JP2005520124A - 第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を測定するためのアッセイ - Google Patents
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Abstract
第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度を決定するための方法を開示しており、この方法は、組織因子の血管内曝露レベルを評価し、凝固能亢進またはその他の凝固障害に対する患者の危険性を評価し、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に関して経時的に患者をモニタし、それによって、凝固能亢進またはその他の凝固障害の危険性、および／または抗凝固療法の有効性の変化を明らかにすることができる。第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度を決定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで使用するのに適する抗体と、その作製方法も開示する。
Description
本出願は、２００１年７月３日出願の、米国仮出願第６０／３０２，８６７号の利益を請求するものである。
本出願は、血液凝固障害のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに関する。
血液が凝固する仕組みの代謝回転度を測定するために、いくつかの臨床アッセイが開発されている。これらのアッセイは、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）などの凝固障害の重篤さを評価するために、日常的に使用されている。これらのアッセイの多くは、凝固能亢進状態、すなわち深静脈血栓症（ＤＶＴ）、心臓発作、虚血性発作、またはその他の血栓性および血栓塞栓性障害に人が罹り易くなる可能性のある状態を予測する際の、それらの有用性に関しても調査がなされている。そのようなアッセイの例として、フィブリノペプチドＡ、トロンビン−アンチトロンビン複合体、プロトロンビン断片１＋２、Ｄ−ダイマー、および第ＶＩＩａ因子の血漿濃度の測定がある（Ａｍｉｒａｌ，Ｊ．およびＦａｒｅｅｄ，Ｊ．（１９６６）「Ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｎｅｗ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２２ Ｓｕｐｐｌ、１：４１〜４８；Ｇｏｕｉｎ−Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｉ．およびＳａｍａｍａ，Ｍ．Ｍ．１９９９「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉｃ ｓｔａｔｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ」Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２５：１６７〜１７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．他、１９９３「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｍｕｔａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」Ｂｌｏｏｄ ８１：７３４〜７４４；およびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．１９９６「Ｐｌａｓｍａ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ」Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ２６：６６〜７１）。これらのアッセイによれば、生体内で血液が凝固する仕組みが活性化する進行の度合いを推察することが可能である。例えば、フィブリノペプチドＡおよびＤ−ダイマーの濃度は、フィブリノゲンがフィブリンに変換される程度を表している。トロンビン−アンチトロンビン複合体およびプロトロンビン断片１＋２の濃度は、プロトロンビンが生体内でトロンビンに変換される程度を表している。血漿中のトロンビン活性レベルは、その活性酵素が極めて短い血漿半減期を有するので（血漿中のプロテアーゼ阻害剤の含量が高いため）、直接測定することはできない。したがって、アンチトロンビン（以前はアンチトロンビンＩＩＩまたはＡＴＩＩＩと呼ばれた）が血漿中のトロンビンの主な阻害剤であり、またこれらの複合体はトロンビンよりもその半減期が非常に長いので、トロンビン−アンチトロンビン複合体の濃度は、生体内でトロンビン活性化が進行する速度を表す。同様に、プロトロンビン断片１＋２は、活性化してトロンビンになるときにプロトロンビンから放出され、またこれらの断片は、測定可能な濃度で血漿中を循環することができる。このため、血漿中のトロンビン−アンチトロンビン複合体またはプロトロンビン断片１＋２の測定値は、生体内でトロンビン生成が進行する速度を表すと考えられる。
トロンビンの活性化に特異的なものの他、その他の血液凝固因子の活性化に関しても、その血漿マーカーを測定するアッセイが開発されている。第ＩＸおよびＸ因子の場合、トロンビンの場合と同様に、活性プロテアーゼ（第ＩＸａおよびＸａ因子）の血漿中での半減期が非常に短く、したがってその濃度を直接測定することができない。しかし、プロトロンビンと同様に、第ＩＸおよびＸ因子の活性化度を間接的に評価するアッセイが開発されている。ある一組の方法では、第ＩＸおよびＸ因子から放出された活性化ペプチドの血漿濃度を、それらが第ＩＸａおよびＸａ因子に変換されるときに測定する。これらの活性化ペプチドは、活性化したプロテアーゼそのものの場合よりも非常に長い半減期で循環し、そのような活性化ペプチドの濃度の測定に基づいたアッセイが開発されて、様々な疫学研究に利用されている（Ｂａｕｅｒ，Ｋ．Ａ．１９９４「Ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １：３４１〜３４６；Ｂａｕｅｒ、Ｋ．Ａ．１９９９「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌ １２：３８７〜４０６；およびＣｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ａ．他、２０００「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｒｙ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２：２８１６〜２８２２）。
第ＩＸまたはＸ因子の活性化が進行する速度を評価する別の方法は、循環する第ＩＸａ因子または第Ｘａ因子とその血漿阻害剤との複合体の濃度を測定することである。この方法は、第ＩＸａ因子−アンチトロンビン複合体に関して行われ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、１９９１「Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＩＸ−ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ：ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ａｎ ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ」Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １１８：３１７〜３２５）、また第Ｘａ−アンチトロンビン複合体に関して行われる（Ｇｏｕｉｎ−Ｔｈｉｂａｕｌｔ，Ｉ．他、１９９５「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ Ｘａ−ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ ｉｎ ｐｌａｓｍａ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９０：６６９〜６８０；Ｂａｕｅｒ，Ｋ．Ａ．１９９４「Ｎｅｗ ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １：３４１〜３４６；およびＢａｕｅｒ，Ｋ．Ａ．１９９９「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ Ｒｅｓ Ｃｌｉｎ Ｈａｅｍａｔｏｌ １２：３８７〜４０６）。さらに、第Ｘａ因子と外因系凝固インヒビター（ＴＦＰＩ）との複合体の循環レベルを測定するためのアッセイも開発されている（Ｏｋｕｇａｗａ，Ｙ．他、２０００「Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｐｌａｓｍａ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ Ｘ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ６５：２１０〜２１４；Ｉｖｅｒｓｅｎ，Ｎ．他、２０００「Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ）ｉｎ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ Ｘ−ＴＦＰＩ ｃｏｍｐｌｅｘ」、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ １１：５９１〜５９８；Ｉｖｅｒｓｅｎ，Ｎ．他、２０００「Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＴＦＰＩ）ｉｎ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ Ｘ−ＴＦＰＩ ｃｏｍｐｌｅｘ」、Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ １１：５９１〜５９８；およびＭｉｌｌｅｒ，Ｇ．Ｊ．２０００「Ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｆｆｅｒｅｎｔ ｌｙｍｐｈ」、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８３：４２７〜４３２）。
