  • pFVIIa plasma FVIIa
  • rFVIIa recombinant
  • TgFVIIa transgene
  • standard sample is meant a sample whose level of activated FVII is known and / or selected, incorporating, for example, appropriate amounts or concentrations of the international standard of FVII (Blood Coagulation Factor VII Concentrate Human, NIBSC reference 97/592) or International Standard for Activated FVII (Blood Coagulation Factor VIIa Concentrate Human, NIBSC Ref 89/688), or a mixture thereof, in a solution of interest, to obtain a desired level of FVII activated.
  • the standard sample can also be obtained from blood or plasma, or comes from a body fluid, purified or not, such as, for example, milk, or a culture medium or a cell homogenate.
  • Plasma as used in the context of the present invention, is of animal origin, preferably mammalian and preferably human.
  • the terms “depleted” or “devoid of” have the same meaning and can be used as alternatives to designate a depletion of a solution of interest (for example a plasma) in one compound (eg a blood coagulation factor), until the presence of the latter is undetectable.
  • a solution of interest for example a plasma
  • one compound eg a blood coagulation factor
  • Plasmid deficient in FVII and in at least one factor chosen from FVIII, FIX or FXI therefore means that the respective concentration of each of these factors FVII, FVIII, FIX or FXI in the plasma in question is less than their detection threshold when their concentration is measured by the assay methods known to those skilled in the art.
  • assay methods are those using commercial kits or reagents (for example, ASSERACHROM® VII: Ag from Diagnostica Stago).
  • the detection threshold of FVII in plasma is about 1 mIU / ml (0.5 ng / ml), a concentration below which FVII can not be detected.
  • the detection threshold of FVIII in the plasma is about 10 mIU / ml (1 ng / ml), a concentration below which FVIII can not be detected.
  • the detection threshold of the FIX in the plasma is about 0.2 mIU / ml (1 ng / ml), concentration below which the FIX can not be detected.
  • the detection threshold of the FXI in the plasma is about 0.5 mIU / ml (2.5 ng / ml), a concentration below which the FXI can not be detected.
  • Plasma depletion techniques as a factor of interest include all techniques known to those skilled in the art. Examples of depletion techniques include immunodepletion, chemical depletion, and the combination thereof.
  • Immunodepletion is the use of antibodies specifically directed against an antigen contained in a solution for the purpose of substantially depleting said solution to the antigen of interest.
  • the antibodies used to carry out an immunodepletion may be polyclonal and / or monoclonal derived from one or different cellular clones.
  • the antibodies used can be directed directly against the antigen that it is desired to eliminate or against a protein that binds to this antigen.
  • Plasma depleted in FVII, FIX or FXI can thus be obtained by using respectively anti-FVII, anti-FIX or anti-FXI antibodies.
  • Plasma free of FVIII may be obtained using anti-FVHI antibodies or antibodies against von Willebrand factor, a plasma protein that transports FVIII to the blood.
  • FVIII-depleted plasma can also be obtained by chemical depletion, using EDTA (ethylene-diamine-tetraacetic acid) since FVIII is a Ca 2+ dependent factor. EDTA is then removed by methods well known to those skilled in the art, for example by dialysis.
  • EDTA ethylene-diamine-tetraacetic acid
  • the plasma used to implement the present invention is a plasma lacking factor VII and at least one other factor selected from FVIII, FIX and FXI.
  • the plasma used to implement the present invention is prepared from a hemophiliac plasma of type A, naturally free of FVIII, from a hemophiliac plasma of type B, naturally free of FIX, or from a plasma from patients with a complete deficiency of factor XI, said plasmas naturally free of FVIII, FIX or FXI are then depleted in FVII, by an immunological or chemical method such as those described above.
  • the plasma used is prepared from a normal plasma which is, initially, spoiled in FVII and then, in a second stage, depleted of FVIII and / or FIX and / or FXI.
  • initiator components of the thrombin generation reaction or “initiator components” means the essential components for starting the thrombin generation from prothrombin.
  • the initiator components of the thrombin generation reaction essentially comprise a source of calcium ion (Ca 2+ ), a phospholipid agent and tissue factor (FT), in concentrations sufficient to trigger the thrombin generation reaction.
  • a source of calcium ions suitable for the purpose of the present invention is any source of biologically compatible calcium ions, such as CaCl 2 .
  • the source of Ca 2+ can be added to the sample / plasma mixture extemporaneously with the other initiator components of the thrombin generation reaction or in a delayed manner, ie after the addition of the other initiating components of the generation reaction. thrombin.
  • a final concentration of calcium ions in the sample + plasma + initiator components mixture in the range of 14 to 18 mM, and in particular equal to 16, 7 mM.
  • Phospholipid agents suitable for use in the present invention may be in the form of a concentrate or lyophilizate and preferably comprise a mixture comprising a major amount of phosphatidylcholine and phosphatidylserine or containing exclusively phosphatidylcholine and phosphatidylserine.
  • a final concentration of phospholipidic agents in the sample + plasma + initiator components mixture in the range from 0.1 to 5 ⁇ M, in particular from 0, 5 to 2 ⁇ M, and more particularly equal to 1 ⁇ M.
  • Tissue factor (FT) suitable for use in the present invention may be selected from the group consisting of any native, plasmatic, recombinant or transgenic tissue factor, any modified tissue factor, including any truncated tissue factor that has lost its function. activation of Factor VIIa Factor VIIa, provided that said modified Tissue Factor has retained, even partially, its ability to act as a cofactor of factor VIIa enzymatic activity.
  • An appropriate modified tissue factor may, for example, be deleted from its transmembrane domain such as the tissue factor of the STACLOT kit of Diagnostica Stago (Reference 00281) available commercially.
  • tissue factor concentration in the sample + plasma + initiator components mixture is in the range from 1 to 10 ⁇ M, in particular from 4 to 6 ⁇ M. , and more particularly equal to 5 ⁇ M.
  • the test sample, the standard sample, the plasma devoid of FVII and at least one other factor chosen from FVIII, FIX or FXI, and / or the initiator components of the generation reaction Thrombin can be in liquid or freeze-dried form. When they are in freeze-dried form, these compounds can advantageously be resuspended, prior to the implementation of the process according to the invention, in a suitable aqueous solvent, such as purified water for injection (PPI).
  • PPI purified water for injection
  • the Applicant has therefore developed a method for measuring the level of activated factor VII in a test sample based on specific experimental conditions that make it possible to overcome the disadvantages resulting from the presence of non-activated FVII in the test sample. .
  • the first step of this method is to mix a test sample containing an unknown level of activated FVII with a FVII-deficient and FVIII-deficient plasma, and / or FIX and / or FXI, so that the final FVII concentration + FVIIa in the resulting mixture is in the range of 10 ⁇ M to 80 ⁇ M. It is this specific combination of properties related to the nature of the plasma and the concentration range used which makes it possible to implement the method for measuring the level of activated FVII according to the invention.
  • Initiating components of the thrombin generation reaction are then added to the test-sample + plasma mixture in order to trigger the cleavage reaction which leads to the generation of thrombin from the prothrombin contained in the plasma.
  • a thrombin generation test is then performed.
  • TGT thrombin generation test
  • the thrombin generation test begins when the sample of interest (or a solution comprising it) is contacted with initiator components of the reaction. This initial time corresponding to the beginning of the thrombin generation test is called t 0 .
  • the generated thrombin is then revealed by the use of a developing agent, preferably by the use of a fluorogenic agent, whose degradation by thrombin causes the appearance of a fluorescent compound, or by the use of a chromogenic agent.
  • a developing agent preferably by the use of a fluorogenic agent, whose degradation by thrombin causes the appearance of a fluorescent compound, or by the use of a chromogenic agent.
  • the fluorogenic agent or the chromogenic agent are added to the sample + plasma mixture at the same time as the initiator components of the thrombin generation reaction.
  • the fluorescence resulting from the degradation of the fluorogenic agent by the newly generated thrombin is detected by a measuring device such as a fluorometer.
  • a measuring device such as a fluorometer.
  • the fluorimeter used is provided with recording means or means for tracing the variation of fluorescence over time.
  • the data collected by the fluorimeter make it possible to establish the curve of variation of fluorescence over time, called thrombinogram.
  • the peak height expressed in nM thrombin, corresponds to the maximum concentration of thrombin generated at a time t max during the reaction
  • the latency expressed in minutes, is the time elapsed between the start of the test
  • the peak time expressed in minutes
  • the velocity expressed in nM thrombin formed / min, corresponds to the peak height divided by the difference between the peak time t max and the lag time.
  • these parameters are directly provided by the device used to measure the formation of thrombin.
