JP2011526691A - 試料中の活性化凝固ｖｉｉ因子のレベルを測定する方法 - Google Patents

試料中の活性化凝固ｖｉｉ因子のレベルを測定する方法 Download PDF

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Abstract

ａ）テスト試料をＶＩＩ因子が欠乏しかつＶＩＩＩ因子、ＦＶＩＸ因子及びＸＩ因子から選ばれた少なくとも他の１つの因子が欠乏する血漿と混合する工程であって、テスト試料＋血漿の混合物はＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの最終濃度が１０〜８０ピコモルの範囲となるように混合する工程と；
ｂ）トロンビン生成反応開始成分を加える工程と；
ｃ）工程ｂ）の混合物にトロンビン生成テストを行いトロンボグラムを得る工程と；
ｄ）工程ｃ）のトロンボグラムのパラメータのうちの少なくとも１つを標準試料に基づいて作成した、活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルが既知であって各標準試料間で異なる標準トロンボグラムから得た相同のパラメータと比較する工程と；
ｅ）工程ｄ）からテスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルの測定値を推定する工程とからなる、テスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルを測定する方法。

Description

（技術分野）
本発明は、ＶＩＩ因子及びＦＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、ＩＸ因子（ＦＩＸ）及びＸＩ因子（ＦＸＩ）から選ばれる因子の１個が欠乏する血漿を用いて、試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）のレベルを測定する方法に関する。
（関連技術の説明）
血液凝固は、生物に血管病変が起こった時に、出血をコントロールしこれによって出血を防ぐ機序である。
血液凝固は、血液中に存在したんぱく質分解性の酵素によって活性化した形態に変換される様々なプロ酵素及びプロ共同因子を含む多段階のカスケード反応に続いて起こる。凝固の多段階の連続（すなわちカスケード反応）において、外因性の凝固経路と内因性の凝固経路の２つの経路が区別される。両者とも活性化凝固因子（ＦＸａ）、活性化凝固Ｖ因子（ＦＶａ）、リン脂質及びカルシウムから構成されるプロトロンビナーゼと呼ばれる複合物の形成を導く。プロトロンビンをトロンビンに活性化し、可溶性のフィブリノゲンを、凝塊を形成する不溶性のフィブリンに変換できるようにするのはプロトロンビナーゼである。
外因性の経路には、血漿中に存在するＦＶＩＩの介在が含まれる。しかし凝固カスケード反応を開始するためには、ＦＶＩＩは予めＦＶＩＩａに活性化されている必要がある。（組織因子と複合していない）ＦＶＩＩａだけが低いたんぱく質分解の活動性を示す。リン脂質と結合するタンパク質である組織因子（ＴＦ）とＦＶＩＩａが複合すると、この活動性が顕在化され血管病変が形成される間に始動される。ＦＶＩＩａ−ＴＦ複合物は、カルシウムイオンの存在下でＸ因子をＸａ因子に変換する。また、ＦＶＩＩａ−ＴＦ複合物はＦＩＸをＦＩＸａに変換する。
翻って、ＩＸａ因子とＸａ因子は、ＦＶＩＩを活性化してＦＶＩＩａに変える。Ｖａ因子及びリン脂質（プロトロンビナーゼ）と複合したＸａ因子は、プロトロンビンをトロンビンに変換する。トロンビンはフィブリノゲンに作用してフィブリンに変換し、他の活動もするが、なかでもＶ因子をＶａ因子に、ＦＶＩＩＩをＦＶＩＩａに変換する。また、トロンビンは、カルシウムの存在下でＸＩＩＩ因子を活性化してＸＩＩＩａ因子に変換し、フィブリン凝塊の硬化を可能にする。
外因性凝固の経路においては、ＦＶＩＩａ／ＴＦの複合物によってＦＩＸが活性化されＦＩＸａになるが、内因性凝固の経路では、ＦＩＸａはＦＩＸａ自体によってＦＩＸから生成されるが、内皮下層のような負の電荷をもった表面と血液が接触することで、それ自体が活性化したＦＩＩ因子によって活性化される。
ＦＶＩＩａと糖たんぱく質はビタミンＫに依存し、従って凝固機序のなかで重要な役割を果たし、血液凝塊を形成する。ＦＶＩＩａは、ＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子がなくても、組織が出血をともなう損傷をした時に放出される組織因子の存在下で局所的に作用できるという利点を有する。これが、出血が顕著なある種の凝固不良を改善するために、ＦＶＩＩａが長年にわたって使用されてきた理由である。
最初の方法は、血漿からＦＶＩＩａを得ることであった。しかし、血漿からＦＶＩＩａを作ることは、供給源の入手可能性の点で制限があり、また血漿の使用によって、例えばプリオンやウィルス等の病原性の作用物質が伝染する危険性がある。これらの問題は、Ｎｏｖｏ・Ｎｏｒｄｉｓｋ・Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社が開発した、構造的に血漿ＦＶＩＩａと同じ糖たんぱく質である組み換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）によって克服された。
ｒＦＶＩＩａの主要な治療上に関する著作は、Ａ型血友病における成長したアンチＶＩＩＩ因子抗体、またＢ型血友病における成長したアンチＦＶＩＸ抗体など、自発性または外科的な出血の治療に関するものである（米国、ＥＵ及び日本）。また欧州においては、先天性ＦＶＩＩ欠乏症の患者及びグランツマン血小板無力症の患者への使用に関する著作である。
さらに、多くの刊行物において、先天性凝固因子欠乏症も血小板無力症もない患者にたいする外科的手術中の出血の制御におけるｒＦＶＩＩａの有効性が報告されている。
ＦＶＩＩａの使用が次第に広がることによって、
（１）ＦＶＩＩａの活動性の測定
（２）ＦＶＩＩａの濃度の判断
（３）活性化ＶＩＩ因子レベルの測定
等の方法が改善につながった。
ＦＶＩＩの活動性を検出する方法で最も知られているのは、凝固時間、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、トロンボエラストログラフィ（ＴＥＧ）及びトロンビン生成テスト（ＴＧＴ）などの測定法である。これらの方法により、ＦＶＩＩａ活動性を検出することを可能にはしたが、試料における活性化ＶＩＩ因子のレベルを直接測定可能にしたものではなかった。
ＦＶＩＩａの免疫分析用の市販キット（ＩＭＵＢＩＮＤ ＶＩＩ因子・ＥＬＩＳＡキット）は入手可能であるが、この技法を実施するための実験条件を習得することは難しい。事実、このキットは使用方法が複雑で、動的範囲が極めて狭く、直線的検出範囲が極めて限定され、そして最も重要な点は＋４℃の温度で作業をしなければならないことである。
ＦＶＩＩａの濃度を測定する他の方法が文献に記載されている。例えば切断組み換えＴＦ（Ｓｔａｒｌｅｔ ＶＩＩａ−ｒＴＦ、Ｓｔａｇｏ）を用いてたんぱく質分解の活動性を測定する方法（ＵＳ５、４７２、８５０、ＵＳ５、７４１、６５８、ＷＯ１９９２／０１８８７０、ＵＳ５、７５０、３５８、ＵＳ５、７４１、６５８、ＵＳ５、４７２、８５０、ＥＰ０ ６４１ ４４３）、あるいはＦＶＩＩａ−アンチトロンビン複合物の濃度を測定する方法（ＷＯ０３／００４６９４）など。これらの方法は極めて正確というわけでなく、また実施が難しい。事実、これらの方法は、ＦＶＩＩａの濃度が低い場合は同時に処理できる試料の数が限られ、凝塊が形成されることは、この方法を正確に実施するには不適当である。
しかしながら、ＦＶＩＩａによって生成されるＦＸａの蛍光発生法または色素分析法は、両者ともＦＶＩＩの作用とＦＶＩＩａの作用を区別することができないので、ＦＶＩＩａの濃度を測定するのに適さないことがわかっている。
ＦＶＩＩａによる治療の効果を評価するために一部の生物学者に使われる方法の中で、しばしば血栓弾性描写法が使われる。この方法は、凝塊の形成を時間の関数として機械的に分析することによって、全血液の物理的特性を測定することからなる。血栓弾性描写法によって生成されるグラフ（ｔｈｒｏｍｂｏｅｌａｓｔｏｇｒａｍｍｅ（登録商標）と呼ばれる）から抽出されたパラメータによって、臨床医は患者の凝固能力を評価することができる。この方法は正確であるが、時間がかかりすぎて定期的、反復的分析には不向きで、また血液を採取してから１時間以内に実施する必要があるのでマルチ・サンプリングには応用できない。さらに、この方法は試料の活性化ＶＩＩ因子のレベルの測定はできない。
このように、特に、試料が非活性化凝固ＶＩＩ因子と活性化凝固ＶＩＩ因子の混合物からなる場合には、試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルを測定するのが有効かつ簡単、入手可能な方法に対する切実な要求がある。
（発明の概要）
出願者は、ＦＩＩ及びＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１つの他の因子が欠乏する血漿を使用することによって、特に、試料が非活性化凝固ＶＩＩ因子及び活性化凝固ＶＩＩ因子を含む場合は、意外にも確実、再現可能、かつ実施が容易な方法で試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルが測定可能であることを発見した。
したがって、本発明の方法において実施される実験条件は、試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルとトロンビン生成テスト（ＴＧＴ）の特定のパラメータの特性及びそこから得られるトロンボグラムとの間の相関関係を確立することを可能とする。