凝固第ＶＩＩ因子は、ペプチド単結合のタンパク質分解によって、活性化した形の第ＶＩＩａ因子に変換されるものであり、これは活性化ペプチドの放出に伴うものではない（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．２００１「Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ他編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、第８９〜１０１頁）。このため、プロトロンビンあるいは第ＩＸまたはＸ因子の場合に行われるように活性化ペプチド・アッセイを使用して、第ＶＩＩ因子の活性化をモニタすることはできない。しかし、第ＶＩＩａ因子はその血漿半減期が比較的長く（約２時間）、したがって、特に血漿中の活性な第ＶＩＩａ因子の濃度を測定することが可能な凝固活性を開発することができた（組織因子の突然変異形態に基づいて）（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．他、１９９３「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｍｕｔａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｂｌｏｏｄ ８１：７３４〜７４４）。
血液が凝固する仕組みは、第ＶＩＩまたはＶＩＩａ因子が細胞表面の組織因子（内在性膜タンパク質）に結合するときに開始するので、第ＶＩＩａ因子の血漿濃度を測定することが注目されている。得られる第ＶＩＩａ因子と組織因子との膜結合複合体は、最も有効な既知の血液凝固開始剤である。組織因子は、通常、血管構造の外側の細胞にのみ存在し、血管損傷後の通常の血流遮断において血液の凝固を引き起こし、それによって血液が組織因子に接触するようになる。組織因子の発現は、炎症性伝達物質によって、単球および内皮細胞上に誘発される。誘発された組織因子の発現は、いくつかの血栓性障害を引き起こす血液凝固の病理学的活性化の一因になると考えられる（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．２００１「Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ他編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、第８９〜１０１頁）。
第ＶＩＩａ因子は、その補因子である組織因子が存在しない状態ではどの血漿プロテアーゼ阻害剤とも本質的に反応しないので、血漿中での半減期が長い（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．２００１「Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：Ｂａｓｉｃ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｒ．Ｗ．Ｃｏｌｍａｎ他編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、第８９〜１０１頁）。しかし、第ＶＩＩａ因子が組織因子に結合すると、アンチトロンビンとＴＦＰＩの両方による阻害を受け易くなる。興味深いことに、組織因子に結合した第ＶＩＩａ因子がアンチトロンビンと反応した場合、得られた第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン（第ＶＩＩａ因子−ＡＴ）複合体は、組織因子に対する親和性を失う。その結果、これらの複合体は、一度形成されると溶中に放出される（Ｈａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．およびＫｉｓｉｅｌ，Ｗ．、１９９８「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ（ＧＡＧＳ） ｏｎ ｔｈｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ−ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ」、Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ６８：６７〜７８；Ｋｏｎｄｏ，Ｓ．およびＫｉｓｉｅｌ，Ｗ．、１９８７「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ ｉｎ ｐｌａｓｍａ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ ｉｓ ｔｈｅ ｓｏｌｅ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ」、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ４６：３２５；Ｌｏｗｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．他、１９９３「Ｃｏｍｐｌｅｘ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ ｂｙ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ ａｎｄ ｈｅｐａｒｉｎ」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：７６７〜７７０；およびＲａｏ，Ｌ．Ｖ．Ｍ．他、１９９３「Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐｅｒｍｉｔｓ ｒａｐｉｄ ａｎｔｉｔｈｏｒｍｂｉｎ ＩＩＩ／ｈｅｐａｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ」、Ｂｌｏｏｄ ８１：２６００〜２６０７）。
第ＶＩＩａ因子は、組織因子に結合したときにアンチトロンビンによる阻害のみ受け易く、また得られる第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体は組織因子から放出されるので、循環する第ＶＩＩａ因子−ＡＴの濃度は、組織因子が血液に曝される度合いを表している。そのような組織因子の血管内曝露は、炎症状態から生じることが予測され、実際に、敗血症に付随する致死性凝固障害を引き起こすことが既に示されている（Ｄｅ Ｂｏｅｒ，Ｊ．Ｐ．他、１９９３「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｅｔｈａｌ ｏｒ ｓｕｂｌｅｔｈａｌ ｄｏｓｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」、Ｃｉｒｃ Ｓｈｏｃｋ ３９：５９〜６７；Ｄｒａｋｅ，Ｔ．Ａ．他、１９９３「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ，ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ，ａｎｄ Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ ｉｎ ｂａｂｏｏｎｓ ｗｉｔｈ ｌｅｔｈａｌ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｅｐｓｉｓ」、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １４２：１４５８〜１４７０ｂ；およびＴａｙｌｏｒ，Ｆ．Ｂ．他、１９９１「Ｌｅｔｈａｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｅｐｔｉｃ ｓｈｏｃｋ ｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」、Ｃｉｒｃ Ｓｈｏｃｋ ３３：１２７〜１３４）。さらに、おそらくは慢性の炎症状態が原因で進行する組織因子の血管内曝露は、血栓性疾患の発症につながる可能性のある凝固能亢進状態の一因となる可能性がある。このため、組織因子の血管内曝露レベルを評価できるようにすることが注目されている。
現在、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の測定可能な濃度が血漿中に見られ、組織因子の血管内曝露レベルを評価するのに使用できることがわかった。血漿中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の濃度が測定されるよう、ＥＬＩＳＡアッセイを開発した。ＥＬＩＳＡで使用される抗体と、患者のリスクを評価しまたは抗凝固療法をモニタするためにこのアッセイを使用した方法も開示する。
血管損傷または慢性炎症状態によって生じる進行性の組織因子の血管内曝露は、日常的に血栓性疾患の発症に至る凝固能亢進状態の一因になる可能性がある。本発明によれば、患者が凝固能亢進状態に入る危険性の診断評価は、患者の血漿中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の量を測定することによって行うことができ、循環する第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の濃度は、組織因子が血管内に曝露される程度を表すと見なされる。経時的に患者をモニタすることにより、患者の循環第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の濃度の増加または減少を使用して、凝固能亢進状態に入った危険性がそれぞれ高まりまたは低下したことを示すことができる。
本発明によれば、循環する第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の測定可能な濃度を患者の血漿中に検出することができる。患者の血漿中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫アッセイにより測定することができる。そのような免疫アッセイでは、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の存在を検出するための抗体を、液相で利用することができ、または固相担体に結合させることができる。第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体に対する抗体は、酵素標識、放射性同位元素標識、非放射性標識、毒素標識、および化学発光標識を含むがこれらに限定することのない当技術分野で知られている任意の様々な標識および標識方法を使用して、標識することができる。これらの標識と抗体との結合は、当技術分野で周知の技法を使用して行うことができる（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第３１９〜３５８頁）。当技術分野で知られている方法によって第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を測定するため、競合的放射免疫測定法を使用することができる。