  • standard thrombograms are obtained from standard samples containing a known level of activated FVII. As described above for the test sample, at least two standard samples containing different levels of activated FVII are mixed with FVII-free plasma and at least one factor selected from FVIII, FIX and FXI. . Initiator components of the thrombin generation reaction are then added to the sample-standard + plasma mixture to begin the Thrombin Generation Test and to obtain standard thrombograms corresponding to each standard sample.
  • the concentration of FVII + FVIIa of the sample-standard + plasma mixture is between 10 ⁇ M and 80 ⁇ M.
  • the concentration of FVII + FVIIa of the sample-standard + plasma mixture is substantially identical to the concentration of FVII + FVIIa of the sample-test + plasma mixture.
  • the plasma mixed with the standard samples is identical to that which has been mixed with the test sample.
  • the interpolation can be of linear, geometric, cubic, polynomial, Lagrangian or Newtonian type.
  • the interpolation performed corresponds to the variation of the latency time as a function of the activated FVII level in the standard samples, to the variation of the peak time as a function of the activated FVII level in the standard samples or to the variation velocity versus FVII activated in standard samples.
  • the level of activated FVII contained in the test sample is determined by plotting at least one of the parameters derived from the thrombinogram of this test sample on a corresponding interpolation made from standard thrombograms. If the reported parameter is the lag time, the interpolation used will correspond to the variation of the lag time as a function of the factor VII level activated in the standard samples. If the reported parameter is the peak time, the interpolation used will correspond to the change in peak time as a function of the factor VII level activated in the standard samples. Finally, if the reported parameter is the velocity, the interpolation used will correspond to the variation of the velocity as a function of the factor VII level activated in the standard samples.
  • the factor VII level determined from the interpolation thus corresponds to the activated factor VII level of the test sample.
  • the method of the invention may comprise an additional step of calculating the concentration of activated factor VII in the test sample from the activated factor VII level determined from the interpolation.
  • the Activated factor VII concentration meets the following formula:
  • FVIIa concentration FVIIa rate x FVII concentration + FVIla
  • FIG. 1 Standard thrombograms obtained in the presence of a final concentration of FVII + FVIla of 50 ⁇ M in the sample-standard / plasma mixture, with a plasma devoid of FVII and FVIII, and for activated FVII levels ranging from 0 to 100% (with 5 ⁇ M Tissue Factor and 1 ⁇ M
  • Figures 2 and 2bis Variations in lag time and peak time, respectively, as a function of the level of FVII activated in the standard sample, with a plasma deficient in FVII and FVIII, for a final concentration of FVII + FVIla 50 pM
  • FIG. 7 Standard thrombograms obtained in the presence of a final concentration of FVII + FVIIa of 50 ⁇ M in the sample-standard / plasma mixture, with a plasma deficient in FVII and in FXI (with 5 ⁇ M Tissue Factor and 1 ⁇ M Phospholipids).
  • Figures 8, 9, 10 and 11 Latency, peak time, peak height, and velocity variations, respectively, as a function of FVII level in the standard sample, with a plasma devoid of FVIII and FXI, for a final concentration of FVII + FVIIa of 50 ⁇ M (with 5 ⁇ M Tissue Factor and 1 ⁇ M Phospholipids).
  • FIG. 12 Standard thrombograms obtained in the presence of a final FVII + FVIIa concentration of 10 ⁇ M in the sample-standard / plasma mixture, with a plasma deficient in FVII and in FVIII (with 5 ⁇ M tissue factor and 1 ⁇ M
  • Figures 13, 14, 15 and 16 Latency, peak time, peak height, and velocity variations, respectively, as a function of FVII level in standard sample, with plasma devoid of FVII and FVIII, for a final FVII + FVIIa concentration of 10 ⁇ M (with 5 ⁇ M Tissue Factor and 1 ⁇ M Phospholipids).
  • Figure 17 Standard thrombograms obtained in the presence of a final concentration of FVII + FVIIa of 80 ⁇ M in the sample-standard / plasma mixture, with a plasma deficient in FVII and FVIII (with 5 ⁇ M Tissue Factor and 1 ⁇ M Phospholipids).
  • Figures 18, and 19 Variations in lag time and peak time, respectively, as a function of the level of FVII activated in the standard sample, with a plasma deficient in FVII and FVIII, for a final concentration of FVII + FVIIa of 80 pM
  • the column was regenerated by eluting the fixed FVII with 20 mL of regeneration buffer (50 mM NaCl, 0.1 M glycine pH 2.4) and then the column was rebalanced with 20 mL of equilibration buffer (10 mM citrate). 0.15 M NaCl pH 7.4).
  • the appropriate volume of an international standard sample of FVII (SI-FVII) provided by NIBSC and / or international standard of FVIIa (SI-FVIIa) also provided by NIBSC is taken to obtain a standard sample containing a known activated FVII, which is added to 80 ⁇ L of FVII- and FVIII-deficient plasma (plasma deficient in FVIII from the company Diagnostica Stago or being a plasma of type A hemophiliacs, which was then depleted in FVII as in Example 2), in order to obtain a mixture which contains a known fixed activated FVII level of between 0% and 100% for a concentration of FVII + FVIIa of between 10 ⁇ M and 80 ⁇ M.
  • initiator factors of the thrombin generation reaction (Ca 2+ , phospholipids and FT) are added to the mixture comprising the plasma and the sample, at final concentrations of 5 ⁇ M in FT, 1 ⁇ M in phospholipids, (reagent Diagnostica Stago 86195 diluted 1/4) and 16.7 mM Ca 2+ , and 20 ⁇ L of agent specific fluorogenic thrombin (Fluca reagent kit Diagnostica Stago 86197).
  • Standard TGT curves (standard thrombograms) were established for fixed and known levels of activated FVII between 0% and 100%, in order to obtain standard thrombograms providing the various parameters (latency, peak height, time at peak and velocity).
  • the thrombograms are established using a fluorimetric device for measuring the thrombin formation time (Fluoroskan - Thermo Electron) equipped with software for establishing thrombinograms (Thrombinoscope BV Company), for a wavelength of excitation of 390 nm and an emission wavelength of 460 nm.
  • FIG. 1 represents standard thrombograms obtained in the presence of 50 ⁇ M of final FVII + FVIIa in the plasma / sample mixture and for variable activated FVII levels ranging from 0 to 100%.
  • a decrease in lag time and thrombin formation time at the peak is observed as a function of the increase in the level of activated FVII in the sample.
  • the peak time reaches a limit that can be estimated at 14 minutes for an activated factor level of 100%. It is noted that a plasma deficient in FVII and FVIII without the addition of FVII or FVIIa does not induce the formation of thrombin.
  • Figures 2 and 2bis show the variations in latency and peak time, respectively, as a function of the rate of activated FVII in the sample. The results obtained show that it is possible to establish a correlation between the level of activated FVII in the sample and the various parameters deduced from thrombograms obtained for a concentration of FVII + FVIIa of 50 ⁇ M in the plasma / sample mixture.
  • Example 4 Preparation of a standard thrombinogram from a FVII and FIX-free plasma, for a concentration of FVII + FVIIa of 50 ⁇ M The experiment of Example 3 is repeated, but using a reactive plasma lacking in FIX, from the company Diagnostica Stago, which was then depleted of FVII according to the procedure of Examples 1 and 2.
  • FIG. 3 represents the thrombograms obtained in the presence of 50 ⁇ M of FVII + FVIIa in the plasma / sample mixture, said plasma being devoid of FVII and of FIX.
  • a decrease in lag time and thrombin formation time at the peak is observed as a function of the increase in the level of activated FVII in the sample.
  • the peak time reaches a limit that can be estimated at 16 minutes for an activated FVII level of 100%. It is noted that plasma deficient in FVII and FIX without the addition of FVII or FVIIa does not induce thrombin formation.
  • FIGS. 4, 5, and 6 respectively show latency, peak time, and velocity variations as a function of the rate of activated FVII in the sample.
  • the results obtained show that it is possible to establish a correlation between the level of activated FVII and the various parameters deduced from the thrombograms obtained in the presence of 50 ⁇ M of FVII + FVIIa in the plasma / sample mixture, said plasma being devoid of FVII. and FIX.
  • EXAMPLE 5 Preparation of a Standard Thrombinogram from a Plasma Free of FVII and FXI for a FVII + FVIIa Concentration of 50 ⁇ M
  • the experiment of Example 3 is repeated, but using a reactive plasma free of FXI, from the company Diagnostica Stago, which was then spoiled in FVII according to the procedure of Examples 1 and 2.
  • Figure 7 shows the thrombograms obtained in the presence of 50 ⁇ M FVII + FVlla in the plasma / sample mixture, said plasma being devoid of FVII and FXI.