かかる相関関係により、前記試料のトロンボグラムのパラメータを既知の活性化ＶＩＩ因子のレベルを構成する合成物から得られる「標準」トロンボグラムのパラメータと比較することによって、テスト対象の試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルを判断することが可能となる。
従って本発明は、テスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルを測定する方法であって、
ａ）前記テスト試料をＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）が欠乏しかつＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、ＦＶＩＸ因子（ＦＩＸ）及びＸＩ因子（ＦＸＩ）から選ばれた少なくとも他の１つの因子が欠乏する血漿と混合する工程であって、テスト試料＋血漿はＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの最終濃度が１０ピコモルから８０ピコモルの範囲となるように混合する工程と；
ｂ）トロンビン生成反応開始成分を加える工程と；
ｃ）工程ｂ）の混合物にトロンビン生成テスト（ＴＧＴ）を行いトロンボグラムを得る工程と；
ｄ）工程ｃ）のトロンボグラムのパラメータのうちの少なくとも１つを標準試料に基づいて作成した、活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルが既知であって各標準試料間で異なる標準トロンボグラムの相同のパラメータと比較する工程と；
ｅ）工程ｄ）からテスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルの測定値を推定する工程とからなる、テスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルを測定する方法、に関する。
本発明の方法は、選択的に工程ｅ）で決まるレベルから前記テスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子の濃度を計算する工程ｆ）からなる。
好適には、標準トロンボグラムは、
（ｉ）ＦＶＩＩａのレベルが既知の標準試料、
（ｉｉ）ＦＶＩＩ及び選択的にＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩが欠乏する血漿を用いて調製し、標準試料＋減損血漿を含む得られる溶液中のＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの最終濃度は、テスト試料＋減損血漿を含む溶液中のＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの最終濃度とほぼ等しい、
（ｉｉｉ） トロンビン生成反応開始成分
を含む混合物にトロンビン生成テストを行うことによって得られる。
前記血漿がＦＶＩＩ及びＦＩＸが欠乏する、またはＦＶＩＩ及びＦＸＩが欠乏するときは、比較されるトロンボグラムのパラメータは、時間差、ピークまでの時間及び速度から選択され、前記血漿がＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏するときは、時間差及びピークまでの時間から選択されることが望ましい。
テスト試料＋血漿及び標準試料＋血漿の混合は、ＦＩＩが欠乏しかつＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１個のその他の因子が欠乏する同じ血漿を使って行われることが好ましい。
トロンビン生成を開始する前記成分は、組織因子（ＴＦ）、リン脂質及びＣａ２からなり、試料＋血漿＋開始成分の混合物中の前記組織因子の最終濃度は１から１０ピコモルの範囲内からなり、試料＋血漿＋開始成分の混合物中の前記リン脂質の最終濃度は、０．１から５マイクロモルの範囲からなり、試料＋血漿＋開始成分の混合物中のＣａ２＋の最終濃度は１４から１８ミリモルの範囲内からなることが好ましい。
レベルが測定される活性化ＦＶＩＩ因子は、血漿由来（ｐＦＶＩＩａ）、組み換え由来（ａＦＶＩＩａ）または遺伝子組み換え由来（ＴｇＦＶＩＩａ）であることが好ましい。
本発明の特定の実施例においては、テスト試料は遺伝子組み換え哺乳動物の母乳または無血清細胞培養基の試料である。
また本発明は、テスト試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルを測定するための、ＦＩＩ及び、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１個の他の因子が欠乏する血漿の使用に関する。
本発明の方法において実施される実験条件は、試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルとトロンビン生成テスト（ＴＧＴ）の特定のパラメータの特性及びそこから得られるトロンボグラムとの間の相関関係を確立することを可能とする。
かかる相関関係により、前記試料のトロンボグラムのパラメータを既知の活性化ＶＩＩ因子のレベルを構成する合成物から得られる「標準」トロンボグラムのパラメータと比較することによって、テスト対象の試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルを判断することが可能となる。
標準試料／血漿の混合物において、最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で、活性化ＶＩＩ因子のレベルの範囲が０から１００％（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用の、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用いて得た標準トロンボグラムである。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用い、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、時間差及びピークまでの時間におけるそれぞれの変化を示す図である。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用い、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、時間差及びピークまでの時間におけるそれぞれの変化を示す図である。 標準試料／血漿の混合物において、最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）を用いて得た標準トロンボグラムである。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差、ピークまでの時間及び速度における変化を示す図である。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差、ピークまでの時間及び速度における変化を示す図である。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差、ピークまでの時間及び速度における変化を示す図である。 ＦＶＩＩ及びＦＸＩが欠乏する血漿（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）を用いて、標準試料／血漿の混合物において、濃度５０ピコモルの最終ＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得た、最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの標準トロンボグラムである。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用の、ＦＶＩＩ及びＦＸＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としてそれぞれ時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化を示す図である。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用の、ＦＶＩＩ及びＦＸＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としてそれぞれ時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化を示す図である。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用の、ＦＶＩＩ及びＦＸＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としてそれぞれ時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化を示す図である。 最終濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用の、ＦＶＩＩ及びＦＸＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としてそれぞれ時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化を示す図である。 ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）を用いて、標準試料／血漿の混合物において、濃度最終１０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得た標準トロンボグラムである。 濃度最終１０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化を示す図である。 濃度最終１０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化を示す図である。 濃度最終１０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化を示す図である。 濃度最終１０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化を示す図である。 ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）を用いて、標準試料／血漿の混合物において濃度８０ピコモルの最終ＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で、得た標準トロンボグラムである。 最終濃度８０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差およびピークまでの時間における変化を示す図である。 最終濃度８０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿（組織因子：５ピコモル、リン脂質：１マイクロモル）を用いて、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、それぞれ時間差およびピークまでの時間における変化を示す図である。 ０から１００％の活性化ＶＩＩ因子レベルの、血漿／試料の混合物中、最終５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得た標準トロンボグラムウを示す図である。 それぞれ０％から１００％の既知の固定活性化ＶＩＩ因子レベル用の、ウサギ母乳を含む予め希釈した試料、ＴｐＯＫ１％のＨＳＡ中の活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、トロンボグラム、時間差における変化及びピークまでの時間を示す図である。 それぞれ０％から１００％の既知の固定活性化ＶＩＩ因子レベル用の、ウサギ母乳を含む予め希釈した試料、ＴｐＯＫ１％のＨＳＡ中の活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、トロンボグラム、時間差における変化及びピークまでの時間を示す図である。 それぞれ０％から１００％の既知の固定活性化ＶＩＩ因子レベル用の、ウサギ母乳を含む予め希釈した試料、ＴｐＯＫ１％のＨＳＡ中の活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、トロンボグラム、時間差における変化及びピークまでの時間を示す図である。
（発明の詳細な説明）
本発明の文脈において、用語「ＶＩＩ因子」すなわち「ＦＶＩＩ」は、凝固を誘発することができない一本鎖プロ酵素に対応する非活性化凝固ＶＩＩ因子を意味する。
用語「活性化凝固ＶＩＩ因子」または「活性化ＶＩＩ因子」すなわちＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩ（プロ酵素）の切断によって生じるジスルフィド架橋によって互いに結び付いた重鎖及び軽鎖からなる一本鎖タンパク質（酵素）を意味し、血液凝固を誘発する能力を有する。
用語「ＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ」は、当該試料に存在するＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａの濃度または量の合計を意味する。ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａの濃度または量の合計は、例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製、ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）、ＶＩ：Ａｇ（コード：００２４１）等の市販のキットを用いた免疫分析によって測定することができる。
用語「活性化凝固ＶＩＩ因子レベル」または「ＦＶＩＩａレベル」は、当該試料における活性化凝固ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）の量または濃度と、当該同試料におけるＶＩＩ因子及び活性化凝固ＶＩＩ因子の量または濃度の合計（ＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ）との割合を示す。ＦＶＩＩａのみを含みＦＶＩＩを含まない試料の場合、活性化ＶＩＩ因子レベルは、１（すなわち、１００％）となり；ＦＶＩＩａとＦＶＩＩを同量の含む試料の場合、活性化ＶＩＩ因子レベルは、０．５（すなわち、５０％）となり；ＦＶＩＩのみを含む（ＦＶＩＩａを含まない）試料の場合、活性化ＶＩＩ因子レベルは、０（すなわち、０％）となる。
用語「テスト試料」は、ＦＶＩＩ、活性化ＶＩＩ因子またはこれらの混合物を含み、その活性化ＶＩＩ因子のレベルが未知の試料を意味する。有利には、テスト試料は、血液または血漿から精製されるか、または例えば哺乳動物の母乳、培養基または細胞ホモジネート等の精製または非精製の体液から得られる。
特定の実施例においては、テスト試料は哺乳動物の母乳の試料、特にその母乳においてＦＶＩＩおよび／またはＦＶＩＩａを作る遺伝子組み換え哺乳動物から得られる母乳の試料である。
別の実施例においては、テスト試料は無血清細胞培養基である。
本発明の一実施例によれば、テスト対象の試料は、治療目的であるかどうかを問わず、液状またはフリーズドライ状の血漿（ｐＦＶＩＩａ）、組み換え（ｒＦＶＩＩａ）または遺伝子組み換え（ＴｇＦＶＩＩａ）及びＦＶＩＩ、またはそれらの混合物から得られるＶＩＩａを含む試料である。
「標準試料」とは、当該溶液において、活性化ＶＩＩ因子レベルが既知および／または選択され、例えば、国際標準ＦＶＩＩ（血液凝固ＶＩＩ因子、濃縮、ヒト、ＮＩＢＳＣコード：９７／５９２）または国際標準活性化ＶＩＩ因子（血液凝固ＶＩＩａ因子、濃縮、ヒト、ＮＩＢＳＣコード：８９／６８８）またはそれらの混合物が、活性化ＶＩＩ因子の望ましいレベルを得るために適切な量または濃度が組み込まれた、試料を意味する。また標準試料は、血液または血漿または、例えば、哺乳動物の母乳、培養基または細胞ホモジネート等の精製または非精製の体液から得ることもできる。
本発明の文脈で用いられる血漿は、動物由来であって、好適には哺乳動物、及び好適にはヒトのものである。
本発明の意味において、「〜が欠失した」または「〜が欠乏する」という表現は同じ意味を表し、合成物（例えば、血液凝固因子）の当該溶液（例えば血漿）の欠失を記述する目的で、合成物の存在が検出できなくなるまで代替語として使用することができる。
従って、「ＦＶＩＩ、かつＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩから選択される少なくとも１個の因子が欠乏する血漿」という表現は、当業者に周知の分析方法によってそれらの濃度を測定したとき、当該血漿中のこれらの因子ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩのそれぞれの濃度が検出閾値以下であることを意味する。分析方法として、例えば市販のキットまたは試薬（例えば、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製、ＡＳＳＥＲＡＣＨＲＯＭ（登録商標）、ＶＩＩ：Ａｇ（コード：００２４１）、またはＫＯＲＤＩＡ社製、ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡセット（コード：ＦＶＩＩ−ＥＩＡ）を用いる分析方法を挙げることができる。
血漿中のＦＶＩＩの検出閾値は、好適には約１ｍＵＩ／ｍｌ（０．５ｎｇ／ｍｌ）であって、それ以下の濃度ではＦＶＩＩは検出されない。
血漿中のＦＶＩＩＩの検出閾値は、好適には約１０ｍＵＩ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ）であって、それ以下の濃度ではＦＶＩＩＩは検出されない。
血漿中のＦＩＸの検出閾値は、好適には約０．２ｍＵＩ／ｍｌ（１ｎｇ／ｍｌ）であって、それ以下の濃度ではＦＩＸは検出されない。
血漿中のＦＩＸの検出閾値は、好適には約０．５ｍＵＩ／ｍｌ（２．５ｎｇ／ｍｌ）、それ以下の濃度ではＦＩＸは検出されない。
血漿から当該因子を除去する技法には、当業者に周知の全ての技法が含まれる。除去技法の例として、特に免疫除去、化学的除去法及び化学的除去法の組み合わせが上げられる。
免疫除去は、当該抗原における前記溶液をほぼ除去する目的で、溶液に含まれる抗原を特にターゲットとする抗体を用いることからなる。免疫除去を行うために使用する抗体としては、単一または幾つかの異なる細胞クローンを由来とする、多クローン性および／または単クローン性の抗体であってもよい。使用する抗体は、除去することが望ましい抗原を直接ターゲットとしてもよく、あるいはこの抗原に結びつくタンパク質をターゲットとしてもよい。
ＦＶＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩが欠失した血漿は、それぞれアンチＦＶＩＩ、アンチＦＩＸまたはアンチＦＸＩ抗体をもちいて得ることができる。
ＦＶＩＩＩが欠乏する血漿は、アンチＦＶＩＩＩ抗体、ヴォン・ヴィルブランド因子をターゲットとする抗体、または血液中をＦＶＩＩＩを搬送する血漿タンパク質を用いて得ることができる。
ＦＶＩＩＩが欠失した血漿は、ＦＶＩＩＩがＣａ２＋依存性因子の場合、ＥＤＴＡ（エチレン−ジアミン−四酢酸）を用いて化学的除去によっても得ることができる。この場合、ＥＤＴＡは当業者に周知の方法、例えば透析法により除去する。
本発明の実施に使用する血漿は、有利にはＶＩＩ因子と少なくともＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択されるその他の因子１つが欠乏する血漿である。
本発明の実施に使用する血漿は、有利には生まれながらＦＶＩＩＩが欠乏するタイプＡの血友病から得た血漿、生まれながらＦＩＸが欠乏するタイプＢ血友病から得た血漿、またはＸＩ因子完全欠乏症を示す患者から得た血漿から作られる。生まれながらＦＶＩＩＩ、ＦＩまたはＦＸＩが欠乏する前記血漿は、上記のような免疫学的または科学的方法によりＦＶＩＩが除去される。
本発明の更に別の実施例においては、使用する血漿は、正常な血漿が用いられ、最初ＦＶＩＩが除去され、つづいてＦＶＩＩＩおよび／またはＦＩＸおよび／またはＦＸＩが除去される。
本発明の意味において、用語「トロンビン生成反応開始成分」または「開始成分」は、プロトロンビンからトロンビン生成を開始する必須成分を意味する。
トロンビン生成反応開始成分は、トロンビン生成反応を誘発するのに適度な濃度で、原則的にカルシウムイオンソース（Ｃａ２＋）、リン脂質作用物質及び組織因子（ＴＦ）からなる。
本発明の文脈においてカルシウムイオンの適切なソースは、ＣａＣｌ２等の生物学的に適合性のあるカルシウムイオンのソースとも対応する。Ｃａ２＋のソースは、下準備なしに他のトロンビン生成反応開始成分と、または他のトロンビン生成反応開始成分を添加した後に、試料／血漿の混合物に添加することができる。
本発明の文脈においてカルシウムイオンの適度な濃度とは、試料＋血漿＋開始成分の混合物におけるカルシウムイオンの最終濃度、１４から１８ミリモルの範囲、特には１６．７ミリモルを意味する。
本発明において使用する適切なリン脂質作用物質は、濃縮またはフリーズドライ製品の形状でもよく、好適には大部分の量をホスファチジルコリンとホスファチジルセリンからなる混合物、またはホスファチジルコリン及びホスファチジルセリンのみを含む混合物からなる。
本発明の意味において、適度な濃度のリン脂質作用物質とは、試料＋血漿＋開始成分の混合物におけるリン脂質作用物質の最終濃度、０．１から５マイクロモル、具体的には０．５から２マイクロモル、更に具体的には１マイクロモルの範囲を意味する。
本発明で使用する適切な組織因子（ＴＦ）は、いかなる天然、血漿、組み換えまたは遺伝子組み換え組織因子で構成されるグループ、またはＶＩＩ因子からＶＩＩａ因子に活性化する機能を失ったいかなる切断組織因子を含むいかなる修飾組織因子から選択してもよいが、前記修飾組織因子は、特にＶＩＩａ因子の酵素活性補助因子として作用する能力を保存しているものとする。適切な修飾組織因子としては、例えば膜貫通ドメインが取り除かれたもので、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社から市販されるＳＴＡＣＬＯＴキット（コード番号：００２８１）の組織因子等でもよい。
本発明の意味において、組織因子の適度な濃度とは、試料＋血漿＋開始成分の混合物における組織因子の最終濃度、１から１０ピコモル、具体的には４から６ピコモル、更に具体的には５ピコモルを意味する。
本発明の文脈において、テスト試料、標準試料、ＦＶＩＩ及びＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩから選択された少なくとも１個の他の因子が欠乏する血漿および／またはトロンビン生成反応開始成分は、液状またはフリーズドライ状であってもよい。フリーズドライ状の場合は、これらの合成物は、本発明の方法を実施するに先立ち、注射精製水（ＷＦＩ）等の適切な水性溶媒に懸濁状態に有利に保つことができる。
本発明の出願者は、これにより、テスト試料に存在する非活性化ＦＶＩＩ因子によって生じる不利な点を克服できる特定の実験条件に基づいて、テスト試料における活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルを測定する方法を開発した。
本方法の第１のステップは、活性化ＶＩＩ因子レベルが未知のテスト試料を、ＦＶＩＩＩ、および／またはＦＩＸおよび／またはＦＸＩが欠乏する血漿と混合し、できた混合物のＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの最終濃度が１０ピコモルから８０ピコモルの範囲とする。この血漿の性質に関わる特性と使用濃度の範囲との特定の組み合わせにより、本発明による活性化ＶＩＩ因子のレベルを測定する方法が実施可能となる。
次に、血漿中に含まれるプロトロンビンからトロンビンの生成を導く切断反応を誘発する目的で、トロンビン生成反応開始成分をテスト試料＋血漿の混合物に加える。ついで、トロンビン生成テストを行う。
トロンビン生成テスト（ＴＧＴ）は当業者に周知のテストである（トロンビン生成分析、臨床的関連文献：Ｈ．Ｃ・Ｈａｎｋｅｒ、Ｒ．Ａｌ・Ｄｉｅｒｉ・＆・Ｓ．Ｂeｇｕｉｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ、２００４、１１、１７０−５）。これにより、連続的にトロンビンの生成量と、当該試料をトロンビン生成反応開始成分と接触させたときのトロンビンの生成に要する時間を測定することが可能となる。
トロンビン生成テストは、当該試料が（または後者を含む溶液が）反応を開始させる成分と接触させると始まる。トロンビン生成テストの開始に対応する初期時間をｔ０とする。
次に、生成トロンビンは、顕示剤は、好適にはトロンビンによる分解により蛍光合成物が現れる蛍光剤、色素剤を用いて顕示される。有利には、蛍光剤または色素剤は、トロンビン生成反応開始成分と同時に試料＋血漿の混合物に添加する。
新しく生成されたトロンビンによって分解される蛍光剤から生じる蛍光は、蛍光光度計等の測定装置によって検出される。使用する蛍光光度計は蛍光の経時変化を記録またはプロットする手段を備えることが好適である。蛍光光度計によって収集されたデータによりトロンボグラムと呼ばれる蛍光の経時変化曲線を得ることができる。
トロンボグラムから次の４つのパラメータを測定することができる：
−ナノモルで表されるトロンビンのピーク高さ：反応の間時間ｔｍａｘに生成されるトロンビンの最高濃度に対応する；
−分で表される時間差：トロンビン生成テスト（ｔ０）の開始からトロンビンの出現までの経過時間に対応する；
−分で表されるピークまでの時間：ＴＧＴ（ｔ０）の開始から最大トロンビンが生成される時間ｔｍａｘまでの経過時間に対応；
−ナノモル／分で表されるトロンビン生成速度：ピークまでの時間ｔｍａｘと時間差との差で割ったピークの高さに対応
これらのパラメータはトロンビンの形成を測定するために使用する装置によって直接与えられることが有利である。
当該試料におけるＦＶＩＩａレベルが高いほど、トロンビンはより速く生成され、ピークまでの時間がより短く、かつ速度がより速い。
テスト試料の活性化ＶＩＩ因子のレベルを判断するために、既知の活性化ＶＩＩ因子レベルを含む標準試料から標準トロンボグラムを得る。上記のように、テスト試料として、異なるレベルの活性化ＶＩＩ因子を含む、少なくとも２つの標準試料を、ＦＶＩＩと、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１個の因子が欠乏する血漿と混合する。トロンビン生成反応開始成分を標準試料＋血漿の混合物に添加し、トロンビン生成テストを開始して各標準試料に対応する標準トロンボグラムを得る。
標準試料＋血漿の混合物のＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの濃度は、１０ピコモルから８０ピコモルからなる。標準試料＋血漿の混合物のＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの濃度は、テスト試料＋血漿の混合物のＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの濃度とほぼ等しいことが好適である。標準試料と混合された血漿は、テスト試料と混合されたものと等しいことが望ましい。
得られた標準トロンボグラムから、各標準試料に含まれる活性化ＶＩＩ因子のレベルと、トロンボグラムから抽出される１個のパラメータの間で補間を行う。
行う補間は、直線、幾何学的、三次元、多項式、ラグランジュまたはニュートンタイプのいずれでもよい。
行われる補間は、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としての時間差の変化、標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としてのピークまでの時間の変化、または標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としてのピークまでの速度の変化に対応することが望ましい。
