JP7152084B1 - 組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法 - Google Patents
組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
<2> 前記凝固第VIII因子の阻害物質は、凝固第VIII因子活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質である前記<1>に記載の検査試薬セット。
<3> 前記TFPIの阻害物質は、TFPI活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、硫酸化多糖類、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質である前記<1>または<2>に記載の検査試薬セット。
<4> 生体試料の組織因子経路インヒビター(TFPI)の抗凝固活性を検査する検査方法であり、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む第一の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第一のトロンビン産生試験工程と、TFPIの阻害物質、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む第二の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第二のトロンビン産生試験工程とを有する、検査方法。
<5> 前記第二のトロンビン産生試験工程によるトロンビン産生量を、前記第一のトロンビン産生試験工程によるトロンビン量産生量との相対比で、前記被験検体中のTFPIの抗凝固活性を表す、前記<4>に記載の検査方法。
<6> TFPIの阻害物質、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む、生体試料の組織因子経路インヒビター(TFPI)の抗凝固活性を検査するための検査試薬。
本発明の検査薬セットは、生体試料の組織因子経路インヒビター(TFPI)の抗凝固活性を検査するための検査試薬セットであり、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む、第一の混合試薬と、TFPIの阻害物質、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む、第二の混合試薬とを、有する。
本発明の検査方法は、生体試料の組織因子経路インヒビター(TFPI)の抗凝固活性を検査する検査方法であり、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む、第一の混合試薬を被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第一のトロンビン産生試験工程と、TFPIの阻害物質、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む、第二の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第二のトロンビン産生試験工程とを有する。
図1は、TFPIのトロンビン産生の抑制作用を示す図である。TFPIは、前述したように、TF-FVIIa及びFXaの活性を阻害する事によってTF-FVIIa凝固経路によるトロンビンの産生を抑制する。
本発明の検査試薬セットの第一の混合試薬および第二の混合試薬は、組織因子(TF)を含む。第一の混合試薬および/または第二の混合試薬における、TFの濃度は、0.1pMから10pMであることが好ましい。0.1pM未満の場合、血液凝固試験時に、十分な反応が生じずに、トロンビンの量を測定しようとするとき検出下限以下となり、評価ができない場合がある。検査試薬のTFが、10pMを超えても、試験に必要な量を超えて反応が飽和し、過剰となる場合がある。
血液凝固第VIII因子(FVIII)は抗血友病因子と呼ばれる血栓形成に不可欠な血液凝固因子である。FVIIIは活性型の血液凝固第IX因子(FIXa)の酵素活性を高める補酵素として機能している。
第一の混合試薬は、TFと、FVIIIの阻害物質を含む。このため、本願において、第一の混合試薬は、「TF/FVIII阻害」と略記する場合がある。
TFPIは、TFに結合したFVIIa及びFXaの活性部位に直接結合する事によって、TF凝固経路、あるいは外因系凝固経路と呼ばれる凝固反応を介したトロンビン産生及び血栓形成を阻害する。
第二の混合試薬は、TFPIの阻害物質と、第一の混合試薬(TF/FVIII阻害)とを含む。このため第二の混合試薬は、「TF/FVIII阻害/TFPI阻害」と略記する場合がある。
第二の混合試薬におけるTFPIの阻害物質の濃度は、その阻害物質の種類に応じて、検査試薬として用いるときにTFPIによるFXa形成量への影響を十分に抑制できる濃度であればよい。TFPIの活性を、その阻害物質を用いないときと比べて、TFPIを含まないコントロールと比べて有意差が無い程度に加えることが好ましい。
TFPI阻害物質を添加した血漿のプロトロンビン(PT)凝固時間を、阻害物質を含まない血漿の凝固時間と比較する事によって、TFPI活性を決定する試みが行われた(参考文献:Dahm et al. , A novel anticoagulant activity assay of tissue factor pathway inhibitor 1 (TFPI). J Thromb Haemost. 3: 651-658, 2005 )。