  • a decrease in lag time and thrombin formation time at the peak is observed as a function of the increase in the level of activated FVII in the sample.
  • the peak time reaches a limit that can be estimated at 12 minutes for an activated FVII level of 100%. It is noted that a plasma lacking FVII and FXI without the addition of FVII or FVIIa does not induce thrombin formation.
  • Figures 8, 9, 10, and 11, respectively, show variations in latency, peak time, peak height, and velocity as a function of the rate of activated FVII in the sample.
  • the results obtained show that it is possible to establish a correlation between the level of activated FVII and the various parameters deduced from the thrombograms obtained in the presence of 50 ⁇ M of FVII + FVIIa in the plasma / sample mixture, said plasma being devoid of FVII. and in FXI.
  • Example 6 Preparation of a standard thrombinogram from a FVII and FVIII-deficient plasma, for a concentration of FVII + FVIIa of 10 ⁇ M The experiment of Example 3 is repeated, but using a final concentration FVII + FVIIa of 10 ⁇ M.
  • FIG. 12 represents thrombograms obtained in the presence of 10 ⁇ M of FVII + FVIIa in the plasma / sample mixture, said plasma being devoid of FVII. and in FVIII.
  • a decrease in lag time and thrombin formation time at the peak is observed as a function of the increase in the level of activated FVII in the sample.
  • the peak time reaches a limit that can be estimated at 21 minutes for an activated FVII level of 100%. It is noted that a plasma deficient in FVII and FVIII without the addition of FVII or FVIIa does not induce the formation of thrombin.
  • Figs. 13, 14, 15, and 16 show variations in latency, peak time, peak height, and velocity, respectively, as a function of the rate of activated FVII in the sample.
  • the results obtained show that it is possible to establish a correlation between the level of activated FVII and the various parameters deduced from the thrombograms obtained in the presence of 10 ⁇ M of FVII + FVIIa in the plasma / sample mixture, said plasma being devoid of FVII. and in FVIII.
  • Example 7 Preparation of a Standard Thrombinogram from a Plasma Free of FVII and FVIII, for a Concentration of FVII + FVIIa of 80 ⁇ M
  • FIG. 17 shows the thrombograms obtained in the presence of 80 ⁇ M of FVII + FVIIa in the plasma / sample mixture, said plasma being devoid of FVII and of FVIII.
  • a decrease in thrombin formation time at the peak is observed as a function of the increase in the level of activated FVII in the sample.
  • the peak time reaches a limit that can be estimated at 12 minutes for an activated FVII level of 100%. It is noted that a plasma devoid of FVII and FVIII without the addition of FVII or FVIIa does not induce thrombin formation.
  • Figures 18, and 19 show the variations in latency and peak time respectively as a function of the rate of activated FVII in the sample.
  • Example 8 Measurement of the activated FVII level of a rabbit milk sample containing FVII The test sample has an unknown rate of
  • Activated FVII and its concentration of FVII + FVIIA is 500 ⁇ M.
  • a volume of 8 .mu.l of this sample to be tested was mixed with 72 .mu.l of plasma lacking FVII and FVIII as described above. This gives a test mixture whose volume is 80 .mu.L and whose concentration of FVII + FVIIA is 50 .mu.M.
  • thrombin generation reaction 20 ⁇ l of the initiator components of the thrombin generation reaction (Phospholipids and FT) were added to final concentrations of 5 ⁇ M FT, 1 ⁇ M phospholipids, (Diagnostica Stago reagent 86195 diluted 1/4), and 20 ⁇ l of a thrombin-specific calcium fluorogenic agent (final concentration of 16.7 mM Ca 2+ ) (Fluca kit Diagnostica Stago 86197 reagent)
  • FVII and FVIII as previously described in order to obtain a concentration of FVII + FVIIa of 50 ⁇ M.
  • initiator components of the thrombin generation reaction were added to the sample / plasma mixture to achieve final concentrations of 5 ⁇ M FT and 1 ⁇ M phospholipids (Diagnostica Stago 86195 reagent diluted 1 / 4).
  • 20 .mu.l of a fluorogenic calcium-specific thrombin agent final concentration of 16.7 mM Ca 2+
  • Fluca kit Diagnostica Stago 86197 reagent were added to the previous mixture.
  • Standard thrombogram parameters were measured to plot standard curves for each of the parameters as a function of the -log of the activated FVII level (see Figures 2 and 2bis and Table 1).
  • the values of the parameters obtained from the thrombinogram of the mixture containing the test sample were plotted on the different standard standard curves, which makes it possible to deduce a measurement of the level of activated FVII in the sample to be tested.
  • a latency time of 6 minutes and 30 seconds and a time at the peak of 18 minutes are obtained, by plotting these values on the different standard curves, a measurement of the level of activated FVII in the sample to be tested equal to 20 is deduced. %.
  • Example 9 Influence of Rabbit Milk on the Thrombin Generation Test
  • the experiment of Example 3 is repeated, but by prediluting the standard sample containing a known level of activated FVII in Owren-Koller buffer containing 1% human serum albumin (Tp OK - 1% HSA) or in Tp OK - 1% SAH containing rabbit milk.
  • Figure 20 shows standard thrombograms obtained in the presence of 50 ⁇ M of final FVII + FVIIa in the plasma / sample mixture and for 0% and 100% activated FVII levels.
  • a perfect superposition of the thrombograms of the prediluted sample in OK-1% SAH Tp and prediluted sample in OK-1% SAH Tp containing rabbit milk is observed, which allows to deduce that rabbit milk has no influence on TGT. It is noted that a plasma deficient in FVII and FVIII without addition of FVII or FVIIa does not generate thrombin formation.
  • Figures 21, 22 and 23 show thrombograms, latency and peak time variations, respectively, as a function of activated FVII level in the prediluted Tp OK-1% SAH sample containing rabbit milk for known fixed activated FVII level between 0% and 100%.
  • Latency 11 8, 83 7, 50 6, 50 5, 33 4, 83 4, 50 4, 17 (min) 50

Abstract

La présente invention concerne un Procédé de mesure du taux de facteur VII activé dans un échantillon à tester, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon-test avec un plasma dépourvu en facteur VII (FVII) et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI), le mélange échantillon-test + plasma ayant une concentration finale en FVII +FVIIa allant de 10 pM à 80 pM; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine; c) obtenir un thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine (TGT) sur le mélange de l' étape b); d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme de l'étape c) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'échantillons- standards dont le taux de Facteur VII activé est connu et varie entre chaque échantillon- standard; e) déduire de l'étape d) une mesure du taux de Facteur VII activé dans l' échantillon-test.

Description

Procédé de mesure du taux de Facteur VII activé dans un échantillon.
DOMAINE TECHNIQUE La présente invention se rapporte à un procédé de mesure du taux de facteur VII activé (FVIIa) dans un échantillon en utilisant un plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le facteur
VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI) .
ART ANTERIEUR
La coagulation sanguine est un mécanisme qui permet aux organismes de contrôler les effusions de sang lors de lésions vasculaires et ainsi d'éviter les hémorragies .
La coagulation sanguine se déroule selon des étapes en cascade impliquant différentes proenzymes et procofacteurs présents dans le sang qui sont convertis, par l'intermédiaire d'enzymes protéolytiques, en leur forme activée. Dans cette succession d'étapes (ou cascade) de la coagulation on distingue deux voies, appelées voie extrinsèque de la coagulation et voie intrinsèque de la coagulation. Toutes deux conduisent à la formation du complexe, appelé prothrombinase, constitué de facteur X activé (FXa) , de facteur V activé (FVa), de phospholipides et de calcium. C'est la prothrombinase qui active la prothrombine en thrombine permettant la transformation du fibrinogène soluble en fibrine insoluble qui forme le caillot.
La voie extrinsèque implique l'intervention du FVII présent dans le plasma. Toutefois, ce dernier doit être préalablement activé en FVIIa pour initier la cascade de la coagulation. Le FVIIa seul (non complexé au facteur tissulaire) présente une faible activité protéolytique. Cette activité est potentialisée lorsque le FVIIa est complexé au facteur tissulaire (FT) , protéine associée à des phospholipides, qui est libérée lors de la lésion vasculaire. Le complexe FVIIa-FT transforme le facteur X en facteur Xa en présence d'ions calcium. Le complexe FVIIa-FT transforme aussi le FIX en FIXa.
Les facteurs IXa et Xa, en retour, activent le FVII en FVIIa. Le facteur Xa complexé au facteur Va et aux phospholipides (prothrombinase) transforme la prothrombine en thrombine. La thrombine agit sur le fibrinogène en le transformant en fibrine et présente également d'autres activités parmi lesquelles l'activation du facteur V en Facteur Va et du FVIII en FVIIIa. La thrombine active également en présence de calcium le facteur XIII en facteur XIIIa qui permet la consolidation du caillot de fibrine.
