JPH06502307A - 血液凝固タンパク質のアンタゴニストおよびその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血液凝固タンパク質のアンタゴニストおよびその利用方法関連出願　゛ 本出願はソウルとブランクの「血液凝固タンパク質のアンタゴニストおよびその 利用方法」と題する１９９０年１０月２２日に出願され、米国特許庁に係属して いる米国特許願第０７／６０１，４５４号の一部継続出願であり、当該出願は添 付の図面と共に参考として本願に含まれる。

発明の分野 本発明は抗体およびその機能性フラグメントに関する、特に血栓症性疾患の患者 の治療や血栓症性疾患の予防を、特定の血液凝固関連タンパク質に対するイムノ グロブリンタンパク質およびそのフラグメント又は誘導体、あるいはそのエピト ープ領域を含有する抗血栓剤を用いて行うことに関する。

発明の背景 止血は損傷を受けた血管からの出血の自発的停止である。例えば、前毛細血管は ある１本が切れれば即座に収縮する。血管の破裂部位あるいは傷害された血管へ 露出した内皮下の血管組織においては、２つの動きが即座に生じる。この止血系 の２つの幹はそれぞれ多くの分子の活性化を含む。凝固（凝塊）系では即座にト ロンビンの製造を始動し、血小板がマトリックスタンパク質に粘着する。血小板 は、その一部分がトロンビンによって活性化され、アデノシンジホスフェート（ ＡＤＰ）を遊離して、さらなる血小板の凝集を、血中のフィブリノーゲンを不溶 性のフィブリンゲルへの転化と提携して血小板のプラグの形成へ導く。この止血 によるプラグはさらなる酵素的架橋によって強化される。時間が経つと、これは 組織の修復に伴って溶解され、局所血管！あるいは組織に残存する病変を伴っで あるいは伴わない正常組織および血管となる。

血栓は一方あるいは両方の止血過程が変化した、病原となる状態である。この状 態において、血管内（動脈あるいは静脈）の血栓は止血の病的な障害によるもの である。血小板の多い血栓形成は、例えば循環している血小板が動脈血管の壁に 付着することによって開始されると考えられている。この開始時の付着、トロン ビンあるいは他のアゴニストによる活性化および付随する血小板からのＡＤＰの 遊離に続いて血小板−血小板間の相互作用あるいは凝集が生じる。フィブリンの 形成は血小板血栓と関連するが、これは重要な成分ではない。動脈の血栓は、血 流を遅らせるような範囲にまで成長して閉塞性となる。

これに対して、フィブリン優勢の血栓は最初に血管内の血液の滞留する領域ある いは血流の遅い領域に生じ、イン・ビトロで形成される血餅と類似している。

静脈の血栓のほとんどが赤血球および血小板をからませたフィブリンネットワー クからなる。静脈の血栓は長い「尾」を引き、剥離しやすく、肺動脈の塞栓を生 じる。こうして、動脈の血栓は局所の虚血により重篤な疾患を生じ、一方モ静脈 の血栓は王に遠位塞栓によりそれを起こす。

ＡＤＰ刺激血小板相互作用によってのみ徐々に形成された血小板栓は不安定であ り、血小板の初期凝集および粘性変形の後すぐ、上記の如くフィブリンが血小板 血栓の重要な成分となる。血小板の塊の部位における血液凝固反応の活性化によ ってトロンビンの生成が行われる。このトロンビンは最初に付着した血小板を活 性化し、さらなる血小板の凝集を刺激する。血小板凝集は血小板からのＡＤＰの 遊離を誘導することのみならず、ＡＤＰより強力な血小板凝集剤であるプロスタ グランジン類の生成を刺激すること、およびプロトロンビナーゼ複合体を活性化 した血小板上へ集め、非常に強力な血小板活性化剤であるトロンビンの形成を加 速させることによっても刺激される。

血液凝固はフィブリンを形成させる。１ダ一ス以上のタンパク質の相互作用がタ ンパク質分解反応の一連のカスケードに含まれる。各段階においては、凝固因子 ザイモーゲン（ｚｙｍｏｇｅｎ）が制限されたタンパク質分解を受け、そしてそ れ自身が活性プロテアーゼとなる。この凝固因子酵素は次の凝固因子ザイモーゲ ンを活性化させ、これはフィブリノーゲンを不溶性のフィブリン塩につなげるト ロンビンが形成されるまで続く。血液凝固因子には第１因子（フィブリノーゲン ）、第１Ｔ因子（プロトロンビン）、組織因子（以前は第エエＩ因子として知ら れていた）、第１Ｖ因子（Ｃａ２“）、第Ｖ因子（不安定因子）、第ＶＩＩ因子 （プロコンベルチン）、第１Ｉａ因子（抗血友病性グロブリンあるいはＡＨＧ） 　、第１Ｘ因子（クリスマス（Ｃｈｒｉｓｔｍａｓ）因子、第Ｘ因子（スチュア ート（Ｓｔｕａｒｔ）因子）、第ＸＩ因子（血漿トロンボプラスチン前駆物質あ るいはＰＴＡ）　、第１Ｉａ因子（ヘイグマン（Ｈａｇｅｍａｎ）因子）、第Ｘ ＨＩ因子（フィブリン安定化因子）及びＨＭＷ−に因子（高分子量キニノーゲン あるいはフィッジェラルド（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）因子）、ＰＲＥ−に因子（ プレカリクレインあるいはフレッチャ−（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ）因子）、Ｋａ因子 （カリクレイン）およびＰＬ因子（リン脂質）を含む。

フィブリノーゲンは酵素トロンビン（第１Ｉａ因子）の基質であり、このトロン ビンは循環系のザイモーゲンであるプロトロンビン（第■Ｉ因子）の活性化によ って凝固ｉ！Ｊ程において形成されるプロテアーゼである。プロトロンビンは活 性化第Ｖ因子、Ｃｏンおよびリン脂質の存在下で活性化第Ｘ因子によりトロンビ ンに転化される。

活性な第Ｘ因子を形成してプロトロンビンを活性化するに至るまでには、２つの 異なる経路があり、内因系および外因系と呼ばれている。内因系では、凝固に要 するすべてのタンパク賀因子は循環血中に存在する。外因系では循環血中には存 在しない組織因子が損傷を受けた血管内皮上および、動脈硬化症のプラーク細胞 あるいは血管壁の外側の細胞によって活性化されたモノサイト上に発現される。

組織因子はその後レセプターとして、そして第ＶＩＩ因子のコファクターとして 機能し、２分子酵素［組織因子：　ＶＨａ］となり、凝固の外因系経路を始動さ せる。

二の機構はまた凝固の内因系経路も活性化させる。組織因子経路は非常に迅速に 血液を凝固させる。

血液はさらに凝固の内因系経路を通しての接触系においても凝固されることが可 能である。この機構は、恐らく多（の反応を必要とするため、組織因子経路より 幾らか遅い。内因系および外因系の両方の経路が過性な止血のためには正常でな くてはならない。ズオールら（Ｚｖａａｌ、　Ｒ，Ｆ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｂｅｍ ｋｅｒ、　Ｈ，Ｃ，）ｒ血液細胞膜および止血」へモスタシス（Ｈａｅｍｏｓｔ ａｓｉｓ）第１１巻第１２−３９頁（１９８２年）参照のこと。

血栓症および様々な関連する疾患は１あるいはそれ以上の凝固プロテアーゼカス ケード経路の活性化に関連し、あるいはその結果であり、凝固／抗凝固／フィブ リン溶解経路の調節が狂うと生じる。これらの疾患の患者は米国内におよそ２５ ０万人いる。４５才以上の米国人口のおよそ３％毎年が何らかの形で血栓症性疾 患を生じるかあるいは播種性の血栓症にかかっている。他の血栓症性疾患は遺伝 的であり、常に約１００．０００人に影響を及ぼしている。４５までにこのよう な患者の７０％が死亡する。

後天的な血栓症性疾患である冠動脈血栓症は１年に約１５０万例、肺血栓塞栓症 は１年におよそ４０％例および敗血症性ショックは年３０万例以上、播種住血管 内凝固（ＤＩＣ）は年間約５万例および深部静脈血栓症は年間１７万５千例発生 し、優勢である。しかしながら、髄膜炎菌血症、出血性発熱ウィルス感染および 他の疾患もかなりの罹病率あるいは死亡率を示す。例えば、カブラン（Ｋａｐｌ ａｎ。

Ｋ）の「血栓症における凝固タンパク質」コールマン（Ｃａｂｍａｎ、　Ｒ，ｆ 、　）ら編集、止血と血栓症（Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏ ｓｉｓ）第１０９８頁（第２版、リソピンコツト社（Ｊ、　Ｂ、　Ｌｉｐｐｉｎ ｃｏｔｔ　Ｃｏ、　））参照のこと。播種住血管内凝固の最も重篤な急性症状の い（つかは、子供に対して様々な二次感染を引き起こす。現在の血栓症性疾患の 治療は全く満足できるものではなく、抗凝固剤、抗血栓剤および血栓溶解剤の使 用を含むものである。

最もよく知られている抗凝固剤の一つはヘパリンである。１９２２年に発見され たヘパリンは、グリコサミノグリカンと呼ばれる不均一な一部の直鎖状陰イオン 性ムコ多糖であり、その分子量は平均１５０００ダルトンである。ヘパリンの市 販品は２種の反復三糖・Ｄ−グルコサミンし一ヨウドウロン酸およびＤ−グルコ サミンＤ−グルキュロン酸の多量体からなる。これはウシ肺およびブタ小腸粘膜 から調製されるが、ヒツジおよびクジラからも得られる。

ヘパリンは肥満細胞を含む哺乳動物組織の細胞内にあるが、７５０．０００ダル トン以上の高分子型でのみ存在する。さらに、このヘパリンは市販ヘパリンのｌ θ〜２０％の抗凝固活性しか有さない。ヘパリンに似た化合物である硫酸ヘパラ ンは抗凝固作用は劣るが哺乳動物の細胞に普遍的に存在する成分である。天然ヘ パリンが肥満細胞の変色性顆粒中での結合、不活性状態から放出されると、マク ロファージに摂取され、速やかに破壊される。ヘパリンは循環血中には検出され ない。