第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を測定する好ましい方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。例えば、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を検出することが可能なモノクローナル抗体は、２サイト・アッセイやサンドイッチ・アッセイなどのイムノメトリック・アッセイで利用することができる。典型的なサンドイッチ・アッセイでは、ある量の非標識抗原を、固相抗体を用いて固体の支持体に結合し、ある量の検出可能な標識済み可溶性抗体を加えて、固相抗体、抗原、および標識済み抗体の間で形成された複合体の検出および／または定量を可能にする（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；１９９１；第２．０．１〜２．１．１８頁）。また、逆ＥＬＩＳＡを使用することも考えられ、すなわちプレートを、アンチトロンビンと第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体に対する抗体で被覆して、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に対する抗体で検出することができる。
本発明によれば、患者の血漿中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体は、実施例１または実施例２に示すサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定することが好ましい。サンドイッチ・アッセイでは、一次捕捉抗体を、固相抗体として利用する。好ましい実施形態では、本発明の方法で一次捕捉抗体として使用されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、すなわち標的抗原に対する抗体が選択されるよう特にアフィニティ精製を行ったモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が、標準的な手順を使用して第ＶＩＩまたはＶＩＩａ因子に対して産生される。第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に対するアフィニティ精製済みのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用することができる。適切な抗体は、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ ＥＬＩＳＡ法も含め、本発明の方法で機能させるのに必要なその性質について試験をすることにより選択される。一次捕捉抗体として選択された抗体は、標的抗原に対する特異性および適切な親和性を有するだけではなく、カルシウム非依存性結合（第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に結合する能力（カルシウム・イオンが存在しない状態であっても）および第ＶＩＩａ因子に結合する能力（アンチトロンビンと複合した状態であっても））を示さなければならない。これらの性質は、本明細書で述べる試験手順を利用することによって確かめることができる。第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子は複数のカルシウム・イオンに結合するので、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に対して産生された多くの抗体は、カルシウム・イオンが存在する場合のみこの抗原に結合することに留意されたい。さらに、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子に対して産生された大部分の抗体は、第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子の両方に十分均等に結合することになる。
カルシウム非依存性結合は、以下のように決定することができる。初めに、ＥＬＩＳＡや放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、またはその他の適切な技法などの標準的な手順を使用して、第ＶＩＩまたはＶＩＩａ因子との反応性に関してモノクローナル抗体をスクリーニングする。どのような方法を使用しても、第ＶＩＩ因子に対する抗体の結合に関するスクリーニングは、カルシウム・イオンが存在しない状態で抗体が第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子と確実に結合するように、ＥＤＴＡやＥＧＴＡなどのカルシウム・キレート剤の存在下（一般に１０ｍＭで十分である）で行わなければならない。ＥＤＴＡの存在下で結合が減少する抗体のみについて、さらに検討する。
アンチトロンビンの存在下で結合する能力は、以下のように決定することができる。第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体（ＶＩＩａ−ＡＴ）は、本明細書で述べるように調製する。候補抗ＶＩＩ／ＶＩＩａ抗体を、実施例１および実施例２で述べるようにマイクロタイター・プレート上に被覆する。第ＶＩＩａ因子−ＡＴとの反応性は、アンチトロンビンに対する抗体を使用して検出する。アンチトロンビンが第ＶＩＩａ因子に結合するときにそのエピトープが不明瞭な第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に対する抗体は、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体に結合することができず、したがってこのＥＬＩＳＡでプラスのシグナルを与えることができない。プラスのシグナルとは、バックグラウンドを超えるシグナルの増加である。バックグラウンドは、プレートに結合した無関係な対照抗体を使用することによって決定される。
ＡＴに対する抗体はいくつかの供給元から市販されており、適切なものは、アンチトロンビンのエピトープが不明瞭でその後に第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体と結合することができないか否かを試験するのに第ＶＩＩａ／ＶＩＩ因子に対する抗体を使用する他は、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体との結合に関する上記試験と同様の試験によって、選択することができる。実施例１に示すように、例示的な捕捉抗体は、抗体＃１１７２と呼ばれるヒト第ＶＩＩ因子に対するＩｇＧ１マウスモノクローナル抗体であって（寄託者の品名＃１１７２でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡに寄託され、かつＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−３４９７が与えられた、ハイブリドーマ細胞）、カルシウムに依存しない手法で第ＶＩＩまたはＶＩＩａ因子に結合するものであり、またそのエピトープは、第ＶＩＩａ因子がアンチトロンビンと反応したときに妨害されないので、抗体＃１１７２は第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体も認識する。一次捕捉抗体は、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体のＡＴ部分を認識することが可能な抗体でもよく、ただし第ＶＩＩａ因子がアンチトロンビンと反応して第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を形成するときに、そのエピトープが妨害されないことを条件とする。一次捕捉抗体に変更を加え、その機能を、アッセイの間保つことも考えられる。例えば、既知の方法を使用してＦａｂまたはＦａｂ’２断片を調製し、そのような断片をアッセイに使用することができる。
一次捕捉抗体を、ポリスチレン９６ウェル・プレートなどの適切なアッセイ容器上に被覆する。抗体をビオチン化し、固定化アビジンまたはストレプトアビジンを使用してプレート上に捕捉するなど、固定化の代替方法を使用することもできる。サンドイッチを逆にした場合、適切に標識したアビジンまたはストレプトアビジンを使用して、ビオチン化＃１１７２結合を検出することもできる。望むなら、当技術分野で知られている任意の許容可能な手段によって、好ましくは脱脂粉乳によって、プレートを非特異的な結合に対して遮断し、次いで適切な緩衝液で洗浄して、結合していない全ての捕捉抗体を除去することができる。遮断技法を使用した例を実施例１に示し、遮断技法を用いない例を実施例２に示す。
本発明のアッセイによれば、患者の血漿または任意のその他の製剤中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の量は、既知の濃度の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を同時にアッセイすることにより作成した標準曲線と比較することによって定量する。患者のサンプルを調製するには、標準的な血液学的技法を使用して、静脈穿刺によって少量の血液を抗凝固薬中に抜き取り、そこから遠心分離によって血漿を調製する。患者の血漿は、クエン酸塩、ＥＤＴＡ、またはその他のカルシウム−キレート剤で抗凝固性になる。次いでこのように得られた血小板に乏しい血漿を、適切な緩衝液で１０倍から４０倍まで、好ましくは２０倍から４０倍まで連続的に希釈し、それぞれ希釈したものからの一定分量をプレートのウェルに加えて、最終濃度の範囲にすることが好ましい。
標準曲線を作成するには、精製済みのタンパク質を使用して、生体害で既知の濃度の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を生成することが好ましい。例示的な最終濃度範囲は、ウェル当たり０、２０、４０、６０、８０、および１００ｐＭであり、より好ましくはウェル当たり０、８、１６、２４、３２、４０、４８、および５６ｐＭである。実施例１および２は、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を得るための、例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏ法を提供する。一般に、第ＶＩＩａ因子（５０〜１００ｎＭ、好ましくは１００ｎＭ）を組織因子（組換え可溶性組織因子に関しては１００〜１５０ｎＭ、好ましくは１５０ｎＭ）と組み合わせて、第ＶＩＩａ因子−組織因子複合体を形成し、次いでこれをアンチトロンビン（１００〜７５０ｎＭ、好ましくは４００ｎＭ）およびヘパリンと反応させて、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を形成する。組織因子とアンチトロンビンの濃度は、第ＶＩＩａ因子の濃度に比べて過剰であることが必要である。第ＶＩＩａ因子は、参照により本明細書に援用する米国特許第５，７４１，６５８号に概説されている手順に従って、単離した第ＶＩＩ因子を第ＶＩＩａ因子に変換することにより得ることができる。精製した組換えヒト第ＶＩＩａ因子を利用することが好ましい。組換え第ＶＩＩａ因子は、当技術分野で知られている任意の手段により生成することができ、または市販されている。第ＶＩＩａ因子−組織因子複合体の生成に有用な組織因子は、完全長のもの、または切断型、単離型、または組換え型（欧州特許出願第０２７８７７６号；およびＭｏｒｒｉｓｓｅｙ他、１９８７「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ，ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ」、Ｃｅｌｌ ５０：１２９〜１３５）、野生型、または修正を加えたものでよい。