このテスト試料のトロンボグラムから抽出されたパラメータのうちの少なくとも１個を標準トロンボグラムから行う補間に移すことによってテスト試料に含まれる活性化ＶＩＩ因子のレベルが判断される。移動するパラメータが時間差の場合は、使用する補間は標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としての時間差の変化に対応する。移動するパラメータがピークまでの時間の場合は、使用する補間は標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としてのピークまでの時間の変化に対応する。移動するパラメータが速度の場合は、使用する補間は標準試料における活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としての速度に対応する。
したがって、補間から判断されるＶＩＩ因子のレベルはテスト試料の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルに対応する。
本発明の方法は、補間によって判断される活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルからテスト試料における活性化凝固ＶＩＩ因子の濃度を計算する別の方法によってもよい。この場合は、活性化凝固ＶＩＩ因子の濃度は、次の公式によって得られる：
ＦＶＩＩａの濃度＝ＦＶＩＩａレベル×ＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの濃度
以下の各例は、その対象を限定せず本発明を説明するものである。
（実施例）
実施例１：ＦＶＩＩが欠乏する血漿の調整
精製ヒト血漿ＦＶＩＩをターゲットとする、ウサギで作られる多クローン性抗体を、ＣＮＢｒ−活性化セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共役させ、ついで得られたゲル２ｍＬをカラムに入れた。カラムは平衡化バッファ（ＮａＣｌ０．１５モル、クエン酸１０ミリモル、ｐＨ７．４）２５ｍＬで平衡化した。続いて、ヒト血漿６ｍＬを数回カラムを通した。係る条件下で、カラムに定着されて残ったＦＶＩＩ及び溶出液を回収した（ＦＩＩが欠乏する血漿）。カラムは、固定されたＦＶＩＩを再生バッファ２０ｍＬ（ＮａＣｌ５０ミリモル；グリシン０．１モル、ｐＨ２．４）で溶離して再生され、ついで、カラムを平衡化バッファ（クエン酸１０ミリモル；ＮａＣｌ０．１５モル、ｐＨ７．４）２０ｍＬで再度平衡処理した。
実施例２：ＦＩＩ及びＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩが欠乏する血漿の調整
精製ヒト血漿ＦＶＩＩをターゲットとする、ウサギで作られる多クローン性抗体を、ＣＮＢｒ−活性化セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共役させ、ついで得られたゲル２ｍＬをカラムに入れた。カラムは平衡化バッファ（ＮａＣｌ０．１５モル、クエン酸１０ミリモル、ｐＨ７．４）２５ｍＬで平衡化した。続いて、それぞれＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ・Ｓｔａｇｏ社より購入した予めＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩが欠失した工業用血漿６ｍＬを、数回カラムを通した。係る条件化で、カラムに定着されて残ったＦＶＩＩ及び溶出液を回収した（ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩ、ＦＩＸまたはＦＸＩを２倍欠乏する血漿）。カラムは、固定されたＦＶＩＩを再生バッファ２０ｍＬ（ＮａＣｌ５０ミリモル；グリシン０．１モル、ｐＨ２．４）で溶離して再生され、ついで、カラムを平衡化バッファ（クエン酸１０ミリモル；ＮａＣｌ０．１５モル、ｐＨ７．４）２０ｍＬで再度平衡処理した。
実施例３：濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ用として、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿から標準トロンボグラムの作成
ＮＩＢＳＣ社製、国際標準ＦＶＩＩ（ＳＩ−ＦＶＩＩ）および／またはＮＩＢＳＣ社、国際標準ＦＶＩＩａ（ＳＩ−ＦＶＩＩａ）及びＦＶＩＩＩ、（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製のＦＩＩＩが欠乏する血漿または実施例２のようにＦＶＩＩを欠失したタイプＡの血友病血漿）の適量の試料を取り、既知の活性化ＶＩＩ因子レベルを含む標準試料を得、それにＦＩＩが欠乏する血漿８０mＬ加え、濃度１０ピコモルから８０ピコモルからなるＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａとして０％から１００％の固定活性化ＶＩＩ因子レベルからなる混合物を得た。血漿及びＴＦ５ピコモルの最終濃度の時、リン脂質１マイクロモル、（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製、８６１９５ 試薬１：４に希釈）及びＣａ２１６．７ミリモル及びトロンビン−特定蛍光剤２０mＬ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製、８６１９７、Ｆｌｕｃａキット試薬）の試料の混合物に、トロンビン生成反応を開始させる２０mＬの因子（Ｃａ２＋、リン脂質及びＴＦ）を加える。
０％から１００％の既知の固定活性化ＶＩＩ因子レベル用のＴＧＴ標準曲線（標準トロンボグラム）を作成し、各種パラメータ（時間差、ピーク高さ、ピークまでの時間及び速度）を提供する標準トロンボグラムを得た。トロンビン形成時間測定用、トロンボグラム（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ・ＢＶ）を作成するための、励起波長３９０ｎｍ、転送波長４６０ｎｍ用ソフトウェア付き蛍光検出器（Ｆｌｏｒｏｓｋａｎ−Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ）を用いて、トロンボグラムを作成する。
図１は、血漿／試料の混合物中、最終５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得た標準トロンボグラムと、０から１００％の範囲の各活性化ＶＩＩ因子レベルを示す。試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベル増加の関数として、ピーク時の時間差及びトロンビン形成時間の減少が観察される。ピークまでの時間は、１００％の活性化因子レベルでは１４分と見積もられる限界に達する。ＦＶＩまたはＦＶＩＩａを加えないＦＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿ＦＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿はトロンビン形成を生じないことがわかる。
図２及び２ａは、試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、時間差及びピークまでの時間の変化をそれぞれ示す。
得られた結果は、試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルと血漿／試料の混合物中の濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの得られたトロンボグラムから推定される各パラメータとの相関関係を示す。
実施例４：濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ用、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＸが欠乏する血漿から標準トロンボグラムの作成
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ・Ｓｔａｇｏ社製のＦＩＸが欠乏する反応性血漿を用いて、実施例１及び２の手順に従いＦＶＩＩを削減した実施例３の実験を繰り返す。
図３は、血漿／試料の混合物中、５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得たトロンボグラムを示し、前記血漿はＦＶＩＩ及びＦＩＸが欠乏する。試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルが増加する関数として、ピーク時の時間差及びトロンビン形成時間の減少が見られる。活性化ＶＩＩ因子のレベルが１００％の時、１６分と推定されるピークまでの時間が限界に達する。ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩａを加えず、ＦＩＩ及びＦＶＩＸが欠乏する血漿はトロンビン形成を生じないことが分かる。
図４、５、及び６はそれぞれ試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルの関数としての時間差、ピークまでの時間及び速度の変化を示す。
得られた結果は、試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルと、血漿／試料の混合物中５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得られたトロンボグラムから推定される各パラメータとの間に相関関係が得られることを示し、前記血漿はＦＶＩＩ及びＦＩＸが欠乏する。
実施例５：濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ用、ＦＩＩ及びＦＸＩが欠乏する血漿から得た標準トロンボグラムの作成