Alors que dans la voie extrinsèque de la coagulation le FIX est activé en FIXa par le complexe FVIIa/FT, dans la voie intrinsèque de la coagulation, le FIXa est généré à partir du FIX par le FXIa lui même activé par le facteur XII activé par le contact du sang avec une surface électronégative telle que le sous-endothélium.
Le FVIIa, une glycoprotéine dépendante de la vitamine K, joue donc un rôle important dans les mécanismes de la coagulation, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Le FVIIa présente l'intérêt de pouvoir agir localement en présence du facteur tissulaire libéré après lésion de tissus engendrant des hémorragies, même en l'absence de Facteur VIII ou IX. C'est pourquoi le FVIIa est utilisé depuis de nombreuses années pour corriger certains troubles de la coagulation se manifestant par des saignements. La première approche fut d'obtenir le FVIIa à partir du plasma. Mais la production de FVIIa à partir du plasma est limitée par la disponibilité de la source d'approvisionnement et cette utilisation de plasma présente des risques de transmission d'agents pathogènes, comme par exemple le prion et les virus. Ces problèmes ont été résolus par Novo Nordisk Pharmaceuticals avec le développement d'un FVIIa recombinant (rFVIIa) qui est une glycoprotéine structurellement similaire au FVIIa plasmatique.
La principale indication thérapeutique pour le rFVIIa (aux USA, EU et Japon) concerne le traitement du saignement spontané ou chirurgical des hémophiles A ayant développé des anticorps anti-facteur VIII et des hémophiles B ayant développé des anticorps anti-facteur IX. En Europe, il est aussi indiqué pour son utilisation chez des patients avec une déficience congénitale en FVII et chez les patients atteints de la thrombasthénie de Glanzmann. En outre, de nombreuses publications rapportent l'efficacité du rFVIIa dans le contrôle de l'hémorragie lors d'interventions chirurgicales, chez des patients qui n'ont ni déficit congénital en facteur de la coagulation ni de thrombasthénie.
Cette utilisation de plus en plus large du FVIIa a conduit à mettre au point des méthodes pour
(1) mesurer l'activité du FVIIa
(2) déterminer la concentration en FVIIa (3) mesurer le taux de FVII activé.
Les méthodes les plus connues pour détecter l'activité du FVIIa sont la mesure du temps de coagulation, le PTT (Partial Thromboplastin Time -
Temps Partiel de Thromboplastine) , l'aPTT (activated partial thromboplastin time - Temps partiel de
Thromboplastine activé) , le TEG ( thromboélastographe) et le TGT (test de génération de thrombine) . Ces méthodes permettent de détecter l'activité du FVIIa mais ne permettent pas jusqu'à présent de mesurer directement le taux de FVII activé dans un échantillon.
Un kit commercial de dosage immunologique du FVIIa est disponible (IMUBIND Factor VII ELISA kit) mais les conditions expérimentales pour la mise en œuvre de cette technique sont difficilement maîtrisables. En effet ce kit est complexe à mettre en œuvre et se caractérise par une plage dynamique extrêmement faible, une gamme linéaire de détection extrêmement limitée et surtout nécessite de travailler à une température de +4°C.
D'autres méthodes de mesure de la concentration de FVIIa sont décrites dans la littérature, comme la mesure de son activité protéolytique avec l'utilisation de FT recombinant tronqué (Staclot VIla-rTF, Stago) (US
5,472,850, US 5,741,658, WO 1992/018870, US 5,750,358,
US 5,741,658, US 5,472,850, EP 0 641 443) ou la mesure de la concentration d'un complexe FVIIa-antithrombine
(WO 03/004694) . Cependant ces méthodes sont peu précises et difficiles à mettre en œuvre. En effet ces méthodes ne permettent de traiter que quelques échantillons en même temps et pour des faibles concentrations en FVIIa le caillot formé n'est pas suffisant mettre en œuvre correctement le procédé.
Par aileurs, les méthodes de dosage fluorogénique ou chromogénique du FXa généré par le FVIIa se sont également révélées inappropriées pour mesurer la concentration de FVIIa car elles ne permettent pas de différencier l'effet du FVII de celui du FVIIa.
Parmi les méthodes employées par certains biologistes pour évaluer l'efficacité d'un traitement avec le FVIIa, la thromboélastographie est quelquefois utilisée. Cette méthode consiste à mesurer les propriétés physiques d'un sang total en analysant de manière mécanique la formation du caillot en fonction du temps. Selon les paramètres extraits d'un graphique (appelé thromboélastogramme®) généré par le thromboélastographe, le clinicien peut évaluer l'aptitude à la coagulation d'un patient. Bien que précise, cette méthode est fastidieuse, peu adaptée à une analyse routinière et répétitive, et difficilement applicable à un multiéchantillonnage car elle nécessite d'être effectuée dans l'heure qui suit le prélèvement sanguin. De plus, cette méthode ne permet pas de mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon.
La méthode la plus connue pour mesurer le taux de FVII activé consiste à mesurer de manière indépendante la concentration en FVII+FVIIa et la concentration en FVIIa afin d'en déduire le taux de FVII activé (rapport concentration en FVIIa/concentration en FVII+FVIIa) . Malgré le fait que la mesure de la concentration en FVII+FVIIa soit précise, les mesures directes de la concentration en FVIIa demeurent imprécises et difficiles à mettre en œuvre.
Il existe donc un réel besoin de disposer d'un procédé efficace et facile à mettre en œuvre pour mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon, en particulier lorsque l'échantillon contient un mélange de Facteur VII non-activé et de Facteur VII activé.
RESUME DE L' INVENTION
La Demanderesse a trouvé de manière surprenante que la mise en oeuvre d'un plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI permet de mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon de manière fiable, reproductible et facile à mettre en œuvre, en particulier lorsque l'échantillon contient du facteur VII non-activé et du facteur VII activé.
Les conditions expérimentales mises en œuvre dans le procédé de l'invention permettent ainsi d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé dans un échantillon et certains paramètres caractéristiques d'un test de génération de thrombine (TGT) et du thrombinogramme qui en résulte.
Une telle corrélation permet de déterminer le taux de FVII activé dans un échantillon à tester, en comparant les paramètres du thrombinogramme dudit échantillon avec ceux de thrombinogrammes « standards » obtenus à partir de compositions comprenant des taux connus de FVII activé. La présente invention concerne donc un procédé de mesure du taux de facteur VII activé dans un échantillon-test, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon-test avec un plasma dépourvu en facteur VII (FVII) et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII) , le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI), le mélange échantillon-test + plasma ayant une concentration finale en FVIl+FVlla allant de 10 pM à 80 pM ,- b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine ; c) obtenir un thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine (TGT) sur le mélange de l'étape b) ; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme de l'étape c) à un paramètre homologue de thrombinogrammes standards établis sur la base d'échantillons-standards dont le taux de Facteur VII activé est connu et varie entre chaque échantillon-standard ; e) déduire de l'étape d) une mesure du taux de Facteur VII activé dans l' échantillon-test.
Le procédé de la présente invention comprend éventuellement une étape f) additionnelle consistant à calculer la concentration du facteur VII activé dans ledit échantillon-test à partir du taux déterminé à 1' étape e) .
De préférence, les thrombinogrammes standards sont obtenus en effectuant un test de génération de thrombine sur un mélange contenant (i) un échantillon- standard dont le taux de facteur VII activé est connu, (ii) un plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI, la concentration finale du mélange échantillon- standard + plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, FIX et le FXI étant sensiblement identique à celle du mélange échantillon-test + plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII ,FIX et FXI, et (iii) des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine.
Avantageusement, le paramètre de thrombinogramme comparé est choisi parmi le temps de latence, le temps au pic et la vélocité lorsque ledit plasma est dépourvu en FVII et en FIX, ou dépourvu en FVII et en FXI ; et parmi le temps de latence et le temps au pic lorsque ledit plasma est dépourvu en FVII et en FVIII.
Préférentiellement , les mélanges échantillon-test + plasma et échantillon-standard + plasma sont réalisés en utilisant un même plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI.
Avantageusement, les composants initiateurs de la génération de thrombine comprennent un Facteur tissulaire (FT) , des phospholipides, et du Ca2+, la concentration finale en ledit facteur tissulaire dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 1 à 10 pM, la concentration finale en lesdits phospholipides dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 0,1 à 5 μM et la concentration finale en Ca2+ dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 14 à 18 mM.