静注すると市販のヘパリンは血液凝固を妨害する。これは、セリンプロテアーゼ インヒビターであっていくつかの活性化された凝固因子、すなわち第ＸＩＩａ因 子、カリクレイン（活性化フレッチャー因子）　、ＸＩａＳＩＸ、Ｘａおよびト ロンビン（ＩＩ　ａ　）を中和する抗トロンビンＩＩＩと複合体を形成すること によって作用する。しかしながら遊離のトロンビンおよび活性化第Ｘ因子（Ｘａ ）を抑制するのに対して最も活性である。抗トロンビンＩＩＩはトロンビンを不 活性化する唯一の巨大分子であると考えられていたが、現在では他の血漿タンパ ク質であって同様の活性を有するものが知られている。抗トロンビンＩＩＩはセ リンプロテアーゼと不可逆性複合体を形成し、けっかとしてこれらのタンパク質 因子を不活性化させる。グリフイス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、　Ｍ、Ｊ、）の「ヘパ リン触媒抑制剤／プロテアーゼ反応：ヘパリンの作用の通常のメカニズムの速度 論的解析」ブロック・ナチュール・アカド・サイ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　ＵＳＡ）第８０巻第５４６０〜５４６４頁（１９ ８３年）。ヘパリンは反応速度を著しく高めるが、この反応の程度を高めること はない。明らかにヘパリン、抗トロンビンＩＩＩ、凝固因子間に三重複合体が形 成される。ビジヨークら（Ｂｊｏｒｋ、　１．　ａｎｄ　Ｌｉｎｄａｈｌ、　Ｌ ：、　）　ｒヘパリンの抗血液凝固作用の機構」　（モル・セル・バイオケム（ Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、））第４８巻第１６１〜１８２頁（１ ９８２年）。低濃度のヘパリンは抗トロンビンＩＩＩの活性、特にＸａ因子とト ロンビンに対する活性を増加させるが、これは治療手段として低用量のヘパリン を投与する根拠となる。

精製されたヘパリンの市販製剤は比較的毒性がないが、ヘパリンの主な副作用は 出血である。ヘパリンはまた約２５％の患者において軽い血小板減少症を生じさ せることがあるが、重篤な血小板減少症は殆ど無く、動脈血栓がたまに生じる。

ヘパリン誘導血小板凝集の結果の軽度の反応の一方で、ヘパリン依存性抗血小板 抗体複合体の形成に続いて起こる重篤な血小板減少症を導く。すべてのヘパリン を投与された患者の血小板数は常にモニターする必要があり、新たな血栓はヘパ リン治療の結果として生じるかもしれず、血小板減少症は出血症状を誘導し、こ れはヘパリン誘導性であると考えられること、そしてこの血栓症はヘパリンが間 欠投与をされるべきであることおよび抗血小板凝集剤および／または経口抗凝固 剤に変えるべきであることが理解される。

「低用量」ヘパリンを投与している患者にさえ重篤な血栓閉塞症、出血、および 死亡が生じることがある。ヘパリン療法はさらに、大量のエタノールを消費した 患者、薬物に敏感な患者、盛んに出血している患者あるいは血友病、紫斑病、血 小板減少症、頭蓋出血、細菌性心内膜炎、活性結節、抹消血管透過性増加、総て の種類の胃腸管の部位、重篤な高血圧症、切迫流産および内蔵性癌患者には禁忌 である。さらにヘパリンは脳、眼あるいはを髄の外科手術の間あるいはその後に は使用されず、腰椎穿刺あるいは領域麻酔ブロックを受けている患者には投与さ れない。（グツドマンとギルマンの「薬物治療の基礎と臨床」第７版第１３３９ 〜１３４４頁（１９８５年）） 医療用に市販されている幾つかの経口抗凝固剤がある。多くの抗凝固薬物は４− ヒドロキシクマリンあるいはその関連化合物の誘導体、インダン−１，３−ジオ ンとして合成されたものである。クマリン誘導体の抗血液凝固活性に対する重要 な化学的性質は、インタクトの３位が炭素である４−ヒドロキシクマリン残基に よる。これらの誘導体の多（は異なる薬理学的効果および毒性を有するが、ワル ファリンナトリウムが米国においては最も広く経口抗凝固剤として使用されてい る。

経口抗凝固剤の主な薬理学的効果は、ビタミン−に依存性凝固因子例えば第１Ｉ 。

第ＶＩＩ、第１Ｘあるいは第Ｘ因子が肝臓において生成後に受ける化学修飾を抑 制して血液凝固を抑える二とである。これらの薬物はイン・ビポでのみ作用する ので間接抗凝固薬とも呼ばれるが、一方、ヘパリンはイン・ビトロでも作用する ので直接凝固薬と呼ばれる。再び、出血が経口抗凝固薬両方で生じる王な副作用 であり、このような療法は常に監視下に置かなくてはならない。合併症を多い順 に上げると、斑状出血、血尿、至急出血、メレナまたは下面、鼻血、血腫、歯肉 出血、喀血、吐血である。上記のヘパリンの使用に関する禁忌症は全て、経口抗 凝固薬に同様にあてはまる。

抗血小板薬は血小板の機能を抑え基本的１＝は動脈血栓症に使用されるが、ワル ファリンおよびヘパリンのような抗凝固薬は凝固因子の生合成あるいは機能を抑 え、静脈血栓症の制御に用いられる。数多くの抗血小板薬があるが、最もよ（知 られているのはアスピリンである。これらの薬剤の急性治療における効能は、し かしながら確立されておらず、実際にはアスピリン出血という問題がある。

血栓溶解薬にはストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性 化物質および、八ＰＳＡＣ（アシル化プラスミノーゲン・ストレプトキナーゼ複 合体）が含まれる。これらは急性血栓症の治療に効果を示すタンパク質である。

これらは、内因性プラスミノーゲンの活性化を促進し、フィブリンを加水分解す る活性化酵素であるプラスミンを生成することによって血栓を溶解する。しかし ながら、これらの薬剤の使用は急性血栓症に限定されている。フィブリン溶解剤 は基本的には慢性の冠動脈血栓症患者の治療に用いられる。

血液凝固プロテアーゼ・カスケードの血管内での活性化の様々な状態に対する効 果的な治療は、血栓症あるいは例えば血管運動虚脱（敗血症性ショック）および 池の播種住血管内凝固のようなより重篤な形態に対しては十分に満足のゆくもの ではなく、敗血性ノヨックの場合には全く満足できない。迅速に動脈性血栓症を 完全に止めることができる効果的な治療法の探求は重要な課題である。近年の研 究からヘパリンは組織プラスミノーゲン活性化剤の血栓溶解療法の終了した患者 の１１〜２０％に生じる再血栓形成における再血栓症に対しては全（効果がない という結果が得られた。

本発明は、これらの必要性に応えてなされたものであり、第ＶＩＩ因子のアンタ ゴニスト類、および第ＶＩＩａ因子および組織因子・第ＶＩＩａ因子複合体の血 液凝固促進作用に特異的なアンタゴニストに関する。本発明には大腸菌（Ｅ、　 ｃｏｌｉ）のようなバクテリア類を含む細胞系、または融合セルラインにより製 造されるモノクローナル型の抗体を含み、この抗体およびその機能性フラグメン トはあらかじめ第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、および／または組織因子と第Ｖ ＩＩａ因子の２分子複合体に対して特異性を有しており、これらのターゲット類 を中和するのに効果的であることに特徴付けられ、播種住血管内凝固（ＤＩＣ） のような症候群および静脈内血栓に対する抗血栓剤として適応できることが発見 されたものである。

本発明はさらにこれらのモノクローナル型抗体を第Ｖ１工因子、第ＶＩＩａ因子 および上記の２分子複合体の精製方法、および第ＶＩＩ因子、第１Ｘａ因子およ び組織因子／第ＶＩＩａ因子２分子複合体のイムノアッセイあるいは免疫検出に 用いる事も含む。生物試料から得られた抗原を含有する第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩ ａ因子および組織因子／第ＶＩＩａ因子２分子複合体の精製は、この生物試料を 、本発明の新規なモノクローナル型の抗体あるいは抗体のフラグメントを固相に 結合した免疫吸着カラムあるいはスラリーを通すイムノーアフィニティクロマト グラフィーによってなすことができる。生物試料中の第Ｖ１工因子、第ＶＩＩ　 ａ因子および組織因子／第ＶＩＩａ因子２分子複合体の検出あるいはこれらのタ ーゲット抗原がある生物試料に含有されているの濃度を調べるイムノアッセイは 該試料を既知量の新規な本発明のモノクローナル型抗体に接触させ、その結果吸 着したモノクローナル抗体の量を測定することによってなされる。

第ＶＩＩ因子は活性セリンプロテアーゼのビタミンに一依存性ザイモーゲンであ る。第ＶＩＩ因子は組織因子と血中で複合体を形成する機能を有し、ＶＨａへと 転化するのに際してこの複合体を形成してその後第Ｘ因子を第Ｘ因子をｉＸａ因 子へと変化させることによって活性化する。凝固促進作用は組織因子：第ＶＩＩ ａ因子複合体にのみ関する。遊離第ＶＩＩ因子および遊離第ＶＩＩａ因子は組織 因子：第ＶＨ複合体と同様、凝固促進作用は有していない。第〜”ＩＩ因子は約 ５０．０００ダルトンの一本のポリペプチド鎖であり、精製系において第Ｘａ因 子、第１Ｘａ因子、トロンビンおよび第ＸＩＩａ因子による蛋白質分解作用によ りジスルフィド結合が切れて活性化される。タカセら、［ヒト第Ｖ１工因子に対 するモノクローナル抗体：ＶＨａｇの１段階イムノラジオメトリック・アッセイ 」ジェイ・タリノ・バソール（Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　ＰａｔｈｏＬ　）第４１巻第 ３３７〜３４１頁（１９８８年）。ヒト第ＶＩＩ因子を部分的あるいは完全に活 性化した場合、ジスルフィド結合でつながった２本のポリペプチド鎖が得られる 。第ＶＩＩおよび第ＶＩＩａ因子は本書類中においては交換して用いることがで き、ターゲットの交換可能性が指摘される場合にはＶＩＩ／ＶＩＩａとする。

ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）とミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）により開発され たハイブリドーマ技術によって、現在では特定の結合部位に対して均一なアフィ ニティーを有する、本賀的に均買な組成物であるモノクローナル抗体を調製する ことが可能である。これらの研究者らによるマウスのハイブリドーマの製造はネ イチャーレーン（Ｈａｒｌｏｗ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｌａｎｅ　Ｄ、）らの「抗体 ：実験マニュアル」（コールド・スプリングス・ハーバ−・ラボラトリ−１９８ ８年）に手法が記載されている。このハイブリドーマ法によって組織培養に適合 するマウス骨髄腫細胞は免疫したマウスの膵臓細胞と融合されてハイブリドーマ と呼ばれ、１種類の抗体分子を大量に生産する融合細胞を得る。一般に動物は抗 原物質を注射され、この免疫した動物に特定の液性の応答が生じた場合に特定の スクリーニング手法が開発される。免疫した動物のテスト用放血からの血清が様 々なスクリーニングに用いられ、効果的な手法が確立された後、実際のハイブリ ドーマの製造を開始する。融合数日前に動物には抗原物質試料によってブースト されるが、この融合は通常は、ガルフエら（Ｇａｌｆｅ）の不一チャー第２６６ 巻第５５０〜５５２頁（１９７７年）に記載されているようにポリエチレングリ コールの存在下で行い、その後リトルフィールド（Ｌｊｔｔｌｅｆｉｅｌｄ）に よりサイエンス第１４５巻第７０９〜７１０頁（１９６４年）に記載されたごと ＜　ＥＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）にて選択を 行う。この融合のために、免疫した動物から得た抗体産生細胞が骨髄腫細胞と混 合され、融合される。この融合の後、細胞は選択培地で希釈されマルチウェル培 養ディツシュへ撒かれる。ハイブリドーマはこの融合後約１週間程の期間で試験 に用いることもできるが、これは正確なものではない。陽性のウェルから得た細 胞は増殖させ、継代培養し、その後単−細胞のクローン化を行う。

ハイブリドーマの製造の最初から最後までにかかる期間が２力月以下であること はめったになく、１年以上かかることもよくある。モノクローナル抗体の製造は ３つの場面があると記載されている：（１）動物の免疫（２）スクリーニング方 法の確立および（３）ハイブリドーマの製造。これらのうちのどの場面において も大変素早ぐ進める必要があるがそれぞれ特有の問題を有していることもまた理 解されるべきである。例えば免疫化は事実上どのような興味ある外来抗原でも行 うことができるが、所望のモノクローナル抗体を製造するため、多くの困難が生 じそして特定の場合には様々な変法が要求される場合もある。特定のハイブリド ーマを調製する試みに先立っては、所望のハイブリドーマが得られること、得ら れた場合にはそれが抗体を産生することあるいはこうして産生された抗体が所望 の特異性あるいは性質を有することに対する確証はない。バーロウおよびレーン （前出）第６章。

ヒト第ＶＩＩ因子に対するモノクローナル抗体の製造は報告されており、これら の試薬は免疫除去血漿の調製あるいは第ＶＩＩ因子欠損患者内の第ＶＩＩ因子交 叉反応性物質の検出に使用されていると記載されている。（同書）第ＶＩ工因子 に対するモノクローナル抗体を第ＶＩＩ因子：ａｇのイムノラジオメトリック・ アッセイに１段階で用いるために製造する方法も報告されている。（同書）著者 らはマウスのモノクローナル抗体を３つ報告しているが、そのうちの２つは第ｖ ■丁因子：ａｇに結合すると記載され、またそのうちの２つはイン・ビトロにお いて第ＶＩＩ因子のインヒビターであると記載されている。ハヮードら、ジェイ ・タリノ・ケム第３５巻１１６１頁も参照のこと。第ＶＩＩ因子あるいは第ＶＩ Ｉａ因子のどちらに対するモノクローナル抗体も、第ＶＩＩ　ａ因子の組織因子 への結合を妨害して治療する、あるいは組織因子／第ＶＩＩａ因子複合体の活性 を中和するとは記載されていない。

発明の概容 本発明はリコンビナントなセルラインあるいはハイブリッド・セルラインにより 産生される新規なモノクローナル型抗体あるいは抗体のフラグメントを提供する が、この抗体類は特定のターゲット、すなわち第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、 組織因子と第ＶＩＩａ因子の２分子複合体およびこれらの特定のエピトープ領域 に対しである先に決められた特異性を有しており、これらのターゲットと結合し た場合に中和する能力を有している。これらの第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因 子に対して競合的な組織因子の非機能性代用薬として結合するため、血液凝固プ ロテアーゼカスケードの活性化を中和する。これらの抗体は上記血液凝固プロテ アーゼカスケードの活性化が病原的作用を及ぼす血栓症状および関連の疾患の予 防および治療に有用である。特定の抗体はまた、第ＶＨおよびＶＩＩａ因子、そ して組織因子／罵ＶＴＩａ因子２分子複合体の精製およびこれらのターゲット抗 原のイムノアッセイにおいても有用である。

本発明はさらに、外因系血液凝固カスケードを選択的に妨害する薬剤によって症 状を軽減する哺乳類の初期のあるいは実存する血栓症性疾患を防止あるいは治療 する方法を提供するが、この方法は哺乳類に必要に応じて組織因子・第ｖＩ工ａ 因子複合体アンタゴニストの予防あるいは治療効果の上がる量を投与することを 含む。本発明は急性播種住血管内凝固、敗血症性ショック、冠動脈血栓症、臓器 移植拒絶および深部静脈血栓症を含む血栓症性疾患の予防および治療法である。

効果的な組織因子：第ＶＨａ因子複合体アンタゴニストにはモノクツ−ナル型の 抗体、好ましくはハイブリドーマセルライン＾ＴＣＣ）（Ｂ　１０５５８によっ て産生される抗体の組織因子：第ＶＩＩａ因子アンタゴニスト性質を有するモノ クローナル抗体またはそのフラグメントを含む。本発明はさらに、第ＶＩＩ／Ｖ ＩＩａ因子の分子上のループ領域のすべであるいは一部、好ましくは第ＶＩＩ／ ＶＩＩａ因子分子上の１９５〜２０８位のアミノ酸からなる構造ループ領域と複 合体を形成する能力を有するモノクローナル抗体を提供する。

本発明はまた、組織因子：第ＶＩＩ　ａ因子複合体アンタゴニストの効果的な量 をを含む血栓症性疾患状態の予防あるいは治療に有用な組成物を提供する。この ような組成物にはモノクローナル抗体および／または上記のモノクローナル抗体 のフラグメントを含有していてもよい。本発明はさらに、実質的に組織因子二第 ＶＩＩａ因子複合体の血液凝固促進活性を抑制する、実質的に精製されたおよび 精製製剤であるモノクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体フラグメントを 提供する。本発明はまた、このようなモノクローナル抗体およびモノクローナル 抗体のフラグメントを産生するハイブリドーマセルラインを提供する。ある動物 種を１あるいはそれ以上の第ＶＩＩａ因子構造ループ領域からなる免疫源で免疫 することを含むこのようなハイブリドーマ・セル・ラインを調製する方法も本明 細書に記載され、請求の範囲とされている。

モノクローナル型の抗体あるいは抗体のフラグンメントであって組織因子：第Ｖ ＩＩ　ａ因子複合体と特異的に反応するが遊離の第ＶＩＩａ因子を実質的に抑制 することのないモノクローナル型の抗体あるいは抗体のフラグンメントを哺乳類 に投与することを含む組織因子　第ＶＩＩａ因子複合体の血液凝固促進作用をイ ン・ビボで抑制する方法もまた、記載され請求の範囲とされている。

第ＶＩＩ　ａ因子および組織因子／第ＶＩＩａ因子２分子複合体に対する特異性 を有する本発明のモノクローナル型抗体は生物試料よりここに記載した方法によ って単離することができる。

図面の簡単な説明 この明細書は特に本発明を構成するものであると見なされる内容を特に指摘し、 明確に権利請求している請求の範囲にまとめているが、添付の図面を考慮に入れ て以下の記載から本発明はより良（理解されるであろう。

ＦＩＧ、１は血液凝固カスケードを示す概念図であり経路は、表面（接触）活性 化、内因系および外因系活性化およびおよび最終通常経路に分けられる。実践は 前駆体ザイモーゲンの酵素への直接活性化を示し、点線は両方のポジティブおよ びネガティブフィードバックを示す。ＰＬはリン脂質を示す。

ＦＩＧ、２は１２Ｄ１０モノクローナル抗体および１２Ｄ１ＯＦ　（ａｂ）フラ グメントが２段階プロトロンビン時間テストにおいてカル／ラム再添加ヒト血漿 凝固の抑制能を示す。

ＦＩＧ、３は１２Ｄ１ＯＦ（ａｂ）を静脈内投与した後の時間に対する血漿ＰＴ （プロトロンビン時間）および第ＶＩＩ因子の凝固活性を示すグラフである。

ＦＩＧ、４は１２Ｄ１０　Ｆ（ａｂ）を静脈内投与した後の時間に対するＰＴお よび第ＶｒＩ因子凝固活性のグラフを示す。

ＦＩＧ、５は１２０１０　Ｆ（ａｂ）を静脈内投与した後の時間に対するＰＴお よび遊離のＶＩＩ／ＶＨａ抗原を示すグラフである。

ＦＩＧ、６は１２Ｄ１０　Ｆ（ａｂ）フラグメントの幹脈内投与後の時間に対す るＰＴおよび１２ＤＩＯＦ（ａｂ）濃度を示すグラフである。

ＦＩＧ、７は一匹のチンパンジーに１２０１０　Ｆ（ａｂ）の投与前および投与 後のＰＴを示すグラフである。

発明の詳細な開示 図１に特に示されたように、血液凝固はへイブマン因子（ＸＩＩ）が接触活性化 を受け、表面に結合しはじめた時に開始することができる。この表面結合因子Ｘ ｎは高分子量キニノーゲン（ＨＭＷ−Ｋ）の存在下でカリクレイン（Ｋａ）によ るタンパク質分解性の活性化を受ける。この表面活性化（接触系、内因系経路） はイン・ビトロの血液凝固を開始させるが関連するイン・ビボ機構ではないと考 えられている、この経路の欠損（ＸＩＩ、プレカリクレインおよびＨＭＷ−Ｋ） はイン・ビトロの凝固時間を遅延させるが、止血異常とはならない。