可溶性組織因子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ，Ｉｎｃ．、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪから得ることができる。アンチトロンビン（アンチトロンビンＩＩＩまたはＡＴＩＩＩとも呼ばれる）は、単離型でも組換え型でもよい（欧州特許第００９０５０５号）。蓄えられた新鮮凍結ヒト血漿から単離したアンチトロンビンＩＩＩの商業上の供給元には、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ、ＣＴ、およびＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴが含まれる。本発明では、抗凝固性を有するヘパリンの任意の商業上の供給元を使用することができる。第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体への変換の検証は、当技術分野で知られている任意の手段によって行うことができる。実施例２は、第ＶＩＩａ因子−組織因子複合体と第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の第ＶＩＩａ因子酵素活性を比較する例示的な手順を示し、この場合、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の形成は、第ＶＩＩａ因子酵素活性が十分に失われ、第ＶＩＩａ因子の出発濃度に関連した第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の濃度によって示される。次いで得られた第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準を、適切な緩衝液で連続的に希釈し、それぞれ希釈したものの一定分量をプレートのウェルに加えて、ｐＭ範囲内の最終濃度を生成する。
一次捕捉抗体と第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体とを反応させる条件下、インキュベーションした後に適切な緩衝液で洗浄し、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体のアンチトロンビン部分または第ＶＩＩａ因子部分のどちらか、すなわち捕捉抗体が結合している部分とは反対側の複合体の部分に結合することが可能な二次抗体で、プレートを処理する（すなわち、捕捉抗体が第ＶＩＩａ因子部分に結合している場合は、アンチトロンビン部分に結合することが可能な二次抗体を使用し、捕捉抗体がアンチトロンビン部分に結合している場合は、第ＶＩＩａ因子部分に結合することが可能な二次抗体を使用する）。第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体に対する特異性は、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子またはアンチトロンビンのどちらかに結合する一次捕捉抗体と、その複合体の反対側の部分に結合する二次抗体との組合せを使用することによって実現される。二次抗体は、酵素標識、放射同位元素標識、非放射性標識、蛍光標識、またはその他の染料、毒素標識、または化学発光標識を用いて検出用に標識することができる。適切な緩衝液で洗浄した後、結合した標識済みの二次抗体に関してプレートの検査をし、各ウェル内の、結合した標識済みの二次抗体の量を、使用した特定のタイプの標識に関して当技術分野で知られている手段によって定量する。
好ましい方法は、色素基質アッセイによって検出可能な二次抗体を使用する。このアッセイに関する例示的な二次抗体は、抗ＩｇＧを容易に入手可能な、動物でヒトアンチトロンビンに対して産生されたポリクローナル抗体である（例えば、ヒトアンチトロンビンに対してウサギで産生されたポリクローナル抗体）。実施例１で示すように、一次抗体＃１１７２は、複数の異なる形の第ＶＩＩまたはＶＩＩａ因子を捕捉し、二次ウサギアンチトロンビン抗体はアンチトロンビンだけを認識し、存在することになるアンチトロンビンだけが、前に第ＶＩＩａ因子と反応したアンチトロンビンである。本明細書で提供した方法により予備試験をする任意の捕捉抗体も、同様にこのアッセイで作用することになる。
適切な緩衝液で洗浄した後、二次抗体を認識する三次抗体でプレートを処理し、したがって三次抗体は、二次抗体が前もって結合しているプレートにのみ結合することになる。色素基質アッセイでは、色素基質と相互に作用することが可能な酵素に、三次抗体が予め結合して、測定可能な分光光度的な変化を形成するが、その多くが当技術分野で周知のものである。実施例１で、三次抗体は、酵素アルカリホスファターゼに結合したウサギＩｇＧに対するロバ抗体である（マウスＩｇＧとの交差反応を最小限に抑えるよう精製することが好ましい）。アルカリホスファターゼに結合したウサギＩｇＧに対する三次ロバ抗体は、プレートに予め結合した二次ウサギ抗−アンチトロンビン抗体にのみ結合することになる。
適切な緩衝液で最終的に洗浄した後、適切な色素基質でプレートを処理し、存在する場合には、三次抗体に結合した酵素が色素基質と反応して、入手可能な酵素で変換される基質の量に比例した測定可能な分光光度的変化を形成することになる。各ウェルにおける分光光度的変化を、視覚的に、または当技術分野で知られている数多くの分光光度読取り機器の１つによって、測定する。実施例１では、適切な緩衝液中、アルカリホスファターゼ基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）を用いてプレートを処理する。次いで４０５ｎｍでの光の吸光度を、マイクロプレート・リーダを使用して測定する。
標識済みの二次抗体または色素基質アッセイから得た結果を用い、一連の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準を使用して標準曲線を作成し、患者の血漿中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体濃度を、その標識済みの値から、標準曲線を参照することによって求める。図１に、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体に関する実施例１の方法によって作成した標準曲線の例を示し、図５に、実施例２の方法により作成した標準曲線を示す。対照実験では、第Ｘａ因子とアンチトロンビンとの複合体の場合にＥＬＩＳＡによってシグナルを与えることができなかったので、実施例１に示すＥＬＩＳＡ法は、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体に特異的であることを示している。
既に述べたように、ＥＬＩＳＡアッセイの代わりに様々な技法を使用することができ、そのような技法は当技術分野で周知である。そのような全ての技法で利用される特徴とは、濃度がわかっている第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の標準曲線を作成することであり、これは本発明独自の特徴である。さらに、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に対する抗体のカルシウム非依存性と、ＡＴと複合体を形成する場合であっても第ＶＩＩａ因子に前記抗体が結合できることは、本発明の新規な特徴である。
実施例１に示す第ＶＩＩａ因子−ＡＴ ＥＬＩＳＡを使用して、本発明者等は、１００人の正常な血液ドナーにおける第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の濃度を測定した。これらドナーの全ては、その血漿中に、検出可能な第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体を持っており、平均濃度は２０２ｐＭで、比較的広い範囲にわたっていた（図２、表Ｉ）。興味深いことに、血漿中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の平均濃度は、第ＶＩＩ因子の総量の約２％に相当し、一方、活性第ＶＩＩａ因子の平均濃度は第ＶＩＩ因子の総量の約０．７％に相当していた（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．他、１９９３、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｍｕｔａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｂｌｏｏｄ ８１：７３４〜７４４）。したがって第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体は、活性第ＶＩＩａ因子よりも約３倍高い濃度で血漿中に存在する。これは、組織因子で触媒されるアンチトロンビンとの相互作用を介して進行する第ＶＩＩａ因子の代謝回転が、第ＶＩＩａ因子の濃度を制御する主要な経路であると考えられることを示している。これは、ＴＦＰＩが第ＶＩＩａ因子の主要な血漿阻害剤であることを示す従来の知識とは異なっている。
第ＶＩＩａ因子と第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の血漿濃度を、１７人の正常なドナーから得た同一サンプルで測定した（図３）。活性第ＶＩＩａ因子濃度と第ＶＩＩａ因子−ＡＴ濃度との間にはやや関連性があるが、統計的に有意なものではなかった（ｐ＝０．１２）。これは、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ濃度が活性第ＶＩＩａ因子濃度に強く拘束されないことを示している。これはおそらく、異なる個体では、血液に対する活性組織因子の曝露レベルが異なることに起因すると考えられる。
第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の血漿濃度は、健常志願者に低用量の細菌性内毒素を静脈内投与した後、大きく変化した（表ＩＩおよび図４）。これは、ほぼ確実に、循環する単球によって組織因子の発現が誘発されたため、血液への組織因子の曝露が増加したことを表している。
組織因子に対する血管内曝露のレベルの変化は、本発明のアッセイを使用して、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の血漿濃度の変化をモニタすることにより測定できる。この方法を使用して、凝固カスケードの活性化が疑われる患者をモニタすることができ、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ濃度が患者の基準線を超えて上昇した場合は、凝固する仕組みが静脈内で活性化したことを示すと考えられる。これを使用することが可能な患者には、敗血症、敗血症性ショック、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、癌、深静脈血栓症、心筋梗塞、虚血性発作、肺動脈塞栓症、産婦人科系合併症（子かん前症および子かんを含む）、および冠状動脈疾患に罹っている（またはその疑いがある）患者が含まれる。