Avantageusement, le facteur FVII activé dont le taux est mesuré est d'origine plasmatique (pFVIIa) , d'origine recombinante (rFVIIa) ou d'origine transgénique (TgFVIIa) .
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'échantillon-test est un échantillon de lait de mammifère transgénique ou un milieu de culture cellulaire sans sérum.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI pour mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon- test.
DESCRIPTION DETAILEE DE L' INVENTION
Dans le cadre de la présente invention, par « Facteur VII », ou « FVII », on entend le Facteur VII non-activé correspondant à la proenzyme monocaténaire qui ne peut pas déclencher la coagulation.
Par « Facteur VII activé » ou « FVII activé », ou FVIIa on entend la protéine bicaténaire (enzyme) , comprenant une chaîne lourde et une chaîne légère reliées entre elles par un pont disulfure, résultant du clivage du FVII (proenzyme) , et qui se montre capable de déclencher la coagulation sanguine. Par « FVII+FVIIa », on entend la somme des concentrations ou la somme des quantités de FVII et de FVIIa présents dans un échantillon d'intérêt. La somme des quantités ou des concentrations de FVII et de FVIIa peut être mesurée, par exemple, par dosage immunologique en utilisant des kits disponibles commercialement tels que ASSERACHROM® VII:Ag de Diagnostica Stago (Référence 00241).
Par « taux de Facteur VII activé » ou « taux de FVIIa », on entend le rapport entre la quantité ou la concentration de Facteur VII activé (FVIIa) dans un échantillon d'intérêt, et la somme des quantités ou des concentrations, respectivement, du Facteur VII et du Facteur VII activé (FVII+FVIIa) dans ce même échantillon d'intérêt. Le taux de FVII activé sera égal à 1 (c'est-à-dire 100%) pour un échantillon contenant uniquement du FVIIa mais ne contenant pas de FVII, ce taux sera égal à 0,5 (c'est-à-dire 50%) pour un échantillon contenant autant de FVIIa que de FVII, et il sera égal à 0 (c'est-à-dire de 0%) pour un échantillon contenant uniquement du FVII (ne contenant pas de FVIIa) .
Par « échantillon-test », on entend un échantillon contenant du FVII, du FVII activé ou un mélange de ceux-ci, mais dont le taux de FVII activé n'est pas connu. Avantageusement, l'échantillon-test est purifié à partir de sang ou de plasma ou provient d'un liquide corporel, purifié ou non, tel que, par exemple, le lait d'un mammifère, un milieu de culture ou un homogénat cellulaire. Dans un mode de réalisation particulier, l'échantillon- test est un échantillon de lait de mammifère, en particulier un échantillon de lait de mammifère transgénique produisant du FVII et/ou du FVIIa dans son lait.
Dans un autre mode de réalisation, l'échantillon-test est un milieu de culture cellulaire sans sérum.
Selon un mode de réalisation de l'invention, l'échantillon à tester est un échantillon thérapeutique ou non contenant du FVIIa plasmatique (pFVIIa) , recombinant (rFVIIa) ou transgénique (TgFVIIa) , et du FVII, ou un mélange de ceux-ci sous forme liquide ou lyophilisée.
Par « échantillon-standard », on entend un échantillon dont le taux de FVII activé est connu et/ou choisi, en incorporant, par exemple, des quantités ou des concentrations appropriées de standard international de FVII (Blood Coagulation Factor VII Concentrate Human, NIBSC référence 97/592) ou de standard international de FVII activé (Blood Coagulation Factor VIIa Concentrate Human, NIBSC référence 89/688), ou d'un mélange de ceux-ci, dans une solution d'intérêt, pour obtenir un taux souhaité de FVII activé. L'échantillon standard peut également être obtenu à partir de sang ou de plasma, ou provient d'un liquide corporel, purifié ou non, tel que, par exemple, le lait, ou un milieu de culture ou un homogénat cellulaire. Le plasma, tel qu'utilisé dans le cadre de la présente invention, est d'origine animale, de préférence mammifère et préférentiellement humaine.
Au sens de la présente invention, les expressions « dépiété en » ou « dépourvu en » revêtent la même signification et peuvent être utilisées en tant qu'alternatives pour désigner un appauvrissement d'une solution d'intérêt (par exemple un plasma) en un composé (par exemple un facteur de coagulation sanguine), jusqu'à rendre indétectable la présence ce dernier.
L'expression « plasma dépourvu en FVII et en au moins un facteur choisi parmi le FVIII, le FIX ou le FXI » signifie donc que la concentration respective de chacun de ces facteurs FVII, FVIII, FIX ou FXI dans le plasma considéré est inférieure à leur seuil de détection lorsque leur concentration est mesurée par les méthodes de dosage connues de l'homme du métier. A titre d'exemples de méthodes de dosage, on peut citer celles qui utilisent des kits ou réactifs commerciaux (par exemple, ASSERACHROM® VII: Ag de Diagnostica Stago
(Référence 00241) ou Factor VII ELISA Set de KORDIA (Référence FVII-EIA) .
De préférence, le seuil de détection du FVII dans le plasma est d'environ 1 mUI/ml (0,5 ng/ml), concentration en dessous de laquelle le FVII ne peut être détecté.
De préférence, le seuil de détection du FVIII dans le plasma est d'environ 10 mUI/ml (1 ng/ml), concentration en dessous de laquelle le FVIII ne peut être détecté. De préférence, le seuil de détection du FIX dans le plasma est d'environ 0,2 mUI/ml (1 ng/ml) , concentration en dessous de laquelle le FIX ne peut être détecté. De préférence, le seuil de détection du FXI dans le plasma est d'environ 0,5 mUI/ml (2,5 ng/ml), concentration en dessous de laquelle le FXI ne peut être détecté.
Les techniques de déplétion du plasma en un facteur d' intérêt comprennent toutes les techniques connues de l'homme du métier. A titre d'exemple de techniques de déplétion, on peut notamment citer l' immunodéplétion, la déplétion chimique, ainsi que la combinaison de celles-ci.
L' immunodéplétion consiste à utiliser des anticorps spécifiquement dirigés contre un antigène contenu dans une solution dans le but d'appauvrir substantiellement ladite solution en l'antigène considéré. Les anticorps utilisés pour réaliser une immunodéplétion peuvent être polyclonaux et/ou monoclonaux issus d'un seul ou de différents clones cellulaires. Les anticorps utilisés peuvent être dirigés directement contre l'antigène que l'on souhaite éliminer ou contre une protéine qui se lie à cet antigène.
Un plasma dépiété en FVII, FIX ou FXI pourra ainsi être obtenu en utilisant respectivement des anticorps anti- FVII, anti-FIX ou anti-FXI.
Un plasma dépourvu en FVIII pourra être obtenu en utilisant des anticorps anti-FVHI ou des anticorps dirigés contre le facteur von Willebrand, une protéine plasmatique qui transporte le FVIII dans le sang.
Un plasma dépiété en FVIII pourra également être obtenu par déplétion chimique, en utilisant de l'EDTA (acide éthylène-diamine-tétraacétique) dans la mesure où le FVIII est un facteur dépendant du Ca2+. L'EDTA est ensuite éliminé par des méthodes bien connues de l'homme de l'art, par exemple par dialyse.
Avantageusement, le plasma utilisé pour mettre en œuvre la présente invention est un plasma dépourvu en facteur VII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI.
Avantageusement, le plasma utilisé pour mettre en œuvre la présente invention est préparé à partir d'un plasma d'hémophile de type A, naturellement dépourvu en FVIII, à partir d'un plasma d'hémophile de type B, naturellement dépourvu en FIX, ou à partir d'un plasma provenant de patients présentant un déficit complet en facteur XI, lesdits plasmas naturellement dépourvus en FVIII, FIX ou FXI sont ensuite dépiétés en FVII, par une méthode immunologique ou chimique telle que celles décrite plus haut.
Dans un autre mode de mise en œuvre de l'invention, le plasma utilisé est préparé à partir d'un plasma normal qui est, dans un premier temps, dépiété en FVII puis, dans un second temps, dépiété en FVIII et/ou en FIX et/ou en FXI.
Au sens de la présente invention, par « composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine » ou « composants initiateurs », on entend les composants indispensables permettant de débuter la génération de thrombine à partir de la prothrombine.
Les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine comprennent essentiellement une source d'ion calcium (Ca2+), un agent phospholipidique et du facteur tissulaire (FT) , dans des concentrations suffisantes pour déclencher la réaction de génération de thrombine.
Une source d' ions calciums appropriée dans le cadre de la présente invention correspond à toute source d' ions calcium biologiquement compatible, telle que le CaCl2. La source de Ca2+ peut être ajoutée au mélange échantillon/plasma extemporanément avec les autres composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine ou de manière différée, c'est à dire après l'ajout des autres composants initiateurs de la réaction de génération de la thrombine.