第１Ｘａ因子はフィードバック回路のアームを構成し、ＨＭＷ−にの存在下でプ レカリクレイン（Ｐｒｅ−にあるいはフレッチャー因子）からのＫａをさらに活 性化させる。ＨＭＷ−にの存在下で第１Ｘａ因子はまた、第ＸＩ因子を活性化す る。

Ｃａ２−の存在下で第１Ｘａ因子は第１Ｘ因子を第１Ｘａに蛋白質分解で活性化 する。

第ＶＩＩＩ因子、第１Ｘａ因子、Ｃａ”、血小板からのリン脂質ミセル（Ｐ　Ｌ ）は第Ｘ因子とりボタンバク質複合体を形成し、これを活性化する。第Ｖ因子、 第Ｘａ因子、Ｃａ”、ＰＬはまた、第１Ｉ因子あるいはプロトロンビンとリポタ ンパク質複合体を形成し、それをＩＩａあるいはトロンビンに活性化する。続い て、トロンビンは大きなフィブリノーゲン（Ｉ）分子から２つの小さなペプチド 対を切り放し、その後直ちに可溶性フィブリンの非共有結合性凝集体が形成され る。第Ｘｌ１１因子はトロンビンによりＸＩＩＩａに活性化され、隣接フィブリ ン単量体と共有結合性に交差結合し、不溶性フィブリン塊を形成する。

組織因子はエンドトキンネミア（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｅｍｉａ）の結果−膜化シ ュワルッマン反応（ＤＴＣ）の血液凝固を開始させるという重要な事実がある。

カブラン（Ｋａｐｌａｎ、　Ｌ　）の血栓における凝固タンパク質。止血と血栓 症（前出）第１０９８頁。フィブリンの微小な血栓が致死ＤＩＣにおいては一様 に認められ、また大動脈および大静脈の血栓症においては４０％にこれが認めら れる。ミンチら（Ｍｉｎｎａ。

Ｊ、Ｄ、、　Ｒｏｂｂｏｙ、　Ｓ、Ｊ、、　Ｃｏｌｍａｎ、　Ｒ１？、）ヒトに おける播種住血管内凝固、シー・／−・トーツス（Ｃ，Ｃ，Ｔｈｏｍａｓ）１９ ７４年。白血球の関与が必要であり、血液凝固促進（血栓形成）場面へエンドト キシンによって誘導される、セマラロ（Ｓｅｍａｒａｒｏ、　Ｎ、）ら。

「エンドトキシン誘導性Ｉ）ＩＣにおける白血球の凝固促進活性の機構コラット およびウサギにおける比較研究の結果からコエージエンツ・アクンヨンズ（核弘 斐Ａｃｔ５μ止）第１１巻第６４６頁１９８１年２６は組織因子を説明している 。コラッチ（Ｃｏｌｕｃｃｉ。

輩、）の「培養ヒト血管内皮細胞がエンドトキシンに応じて組織因子を産生ずる 」ンエイ・タリノ・インベスト′Ｍ７３巻第１８９３頁１９８３年。同時に、血 管内皮細胞にもまた組織因子の発現、血液凝固開始および抗凝固性の低下が誘導 される。ムーア（Ｍｏｏｒｅ。

Ｋ、　Ｌ、　）ｒエンドトキシンが組織因子を増加させ、イン・ビトロにおいて ヒト血管内皮細胞のスロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）を抑 制する。」ジエイ・タリノ・インベスト第７９巻第１２４〜１３０頁（１９８７ 年）。

外因系凝固カスケードは組織因子を発現している細胞の表面上に［組織因子：Ｖ ＩＩ］と［組織因子：ｖＩＩａｌの複合体が形成されることによって開始すると 考えられている。組織因子は通常は血液細胞や血管内皮細胞には発現されていな いが、ＬＰＳ、ＴＮＦアルファあるいはＩＬ−１の刺激に続いて血管内皮細胞は この分子を転写して発現する。組織因子の発現されている分子数が少ないにもか かわらず、第１Ｘａ因子は結合され、結合した第ＶＩＩ因子のＸａ因子フィード ・Ｉ＜、。

り活性化によって迅速にｖＩＩａｌ：転化する。血管内皮細胞の第１Ｘ／ＩＸａ 因子受容体（ＩＸ−Ｒ）および第ＶＩＩＩ因子（Ｘａあるいはトロンビンのフィ ード／り、ツタにより第ＶＩ’Ｈａ因子に活性化された）は第Ｘ因子の限定的タ ンパク質分解性活性化による第Ｘａ因子産生の速度を顕著に上昇させる。細胞の 表面に細胞表面関連因子Ｖ（）ロンビンフィードバックにより活性化された）は さらにＸａのＶｍａｘヲ増幅し、血漿ヘパリン：　ＡＴ’−ＩＩＩプロテアーゼ インヒビターによる抑制を防止する。プロトロンビンは効果的にトロンビンに転 化されてこれがフィブリノーゲンをフィブリンに転化させ、化学走行剤として働 くプラスミノーゲン活性化剤のインヒビター■の遊離を導き、血小板を凝集さ也 単球のＭａｃ−ルセブターの活性化をし、そして他の炎症性効果を生じさせる。

現在のところ二の外因系経路の抑制をするのに効果的な薬物はない。ヘパリンは 効果がないことが示されているが、にもかかわらず臨床投与を続けると血小板へ の影響という第２の問題が付随する。抗トロンビンＩＩＩ欠損性ＤＩＣにおいて はヘパリンは直接抗凝固薬ではなく、［ヘパリン　抗トロンビン−ｍＨ複合体と して存在する場合にトロンビン抑制剤である抗トロンビン−ＩＩＩのコファクタ ーとしてのみ有用であるからである。抗血小板薬物は血液凝固プロテアーゼカス ケードを抑制せず、この薬物は血小板に必要な止血性質を減少させるのみである 。

ビタミンＫに支援される第ｖ■、ＩＸ、ＩＸ因子およびプロトロンビンのガンマ カルボキシル化を妨害するワルファリン療法は非常に遅く、プロティンＣおよび プロティンＳのガンマカルボキシル化の抑制のため天然の抗血液凝固経路の活性 の減少を伴う。本発明は、［組織因子：ｖＩＩａｌのタンパク質分解性複合体の 始動というできるだけ早い段階でこの反応経路を抑制することによってこの要求 に答えるものであり、組繊因子陽性細胞、すなわち血管内皮細胞、単球およびア テローム性動脈硬化栓内の組織因子陽性泡沫細胞による血管内での血液凝固の始 動をブロックするものである。

本発明は中和アンタゴニスト代用薬コファクター、好ましくは組織因子とＶＩＩ ／ＶＩＩａの機能性２分子開始複合体に対してのモノクローナル抗体あるいは抗 体のフラグメント、より好ましくはこの組織因子・ＶＩｒ　ａ複合体あるいはこ れに代えてＶＩＩあるいはＶＨａ、好ましくはそのループ領域に対する中和モノ クローナル抗体を用いる。このようなモノクローナル抗体は［組織因子：ｖＩＩ ａｌに対してＶＩＩ／〜’Ｔｌ　ａの活性部位をブロックするように結合し、Ｖ ＩＩａを組織因子から分離させ、あるいは基質のセリンプロテアーゼのザイモー ゲンである第Ｘ因子あるいはＩＸ因子との連絡を競合的に抑制して血管細胞の血 液凝固開始を抑制し、血栓症性疾患の主要な発症経路を止める。

血液凝固の活性化は、長い間血栓形成および成長の中心であり、また必要なもの であると考えられてきたが、血管向凝固の拡散に対しては、特に最も悪性の敗血 症性ショックにおいては多くの機構が働いている。ＴＮＦアルファに対するモノ クローナル抗体はエンドトキシン媒介性敗血症性ショックからヒヒ属を守ること がトレイ／−（Ｔｒａｃｅｙ　Ｋ、　Ｊ、　）の「抗力ケクチン／ＴＮＦモノク ローナル抗体は致死菌血症における敗血症性ブロックを防止する」ネイチャー第 ３３０巻第６６２頁（１９８７年）により示されている、ＴＮＦアルファはエン ドトキシン、ＩＬ−１および毒性ショックトキシン１により誘導されるからであ る。ミツシー（Ｍｉｃｈｉｅ、　Ｈ，Ｒ，）「エンドトキシン投与後の循環性腫 瘍壊死因子の検索」エヌ・インク・ジェイ・メト（Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅ ｄ、）第３ｔｇ巻第１４８１頁（１９８８年）、ジニビン（Ｊｕｐｉｎ、　Ｃ， ）ら、「プロティンＣがヒヒ属の大腸菌感染の凝血異常および致死効果を防止す る。」ジエイ・タリノ・インベスト第７９巻第１８頁（１９８７年）。しかしな がら、抗ＴＮＦアルファあるいは抗ＬＰＳモノクローナル抗体は一旦発病過程が 確立した後には低い効果しかない。近年、天然の抗凝血タンパク質である活性化 プロティンＣの大用量投与が初期の敗血症性ショックの進行を止め、さらには回 復させることができることが示されている。ティラー（Ｔａｙｌｏｒ、　Ｆ、Ｂ 、）　ｒプロティンＣがヒヒ属の大腸菌感染の凝血異常および致死効果を防止す る。」ジェイ・タリノ・インベスト第７９巻第９１８頁（１９８７年）。現在、 同じグループの同じモデルからの結果は、組織因子に対するモノクローナル抗体 によって血液凝固の開始を止めることはヒヒ属への致死量の大腸菌のチャレンジ における敗血症性ショックの治療に効果があることを指摘する（エノントン（Ｅ ｄｇｉｎｇｔｏｎ）ら、「組織因子・分子生物学とグラム陰性菌による敗血症ノ ヨックの病理生理学における有用性」（「高危険性也者における微生物学、化学 療法および免疫学の問題」ガラン（Ｅ、　Ｇａｒａｃｉ）ら編集、レイパン・プ レス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）ニューヨーク第６１巻筒２９−３７頁（１９８ ９年））。