別の実施形態では、抗凝固療法の効能をモニタする感度の高い方法として、第ＶＩＩａ因子−ＡＴの値を使用することができる。これは、経口抗凝固剤（ワルファリンおよび関連する化合物）と、ヘパリンおよびヘパリン誘導体も含むと考えられる。さらに別の実施形態では、第ＶＩＩａ因子−ＡＴの値を使用して、特に第ＶＩＩａ因子または組織因子−第ＶＩＩａ因子複合体を標的とする新規な抗凝固剤の効能をモニタすることができる。
ｐ−ＮＰＰ基質を使用して血漿中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の濃度を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイ（遮断薬を使用する）
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒト血漿中およびその他のサンプル中の、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン（第ＶＩＩａ因子−ＡＴ）複合体の濃度を測定した。
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒト血漿中およびその他のサンプル中の、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン（第ＶＩＩａ因子−ＡＴ）複合体の濃度を測定した。
第ＶＩＩａ因子−ＡＴ ＥＬＩＳＡを標準化するための、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の調製
１００ｎＭの第ＶＩＩａ因子［第ＶＩＩａ因子（組換え）；カタログ＃４０７ｒｅｃＢ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ、ＣＴ］と１５０ｎＭのｓＴＦ［当技術分野で知られている方法により生成した組換え可溶性組織因子タンパク質］の１．１ｍｌ溶液を、ＨＢＳＡ／カルシウムに溶かして調製した［ＨＢＳＡ／カルシウム：３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、および０．１％ｗ／ｖアジ化ナトリウム、４℃の保存］。
１００ｎＭの第ＶＩＩａ因子［第ＶＩＩａ因子（組換え）；カタログ＃４０７ｒｅｃＢ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｉｎｃ．、Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ、ＣＴ］と１５０ｎＭのｓＴＦ［当技術分野で知られている方法により生成した組換え可溶性組織因子タンパク質］の１．１ｍｌ溶液を、ＨＢＳＡ／カルシウムに溶かして調製した［ＨＢＳＡ／カルシウム：３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、および０．１％ｗ／ｖアジ化ナトリウム、４℃の保存］。
一定分量０．１ｍｌを取り出し、氷上で保持して、第ＶＩＩａ因子−ｓＴＦ複合体を形成した。
残り１．０ｍｌの反応混合物に、ヘパリン（カタログ＃Ｈ３３９３；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加してその最終濃度を１ｕｎｉｔ／ｍｌにし、アンチトロンビン（以前はアンチトロンビンＩＩＩと呼ばれたもの；カタログ＃ＨＣＡＴＩＩＩ−０１２０；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴ）を添加してその最終濃度を３００ｎＭにした。この混合物を３７℃で６０分間インキュベートし、次いで氷上に配置して、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準（ヘパリンおよびアンチトロンビンで処理した第ＶＩＩａ因子−ｓＴＦ）を形成した。
第ＶＩＩａ因子−ｓＴＦ複合体と第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準のそれぞれ少量を取り、Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ他が示した手順に従い（Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ Ｐ．Ｆ．他、１９９３、「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｐＨ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ７０：９７０〜９７７）、クロモザイムｔ−ＰＡ基質（カタログ＃１０９３０３７、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、残されている第ＶＩＩａ因子の酵素活性を測定した（第ＶＩＩａ因子の最終濃度５ｎＭ）。第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準における第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体と活性第ＶＩＩａ因子−ｓＴＦ複合体の活性の比較では、ヘパリンとアンチトロンビンを合わせた処理の後、初期活性の５％未満が残るべきである。当初の活性の５％未満が残っている場合、最終反応混合物中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の濃度は、第ＶＩＩａ因子の出発濃度に等しいと考えられる。第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準を、５０μｌの一定分量に分けて、−８０℃で凍結した。
第ＶＩＩａ因子−ＡＴ ＥＬＩＳＡアッセイで使用する日に、第ＶＩＩａ因子ＡＴ標準の一定分量を３７℃急速に解凍し、次いで必要になるまで４℃に保った。余分な標準は廃棄した。
アッセイ
抗−第ＶＩＩａ因子モノクローナル抗体＃１１７２ＩｇＧ（抗体＃１１７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｌａｂ；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−３４９７として寄託されたハイブリドーマ）を、０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈した［炭酸緩衝液：重炭酸ナトリウム４．２０ｇをＨ２Ｏ ４００ｍｌに溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ９．２に調節し、Ｈ２Ｏを十分に添加して最終体積を５００ｍｌにしたもの］。抗体＃１１７２溶液を、９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＥＩＡ／ＲＩＡプレート、カタログ＃９０１８；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に、ウェル当たり０．１ｍｌでピペット分注し、４℃で一晩インキュベートした。
抗−第ＶＩＩａ因子モノクローナル抗体＃１１７２ＩｇＧ（抗体＃１１７２；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｌａｂ；ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−３４９７として寄託されたハイブリドーマ）を、０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈した［炭酸緩衝液：重炭酸ナトリウム４．２０ｇをＨ２Ｏ ４００ｍｌに溶解し、水酸化ナトリウムでｐＨ９．２に調節し、Ｈ２Ｏを十分に添加して最終体積を５００ｍｌにしたもの］。抗体＃１１７２溶液を、９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ ＥＩＡ／ＲＩＡプレート、カタログ＃９０１８；Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に、ウェル当たり０．１ｍｌでピペット分注し、４℃で一晩インキュベートした。
ＥＬＩＳＡプレートを上下逆さにしながら軽く振ることによって、ウェルを空にした。ウェルを、ＴＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｔｗｅｅｎで１回濯いだ［ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．１％ｗ／ｖアジ化ナトリウム；ＴＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｔｗｅｅｎ：ＴＢＳに１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＥＤＴＡから希釈したもの）および０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を加えた］。
これらのウェルに、ウェル１個当たり約０．３ｍｌでＢＬＯＴＴＯ［ＢＬＯＴＴＯ：ＴＢＳに溶かした５％ｗ／ｖ脱脂粉乳］を充填した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、または４℃で一晩インキュベートした（プレートは、このプロトコルのこの時点で、少なくとも１週間、４℃でＢＬＯＴＴＯ中に保持することができる）。ウェルを上下逆さにしながら軽く振ることによって、ウェルを空にした。ウェルを、ＴＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｔｗｅｅｎで３回濯いだ。
第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準、および既知のサンプル（一般には、クエン酸処理した血漿サンプル）を、ＴＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡ［ＴＢＳ／ＥＤＴＡ／ＢＳＡ：ＴＢＳに１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４、０．５Ｍ ＥＤＴＡから希釈したもの）および０．１％ウシ血清アルブミンを加えた］に入れて、下記のように希釈した。すなわち、血漿サンプルに関しては２０倍または４０倍に希釈し、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準に関しては、ウェル当たりの第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の最終濃度が０、８、１６、２４、３２、４０、４８、および５６ｐＭになるようにした。各サンプルまたは標準ごとに、０．１ｍｌずつ２つのウェルにピペット分注した。３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルを上下逆さにしながらＥＬＩＳＡプレートを軽く振ることによって、ウェルを空にした。これらのウェルを、ＴＢＳ／ＥＤＴＡ／Ｔｗｅｅｎで３回濯いだ。