この検査は、血液凝固活性がかかわる様々な疾患の指標の検査に用いることができる。被験検体は、血液、血漿、あるいは尿などの生体から採取した生体試料などを対象とすることができる。本発明の検査方法は、被験検体を検査試薬と反応させることによって生じるトロンビンを定量するトロンビン産生試験工程を行う。
本発明の検査方法は、生体試料の組織因子経路インヒビター(TFPI)の抗凝固活性を検査する検査方法に関する。
本発明の検査方法は、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む第一の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する工程である。
本発明の検査方法は、TFPIの阻害物質、組織因子、および凝固第VIII因子の阻害物質を含む第二の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する工程を有する。
検体中のTFPIの抗凝固活性は、次の「トロンビン産生量(2)/トロンビン産生量(1)」の相対比(任意単位、arbitrary unit)で求めることができる。すなわちこの相対比は、TFPIの阻害物質の有無によるトロンビン産生量の差を求めるものとなる。
トロンビン産生量(1):「本発明の第一の混合試薬(TFPI阻害物質を含まないTF/FVIII阻害検査試薬)との反応によって生じたトロンビン産生量」
トロンビン産生量(2):「本発明の第二の混合試薬(TF/FVIII阻害/TFPI阻害検査試薬)との反応によって生じたトロンビン産生量」
(方法)
(1)FVIII阻害物質
FVIII阻害物質として、血友病A患者から調製したFVIIIに対するモノクローナル抗体BOIIB2(Life Sciences Research Partnersから購入)の性状を解析した。
FVIII阻害物質は二つの異なる検査試薬と方法を用いたトロンビン産生試験によって解析した。
APTT検査試薬(アクチン:シスメックス社)は、0.5%ウシ血清アルブミン(富士フィルム和光純薬)と0.15M塩化ナトリウム(富士フィルム和光純薬)を含む50mMトリス緩衝液(BSA/TBS、pH7.4)によって16倍希釈した。
混合試薬は、BSA/TBSで希釈したTF(Dade Innovin:シスメックス社)溶液、FXIa(Haematologic Technologies社)溶液、さらに合成リン脂質(Haematex社)溶液を混合して調製した。
1)APTT試薬添加によって生じるFVIII依存性のトロンビン産生に対するFVIII阻害物質の影響
コントロール血漿に抗FVIIIモノクローナル抗体BOIIB2を0.6μg/mL、もしくは2.4μg/mLの濃度で加えた後、APTT試薬添加によって生じるFVIII依存性のトロンビン産生量への影響を調べた。その結果トロンビン産生は前記抗体によってほぼ完全に抑制された(図2のパネルAとB)。
・パネルB.総トロンビン産生量。総トロンビン産生量はトロンビン産生図中の曲線のArea under the curveを計算する事で算出した。各バーは平均値と標準偏差値は示す(n=2-3)。
コントロール血漿に抗FVIIIモノクローナル抗体BOIIB2を0.3μg/mL、1.3μg/mL、あるいは5μg/mLの濃度で加えた後、TFとFXIaの混合試薬添加によって生じるFVIII依存性のトロンビン産生量に対する阻害効果を調べた。その結果、トロンビン産生は前記抗体によって濃度依存的に抑制され、1.3μg/mL以上の濃度で95%以上のトロンビン産生が抑制された(図3)。
(方法)
(1)TFPI阻害物質
TFPI阻害物質として、抗ヒトTFPIポリクローナル抗体の性状を解析した。抗体は精製したヒトTFPIをウサギに免疫する事で作成した抗ヒトTFPI抗血清からprotein Gカラム(Cytiva社)を用いて精製した。
TFPIはTFに結合したFVIIa(TF-FVIIa)の活性及びFXaの活性を阻害する。本発明においては、これらのTFPIの阻害作用に対する抑制効果を指標にしてTFPI阻害物質の活性を解析した。
先ずTF-FVIIaの活性は、10μLのヒトFX(100nM)を96ウエルのマイクロタイタープレートに加えた後、45μLのTF-FVIIaの混合試薬(50pMのヒトTF、200pMのヒトFVIIa、2.5mMの塩化カルシウム溶液を含む)を添加し、37℃での2分間の反応によって形成する活性型FX(FXa)の量を定量する事によって算出した。
FXa活性は、90μLのヒトFXa(1.25nM)を25μLのFXa基質(CS-11、190μM)と37℃で反応させる事で生じる発色強度をプレートリーダー(405nmにおいて)によって3分間連続して測定し、時間あたりの発色強度(mOD/分)を求める事で定量化した。TFPIによるFXa阻害活性は、FXaを2.5nMの遺伝子組換え型ヒトTFPIと37℃で10分間反応させた後、残存のFXa活性を測定する事で求めた。
1)TFPIによるTF-FVIIa活性阻害に対するTFPI阻害物質の影響
先ず、TFPIはTF-FVIIaによるFXの活性化を濃度依存的に阻害した(図4)。そして、一定濃度のTFPI(0.5nM)に抗TFPIポリクローナル抗体(40μg/mL)を添加すると、TFPIによる阻害が全く見られなくなり、TFPI非存在下のコントロールと同様なレベルまでFXの活性化、つまりFXaの形成量が回復した(図4のパネルB)。この事は、抗TFPIポリクローナル抗体がTFPIのTF-FVIIa阻害活性を完全に中和した事を示していた。
TFPIをFXaと反応させるとFXaによる基質の加水分解が低下した。しかし、この低下は抗TFPIポリクローナル抗体(40μg/mL)の存在下で完全に抑制され、FXaの活性はTFPI非存在下のコントロールと同様なレベルまで回復した(図6)。