抗−タンパク質抗体を製造するのに有用な一つの方法はこのタンパク質配列のう ちのタンパク質の表面にある領域の合成ペプチドを用いて所望の抗体を調製し、 および／または選択することを含む。しかしながら第ＶＩＩａ因子の場合は構造 に関する実験データは得られていない。アミノ酸配列が知られているのみである 。

第ＶＩＩａ因子は、Ｘ線結晶解析によってその構造が決定されているいくつかの 他のプロテアーゼとその触媒性ドメインにおいていくらかの配列および構造的相 同性を有する。これらのプロテアーゼの配列は解析されており、第ＶＩＩａ因子 の触媒ドメインの配列が比較された。第ＶＨａ因子分子には、より可変構造を取 る領域と同様、非常に構造が保存され、しばしばこのタンパク質のコア構造を示 す領域が発見された。可変構造を示す配列を有する領域をここでは「ループ」と よぶが、これらは触媒ドメインの表面上に発見された。

第ＶＩＩａ因子の触媒ドメインの配列中、１１のループ領域が同定された。含有 するペプチドは第１６５〜１７７．１９５〜２０８．２０９〜２１８．２３４〜 ２４８．２４８〜２５８２６３〜２７８．２８５〜２９５．３１３〜３２１．３ ３０〜３３９．３４８〜３６０および３６７〜３９０位のアミノ酸からなる。第 ＶＩＩａ因子の触媒ドメインの構造のコンピューターモデルが構築され、構造的 可変ループの位置を確認した。一群のループは第ＶＩＩａ因子の触媒部位の近辺 に位置し、他は様々なプロテアーゼが不活性−末鎖である第ＶＩＩ因子を酵素的 に切断して活性化２本鎖である第ＶＩＩ　ａ因子に活性化する活性化部位の回り に密集している。

中和を目的とする抗−第ＶＩＩ／〜’ＩＩ　ａ因子抗体のエピトープは、ループ 領域に結合することによって第ＶＩＩａ因子の活性を中和あるいは抑制するよう その後規定された抗体を製造するのに用いられる。これらのループが活性部位に ある場合接近をブロックし、このため第ＶＩＩａ因子の機能を抑制する。このよ うにして外因系血液凝固経路をブロックする抗体が製造される。

ハイブリドーマの調製および第ＶＩＩ／ＶｒＩａ因子および組織因子／第ＶＩＩ ａ因子複合体に対するモノクローナル抗体の初期の性質は以下の実施例１に示し た。

パラメーターは抗原の調製、抗原の用量および形態、接種の経路および免疫プロ トコール、ハイブリドーマの製造およびモノクローナル抗体の選択、単離および 最初の性質の解析に関して記載している。１２Ｄ１０（＾ＴＣＣ［ＩＢ　１０５ ５８）と名付けられたモノクローナル抗体の性質は説明されている。この抗体は 第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子に結合し、組織因子　第ＶＩＩａ因子複合体の活性を劇 的に抑制することが示された。

実施例２の結果に示されているように、１２Ｄ１０抗体は遊離の第ＶＩＩａ因子 の活性を抑制することもできる。１２Ｄ１０モノクローナル抗体は第ＶＩＩ／Ｖ Ｈａ分子の１９５〜２０８位のアミノ酸に特異的であることが実施例３に示され ている。実施例５に記載されているように１２Ｄ１０モノクローナル抗体を分裂 することは、さらに有益なことにその血液凝固抑制活性に影響を及ぼさなかった 。

抗体およびその所望の結合部位にはＦ　（ａｂ）およびＦｖフラグメントを含み 、イムノグロブリン遺伝子ライブラリーのクローニングを含む工程により製造す ることができる。ヒュース（ｍｕｓｅ）ら、「ラムダファージ内のイムノグロブ リン・レパートリ−の大きな組み合わせライブラリーの構築」サイエンス第２４ ６巻第１２７５〜１２８１頁（１９８９年１２月８日）。これらの方法を用いて 、ベクタ系は膵臓細胞より単離されたメンセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の、 増幅生成物の末端に制限部位を導入するオリゴヌクレオチドとのＰＣＲによる増 幅に続いて構築される。分離した重鎮と軽鎖ライブラリーが構築され、ランダム に組み合わされて共にこれらの分子を発現し、抗原の結合性で選択されてもよい 。−末鎖抗体をまた調製して利用してもよい。

第Ｖｒｒａ因子−組織因子２分子細胞表面活性化複合体を中和する他のモノクロ ーナル類は抗血栓モノクローナル抗体の３つのクラスから製造され選択される。

この３つのクラスの抗体の特異性は、第ＶＩＩおよびＶｒｌａ因子と反応性であ りアミド分解活性を中和するものを含む。抗体の２つのサブセントが生み出され る。

一方は組織因子と第ＶＩＩ／Ｖｆｌａ因子の連絡を妨害して第Ｖｉａ因子の活性 を抑制し、もう一方は直接第ＶＨａ因子の活性を抑制する。第２のクラスには第 ＶＩＩａ因子とのみ反応性でありアミド分解活性を中和するモノクローナル抗体 を含み、第３のクラスには組織因子と第Ｖ丁Ｉ因子の連携の結果発現されるネオ エピトープと反応して中和する抗体が含まれる。これらのネオエピトープ類は遊 離の組織因子あるいは第ＶＩＩ因子上には発現されず、それゆえ血液凝固開始複 合体に制限される。

この３つのクラスの抗体それぞれによって、抗血栓治療への独特な機構でのアブ ａ−チがさらに可能となる。第１クラスの抗体類は１２ＤｌＯモノクローナルの 特異性によって規定される。第２の特異的クラスの抗体はりコンビナンドの第Ｖ ＩＩａ因子でマウスを免疫することによって開発される。第ＶＩＩａ因子と反応 するが第ＶＩＩ因子とは反応しないモノクローナル抗体が選択される。好ましい 薬剤は、さきに形成された組織因子：第ＶＨａ因子複合体の活性を抑制する。こ の機能性２分子後合体の上に発現されるネオエピトープ類は、活性を中和するモ ノクローナル類の開発のための免疫原ターゲットとなる。これらの抗体はネズミ の牌細胞を、最適なリン脂質の環境下で先に調製した組織因子・第ＶＩＩａ因子 の複合体を用いてイン・ビトロ免疫化を行うことによって調製される。イン・ビ トロ免疫化はこの複合体のイン・ビボにおけるタンパク質分解性の不安定性質の ため好ましい；しかしながら、ヘパリンで処置したマウスの標準的なイン・ビポ 免疫化もまた用いることができる。選択は遊離の組織因子、第ＶＩＴａ因子と反 応性である抗体と対立する、組織因子・第ＶＨａ因子複合体と反応性である抗体 のみを同定するために行われる。これらの抗体類は障害あるいは活性化の部位の 血液凝固のみを抑制し、正常な止血には影響を及ぼさない。

実施例１ ハイブリドーマの調製と所望のモノクローナル抗体の同定は以下のようにして行 った。雌性バルブ・シー（ｂａｌｂ／ｃ）マウスを、約６カ月以上の間保存した ヒト血漿より単離した精製ヒト第ｖ■工因子（第ＶＩＩ因子）で免疫した。完全 フロイント・アジュバントを最初の免疫に、そして不完全フロイント・アジュバ ントをブースター免疫に用いた。１から１０マイクログラムのタンパク質を各免 疫において用いた。免疫の経路は腹腔内および皮下の両方である。融合の３日前 に生理的食塩水中の精製筒ＶＩ■因子（２０μｇ）の静脈内潅流ブーストを行っ た。膵臓を取り出し、＃臓細胞を５Ｐ２１０ミエローマと以下の標準ハイブリド ーマ方法にて融合させた。

スクリーニング方法としては３段階方法を用いた。第１段階のスクリーニングで は第ＶＩＩ抗原あるいはＶＩＩａ抗原と反応するハイブリドーマの抗体を確認し た。

第２段階のスクリーニングにおいては第ＶＩＩａ因子の機能的活性を抑制するこ とのできる抗体を、第Ｘ因子活性化色素生成基質アッセイによる評価で確認した 。

第３段階のスクリーニングにおいてはカルシウム再添加血漿の血栓形成の抑制を ２段階プロトロンビン時間テストによって評価して確認した。

第１スクリーニングのアッセイは抗体の１２５■−第ＶＩＩ因子への結合を調べ るラジオイムノアッセイであるｅ間車にいうと、９６穴のポリ塩化ビニル製マイ クロリッタープレート上に、ングマ・ケミカル・カンパニー（米国セントルイス 、ＭＯ）より購入した、アフィニティーで精製したヤギ抗マウスＩｇＧを受身被 覆した。抗体被覆プレートはつ／アルブミンでブロックし、培養上清（少なくと も１．５０に希釈）をこのプレートに結合させた。プレートを洗浄して結合して いない抗体を除き、１２５Ｉ−第ＶＩＩ因子あるいは第ＶＩＩ　ａ因子（１００ ，０００ｃｐｍ／ウェル、第ＶＩＩ因子の固有活性は６μＣｉ／μｇ、第ＶＩＩ ａ因子の固有活性は４μＣｉ／μｇ）を添加して続いて培養した。このプレート を洗浄して結合していない第ＶＩＩ因子を除き、各ウェルをガンマカウンターに 移して結合した標識第ＶＩＩ因子ツクローナル抗体を分泌するセルライ／から得 られたハイブリドーマの培養上清、滅菌培養メディウムおよび緩衝液を含有する 。過剰の非標識リガンドとの１２５１−第ＶＩＩ因子の抗体への結合の競合はさ らに特異性の測定にも用いた。

第２段階のスクリーニングは単離した抗体が、第Ｘ因子からの第Ｘａ因子への添 加として反映される組織因子の触媒する第ＶＩＩ因子の活性を抑制する能力を評 価する。ヒト膀胱癌のセルラインＪ−８２（ＡＴＣＣＨＴＢ−１）は細胞表面− 関連組織因子を発現しており、組織因子およびリン脂質源として用いられる。