ウサギ抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ポリクローナル抗体；カタログ＃Ａ０２９６；ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を、ＴＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ［ＴＢＳ／ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ：ＴＢＳに０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミンと０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を加え、４℃の保存したもの］に入れて０．１μｇ／ｍｌに希釈し、次いでウェル当たり０．１ｍｌでウェルにピペット分注した。３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルを上下逆さにしながらＥＬＩＳＡプレートを軽く振ることによって、ウェルを空にした。これらのウェルを、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回濯いだ［ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ：ＴＢＳに０．１％ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたもの］。
ロバ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体［Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）ロバ抗ウサギＩｇＧアルカリ（Ｈ＋Ｌ）、（ｍｉｎ ｘ ＢｖＣｈＧｔＧｕＨａＨｓＨｎＭｓＲｔＳｈ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）、アルカリホスファターゼ複合体；カタログ＃３１３４５；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＩＬ］を、ＴＢＳ／ＢＳＡ［ＴＢＳ／ＢＳＡ：ＴＢＳに０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミンを加えたもの］に入れて０．２５μｇ／ｍｌに希釈し、次いでウェル当たり０．１ｍｌでウェルにピペット分注した。３７℃で１時間インキュベートした後、ウェルを上下逆さにしながらＥＬＩＳＡプレートを軽く振ることによって、ウェルを空にした。これらのウェルを、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで４回濯いだ。
次に、１００μｌのｐ−ＮＰＰ溶液［ｐ−ＮＰＰ溶液：使用前に、ｐ−ＮＰＰ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および０．０２％ｗ／ｖアジ化ナトリウム）にｐ−ＮＰＰ（最終１ｍｇ／ｍｌ）を入れたもの］を、各ウェルに分注した。ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で約３０〜６０分間インキュベートし、または標準に良好な色が生成されるまでインキュベートした。９６ウェル・プレート・リーダを使用して、ＥＬＩＳＡプレートの、４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。吸光度の読取りを遅らせる必要がある場合は、ＮａＯＨでｐＨ９．５にした０．１Ｍ ＥＤＴＡを、ウェル当たり０．１ｍｌ添加することによって、反応を停止させた。
第ＶＩＩａ因子−ＡＴ濃度に対して４０５ｎｍ（Ａ４０５）での吸光度をプロットすることにより、標準曲線を作成した。次いで未知の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ濃度を標準曲線から読み取った。未知のもののＡ４０５値が、標準曲線の最高点よりも高い場合は、高度第ＶＩＩａ因子−ＡＴ希釈液で試験を繰り返した。
第ＶＩＩａ−アンチトロンビン（ＶＩＩａ−ＡＴ）複合体用ＥＬＩＳＡ（遮断薬なし）
材料
この実施例で使用した材料は下記の通りであった。
材料
この実施例で使用した材料は下記の通りであった。
抗第ＶＩＩ因子モノクローナル抗体−Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｌａｂでヒト第ＶＩＩ因子に対して産生されたカルシウム非依存性マウスモノクローナル抗体、ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ−３４９７として寄託されたハイブリドーマ細胞。
抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ウサギポリクローナル抗体）−ＤＡＫＯカタログ番号Ａ０２９６。
ウシ血清アルブミン−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号１２６５９（「アルブミン、ウシ血清、フラクションＶ、低重金属」）
ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、（ｍｉｎ ｘ ＢｖＣｈＧｔＧｕＨａＨｓＨｎＭｓＲｔＳｈ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）、Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）、アルカリホスファターゼ複合体−Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号３１３４５。
ＥＬＩＳＡプレート−Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．製の平底ＣｏｓｔａｒＥＩＡ／ＲＩＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ番号９０１８）。
第ＶＩＩ因子−欠乏血漿−先天性第ＶＩＩ因子−欠乏血漿（クエン酸処理）、Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．製（ｗｗｗ．ｋｉｎｇｂｉｏｍｅｄ．ｃｏｍ）。
ｐＮＰＰ（リン酸ｐ−ニトロフェニル）−Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｎ１８９１（ＳＩＧＭＡ ＦＡＳＴＴＭ リン酸ｐ−ニトロフェニル錠剤セット；５ｍｇ／錠剤）。
溶液
ＥＬＩＳＡアッセイで使用した溶液は、以下のように調製した。特に示さない限り、溶液は室温で保存した。
ＥＬＩＳＡアッセイで使用した溶液は、以下のように調製した。特に示さない限り、溶液は室温で保存した。
炭酸緩衝液：０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．２。これは、重炭酸ナトリウム４．２０ｇをＨ２Ｏ ４００ｍｌに溶解し、１０Ｎ ＮａＯＨを１滴ずつ添加しながらｐＨを９．２に調節することによって、調製する。最終体積は、Ｈ２Ｏで５００ｍｌにする。
ＴＢＳ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ７．４；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．０２％ｗ／ｖアジ化ナトリウム
洗浄緩衝液：ＴＢＳに溶かした０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
サンプル希釈液：０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、および１０ｍＭ ＥＤＴＡをＴＢＳに溶かしたもの。４℃で保存（これを作製するため、ｐＨ７．５のＥＤＴＡストック溶液を使用）。
抗体希釈液：０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン、および０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０をＴＢＳに溶かしたもの。４℃で保存。
ｐＮＰＰ緩衝液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ９．５；１００ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ２；０．０２％ｗ／ｖアジ化ナトリウム
ｐＮＰＰ溶液：使用直前に、ｐＮＰＰ緩衝液にｐＮＰＰを溶解する（最終１ｍｇ／ｍｌ）（ｐＮＰＰ緩衝液５ｍｌ当たり、５ｍｇ錠剤１個）。
ＶＩＩａ−ＡＴ ＥＬＩＳＡを標準化するためのＶＩＩａ−ＡＴ複合体の調製
材料および溶液
アンチトロンビン（アンチトロンビンＩＩＩ）−Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＨＣＡＴＩＩＩ−０１２０。
材料および溶液
アンチトロンビン（アンチトロンビンＩＩＩ）−Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＨＣＡＴＩＩＩ−０１２０。
ウシ血清アルブミン−Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍカタログ番号１２６５９（「アルブミン、ウシ血清、フラクションＶ、低重金属」）。
クロモザイムｔ−ＰＡ基質−Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓカタログ番号１０９３０３７
第ＶＩＩａ因子（組換え）−Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａカタログ番号４０７ｒｅｃＢ。
ヘパリン−一般にＳｉｇｍａ製（カタログ番号Ｈ９３９９）；その他数多くのヘパリンの供給元がある。
ｓＴＦ−組換えヒト可溶性組織因子（アミノ酸１〜２１９）（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．１９８７、Ｃｅｌｌ ５０：１２９〜１３５）。
ＨＢＳＡ／カルシウム：３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．４；４℃で保存。１００ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭＣａＣｌ２；０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン；０．０２％ｗ／ｖアジ化ナトリウム。
手順
この手順は、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準のより多くのストックを作製するために規模を拡大することができる。
この手順は、第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準のより多くのストックを作製するために規模を拡大することができる。
１．１００ｎＭの第ＶＩＩａ因子と１５０ｎＭのｓＴＦをＨＢＳＡ／カルシウムに溶かして１．１ｍｌの溶液を調製する。