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社製、ＦＸＩが欠乏する反応性血漿を用い実施例３の実験を繰り返し、実施例１及び２の手順に従いＦＶＩＩを削減した。
図７は、血漿／試料の混合物中、５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得たトロンボグラムを示し、前記血漿は、ＦＶＩＩ及びＦＸＩが欠乏する。試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルが増加する関数として、ピーク時の時間差及びトロンビン形成時間の減少が見られる。活性化ＶＩＩ因子のレベルが１００％の時、１２分と推定されるピークまでの時間が限界に達する。ＦＩＩまたはＦＶＩＩａを加えないＦＩＩが及びＦＸＩ欠乏する血漿はトロンビン形成を生じないことがわかる。
図８、９、１０及び１１は、それぞれ試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度における変化をしめす。
得られた結果から、試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルと血漿／試料の混合物中５０ピコモルのＦＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得られたトロンボグラムから推定されるそれぞれのパラメータとの間に相関関係が確立されることが分かる。前記血漿は、ＦＩＩ及びＦＸＩが欠乏する。
実施例６：濃度１０ピコモルのＦＩＩ＋ＦＶＩＩａ用、ＦＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿から標準トロンボグラムの作成
最終濃度１０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａを使い、実施例３の実験を繰り返す。
図１２は、血漿／試料の混合物中、１０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得られたトロンボグラムを示し、前記血漿はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する。試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルが増加する関数として、時間差及びピーク時のトロンビン形成時間の減少が観察される。活性化ＶＩＩ因子レベルが１００％の時２１分と見積もられるピークまでの時間が、限界に達する。ＦＩＩまたはＦＶＩＩａを加えないＦＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿は、トロンビン形成を生じないことが分かる。
図１３、１４、１５及び１６は、試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、時間差、ピークまでの時間、ピーク高さ及び速度の変化をそれぞれ示す。得られた結果は、血漿／試料の混合物中、活性化ＶＩＩ因子レベルと、１０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得られたトロンボグラムから推定される各パラメータとの相関関係が確立できることを示す。前記血漿は、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する。
実施例７：濃度８０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａ用、ＦＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿標準トロンボグラムの作成
最終濃度８０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａを用いて、実施例３の実験を繰り返す。
図１７は、血漿／試料の混合物中、８０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得たトロンボグラムを示し、前記血漿はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する。試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルが増加する関数として、ピーク時のトロンビン形成時間の減少が観察される。ピークまでの時間は、活性化ＶＩＩ因子レベルが１００％のとき１２分と見積もられる限界に達する。ＦＩＩまたはＦＶＩＩａを加えない、ＦＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿はトロンビン形成を起こしえないことが分かる。
図１８及び１９は、試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルの関数としての時間差及びピークまでの時間の変化をそれぞれ示す。
得られた結果は、試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルと血漿／試料の混合物中、８０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得たトロンボグラムから推定される各パラメータとの相関関係が確立できることを示す。前記血漿は、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する。
実施例８：ＦＶＩＩを含むウサギの母乳の試料の活性化ＶＩＩ因子レベルの測定
対象試料は、活性化ＶＩＩ因子のレベルが未知で、ＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの濃度が５００ピコモルである。
上記のように、８mＬの対象試料とＦＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿７２mＬと混合する。このようにして、体積８０mＬ、濃度５０ピコモルのＦＩＩ＋ＦＶＩＩａのテスト用反応混合物が得られる。次に、ＴＦの最終濃度５ピコモル、リン脂質１マイクロモル（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社、８６１９５試薬、１：４希釈済み）、及びトロンビン−特定石灰質蛍光剤２０mＬ（Ｃａ２＋、最終濃度１６．７ミリモル）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社、８６１９７、Fｕｌｃｒａキット試薬）の時、トロンビン生成反応開始成分（リン脂質及びＴＦ）を２０mＬ加えた。
トロンボグラム及び対応する各パラメータ：すなわち時間差及びピークまでの時間を得るためにＴＧＴを行った。
同時に、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａの試料（国際標準ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａ、ＮＩＢＳＣ社製）を混合し、活性化ＶＩＩ因子レベルは既知であって、０％から１００％からなる標準試料を得た。上記のように、これらの標準試料とＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿を混合し、濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａを得た。次に、トロンビン生成反応開始成分（リン脂質及びＴＦ）を試料／血漿の混合物に加え、最終濃度５ピコモルのＴＦ及び１マイクロモルのリン脂質を得た（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ社、８６１９５試薬、１：４希釈済み）。最後に、トロンビン−特定石灰質蛍光剤２０mＬ（最終濃度１６．７ミリモルのＣａ２＋）（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ・Ｓｔａｇｏ社、８６１９７、Ｆｕｌｃｒａキット試薬）を先の混合物に加えた。標準トロンボグラムの各パラメータを測定し、活性化ＶＩＩ因子のレベルの−ｌｏｇの関数としての、各パラメータの標準曲線をプロットした（図２及び２ａ及び表１参照）。
テスト対象の試料を含む混合物のトロンボグラムから得た各パラメータ値を各標準曲線に移し、テスト対象の試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルを測定値を推定できるようにした。時間差６分３０秒、ピーク時間１８分が得られ、これらの数値を各標準曲線に移動し、試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルの測定値、２０％が推定される。
実施例９：トロンビン生成テストにたいするウサギ母乳の影響
実施例３の実験を繰り返す。ただし、予め希釈した標準試料は、ヒト血清アルブミン（ＯＫバッファ−１％ＨＳＡ）１％を含む、またはウサギ母乳を含むＯＫバッファ−１％ＨＳＡウォーレンコラーバッファー中に既知の活性化ＶＩＩ因子レベルを含む。
図２０は、０から１００％の活性化ＶＩＩ因子レベルの、血漿／試料の混合物中、最終５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの存在下で得た標準トロンボグラムウを示す。ＯＫバッファ１％のＨＳＡを予め希釈した試料、及びＯＫバッファ１％のＨＳＡ中にウサギ母乳を含む予め希釈した試料のトロンボグラムは、完全に重なることが観察でき、ウサギ母乳はＴＧＴに何ら影響を与えないことが推定できる。ＦＩＩまたはＦＶＩＩａを加えずＦＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する血漿は、トロンビン形成を生じないことが分かる。