第ＶＩＩａ因子の活性の量に応じて色素を生成する第Ｘａ因子に対する色素生成 基質を用いた。逆に、色素は第ＶＩＩ因子の活性がブロックされていれば生成さ れない。アッセイは以下のようにして行った。Ｊ−８２細胞はトリス緩衝セーラ インで１ｍｌあたりｌＸｌ０’細胞となるよう希釈した。５０μｔの細胞懸濁液 を９６穴ポリスチレン製マイクロリツター・プレートの各ウェルに添加した。少 なくとも１：１０に希釈した５０μｌのハイブリドーマの培養上清を適当なウェ ルに添加し、さらに２０ｍＭのＣａ　Ｃ１２を２５μを添加した。ネガティブコ ントロールは関係の無いハイブリドーマの培養上清（抗−ｔＰＡの上演）であり 、およびポンチイブコントロールとしては１０μＭのＰＰＡＣＫ（ｄ−フェニル アラニン−プロリン−アルギニン−クロロメチルケトン）である。９０μＭの第 Ｘ因子を２５μｌおよびスベクトロザイムＸ　ａ　（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ　 Ｘａ）基質を５０μｆ各ウエルへ添加した。続いて３０分間室温でインキュベー ジタンし、○Ｄ−４０５を測定した。

最大活性（ネガティブコントロール）は緩？＃液あるいは関係の無いハイブリド ーマの培養上清で処理した標本により得られる。このアッセイのＰ　Ｐ　Ａ　Ｃ Ｋにより得られる完全な抑制（ポジティブコントロール）を以下の表１に示した 。

表１・第Ｘ因子活性化アッセイ 緩衝液　１．１０１ 抗−１Ｐ、Ａハイブリドーマ　１．１５１培養土清（１：　１０） ナル抗体の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子結合アッセイおよび第Ｘ因子活性化アッセイ における性質を以下の表２および３に示した。

好ましいハイブリドーマより単離され、１２Ｄ１０と名付けられたモノクローナ ル抗体の篤ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子結合アッセイおよび第Ｘ因子活性化アッセイに おける性質を以下の表２および３に示した。

表２．第〜’ＩＩ／ＶＩＩａ因子抗原結合アッセイによるハイブリドーマ抗体１ ２ＤＩＯの１２Ｄ１．Ｏｒｅｃ第ＶＩＩａ因子　３０４８９１２Ｄ１０　ｒｅｃ 第ＶＩ丁因子÷５０倍モル過剰コールドｒｅＣ第ＶＩＩ因子　１８７８１２Ｄ１ ０　ｒｅｃ第ｖＩ■ａ因子＋５０倍モル過剰コールドｒｅｃ第ＶＩＩａ因子　２ ７７１培地　ｒｅｃ第ＶＩＩａ因子　４３１１異的に反応することを示す。

表３　ハイブリドーマ抗体１２Ｄ１０の中和活性の同定抗−ｔＰＡモノクローナ ル抗体　３ ＰＰＡＣＫ　（１μＭ）　１００ する。

実施例２ １２０１０モノクローナル抗体による抑制機構を調べるため、第Ｘ因子活性化試 験を用いた。ハイブリドーマの培養上清を１：５０に希釈し、先にＪ−８２細胞 の表面上に発現されている組織因子と複合体を形成させたｒＦ、ＶＩＩまたはｒ Ｆ。

ＶＨａ　（ｒＦ、ＶＩＩまたはｒＦ、Ｖｌｌａは、これらの分子のりコンビナン ド源を示す）のどちらかと共に前培養した。抗体のインキュベージタンは室温で ３０分間行った。抗体のブロッキング効率は第Ｘ因子活性化アッセイにて評価し た。コントロールとしては関係の無いノゾブリドーマ抗体（抗−ｔＰＡ）および 組織因子と第ＶＩＩａ因子の連携を妨げるが複合体形成後の活性は抑制しないこ とが知られている第ＶＩＩａ因子に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ　１２９ ６）とを用いた。

抗血栓症モノクローナル抗体として最適な特異性は細胞の組織因子と第ＶＩＩａ 因子の複合体を抑制するものである。この実験の結果を表４に示した。

表４＝ハイブリドーマの抗体１２Ｄ１０による第ＶＩＩ　ａ因子活性抑制の機構 １２０１０　組織因子：第ＶＩｌａ因子　９８±０１２９６　第ＶＩＩａ因子　 ８５立１ 】２９６　組織因子：第ＶＩＩａ因子　２２立１２抗ｔ−ｐ＾　第ＶＩＩａ因子 　０立０ 織因子および第ＶＩＩａ因子複合体の両方の活性を抑制するという、開示された 血液凝固に対する治療に重要な性質を証明する。

実施例３ １２Ｄ１０モノクローナル抗体の特異性を以下のごとく詳細に評価した。第ＶＩ Ｉａ因子の２本のｇｌａＦメイン、ＥＧＦドメイン、軽鎖および触媒部位を示す 一連の合成ペプチドと１２Ｄ１０モノクローナル抗体との反応性を試験した。こ の実施例は１２Ｄ１０モノクローナル抗体で被覆したマイクロタイター・ウェル によって行い、この捕獲抗体と指定したペプチドの１００μＭ溶液２５μｔとを ３７℃で３０分間反応させ、この培養に続いて、２５μｌの１０Ｍ１２ｆｉｌ− 第ＶＩＩａ因子を各ウェルに添加して１時間室温に置いた。１９５〜２０８位の アミノ酸残基を含有する第ＶＩＩａ因子のペプチドは】２Ｄ１０モノクローナル 抗体が１２５■−第ＶＩＩａ因子に結合するのを妨げた。

この結果は１２Ｄ１０モノクローナル抗体の第ＶＩＩａ因子の１９５〜２０８位 のペプチドへの直接結合によって確認された。各ペプチドをマイクロタイターウ ェルへＩｍｇ／ｍｌの濃度で３７℃で２時間吸着させた。ウェルをアルブミンで ブロックし、１２ＤＩＯモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）と２時間３７℃ で反応させた。ヒツジ抗マウスＩｇＧパーオキシダーゼ共役体を結合したモノク ローナル抗体を調べるのに用い、その後基質の生成および０Ｄ−４５０による測 定を行った。ｇｌａ（２ペプチド）、ＥＧＦ　（８ペプチド）、軽鎖（２ペプチ ド）および触媒ドメイン（１１ペプチド）を示すペプチドを試験した。触媒ドメ インペプチド１９５〜２０８は１２ｆ）２０抗体に結合した（ＯＤ−４５０＝０ ．４５０）が、他のすべてのペプチドは陰性であった（ＯＤ−４５０≦０，０４ ２）。第■工Ｉａ因子の触媒ドメインに対するモノクローナル抗体１２Ｄ１０の 特異性はこの抗体がＶＩＩａと、組織因子：ＶＩＩ複合体形成の前および後で反 応させても結合するという発見と合致する。

実施例４ １２Ｄ１０抗体のＦ　（ａｂ）フラグメントの活性の解析を以下のようにして行 った。１２ＤｌＯモノクローナル抗体のＦ（ａｂ）フラグメントの調製は市販の キットを用いて行った（バイオプローブ・インターナショナル・ツースチン、カ リフォルニア）。Ｆ（ａｂ）フラグメントはＩｇＧのパパインによる切断により 調製した。パパインは抗パパインポリクローナル抗体の添加で抑制し、除いた。

プロティンＡクロマトグラフ法をＦｃフラグメント、インタクトのＩｇＧおよび パパイン中に含まれる免疫複合体の精製に用いた。Ｆ　（ａｂ）フラグメントは さらにスーパーローズ１２（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２）カラムを用いたサイズ・エ クスクル−ジョン（ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフ法によって 精製した。上記のようにして精製したモノクローナル抗体１２０１０はパパイン の消化の前後で分析した。得られた１２Ｄ１０　ＩｇＧおよびＦ　（ａｂ）フラ グメントの純度は約９５％であった。これらのＦ　（ａｂ）フラグメントの活性 をインタクトな１２Ｄ］ＯＩ　ｇ　Ｇの活性と、第Ｘ因子活性化アッセイおよび 血液凝固抑制アッセイの両方において比較した。第Ｘ因子活性化アッセイにおけ る１２Ｄ１０　Ｉ　ｇ　ＧおよびＦ　（ａｂ）フラグメントの分析は、組織因子 源として、最適条件で再脂肪化したりコンビナンドのヒト組織因子をＪ−８２細 胞の替わりに用いる以外は上記のごとく行った。この変法は、アッセイの正確さ および再現性を上昇させ、Ｊ−８２細胞を得るための細胞培養の手間をはふいて 作業を楽にする。これらの実施例において、第ＶＨ因子は３０分間室温で１２Ｄ Ｉ０　ＩｇＧまたはＦ　（ａｂ）と前培養して、この免疫複合体を第Ｘ因子活性 化あるいは血液凝固アッセイに用いた。

表５・１２Ｄ１０１　ｇ　ＧおよびＦ（ａｂ）による第Ｘ因子活性化の抑制抑制 剤　第ＶＩＩａ因子抗体　抑制率％１２ＤｌＯＩｇＧ　１０　１００ １２Ｄ１０　ＩｇＧ　１．０　１００ １２０１０　ＩｇＧ　Ｏ，１２８ １２Ｄ１０　Ｆ（ａｂ）　１００　１００１２ＤＩＯＦ（ａｂ）　１０　１００ １２０１０　Ｆ（ａｂ）　１．０　１００１２Ｄ１０　Ｆ（ａｂ）　０．１　４ ５抗−ｔＰＡＩｇＧ　１００　５ 抗−ｔＰＡ　ＩｇＧ　１０　０ 抗−ｔＰＡＩｇＧ　１．０　２ 抗−ｔＰＡＩｇＧ　Ｏ，１０ 表５に示された結果は１２Ｄ１０抗体のフラグメント化は生物活性の消失にはつ ながらないことを指摘する。ＩｇＧとＦ　（ａｂ）フラグメントの活性はこれら の実験条件下においては本質的に同じである。１２Ｄ１０抗体の有効性はこの、 抗体部位の酵゛　素に対するモル比が１：１での抑制率から明らかである。第Ｖ ＩＩ　ａ因子：モノクローナルの比が１以下での第Ｘ因子活性化の抑制値は、こ のアッセイの読みは、試料中の残存（非抑制）量の第ＶＩＩ　ａ因子の活性が非 常に増幅されているという事実から説明される。