２．一定の分量０．１ｍｌを取って氷上に保持する。
３．残りの１．０ｍｌの反応混合物に、ヘパリンを添加して最終濃度を１０ｕｎｉｔ／ｍｌにし、アンチトロンビン（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を添加して最終濃度を４００ｎＭにする。
４．混合物を、３７℃で６０分間インキュベートし、次いで氷上に混合物を配置する。
５．各混合物ごとに（ステップ２および４から）少量を取り、クロモザイムｔ−ＰＡ基質を使用して、残っている第ＶＩＩａ因子酵素活性を測定する（第ＶＩＩａ因子の最終濃度５ｎＭで）（Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒ Ｐ．Ｆ．他、１９９３、「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｐＨ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｏｎ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩａ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ７０：９７０〜９７７）。ステップ２で取った一定分量中の第ＶＩＩａ因子−ｓＴＦ複合体の活性と、ステップ４でヘパリンおよびアンチトロンビンと共にインキュベートした後に残された活性とを比較する。ヘパリンとアンチトロンビンを合わせて処理をした後は、初期活性の５％未満が残されていると予測する。この試験に合格した場合は（当初の活性の５％未満が残されている）、最終反応混合物中の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ複合体の濃度が第ＶＩＩａ因子の出発濃度に等しいと考えられる。
６．ストックを５０μｌの一定分量に分け、−８０℃で凍結する。
７．使用する日、一定分量の第ＶＩＩａ因子−ＡＴ標準を３７℃で急速に解凍し、次いで必要になるまで４℃で保持する。余分な量は廃棄し、再度凍結させない。
洗浄技法
ＥＬＩＳＡプレートのウェルの洗浄は、手で、または自動ＥＬＩＳＡプレート洗浄器を使用して行うことができる。例示的な、自動洗浄器に関する適切な技法は、以下の通りである。Ｓｋａｎ Ｗａｓｈｅｒ ３００自動ＥＬＩＳＡプレート洗浄器では、吸引２．５秒、洗浄４００ＮＩ、浸漬１５秒、その後、最終吸引８秒というサイクルを３回使用した。Ｍｕｌｔｉ Ｗａｓｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅの工業用自動ＥＬＩＳＡプレート洗浄器では、以下の別の設定、すなわち速度＝４５、浸漬＝６０秒、モード＝プレート洗浄、底部洗浄＝オフ、およびクロス吸引＝オンという設定で、０．８ｍｌの洗浄を行うサイクルを３回使用した。
ＥＬＩＳＡプレートのウェルの洗浄は、手で、または自動ＥＬＩＳＡプレート洗浄器を使用して行うことができる。例示的な、自動洗浄器に関する適切な技法は、以下の通りである。Ｓｋａｎ Ｗａｓｈｅｒ ３００自動ＥＬＩＳＡプレート洗浄器では、吸引２．５秒、洗浄４００ＮＩ、浸漬１５秒、その後、最終吸引８秒というサイクルを３回使用した。Ｍｕｌｔｉ Ｗａｓｈ Ａｄｖａｎｔａｇｅの工業用自動ＥＬＩＳＡプレート洗浄器では、以下の別の設定、すなわち速度＝４５、浸漬＝６０秒、モード＝プレート洗浄、底部洗浄＝オフ、およびクロス吸引＝オンという設定で、０．８ｍｌの洗浄を行うサイクルを３回使用した。
手で洗浄する場合、まず、シンク内でプレートを上下逆さに「軽く振る」ことによって、ウェルを空にする。次いでこれらのウェルに、スクイズ・ボトルから定量吐出した洗浄溶液を満たす（泡を発生させないように）。全てのウェルを満たしたら、再びウェルを「軽く振る」ことによって空にし、プロセスを最初からやり直す。３回めの洗浄の終わりに、実験台上の何枚かのペーパ・タオルに向け、プレートを上下逆さにして繰り返し軽く叩くことにより、ウェルを完全に空にする。ウェル内に液体が見えなくなるまでこの動作を行う。
アッセイ
この実施例では、抗第ＶＩＩａ因子モノクローナル抗体を、炭酸緩衝液中で１μｇ／ｍｌに希釈した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに０．１ｍｌずつピペット分注し、４℃で一晩インキュベートした。次いでこれらのウェルを、洗浄緩衝液で３回濯いだ。
この実施例では、抗第ＶＩＩａ因子モノクローナル抗体を、炭酸緩衝液中で１μｇ／ｍｌに希釈した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに０．１ｍｌずつピペット分注し、４℃で一晩インキュベートした。次いでこれらのウェルを、洗浄緩衝液で３回濯いだ。
フリーザ内での保存からＶＩＩａ−ＡＴ標準を取り出し、３７℃で急速に解凍し、次いで使用するまで氷上に配置した。ＥＬＩＳＡで使用しなかった余分な標準は廃棄した（標準は、再使用も再凍結もせずに廃棄すべきである）。１００ｎＭのＶＩＩａ−ＡＴ標準１０μｌを、１０ｍｌのサンプル希釈液に入れて希釈した（１００ｐＭのストックが得られる）。次いで、１００ｐＭのストックを、下記の表ＩＩＩのようにさらに希釈した。
未知のサンプル（クエン酸処理した血漿サンプル）を、サンプル希釈液で２０倍に希釈した。これは、１５μｌの試験血漿を２８５μｌのサンプル希釈液に添加することにより行った。
各サンプルまたは標準ごとに、２つのウェルのそれぞれに上述の希釈液０．１ｍｌをピペット分注し、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、これらのウェルを洗浄緩衝液で３回濯いだ。
ウサギ抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ（ＤＡＫＯ）を、以下のように抗体希釈液で０．１μｇ／ｍｌに希釈した。１．３ｍｇ／ｍｌのストック溶液では、３μｌを３６μｌの抗体希釈液と混合して、１００μｇ／ｍｌのＩｇＧ抗体を得た。次いで希釈した抗体１２μｌを、１２ｍｌの抗体希釈液と混合して、０．１μｇ／ｍｌにした。０．１μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトアンチトロンビンＩＩＩ抗体をウェル当たり０．１ｍｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次いでウェルを、洗浄緩衝液で３回濯いだ。
ロバ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体を、以下のように抗体希釈液で０．２５μｇ／ｍｌに希釈した。６００μｇ／ｍｌのストック溶液では、５μｌを１２ｍｌの抗体希釈液と混合して、０．２５μｇ／ｍｌのＩｇＧを得た。０．１ｍｌを各ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。次いでこれらのウェルを、洗浄緩衝液で３回濯いだ。
次いでｐＮＰＰ溶液１００μｌを各ウェルにピペット分注した。プレートを、３７度で約３０〜６０分インキュベートした（標準に良好な色が生成されるまで−場合によっては長くかかる）。最高標準（３０ｐＭ）は、そのＡ４０５が約１．５であるべきである。
９６ウェル・プレート・リーダで、４０５ｎｍの吸光度を読み取った。望むなら、ウェル当たり０．１ｍｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ＮａＯＨでｐＨ９．５にした）を添加することによって、反応を止めることができる。反応の停止は、読取りを遅くしたい場合のみ必要である。
ＶＩＩａ−ＡＴ濃度に対して４０５ｎｍの吸光度をプロットすることによって、標準曲線を作成した。次いで未知のＶＩＩａ−ＡＴ濃度を標準曲線から読み取った。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＰＬＵＳ ３８４マイクロプレート・リーダで読み取り（バックグラウンドは差し引かず）、二次多項式をデータに当てはめた。図５で標準曲線を見ることができる。
Claims (17)
- 患者の血漿サンプル中の、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度を測定する方法において、
ある量の前記血漿サンプルを、固相に固定した一次捕捉抗体と混合するステップであって、前記捕捉抗体が、前記血漿サンプル中に存在する可能性のある第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の第ＶＩＩａ因子部分に結合することができることを特徴とするものであるステップ、および前記混合物を、前記捕捉抗体と、前記血漿サンプル中に存在する可能性のある前記第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体との結合を促進させる条件下でインキュベートして、結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体および非結合混合物を形成するステップと、
前記非結合混合物を除去するステップと、
前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体のアンチトロンビン部分に結合することができることを特徴とする二次抗体と混合して、結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン−二次抗体複合体および非結合二次抗体混合物を形成するステップと、
非結合二次抗体混合物の全てを除去するステップと、
結合二次抗体の量を決定するステップと、
結合二次抗体の量を、既知の濃度の結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に関して決定された結合二次抗体の標準の量と比較するステップと
を含む方法。 - ある量の、前記既知の濃度の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の第ＶＩＩａ因子部分に結合することができることを特徴とする一次捕捉抗体と混合し、前記混合物を、前記捕捉抗体と前記第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体との結合を促進させる条件下でインキュベートして、結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を形成するステップと、非結合混合物を全て除去するステップと、前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体のアンチトロンビン部分に結合することができることを特徴とする二次抗体と混合するステップと、非結合二次抗体を全て除去するステップと、結合二次抗体の量を決定するステップと、前記既知の濃度の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、前記結合二次抗体の量と相関させて、標準曲線を作成するステップとによって、前記結合二次抗体の標準の量を、複数の既知の濃度の結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に関して決定する、請求項１に記載の方法。