Au sens de la présente invention, par concentration suffisante en ions calcium, il est entendu une concentration finale en ions calcium dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs comprise dans la gamme allant de 14 à 18 mM, et en particulier égale à 16,7 mM.
Des agents phospholipidiques appropriés pour être utilisés dans la présente invention peuvent se présenter sous la forme de concentré ou de lyophilisât et consistent, de préférence, en un mélange comprenant une quantité majoritaire de phosphatidylcholine et de phosphatidylsérine ou contenant exclusivement de la phosphatidylcholine et de la phosphatidylsérine.
Au sens de la présente invention, par concentration suffisante en agents phospholipidiques , il est entendu une concentration finale en agents phospholipidiques dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs comprise dans la gamme allant de 0,1 à 5 μM, en particulier de 0,5 à 2 μM, et plus particulièrement égale à 1 μM.
Un facteur tissulaire (FT) approprié pour être utilisé dans la présente invention peut être choisi dans le groupe constitué par tout facteur tissulaire natif, plasmatique, recombinant ou transgénique, tout Facteur tissulaire modifié, y compris tout Facteur tissulaire tronqué ayant perdu sa fonction d' activation du facteur VII en facteur VIIa, à condition que ledit Facteur tissulaire modifié ait conservé, même partiellement, sa capacité à agir en tant que cofacteur de l'activité enzymatique du facteur VIIa. Un facteur tissulaire modifié approprié peut, par exemple, être délété de son domaine transmembranaire tel que le facteur tissulaire du kit STACLOT de Diagnostica Stago (Référence 00281) disponible dans le commerce.
Au sens de la présente invention, par concentration suffisante en Facteur tissulaire, il est entendu une concentration finale en Facteur tissulaire dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs comprise dans la gamme allant de 1 à 10 pM, en particulier de 4 à 6 pM, et plus particulièrement égale à 5 pM. Dans le cadre de l'invention, l'échantillon test, l'échantillon standard, le plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, FIX ou FXI, et/ou les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine peuvent se présenter sous forme liquide ou lyophilisée. Lorsqu'ils se présentent sous forme lyophilisée, ces composés peuvent avantageusement être remis en suspension, préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention, dans un solvant aqueux approprié, tel que l'eau purifiée pour injection (PPI) .
La Demanderesse a donc mis au point un procédé de mesure du taux de facteur VII activé dans un échantillon-test reposant sur des conditions expérimentales spécifiques qui permettent de s'affranchir des désavantages résultant de la présence de FVII non activé dans l'échantillon-test.
La première étape de ce procédé consiste à mélanger un échantillon-test contenant un taux inconnu de FVII activé avec un plasma dépourvu en FVII et dépourvu en FVIII, et/ou en FIX et/ou en FXI, de sorte que la concentration finale en FVII+FVIIa dans le mélange résultant soit comprise dans la gamme allant de 10 pM à 80 pM. C'est cette combinaison spécifique des propriétés liées à la nature du plasma et à la gamme de concentration utilisées qui permet de mettre en œuvre le procédé de mesure du taux de FVII activé selon l'invention.
Des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine sont ensuite ajoutés au mélange échantillon-test + plasma dans le but de déclencher la réaction de clivage qui conduit à la génération de thrombine à partir de la prothrombine contenue dans le plasma. Un test de génération de la thrombine est alors réalisé.
Le test de la génération de thrombine (TGT) est un test connu de l'homme du métier (Thrombin génération assays : accruing clinical relevance, H. C Hemker, R. Al Dieri & S. Béguin, Curr. Opin. Hematol . , 2004, 11, 170-5) qui permet de mesurer, de manière continue, la quantité de thrombine générée et le temps nécessaire pour générer cette thrombine lorsqu'un échantillon d'intérêt est mis en contact avec des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine.
Le test de génération de thrombine débute lorsque l'échantillon d'intérêt (ou une solution comprenant ce dernier) est mis en contact avec des composants initiateurs de la réaction. Ce temps initial correspondant au début du test de génération de thrombine est appelé t0.
La thrombine générée est ensuite révélée par l'utilisation d'un agent de révélation, de préférence par l'utilisation d'un agent fluorogénique, dont la dégradation par la thrombine provoque l'apparition d'un composé fluorescent, ou par l'utilisation d'un agent chromogénique . Avantageusement, l'agent fluorogénique ou l'agent chromogénique sont ajoutés au mélange échantillon + plasma en même temps que les composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine.
La fluorescence résultant de la dégradation de l'agent fluorogénique par la thrombine nouvellement générée est détectée par un dispositif de mesure tel qu'un fluorimètre. De préférence, le fluorimètre utilisé est pourvu de moyens d'enregistrement ou de moyens de traçage de la variation de fluorescence au cours du temps. Les données recueillies par le fluorimètre permettent d' établir la courbe de variation de la fluorescence au cours du temps , appelée thrombinogramme .
Quatre paramètres dérivés peuvent être mesurés à partir d' un thrombinogramme : la hauteur de pic, exprimée en nM de thrombine, correspond à la concentration maximale de thrombine générée à un instant tmax au cours de la réaction ; le temps de latence, exprimé en minutes, correspond au temps qui s'écoule entre le début du Test de
Génération de la thrombine (to) et l'apparition de la thrombine ; le temps au pic, exprimé en minutes, correspond au temps qui s'écoule entre le début du TGT (to) et le temps tmax correspondant au maximum de thrombine générée ; la vélocité, exprimée en nM de thrombine formée/min, correspond à la hauteur de pic divisée par la différence entre le temps au pic tmax et le temps de latence.
Avantageusement, ces paramètres sont directement fournis par le dispositif utilisé pour mesurer la formation de la thrombine.
Plus le taux de FVIIa dans l'échantillon d'intérêt est important, plus la thrombine est générée rapidement, plus le temps au pic est faible et plus la vélocité est élevée. Afin de déterminer le taux de l'échantillon-test en FVII activé, des thrombinogrammes standards sont obtenus à partir d'échantillons-standards contenant un taux connu de FVII activé. Comme décrit ci-dessus pour l'échantillon-test, au' moins deux échantillons- standards contenant des taux différents de FVII activé sont mélangés à un plasma dépourvu en FVII et en au moins un facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI. Des composants initiateurs de la réaction de génération de la thrombine sont ensuite ajoutés au mélange échantillon-standard + plasma pour débuter le Test de Génération de la Thrombine et pour obtenir les thrombinogrammes standards correspondant à chaque échantillon-standard.
La concentration en FVII+FVIIa du mélange échantillon- standard + plasma est comprise entre 10 pM et 80 pM. De préférence, la concentration en FVII+FVIIa du mélange échantillon-standard + plasma est sensiblement identique à la concentration en FVII+FVIIa du mélange échantillon-test + plasma. Avantageusement, le plasma mélangé aux échantillons-standards est identique à celui qui a été mélangé à l' échantilon-test .
A partir des thrombinogrammes standards obtenus, une interpolation est réalisée entre le taux de FVII activé contenu dans chaque échantillon-standard et l'un des paramètres dérivé d'un thrombinogramme .
L' interpolation réalisée peut être de typé linéaire, géométrique, cubique, polynomiale, lagrangienne ou newtonienne . Avantageusement, l'interpolation réalisée correspond à la variation du temps de latence en fonction du taux de FVII activé dans les échantillons-standards , à la variation du temps au pic en fonction du taux de FVII activé dans les échantillons-standards ou à la variation de la vélocité en fonction du taux de FVII activé dans les échantillons-standards.
Le taux de FVII activé contenu dans l' échantillon-test est déterminé en reportant au moins l'un des paramètres dérivés du thrombinogramme de cet échantillon-test sur une interpolation correspondante réalisée à partir des thrombinogrammes standards. Si le paramètre reporté est le temps de latence, l'interpolation utilisée correspondra à la variation du temps de latence en fonction du taux de facteur VII activé dans les échantillons standards. Si le paramètre reporté est le temps au pic, l'interpolation utilisée correspondra à la variation du temps au pic en fonction du taux de facteur VII activé dans les échantillons standards. Enfin, si le paramètre reporté est la vélocité, l'interpolation utilisée correspondra à la variation de la vélocité en fonction du taux de facteur VII activé dans les échantillons standards.
Le taux de facteur VII déterminé à partir de l'interpolation correspond donc au taux de facteur VII activé de l'échantillon-test.