図２１、２２及び２３は、それぞれ０％から１００％の既知の固定活性化ＶＩＩ因子レベル用の、ウサギ母乳を含む予め希釈した試料、ＴｐＯＫ１％のＨＳＡ中の活性化ＶＩＩ因子レベルの関数として、トロンボグラム、時間差における変化及びピークまでの時間を示す。
得られた結果は、実施例３と同様、ウサギ母乳を含む試料中の活性化ＶＩＩ因子レベルと血漿／試料の混合物中、濃度５０ピコモルのＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａのトロンボグラムから推定される各パラメータとの間の相関関係が確立できることを示す。
Figure 2011526691
本発明は、試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）のレベルを測定する方法に関し、血液凝固の活性化凝固因子の判定に応用できる。

Claims (12)

  1. テスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルを測定する方法であって、
    ａ）前記テスト試料をＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）が欠乏しかつＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、ＦＶＩＸ因子（ＦＩＸ）及びＸＩ因子（ＦＸＩ）から選ばれた少なくとも他の１つの因子が欠乏する血漿と混合する工程であって、テスト試料＋血漿の混合物はＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの最終濃度が１０ピコモルから８０ピコモルの範囲となるように混合する工程と；
    ｂ）トロンビン生成反応開始成分を加える工程と；
    ｃ）工程ｂ）の混合物にトロンビン生成テスト（ＴＧＴ）を行いトロンボグラムを得る工程と；
    ｄ）工程ｃ）のトロンボグラムのパラメータのうちの少なくとも１つを標準試料に基づいて作成した、活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルが既知であって各標準試料間で異なる標準トロンボグラムから得た相同のパラメータと比較する工程と；
    ｅ）工程ｄ）からテスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルの測定値を推定する工程とからなる、テスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルを測定する方法。
  2. 各前記標準トロンボグラムは、
    （ｉ）活性化凝固ＶＩＩ因子のレベルが既知の標準試料、
    （ｉｉ）ＦＶＩＩが欠乏しかつＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選ばれた少なくとも他の１つの因子が欠乏する血漿であって、テスト試料＋血漿の混合物はＦＶＩＩ＋ＦＶＩＩａの最終濃度が１０ピコモルから８０ピコモルの範囲となる混合物である、及び
    （ｉｉｉ）トロンビン生成反応開始成分
    を含む混合物にトロンビン生成テストを行うことによって得られる、請求項１に記載の方法。
  3. 工程ｄ）において、前記比較されるトロンボグラムのパラメータは、時間差、ピークまでの時間及び速度から選択される、請求項１及び２いずれかに記載の方法。
  4. 前記血漿はＦＶＩＩ及びＦＩＸが欠乏、またはＦＶＩＩ及びＦＸＩが欠乏する、請求項３に記載の方法。
  5. 工程ｄ）において、前記比較されるトロンボグラムのパラメータは時間差及びピークまでの時間から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  6. 前記血漿はＦＶＩＩ及びＦＶＩＩＩが欠乏する、請求項５に記載の方法。
  7. テスト試料＋血漿及び標準試料＋血漿の混合物は、ＦＩＩが欠乏しかつＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくともその他１つの因子が欠乏する同じ血漿を使って作られる、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
  8. トロンビン生成を開始する前記成分は組織因子（ＴＦ）、リン脂質及びＣａ２からなり、試料＋血漿＋開始成分の混合物中の前記組織因子の最終濃度は１から１０ピコモルの範囲内からなり、試料＋血漿＋開始成分の混合物中の前記リン脂質の最終濃度は、０．１から５マイクロモルの範囲からなり、試料＋血漿＋開始成分の混合物中のＣａ２＋の最終濃度は１４から１８ミリモルの範囲内からなる、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. テスト試料は遺伝子組み換え哺乳動物の母乳または無血清細胞培養基の試料である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. レベルが測定される活性化ＦＶＩＩ因子は血漿由来（ｐＦＶＩＩａ）、組み換え由来（ｒＦＶＩＩａ）または遺伝子組み換え由来（ＴｇＦＶＩＩａ）である、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
  11. 更に、工程ｅ）で決まるレベルから前記テスト試料中の活性化凝固ＶＩＩ因子の濃度を計算する工程ｆ）からなる、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. テスト試料中の活性化ＶＩＩ因子のレベルを測定するための、ＦＩＩが欠乏する血漿及びＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸＩから選択される少なくとも１個の他の因子の使用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6883899B1 (ja) * 2020-12-07 2021-06-09 株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ 血液凝固検査試薬、および血液凝固検査方法
JP7152084B1 (ja) * 2022-02-22 2022-10-12 株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ 組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103185710B (zh) * 2013-02-04 2015-01-07 中国医学科学院输血研究所 人静脉注射免疫球蛋白中活化凝血因子ⅺ检测方法
TWI701435B (zh) * 2014-09-26 2020-08-11 日商中外製藥股份有限公司 測定ｆｖｉｉｉ的反應性之方法
TWI700300B (zh) 2014-09-26 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 中和具有第ｖｉｉｉ凝血因子（ｆｖｉｉｉ）機能替代活性的物質之抗體
CN106093440A (zh) * 2016-06-06 2016-11-09 中国人民解放军总医院 一种用于检测人体血液凝集功能的诊断试剂及其制备方法与使用方法
CN107796793B (zh) * 2017-09-28 2020-04-10 中国科学技术大学 FXa的检测试剂及检测方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06506601A (ja) * 1991-04-10 1994-07-28 オゥクラホゥマ、メディカル、リサーチ、ファウンデイシャン 活性化因子ｖｉｉに関する定量的凝血検定
JP2002519703A (ja) * 1998-07-01 2002-07-02 シグマ−アルドリッチ・カンパニー Ｐｔ、及び、ａｐｔｔ分析のための血液凝固コントロール
US20030211460A1 (en) * 2000-06-30 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. Methods for detecting activity of clottings factors
JP2005520124A (ja) * 2001-07-03 2005-07-07 オゥクラホゥマ、メディカル、リサーチ、ファウンデイシャン 第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を測定するためのアッセイ
JP2005528097A (ja) * 2002-05-01 2005-09-22 シナプス ベスローテン フェンノートシャップ 複合生物媒体における、一時的なタンパク質分解活性の濃度を決定するための診断試験
WO2006117246A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 Synapse B.V. Measuring thrombin activity in whole blood
JP2008530208A (ja) * 2005-02-16 2008-08-07 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ 万能前凝固薬