実施例５ １２Ｄ１０モノクローナル抗体は、２段階プロトロンビン・タイム試験において カルシウム再添加ヒト血漿の凝血を抑制する。この性質におけるＦ　（ａｂ）フ ラグメント化過程の効果を以下のようにして分析した。血漿は２ｍＭのクエン酸 ナトリウムで１＝２に希釈した。指示した濃度のＩｇＧまたはＦ　（ａｂ）５０ μｌを１００μｌの希釈した血漿中に添加し、室温での培養を２０分間行った。

ヒトのトロンボプラスチン（トロンポレル・ニス（Ｔｈｒｏｍｂｏｒｅｌ　Ｓ： ベーリング・ダイアグノスティックス））を３０ｍＭのＣａＣ１ｚにて１　：　 １０００に希釈し、その２００　μＩを血漿／抗体溶液に添加した。

凝血時間はコーガメート光学凝血測定器（Ｃｏａｇａｍａｔｅ　ｏｐｔｉｃａｌ 　ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）（オルガノン・テクニカ）にて測定した。凝血時 間は組織因子の活性パーセントに、先にハバタムら（Ｈｖａｔｕｍ、　Ｍ、　ａ ｎｄ　Ｐｒｙｄｚ、　１１．）の組織トロンボプラスチンの研究に記載されたア ルゴリズムを用いて変換した。ジオキシ胆汁酸ナトリウムへの溶解性。バイオケ ム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ） 第１３０巻第９２〜１０１頁（１９６６）。結果をｆｉｇｕｒｅ２＋こ示した。

これらの結果は１２Ｄ１０のＦ　（ａｂ）フラグメントがヒトの血漿の凝血の強 力な抑制剤であることを示す。

実施例６ チンパンジーにイン・ビボ投与した場合、１２Ｄ１０モノクローナル抗体は遊離 の第ＶＴＴ／ＶＩＩａ因子抗原のレベルを減少させる。この、抗原のレベルの減 少は１時間以上の間維持され、いくつかのケースにおいては５時間以上、あるい は１０時間以上維持される場合すらある。

１２Ｄ１０モノクローナル抗体のＦ　（ａｂ）フラグメントを、チンパンジーに 投与して薬動力学、全身性抗凝血効果および限定された毒性を評研した。３匹の 正常な青年期のチンパンジー（４５〜５５　ｋ　ｇ）をこの研究のために選んだ 。すべての動物は獣医による生理学試験に供され、全血球計測（ＣＢＣ）、血清 化学試験、糞試験（卵母細胞および寄生虫）および肝炎の血清学的試験を行った 。血液学、血液凝固および臨床化学パラメーターを試験し、正常範囲にあること が示された。

動物は不ズミのタンパクに暴露された経験のない、チノパンツー抗ネズミ抗体（ ＣＨＡＭＡ）陰性の個体を選んだ。

動物は術前にケタミンで間欠的に麻酔した。最初に５用量の投与を行った。プロ トロンビン時間を延長させた用量を他の２匹のチンパンジーにも投与した。投与 の−１５，１５，３０，６０，１２０，２４０，３４０，１４４０および２８８ ０分後に血液学的、生理学的および凝固パラメーターの評価のために血漿サンプ ルを取った。トータルで１６回の１２Ｄ１０Ｆ　ａ　ｂフラグメントの投与のた めに二の研究には５週間かかった。即時に認められる病的症状はなかったが、い （らかの血腫の形成およびケタミン投与部位からの出血が高用量では認められた 。

低レベル（１キログラム当たり０．００２３〜０．００５８ｍｇ）の投与ではＰ Ｔあるいは第ＶＩＩ因子活性（両方とも、標準的なアッセイ方法で測定した）に 対するあきらかな影響は認められなかった。ｆｉｇｕｒｅ３はＰＴ値と第ＶＴ工 因子凝固活性が０．００３５ｍｇ／ｋｇの用量の１２ＤＩＯＦ（ａｂ）フラグメ ントの投与後も本質的には定常にに保たれることを示す。

全身への影響が認められる境界は１ｋｇあたり０．０４ｍｇの用量である。この 用量レベルにおいては、プロトロンビン時間は３０秒以上に伸び、同時に第ＶＩ Ｉ因子凝固活性および遊離の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ抗原がそれぞれ１０％以下１０ ｎｇ／ｍ１以下に減少する。

凝固パラメーターにおける１２Ｄ１０　Ｆ（ａｂ）フラグメントの全身への影響 は、０．０５４７１ｕｇ／ｋｇノ１２ＤＩＯＦ（ａｂ）フラグメントを静脈内投 与したチンパンジーに認められる。

ｆｉｇｕｒｅ４には血漿のＰＴ値の迅速な上昇が付随する第〜’ＩＩ因子の凝固 活性に反映されていることを示す。この遊離の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ抗原レベルの 減少はｆｉｇｕｒｅ５に示した。

研究期間の間、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子抗原および第ＶＩＩ凝固レベルが低下す るのに従い、血漿中の１２ＤＩＯＦ（ａｂ）フラグメントのレベルは劇的にＰＴ Ｉ！：と平行して増加した。血漿中のＦ（ａｂ）フラグメントのレベルは血漿の ＰＴ値と直接相関し、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子抗原レベルと逆相関する。血漿Ｆ （ａｂ）フラグメントは投与から最初の１５分以内にピーク濃度に達する。血漿 中の１２Ｄ１０　Ｆ（ａｂ）フラグメントのレベルはｆｉｇｕｒｅ６に示した。

ｆｉｇｕｒｅ　７は１匹のチンパンジーに投与した用量を比較したものである。

応答の遅れは用量レベルが上がるにつれ増加した。０　、１　ｍｇ／ｋｇレベル における応答の遅れはほぼ０．０５４７ｍｇ／ｋｇレベルにおける遅れの２倍と なる。用量増加の影響はまたこれらのデータからも明らかである。この個体にお ける境界値は約０．０４ｍｇ／ｋｇの１２ＤＩＯＦ（ａｂ）フラグメント投与で ある。

他の具体例は以下の請求の範囲に含まれる。

免疫部位（ｎＭ） ＦＩＧ、　２ 時間（分） ＦＩＧ　７ ＰＴ時間（秒）　ＰＴ時間（秒） 国際調査報告 ｍ″ｍｍｌｍｍ１Ａ＋＋ｗ１１ａ゛ｐ１７ｆｉ／１７７Ｂ！１＾「ｔ　Ｕｎｉｔ 　Ｌａ＠６ ＰＣＴ／Ｕ３９１／［Ｆ］７８１１ ＾ｔｔａｅｈｍｅｎ＄ Ｘ、　ＣｌａｉＩＩＩｍ　１−２７．　ココ−コロ、ａｎｄ　コ９−４＠、ｄｒ ａｗｎ　ｔｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆｔｒｅａｔ工ｎｇ　ａ　ｗ＋ｗｍｓｌｉ ｓｎ　ｇｐｅｅ１＊ａ　ｆｏｒ　ｓ　ｔｈｒｏ＋５ｂｏｔＬｅ　ｄ工ｇｅｅｓｅ 　ｃｏｎｄｉｔｉｏ氏B ａ　ｅｏ＋＋＋ｐｏ＊ｔｔｔｏｒｔ　ｕｓｅｆｕｌ　１ｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｖ・ ｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　：ｒｅｓＬｍｅｎｔ　ｏｆ　＠ｔｈｒａｍｂｏｔ４ｏ　ｄ ｉｇｗｓ＊ｅ　ｅｏｎｄｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａ　ｐｈａｒｍｓｃｅｕｔｌｃｓ ｌ　ｐｒｏｄｕｅｔ。

ｅｌｍｗｓｔｆｔｅｄ　Ｌｎ　Ｃ１ａｓｓ　４２４．　ｓｕｂｃｌｍｇｇ　Ｍ５ １゜ＩＩ、　Ｃ１ｍ！＋ｅｓ　２ａ−コ２．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　−ｓｏｒ＋ａ Ｃ１ｏｒｖｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｄｈｙｂｒＬｄｏ＋＊＠　ｅ・１１　工 Ｌｎｅｒ　ａｌａｓｓ１４１・ｄ　Ｌｎ　Ｃ１ａｓｓ　５コの、５ｕｂｃｉａｓ ＋＋　３ｇ７　ａｎｄＣｌａｓｓ　４コ５１　ｇｕｈｅｌａｓｍ　２４６．２７ 　。

ＩＸＺ、ＣＬｍＬｖａ−コアー３Ｌ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　−ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏ ｒ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａｈｙｂｒｉｄｏ＋ｙａ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ、ｃｌ ａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　ａゴ５．　ｇｕｈｅｌａｓｍ　１７２． ２゜ＸＶ、　Ｃ１Ｃ１５ｉ　４１−４４＋　ｄｒａｗｎ　ｔｃｌ　ａｎ　ｔｍｓ ｕｒ＋ａｇｅｎ、ｃｌｍｍｇＬｆｉｅｄ　１ｎＣ１ａｓｓ　４２４．　ｇｕｈｅ ｌａｓｍ　ｓｔａ。