Le procédé de l'invention peut comprendre une étape additionnelle consistant à calculer la concentration du facteur VII activé dans l'échantillon-test à partir du taux de facteur VII activé déterminé à partir de l'interpolation. Dans ce cas particulier, la concentration de facteur VII activé répond à la formule suivante :
Concentration de FVIIa = Taux de FVIIa x Concentration en FVII+FVIla
Les exemples ci-dessous illustrent l'invention sans en limiter la portée.
FIGURES : Figure 1 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIla de 50 pM dans le mélange échantillon- standard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, et pour des taux de FVII activé allant de 0 à 100% (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 μM
Phospholipides )
Figures 2 et 2bis : Variations du temps de latence et du temps au pic, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration finale en FVII+FVIla de 50 pM
(avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 μM
Phospholipides) .
Figure 3 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIla de 50 pM dans le mélange échantillon- standard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FIX (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 μM Phospholipides) . Figures 4, 5, et 6 : Variations du temps de latence, du temps au pic et de la vélocité, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon- standard, avec un plasma dépourvu en FVII et en FIX, pour une concentration finale en FVII+FVIla de 50 pM (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 μM Phospholipides) .
Figure 7 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIIa de 50 pM dans le mélange échantillon- standard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FXI (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 μM Phospholipides) . Figures 8, 9, 10 et 11 : Variations du temps de latence, du temps au pic, de la hauteur du pic, et de la vélocité, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l' échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVIII et en FXI, pour une concentration finale en FVII+FVIIa de 50 pM (avec 5 " pM Facteur Tissulaire et 1 μM Phospholipides).
Figure 12 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIIa de 10 pM dans le mélange échantillon- standard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 μM
Phospholipides) .
Figures 13, 14, 15 et 16 : Variations du temps de latence, du temps au pic, de la hauteur du pic, et de la vélocité, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration finale en FVII+FVIIa de 10 pM (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 μM Phospholipides) .
Figure 17 : Thrombinogrammes standards obtenus en présence d'une concentration finale en FVII+FVIIa de 80 pM dans le mélange échantillon- standard/plasma, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII (avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 μM Phospholipides) . Figures 18, et 19 : Variations du temps de latence et du temps au pic, respectivement, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon-standard, avec un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration finale en FVII+FVIIa de 80 pM
(avec 5 pM Facteur Tissulaire et 1 uM Phospholipides) .
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation d'un plasma dépourvu en FVII
Des anticorps polyclonaux fabriqués dans le lapin dirigés contre le FVII plasmatique humain purifié ont été couplés à de la Sépharose activée au CNBr (Pharmacia) , puis 2 mL du gel obtenu ont été placés dans une colonne. La colonne a été équilibrée avec 25 mL de tampon d'équilibrage (NaCl 0,15 M, citrate 10 mM, pH 7,4). Ensuite, 6 mL de plasma humain ont été passés plusieurs fois sur la colonne. Dans ces conditions, le FVII est resté fixé sur la colonne et l'éluat a été récupéré (plasma dépourvu en FVII) . La colonne a été régénérée en éluant le FVII fixé avec 20 mL de tampon de régénération (NaCl 50 mM; glycine 0,1 M pH 2,4) puis la colonne a été rééquilibrée avec 20 mL de tampon d'équilibrage (citrate 10 mM; NaCl 0,15 M pH 7,4).
Exemple 2: Préparation d'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, en FIX ou en FXI
Des anticorps polyclonaux fabriqués dans le lapin dirigés contre le FVII plasmatique humain purifié ont été couplés à de la Sépharose activée au CNBr (Pharmacia) puis 2 mL du gel obtenu ont été placés dans une colonne. La colonne a été équilibrée avec 25 mL de tampon d'équilibrage (NaCl 0,15 M, citrate 10 mM, pH 7,4). Ensuite, 6 mL de plasma commercial déjà dépiété en FVIII, en FIX ou en FXI, chacun provenant de la
Société Diagnostica Stago, ont été passés plusieurs fois sur la colonne. Dans ces conditions, le FVII est resté fixé sur la colonne et l'éluat a été récupéré
(plasma doublement dépourvu en FVII et en FVIII, en FIX ou en FXI) . La colonne a été régénérée en éluant le
FVII fixé avec 20 mL de tampon de régénération (NaCl 50 mM; glycine 0,1 M pH 2,4) puis la colonne a été rééquilibrée avec 20 mL de tampon d'équilibrage
(citrate 10 mM; NaCl 0,15 M pH 7,4).
Exemple 3 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration de FVII+FVIIa de 50 pM
On prélève le volume adéquat d'un échantillon de standard international de FVII (SI-FVII) fourni par le NIBSC et/ou de standard international de FVIIa (SI- FVIIa) fourni également par le NIBSC afin d'obtenir un échantillon standard contenant un taux de FVII activé connu, que l'on ajoute à 80 μL de plasma dépourvu en FVII et en FVIII, (plasma dépourvu en FVIII provenant de la Société Diagnostica Stago ou étant un plasma d'hémophiles de type A, qui a été ensuite dépiété en FVII comme dans l'Exemple 2), afin d'obtenir un mélange qui contient un taux de FVII activé fixé connu compris entre 0% et 100% pour une concentration de FVII+FVIIa comprise entre 10 pM et 80 pM. 20 μL de facteurs initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Ca2+, phospholipides et FT) sont ajoutés au mélange comprenant le plasma et l'échantillon, à des concentrations finales de 5 pM en FT, 1 μM en phospholipides, (réactif Diagnostica Stago 86195 dilué au 1/4) et 16,7 mM en Ca2+, et de 20 μL d'agent fluorogénique spécifique de la thrombine (réactif Fluca kit Diagnostica Stago 86197) .
Les courbes de TGT standards (thrombinogrammes standards) ont été établies pour des taux fixes et connus de FVII activé compris entre 0% et 100%, de manière à obtenir des thrombinogrammes standards fournissant les divers paramètres (temps de latence, hauteur de pic, temps au pic et vélocité) . Les thrombinogrammes sont établis à l'aide d'un dispositif fluorimétrique de mesure du temps de formation de la thrombine (Fluoroskan - Thermo Electron) muni d'un logiciel pour établir les thrombinogrammes (Société Thrombinoscope BV), pour une longueur d'onde d'excitation de 390 nm et une longueur d'onde d'émission de 460 nm.
La figure 1 représente les thrombinogrammes standards obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa final dans le mélange plasma/échantillon et pour des taux de FVII activé variables allant de 0 à 100%. Il est observé une diminution du temps de latence et du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 14 minutes pour un taux de facteur activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII sans ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine.
Les figures 2 et 2bis représentent respectivement les variations du temps de latence et du temps au pic, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon. Les résultats obtenus montrent qu' il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé dans l'échantillon et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus pour une concentration de FVII+FVIIa de 50 pM dans le mélange plasma/échantillon. Exemple 4 : Préparation d' un thrombinogramme standard à partir d' un plasma dépourvu en FVII et en FIX, pour une concentration de FVII+FVIIa de 50 pM L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en utilisant un plasma réactif dépourvu en FIX, provenant de la Société Diagnostica Stago, qui a ensuite été dépiété de FVII selon la procédure des Exemples 1 et 2.
La figure 3 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et de FIX. Il est observé une diminution du temps de latence et du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 16 minutes pour un taux de FVII activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FIX sans l'ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine.
Les figures 4, 5, et 6 représentent respectivement les variations du temps de latence, du temps au pic et de la vélocité, en fonction du taux de FVII activé dans 1' échantillon. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu de FVII et de FIX.
Exemple 5 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FXI, pour une concentration de FVII+FVIIa de 50 pM L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en utilisant un plasma réactif dépourvu en FXI, provenant de la Société Diagnostica Stago, qui a ensuite été dépiété en FVII selon la procédure des Exemples 1 et 2. La figure 7 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVlla dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et de FXI. Il est observé une diminution du temps de latence et du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 12 minutes pour un taux de FVII activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FXI sans ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine.
Les figures 8, 9, 10 et 11 représentent respectivement les variations du temps de latence, du temps au pic, de la hauteur du pic, et de la vélocité en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et en FXI.
Exemple 6 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration de FVII+FVIIa de 10 pM L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en utilisant une concentration finale FVII+FVIIa de 10 pM.
La figure 12 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 10 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et en FVIII. Il est observé une diminution du temps de latence et du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 21 minutes pour un taux de FVII activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII sans ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine.
Les figures 13, 14, 15 et 16 représentent respectivement les variations du temps de latence, du temps au pic, de la hauteur du pic, et de la vélocité en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon. Les résultats obtenus montrent qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus en présence de 10 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et en FVIII.