(方法)
(1)トロンビン産生試験に用いるTF検査試薬と検出試薬の調製方法
1)TFを含む検査試薬の調製法
TFを含む検査試薬は、BSA/TBS緩衝液(pH7.4)によって希釈したヒトTF試薬(1pM、あるいは2.5pM)を合成リン脂質溶液(20μM)と混合して調製した。
1)で作成した検査試薬に抗ヒトFVIIIモノクローナル抗体BOIIB2(0.63μg/mL)を添加する事で調製した。
この試薬は、2)で作成した検査試薬に抗ヒトTFPIポリクローナル抗体(40μg/mL)をさらに添加、混合して調製した。
トロンビン検出試薬は、50μMのトロンビン蛍光基質(Pefafluor TH)と10mMのEDTA溶液を混合して調製した。
先ず、35μLの血漿検体、あるいは正常コントロール血漿(Simens血液凝固試験用コントロール血漿N)、10μLのTF検査試薬(1pM、もしくは2.5pM TFと20μMリン脂質を含む)を96ウエルのマイクロタイタープレートに加え37℃で2分間加温した。その後、10μLの塩化カルシウム溶液(88mM)を血漿検体に添加して37℃で2.5分間インキューベーションする事によってトロンビンを産生させた。
対象群間の有意差検定は統計解析ソフトのGraphpad Prism 8(GraphPad Software)を用いて行った。なお、危険率5%以下を有意差ありと判定した。
(1)TFPI抗凝固活性の検出感度に対するFVIII阻害物質の影響
近年、FVIIIを欠損した血友病患者で頻発する出血症状をTFPI阻害薬の投与によって予防、あるいは治療する試みが行われてきた(参考文献:Peterson et al. Targeting TFPI for hemophilia treatment. Thromb. Res. 141 Suppl 2: S28-30, 2016)。この事はトロンビン産生においてTFPIの抗凝固作用がFVIIIを介した凝固反応と競合している可能性を示唆していた。発明者らはこの点に着目し、トロンビン産生試験を用いたTFPI活性の検出へのFVIII阻害物質の影響を調べた。
この抗ヒトTFPIポリクローナル抗体によるトロンビン産生の増加率を、抗ヒトFVIIIモノクローナル抗体の有無で比較した結果、抗ヒトFVIIIモノクローナル抗体の添加がトロンビン産生をより増加させる事が明らかとなった(図7のパネルC)。
この結果も、TFPI抗凝固活性の検出感度を高めるためには、FVIII阻害物質によってFVIII凝固経路を遮断する事が有用である事を示した。
TFPIの抗凝固活性とトロンビン産生阻害との相関を調べる目的で、抗ヒトFVIIIモノクローナル抗体を含む正常コントロール血漿に全長型のTFPI(Full-length TFPI, FL-TFPI、参考特許:特開平07-079774)を添加し、TF試薬(1pM)によるトロンビン産生に対するFL-TFPIの影響を検討した。FL-TFPIは濃度依存的にトロンビン産生を阻害し、2nMのTFPIはトロンビン産生をほぼ完全に抑制した(図8のパネルA)。
ヒト健常者血漿検体は、国立大学法人金沢大学の倫理審査委員会の承認を得た後、健常者のドナーから採取した血液から調製した。血液検体を採取する際には、担当医から患者に口頭及び文書による説明を行い、その上で同意書への署名を得て採取した。試験に用いる血漿検体は、抗凝固剤であるクエン酸を用いて採血した血液を室温で遠心分離(2,000gで10分間)する事によって調製した。なお血漿検体は試験開始まで-80℃において凍結保存し、試験直前に37℃で解凍して使用した。
・パネルB.抗ヒトTFPIポリクローナル抗体による増加率をもとに算出されたTFPIの抗凝固活性値は1.58±0.46 arbitrary units(平均値±標準偏差値)であったが、顕著な個人差が確認された。図は活性値の平均値と95%の信頼区間を示す。
Claims (6)
- 生体試料の組織因子経路インヒビター(TFPI)の抗凝固活性を検査するための検査試薬セットであり、
組織因子と、凝固第VIII因子の阻害物質と、を含む第一の混合試薬と、
TFPIの阻害物質と、組織因子と、凝固第VIII因子の阻害物質と、を含む第二の混合試薬と、を有する、検査試薬セット。 - 前記凝固第VIII因子の阻害物質は、凝固第VIII因子活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質である請求項1に記載の検査試薬セット。
- 前記TFPIの阻害物質は、TFPI活性を特異的に阻害するタンパク質、オリゴヌクレオチド、硫酸化多糖類、化学薬品、及びペプチドからなる群から選択されるいずれかの物質である請求項1または2に記載の検査試薬セット。
- 生体試料の組織因子経路インヒビター(TFPI)の抗凝固活性を検査する検査方法であり、
組織因子と、凝固第VIII因子の阻害物質と、を含む第一の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第一のトロンビン産生試験工程と、
TFPIの阻害物質と、組織因子と、凝固第VIII因子の阻害物質と、を含む第二の混合試薬を、被験検体と反応させることによって生じるトロンビンを定量する第二のトロンビン産生試験工程と、を有する、検査方法。 - 前記第二のトロンビン産生試験工程によるトロンビン産生量を、前記第一のトロンビン産生試験工程によるトロンビン量産生量との相対比で、
前記被験検体中のTFPIの抗凝固活性を表す、請求項4に記載の検査方法。 - TFPIの阻害物質と、組織因子と、凝固第VIII因子の阻害物質と、を含む、生体試料の組織因子経路インヒビター(TFPI)の抗凝固活性を検査するための検査試薬。
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