- 前記二次抗体が、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性標識、蛍光標識、毒素標識、および化学発光標識からなる群から選択された標識によって検出可能である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記結合二次抗体に結合することができることを特徴とする三次抗体を、前記結合二次抗体と反応させ、前記三次抗体が、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性標識、蛍光標識、毒素標識、および化学発光標識からなる群から選択された標識によって検出可能なものである、請求項１または２に記載の方法。
- 患者の血漿サンプル中の、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度を測定する方法において、
ある量の前記血漿サンプルを、固相に固定した一次捕捉抗体と混合するステップであって、前記捕捉抗体が、前記血漿サンプル中に存在する可能性のある第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体のアンチトロンビン部分に結合することができることを特徴とするものであるステップ、および前記混合物を、前記捕捉抗体と、前記血漿サンプル中に存在する可能性のある前記第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体との結合を促進させる条件下でインキュベートして、結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体および非結合混合物を形成するステップと、
非結合混合物を除去するステップと、
前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の第ＶＩＩａ因子部分に結合することができることを特徴とする二次抗体と混合して、結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン−二次抗体複合体および非結合二次抗体を形成するステップと、
非結合二次抗体の全てを除去するステップと、
結合二次抗体の量を決定するステップと、
結合二次抗体の量を、既知の濃度の結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に関して決定された結合二次抗体の標準の量と比較するステップと
を含む方法。 - ある量の、前記既知の濃度の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体のアンチトロンビン部分に結合することができることを特徴とする一次捕捉抗体と混合し、前記混合物を、前記捕捉抗体と前記第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体との結合を促進させる条件下でインキュベートして、結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を形成するステップと、非結合混合物を全て除去するステップと、前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の第ＶＩＩａ因子部分に結合することができることを特徴とする二次抗体と混合するステップと、非結合二次抗体を全て除去するステップと、結合二次抗体の量を決定するステップと、前記既知の濃度の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、前記結合二次抗体の量と相関させて、標準曲線を作成するステップとによって、前記結合二次抗体の標準の量を、複数の既知の濃度の結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に関して決定する、請求項５に記載の方法。
- 前記二次抗体が、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性標識、蛍光標識、毒素標識、および化学発光標識からなる群から選択された標識によって検出可能である、請求項５または６に記載の方法。
- 前記結合二次抗体に結合することができることを特徴とする三次抗体を、前記結合二次抗体と反応させ、前記三次抗体が、酵素標識、放射性同位体標識、非放射性標識、蛍光標識、毒素標識、および化学発光標識からなる群から選択された標識によって検出可能なものである、請求項５または６に記載の方法。
- 患者の組織因子の血管内曝露の変化を測定する方法において、
第１の時点で、ある量の前記患者の血漿サンプルを、固相に固定した一次捕捉抗体と混合するステップであって、前記捕捉抗体が、前記血漿サンプル中に存在する可能性のある第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に結合することができることを特徴とするものであるステップ、および前記混合物を、前記捕捉抗体と、前記血漿サンプル中に存在する可能性のある前記第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体との結合を促進させる条件下でインキュベートして、結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体および非結合混合物を形成するステップと、
前記非結合混合物を除去するステップと、
前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を、前記結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に結合することができることを特徴とする二次抗体と混合して、結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン−二次抗体複合体および非結合二次抗体を形成するステップと、
前記非結合二次抗体を除去するステップと、
結合二次抗体の量を決定するステップと、
結合二次抗体の量を、既知の濃度の結合第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に関して決定された結合二次抗体の標準の量と比較して、前記第１の時点での前記患者の血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度を得るステップと、
第２の時点で、前記第１の時点で使用した方法を繰り返すことによって、前記患者の血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度を決定し、各時点での第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量が、上昇しているか、低下しているか、または同じであるかどうかを比較するステップとを含み、
前記第２の時点における前記患者の血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度が、前記第１の時点における前記患者の血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度に比べて上昇している状態は、前記患者の組織因子の血管内曝露が増大していることを表し、前記第２の時点における前記患者の血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度が、前記第１の時点における前記患者の血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の濃度に比べて低下している状態は、前記患者の組織因子の血管内曝露が減少していることを表す方法。 - 前記結合捕捉抗体が、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の第ＶＩＩａ因子部分に結合する、請求項９に記載の方法。
- 前記結合捕捉抗体が、第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体のアンチトロンビン部分に結合する、請求項９に記載の方法。
- 患者が凝固能亢進状態に入る危険性を測定する方法において、
第１の時点で、前記患者からの血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量を測定するステップと、
第２の時点で、前記患者からの血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量を測定するステップと、
前記第２の時点での前記患者からの血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量と前記第１の時点での前記患者からの血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量を決定する量を比較するステップとを含み、
前記第１の時点での前記患者からの血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量を超えた、前記第２の時点での前記患者からの血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量の増加が、前記患者が凝固能亢進状態に入る危険性が増大したことを示し、前記第１の時点での前記患者からの血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量を超えた、前記第２の時点での前記患者からの血漿サンプル中の第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体の量の減少が、前記患者が凝固能亢進状態に入る危険性が低下したことを示す方法。 - 第１の時点および第２の時点で第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体を試験し、得られた値を比較することにより、抗凝固療法の有効性をモニタするための方法であって、前記第２の時点での前記複合体の増加が、前記療法が失敗する可能性があり、または望ましくない凝固現象が発症しないように前記療法を調節する必要があることを示す方法。
- カルシウム・イオンが存在しない状態で第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に結合する能力と、第ＶＩＩａ因子に、アンチトロンビンと複合した状態であっても結合する能力を有する抗体。
- カルシウム・イオンが存在しない状態で第ＶＩＩａ因子−アンチトロンビン複合体に結合できるために選択されたモノクローナル抗体。
- ハイブリドーマ細胞ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ３４９７。
- ハイブリドーマ細胞ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＰＴＡ３４９７によって生成されたモノクローナル抗体。
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