Ｘｎ　ｔｈｅ　１ｎｓｔａｎｔ　ｃａｇｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　 ｇｒｏｕｐｓ　Ｔｌ　ａｎｄ　ｒＶ　ｃ−ｎ　ｂｅｕｓｅｄ　ｉｎ　ｓ　＋ｅｓ ｔｅｒｉ−上工ｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒａｅｅ−ｓ　５ｕｃｈ　ａｓ　１ ＋ｕａｕｎｏｐｕｒＬｆ１ｃａ狽撃盾■ ｏｒ　ｉ＋ｕ＋＋ｕｎｏａｓ＋＋ｎｙ、Ｔｈｅ　ｐｒ６ｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｇｒ ｏｕｐｓ　ＩＩ　ａｎｄ　ＩＶ　ｃｌｅａｒｌｙ　ｄｉｆｆ■■ ｌｎ　ｔｈ−ｔｔｈ・ｙ　ａｒｅ　−ｔｒｕｅｔｕｒａＨｙ　ａｎｄ　ｆｕｎｃ ｔｉｏｎａｌｌｙ　ｄＬ自ｔｉｎｅｔ　ａｎｄ　ｓｒ・＋ｅｓｄｅ　ｂｙ　ｄｉ ｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｔｈｕｓ、　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｇ　 ｅＬｅｍｒｌｙ　ａｒｅｉｎｄ＊ｐｅｒ＋ｄｅ内ｔ　ｍｒ＋ｄ　ｄｌｓｔｉｎｃ ｔ　ｆｒｏｍ　ｅａｅｈ　ｏｔｈｅｒ　ｓｎｄ　ａｄｄｚｔｔｏｎ龜１１ｙ、ｄ ｉｆI５ｒ Ｌｎ　ｔＭｌｒ　ｃｌ龜ｓ自１ｆｉｅａｔｉｏｒ＋　ｓａｈｅｗ。

Ｔｈ＠　１Ｉｅｔｈｏｄ＊　ｏｆ　ｇｒｏｕｐｓ　Ｚ　ａｎｄ　ＩＩＩ　ｃｌｅ ａｒｌｙ　ｄｉｆｆｅｒ　工ｒ＋　ｔｈｅｍｅｔｈｏｄ　ｐ＊ｒ＊＋＋＋ｖｔｗ ｒ＋ｗ、５ｔｅｐｓ　ａｎｄ　ｒｅｓｇｅｎｔｍ　ｕｓｅｄ、Ｔｈｅ　ｍｅｔｈ ｏｄ　Ｏイ　ｇｒｏｕ吹@１ １ｇ　ｄｉｒｗｅｔｅｄ　ｔｏ　−　ｖＩＩｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｒｅａｔｉ ｎｇ　ａ　＋＊ａｍｍ自１１ｓｎ　５ｐｅｅｌｅｓ　（ｏｒ@ａ ＬｈｒａｎｂｏｔｊＬｃ　ｄｉｍｅｓ−・、　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｇ ｒｏｕｐ　Ｉｌｌ　ｔｍ　ｃ＋１ｒｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ａ＾ｒｔ　Ｕｎｉｔ　Ｌ ＡＩＢ６ ｓｅｔｈｏｄ　１６ｔ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ａ　ｈｙｂｒｉｄｏｗ　ｅｅｌｌ 　１ｉｎｅ、　ｉ’ｈｅｓｅ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｒｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｒ＋ ｔ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｆｒＱＭ　ｅａｃｈ　０ｔｈｅｒ　ａｎｄ　ａ ｒｅ　ｅｌａ−ｗｉｆｆｉｉｅｄ　Pｆ＋ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａ工１１＃ｌｌ伊＠　ａｎｄ　ｓｕｂａｌａｇ＊＊＊　ｆ ｒｏｍ　ｅａｃｈ　ｏｔｈｅｒ。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０２ （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、Ｃ Ａ、ＦＩ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎ。

Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．治療を必要とする哺乳類に、治療効果量の組織因子：第ＶＩＩ因子および／ または組織因子：第ＶＨａ因子複合体のアンタゴニストを投与することを含む、 哺乳類の血栓症性疾患状態を血液凝固カスケードを選択的に妨害する薬剤により 緩和する方法。 ２．血栓症性疾患状態が急性播種性血管内凝固である第１項記載の方法。 ３．血栓症性疾患状態が敗血症性ショックである第１項記載の方法。 ４．血栓症性疾患状態が冠状動脈血栓症である第１項記載の方法。 ５．血栓症性疾患状態が臓器移植拒絶である第１項記載の方法。 ６．血栓症性疾患状態が深部静脈血栓症である第１項記載の方法。 ７．アンタゴニストがモノクローナル抗体製剤を含有し、このモノクローナル抗 体が組織因子：第ＶＩＩ／ＶＨａ因子複合体の凝固促進活性を複合体の形成後に 実質的に抑制する能力を有する第１項記載の方法。 ８．モノクローナル抗体が遊離の第ＶＨまたはＶＨａ因子に結合する能力をさら に有している第７項記載の方法。 ９．モノクローナル抗体がハイブリドーマ・セル・ラインＡＴＣＣ　ＨＢ　１０ ５５８により産生される抗体のイン・ビトロ血液凝固アンタゴニスト特性を有す る第７項記載の方法。 １０．　モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体１２Ｄ１０である第９項記 載の方法。 １１．組織因子：第ＶＩＩ／ＶＨａ因子複合体のアンタゴニストがモノクローナ ル抗体１２Ｄ１０のＦ（ａｂ）フラグメントである第１〜８項いずれかまたは９ 項に記載の方法。 １２．モノクローナル型抗体かモノクローナル型抗体のフラグメントである第１ 項記載の方法。 １３．モノクローナル型抗体のフラグメントがＦ、フラグメントである第１２項 記載の方法。 １４．組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子複合体のアンタゴニストがモノクロー ナル抗体製剤を含有し、このモノクローナル抗体が第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子分子 上のループ領域と抜合体を形成することができる第１項記載の方法。 １５．ループ領域が第１９５〜２０８位のアミノ酸を含有する第１４項記載の方 法。 １６．ループ領域が第１６５〜１７７、２０９〜２１８、２３４〜２４８、２４ ８〜２５８、２６３〜２７８、２８５〜２９５、３１３〜３２１、３３０〜３３ ９、３４８〜３６０および３６７〜３９０位のアミノ酸からなる群から選択され る第１４項記載の方法。 １７．組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子複合体のアンタゴニストとして作用す る抗体あるいは抗体の誘導体の有効量を含有する、血栓症性疾患状態の予防ある いは治療に有効な組成物。 １８．組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子複合体のアンタゴニストが、この組織 因子：第ＶＩＩａ因子の血液凝固促進活性を実質的に抑制する能力を有するモノ クローナル抗体を含有する第１７項記載の組成物。 １９．モノクローナル抗体が、組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子複合体の血液 凝固促進活性を複合体形成の後に実質的に抑制する能力を有する第１８項記載の 組成物。 ２０．モノクローナル抗体がさらに遊離の第ＶＩＩまたはＶＩＩａ因子と結合す る能力を有する第１９項記載の組成物。 ２１．モノクローナル抗体か、モノクローナル抗体１２Ｄ１０の血液凝固促進作 用アンタゴニスト特性を有する第２０項記載の組成物。 ２２．モノクローナル抗体がモノクローナル抗体のフラグメントである第１８項 記載の組成物。 ２３．モノクローナル抗体フラグメントがモノクローナル抗体１２Ｄ１０のＦ（ ａｂ）フラグメントである第２２項記載の組成物。 ２４．モノクローナル抗体のフラグメントがＦｖフラグメントである第２２項記 載の組成物。 ２５．組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子複合体の血液凝固促進活性を実質的に 抑制するモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体フラグメントの実質的に 精製された製剤。 ２６．モノクローナル抗体が、モノクローナル抗体１２Ｄ１０の血液凝固促進抑 制活性の特性を有する第２５項記載の製剤。 ２７．モノクローナル抗体のフラグメントがモノクローナル抗体１２Ｄ１０のＦ （ａｈ）フラグメントである第２５項記載の製剤。 ２８．モノクローナル抗体１２Ｄ１０。 ２９．モノクローナル抗体１２Ｄ１０の機能性結合フラグメント。 ３０．モノクローナル抗体１２Ｄ１０の組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子複合 体のアンクゴニスト性質を有する抗体を産生するハイブリドーマ・セル・ライン 。 ３１．遊離の第ＶＩＩａ因子の作用を実質的に抑制する能力をさらに有する抗体 を産生する第３０項記載のハイブリドーマ・セル・ライン。 ３２．ハイプリドーマ・セル・ラインＡＴＣＣ　ＨＢ　１０５５８．３３．特異 的に組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子複合体と反応するが、遊離の第ＶＩＩ因 子の組織因子への結合と、第ＶＩＩａ因子への変化に続く血液凝固促進作用の露 出を防ぐことにより止血させないモノクローナル型抗体あるいは抗体の誘導体を 哺乳類に投与することを含む、組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ複合体のイン・ビ ポにおける血液凝固促進作用を抑制する方法。 ３４．モノクローナル抗体が遊離の第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子に結合す ることによって血液凝固促進作用を抑制する第３３項記載の方法。 ３５．モノクローナル型抗体がモノクローナル抗体１２Ｄ１０である第３３項記 載の方法。 ３６．　モノクローナル型抗体のフラグメントがモノクローナル抗体１２Ｄ１０ のＦ（ａｂ）フラグメントである第３３項記載の方法。 ３７．動物種を１あるいはそれ以上の第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子のループ領域のポ リペプチドを含有する免疫原で免疫することを含む組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩ ａ因子複合体の血液凝固促進作用を、複合体の形成の後に実質的に抑制する抗体 を分泌するハイブリドーマ・セル・ラインを調製する方法。 ３８．ループ領域のポリペプチドが第ＶＩＩａ因子の第１９５〜２０８位のアミ ノ酸を含有する第３７項記載の方法。 ３９．組織因子：第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子複合体の血液凝固促進作用のアンタゴ ニストとして作用するモノクローナル抗体誘導体の効果量を製薬上許容可能な担 体中に含有させた薬品組成物。 ４０．第ＶＩＩ因子の第ＶＩＩａ因子への転化を実質的に抑制するモノクローナ ル型抗体を含有する組成物。 ４１．第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子のループ領域の分子を含有する免疫原。 ４２．免疫原の免疫原性を高める担体分子をさらに含有する第４１項記載の免疫 原。 ４３．ループ領域が第１９５〜２０８位のアミノ酸を含有している第４１項記載 の免疫原。 ４４．担体分子がウシ血清アルブミンである第４２項記載の免疫原。