Exemple -7 : Préparation d'un thrombinogramme standard à partir d'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII, pour une concentration de FVII+FVIIa de 80 pM
L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en utilisant une concentration finale FVII+FVIIa de 80 pM. La figure 17 représente les thrombinogrammes obtenus en présence de 80 pM de FVII+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et de FVIII. Il est observé une diminution du temps de formation de la thrombine au pic en fonction de l'augmentation du taux de FVII activé dans l'échantillon. Le temps au pic atteint une limite que l'on peut estimer à 12 minutes pour un taux de FVII activé de 100%. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII sans ajout de FVII ou de FVIIa n'induit pas la formation de thrombine.
Les figures 18, et 19 représentent respectivement les variations du temps de latence et du temps au pic en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon.
Les résultats obtenus montrent qu' il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes obtenus en présence de 80 pM de FVIl+FVIIa dans le mélange plasma/échantillon, ledit plasma étant dépourvu en FVII et en FVIII.
Exemple 8 : Mesure du taux de FVII activé d'un échantillon de lait de lapine contenant du FVII L'échantillon à tester présente un taux inconnu de
FVII activé et sa concentration en FVII+FVIIA est de 500 pM.
Un volume de 8 μL de cet échantillon à tester a été mélangé à 72 μL de plasma dépourvu en FVII et en FVIII tel que décrit précédemment. On obtient ainsi un mélange réactionnel à tester dont le volume est de 80 μL et dont la concentration en FVII+FVIIA est de 50 pM. Ensuite, on y a ajouté 20 μl des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Phospholipides et FT) à des concentrations finales de 5 pM en FT, 1 uM en phospholipides, (réactif Diagnostica Stago 86195 dilué au 1/4), et 20 μl d'un agent fluorogénique calcique spécifique de la thrombine (concentration finale de 16,7 mM en Ca2+) (réactif Fluca kit Diagnostica Stago 86197)
Un TGT a été réalisé pour obtenir un thrombinogramme et les différents paramètres correspondants : temps de latence et temps au pic. Parallèlement, des échantillons de FVII et de FVIIa
(standards internationaux de FVII et de FVIIa fournis par le NIBSC ont été mélangés afin d'obtenir des échantillons standards dont le taux de FVII activé est connu et compris entre 0%' et 100%. Ces échantillons standards ont été mélangés avec un plasma dépourvu en
FVII et en FVIII tel que décrit précédemment afin d'obtenir une concentration en FVII+FVIIa de 50 pM.
Puis, des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine (Phospholipides et FT) ont été ajoutés au mélange échantillon/plasma pour parvenir à des concentrations finales de 5 pM en FT et de 1 μM en phospholipides (réactif Diagnostica Stago 86195 dilué au 1/4). Enfin, 20 μl d'un agent fluorogénique calcique spécifique de la thrombine (concentration finale de 16,7 mM en Ca2+) (réactif Fluca kit Diagnostica Stago 86197) ont été ajoutés au mélange précédent. Les paramètres de thrombinogrammes standards ont été mesurés de manière à tracer des courbes étalon pour chacun des paramètres en fonction du -log du taux de FVII activé (voir figures 2 et 2bis et tableau 1) . Les valeurs des paramètres obtenus à partir du thrombinogramme du mélange contenant l'échantillon à testeront été reportées sur les différentes courbes étalon standard, ce qui permet de déduire une mesure du taux de FVII activé dans l'échantillon à tester. On obtient un temps de latence de 6 minutes et 30 secondes et un temps au pic de 18 minutes, en reportant ces valeurs sur les différentes courbes étalon, on en déduit une mesure du taux de FVII activé dans l'échantillon à tester égale à 20%.
Exemple 9 : influence du lait de lapine sur le test de génération de thrombine L'expérience de l'Exemple 3 est reprise, mais en prédiluant l'échantillon standard contenant un taux connu de FVII activé dans du tampon Owren-Koller contenant 1% de sérum albumine humaine (Tp OK - 1% SAH) ou dans du Tp OK - 1% SAH contenant du lait de lapine.
La figure 20 représente les thrombinogrammes standards obtenus en présence de 50 pM de FVII+FVIIa final dans le mélange plasma/échantillon et pour des taux de FVII activé de 0% et de 100%. Il est observé une parfaite superposition des thrombinogrammes de l'échantillon prédilué dans du Tp OK - 1% SAH et de l'échantillon prédilué dans du Tp OK - 1% SAH contenant du lait de lapine ce qui permet de déduire que le lait de lapine n'a pas d'influence sur le TGT. On note qu'un plasma dépourvu en FVII et en FVIII sans ajout de FVII ou de FVIIa ne génère pas de formation de thrombine .
Les figures 21, 22 et 23 représentent respectivement les thrombinogrammes, les variations du temps de latence et du temps au pic, en fonction du taux de FVII activé dans l'échantillon prédilué en Tp OK - 1% SAH contenant du lait de lapine pour des taux de FVII activé fixés connus compris entre 0% et 100%.
Les résultats obtenus montrent, comme dans l'exemple 3, qu'il est possible d'établir une corrélation entre le taux de FVII activé dans l'échantillon contenant du lait de lapine et les différents paramètres déduits des thrombinogrammes pour une concentration en FVII+FVIIa de 50 pM dans le mélange plasma/échantillon.
Taux d'activation
0 % 5 % 10 % 20 % 40 % 60 % 80 % 100 % du FVII
Temps de latence 11, 8, 83 7, 50 6, 50 5, 33 4, 83 4, 50 4, 17 (min) 50
Temps au pic 23,
21 ,00 19 67 18 00 16 67 16 00 15 50 14 ,33 (min) 50
Tableau 1 : 50 pM FVII+FVIIa final dans un plasma dépourvu en FVII et FVIII (5 pM FT - 1 μM PL)

Claims

Revendications
1. Procédé de mesure du taux de facteur VII activé dans un échantillon-test, comprenant les étapes consistant à : a) mélanger ledit échantillon-test avec un plasma dépourvu en facteur VII (FVII) et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le facteur VIII (FVIII), le facteur IX (FIX) et le facteur XI (FXI), le mélange échantillon-test + plasma ayant une concentration finale en FVII+FVIIa allant de 10 pM à 80 pM ; b) ajouter des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine ; c) obtenir un thrombinogramme en effectuant un test de génération de thrombine (TGT) sur le mélange de l'étape b) ; d) comparer au moins l'un des paramètres du thrombinogramme de l'étape c) à un paramètre homologue obtenu à partir de thrombinogrammes standards établis sur la base d'échantillons- standards dont le taux de Facteur VII activé est connu et varie entre chaque échantillon- standard ; e) déduire de l'étape d) une mesure du taux de
Facteur VII activé dans l'échantillon-test.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel chacun desdits thrombinogrammes standards est obtenu en effectuant un test de génération de thrombine sur un mélange contenant (i) un échantillon-standard dont le taux de facteur VII activé est connu, (ii) un plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI, la concentration finale du mélange échantillon-standard + plasma en FVII+FVIIa étant sensiblement identique à celle du mélange échantillon-test + plasma, et (iii) des composants initiateurs de la réaction de génération de thrombine .
3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 2, dans lequel, à l'étape d) , ledit paramètre de thrombinogramme comparé est choisi parmi le temps de latence, le temps au pic et la vélocité.
4. Procédé selon la revendication 3, dans lequel ledit plasma est dépourvu en FVII et en FIX, ou dépourvu en FVII et en FXI.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel, à l'étape d) , ledit paramètre de thrombinogramme comparé est choisi parmi le temps de latence et le temps au pic.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ledit plasma est dépourvu en FVII et en FVIII.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel les mélanges échantillon-test + plasma et échantillon-standard + plasma sont réalisés en utilisant un même plasma dépourvu en FVII et dépourvu en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel lesdits composants initiateurs de la génération de thrombine comprennent un Facteur tissulaire (FT) , des phospholipides, et du Ca2+, la concentration finale en ledit facteur tissulaire dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 1 à 10 pM, la concentration finale en lesdits phospholipides dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 0 , 1 à 5 μM et la concentration finale en Ca2+ dans le mélange échantillon + plasma + composants initiateurs étant comprise dans la gamme de 14 à 18 mM.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel l'échantillon-test est un échantillon de lait de mammifère transgénique ou un milieu de culture cellulaire sans sérum.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel le facteur FVII activé dont le taux est mesuré est d'origine plasmatique (pFVIIa) , d'origine recombinante (rFVIIa) ou d'origine transgénique (TgFVIIa) .
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, comprenant en outre l'étape f) consistant à calculer la concentration du facteur VII activé dans ledit échantillon-test à partir du taux déterminé à l'étape e) .
12. Utilisation d'un plasma dépourvu en FVII et en au moins un autre facteur choisi parmi le FVIII, le FIX et le FXI pour mesurer le taux de FVII activé dans un échantillon-test.
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