JP2010515045A (ja) * 2006-12-29 2010-05-06 エルエフビー バイオテクノロジーズ ソサイエテ パー アクションズ シンプリフィー ユニパーソンネリー サンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法及びこの方法を実施するために用いるキット、そして因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE122007000007I1 (de) * 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
CA2080428C (en) * 1991-10-22 2004-01-27 Ray F. Ebert A method for preparing a thromboplastin reagent from cultured cells that is suitable for use in the prothrombin time test
WO2007018511A1 (en) * 2005-07-28 2007-02-15 American Diagnostica Inc. Lupus anticoagulant testing
FR2892724B1 (fr) * 2005-11-02 2008-01-04 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxiques diriges contre des anticorps inhibiteurs du facteur viii.
FR2894145B1 (fr) * 2005-12-07 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation de facteur h du complement a titre de medicament
FR2895262B1 (fr) * 2005-12-22 2009-07-17 Lab Francais Du Fractionnement Inhibition de la reponse immunitaire anti-fviii
FR2897868B1 (fr) * 2006-02-24 2012-08-31 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps anti-idiotypiques neutralisant l'activite inhibitrice d'un anticorps inhibiteur dirige contre le domaine c1 du facteur viii.
FR2901707B1 (fr) * 2006-05-31 2017-09-29 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
FR2904558B1 (fr) * 2006-08-01 2008-10-17 Lab Francais Du Fractionnement "composition de facteur vii recombinant ou transgenique, presentant majoritairement des formes glycanniques biantennees, bisialylees et non fucosylees"
EP1985631A1 (en) * 2007-04-20 2008-10-29 LFB Biotechnologies Demannosylated recombinant factor VIII for the treatment of patients with hemophiila A
FR2918375B1 (fr) * 2007-07-05 2009-10-16 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation d'un support de chromatographie pour reduire la quantite d'adamts13 dans une solution derivee du plasma
FR2920429B1 (fr) * 2007-08-30 2012-10-05 Lfb Biotechnologies Procede de purification du facteur viii et du facteur von willebrand

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06506601A (ja) * 1991-04-10 1994-07-28 オゥクラホゥマ、メディカル、リサーチ、ファウンデイシャン 活性化因子ｖｉｉに関する定量的凝血検定
JP2002519703A (ja) * 1998-07-01 2002-07-02 シグマ−アルドリッチ・カンパニー Ｐｔ、及び、ａｐｔｔ分析のための血液凝固コントロール
US20030211460A1 (en) * 2000-06-30 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. Methods for detecting activity of clottings factors
JP2005520124A (ja) * 2001-07-03 2005-07-07 オゥクラホゥマ、メディカル、リサーチ、ファウンデイシャン 第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を測定するためのアッセイ
JP2005528097A (ja) * 2002-05-01 2005-09-22 シナプス ベスローテン フェンノートシャップ 複合生物媒体における、一時的なタンパク質分解活性の濃度を決定するための診断試験
JP2008530208A (ja) * 2005-02-16 2008-08-07 ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・イリノイ 万能前凝固薬
WO2006117246A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-09 Synapse B.V. Measuring thrombin activity in whole blood
JP2010515045A (ja) * 2006-12-29 2010-05-06 エルエフビー バイオテクノロジーズ ソサイエテ パー アクションズ シンプリフィー ユニパーソンネリー サンプル中の因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法及びこの方法を実施するために用いるキット、そして因子を欠失した血漿を用いてサンプル中の因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の濃度を測定する方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012041655; Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｌ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ Ｖｏｌ．１４，　Ｎｏ．５，　Ｐａｇｅ．５０５-５１１, 2003 *
JPN6012041657; Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏａｇｕｌ　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ Ｖｏｌ．１１，　Ｓｕｐｐｌ１，　Ｐａｇｅ．Ｓ１５９-Ｓ１６４, 2000 *
JPN6012041660; Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌ．８１，　Ｎｏ．３，　Ｐａｇｅ．７３４-７４４, 1993 *
JPN6012041663; Ａｎｅｓｔｈ　Ａｎａｌｇ Ｖｏｌ．１０３，　Ｎｏ．４，　Ｐａｇｅ．８４１-８４５, 2006 *
JPN6012041666; Ａｃｔａ　Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｏｌ　Ｓｃａｎｄ Ｖｏｌ．４９，　Ｎｏ．２，　Ｐａｇｅ．２２２-２３１, 2005 *
JPN6012041667; Ｂｌｏｏｄ Ｖｏｌ．１０６，　Ｎｏ．１１，　Ｐａｒｔ１，　Ｐａｇｅ．６０５Ａ, 2005 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6883899B1 (ja) * 2020-12-07 2021-06-09 株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ 血液凝固検査試薬、および血液凝固検査方法
WO2022123827A1 (ja) * 2020-12-07 2022-06-16 株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ 血液凝固検査試薬、および血液凝固検査方法
JP7152084B1 (ja) * 2022-02-22 2022-10-12 株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ 組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法

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