JPH07507769A - Ｘ因子のグリコシル化媒介による阻害 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 Ｘ因子のグリコジル化媒介による阻害 技術分野 本発明は、Ｘ因子の活性化を阻害する薬剤であって、従って、血栓症の治療また は予防のために使用できる可能性のある薬剤に関する。より具体的には、本発明 は、Ｘ因子の正常なグリコジル化パターンに影響を与え、その活性型への変換を 減少させる薬剤に関する。Ｘ因子の活性型、即ち、Ｘａ因子はトロンビンの形成 に必須であり、該トロンビンは血液凝固の形成に必須であり、平滑筋細胞の増殖 の誘導因子でもある。

技術背景 トロンビンは数種の重要な生体反応を制御する多機能プロテアーゼである。例え ば、トロンビンは既知の血小板活性化因子の中で最も作用の強いものの１つであ る。さらに、トロンビンは、血塊形成を開始させるために、フィブリノーゲンを 開裂してフィブリンとするのに必須である。これらの２つの要素は正常な止血に 関与しているが、アテローム硬化動脈においては血栓の形成を開始させることが できる。血栓は、心筋梗塞、不規則なアンギナ（ｕｎｓｔａｂｌｅ　ａｎｇｉｎ ａ）、非出血発作（ｎｏｎｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　５ｔｒｏｋｅ）および血管 形成または血栓崩壊治療後の冠動脈の再閉塞等の血管閉塞状態の病因の主要な因 子である。トロンビンはまた、平滑筋細胞の増殖の強い誘導因子でもあり、従っ て、血管形成後の再狭窄および移植誘導によるアテローム硬化等の種々の増殖反 応に関与しているかもしれない。さらに、トロンビンは白血球に関して化学走性 を有し、従って、炎症反応に関与するかもしれない（Ｈｏｏｖｅｒ、Ｒ，Ｊ、ら またはトロンビン自体の阻害が、血栓症の予防および治療、再狭窄の制限並びに 炎症の制御に有効である可能性が示唆される。

トロンビンは、前駆体であるプロトロンビンの２７１−２７２位のＡｒｇ−Ｔｈ ｒ結合、および３２０−３２１位のＡｒｇ−１ｉｅ結合がタンパク質分解開裂さ れた結果形成される。この活性は、血小板、単球および上皮細胞の細胞膜表面上 に集合したプロトロンビナーゼ複合体によって触媒される。複合体は、Ｘａ因子 （セリンプロテアーゼ）、Ｖａ因子（補因子）、カルシウムイオンおよび酸性リ ン脂質表面を含む。Ｘａ因子はその前駆体Ｘ因子の活性型である。Ｘ因子は肝臓 から５８ｋｄの前駆体として分泌され、外因性と内因性の双方の血液凝固経路に おいて活性型Ｘａ因子に変換される。Ｘ因子およびＶａ因子の前駆体、■因子の 循環レベルは、１０−’Ｍの単位であることが知られている。対応する活性型■ ａ因子およびＸａ因子のレベルは測定されたことがない。

ヒトのＸ因子およびＸａ因子の完全アミノ酸配列が知られており、Ｄａｖｉｅ。

Ｅ、　Ｗ、によって記載されている（Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏ ｍｂｏｓ工亙、第２版、Ｒ，Ｗ、Ｃｏｌ　ｅｍａｎら　編集（１９８７）２５０ 頁）。Ｘ因子は、カルシウムイオン結合、ガンマ　カルボキングルタミル（Ｇｌ ａ＞含有、ビタミンに依存、血液凝固糖タンパク質ファミリーのメンバーである 。このファミリーには、ＶＩＩ因子およびＩＸ因子、プロトロンビン、プロティ ンＣおＸ因子の成熟タンパク質の前には４０残基のブレープロ　リーダー配列が あり、これは細胞内プロセノンングおよび分泌の間に取り除かれてしまう。Ｘａ 因子の成軌Ｘ因子前駆体は、続いて軽鎖のＣ末端と活性ペプチド／重鎖Ｎ末端の 間の３アミノ酸残基（ＲＫＲ）の除去により２本鎖の型に開裂される。最後に、 二本鎖のＸ因子は、５２アミノ酸の「活性化ペプチド」配列の除去によって、１ ３９残基の軽鎖と２５４残基の重鎮を生成し、Ｘａ因子に変換される。これらは 、軽鎖の１２８位と重鎮の１０８位の間の１つのジスルフィド結合を通してつな がっている。！ｌ鎖はＧｌａ領域および上皮成長因子様領域を含んでいる。プロ テアーゼ活性は重鎖中に存在し、・１２位にヒスチジン、８８位にアスパラギン および１８５位にセリンを含む。

ウソのＸ因子についても研究が行われ、そのアミノ酸配列が報告された（Ｔｉｔ ａｎｉ、に、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９７５ ）７２　：　３０８２−３０８６）。ウシのＸ因子の活性化ペプチドは長さ５１ アミノ酸残基であり、はぼ等量のポリペプチドと炭水化物を含む（Ｄｉｓｃｉｐ ｉｏ。

Ｒ，Ｇ、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７７）　１６：５２５３）。

二本鎖Ｘ因子をｉｎ　ｖｉｖｏで活性化するには既知の２つの経路がある。活性 化はプロテアーゼがプロトロンビナーゼ複合体に取り込まれる前に起こらなけれ ばならない（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、Ｍ、ら、　Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄＴ ｈｒｏｍｂｏｓ　ｉｓ、Ｃｏｌｅｍａｎ、Ｒ，Ｗ、　ら　編集　（１９８７）　 Ｊ。

Ｂ、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　ＰＡ、　ｐ、１１２ ）。内因性経路では、細胞表面に集合したＩＸａ因子、Ｖｌｌｌａｌｌｌ上びカ ルシウムイオンを含む「テナーゼ（ｔｅｎａｓｅ）Ｊ複合体によってＸ因子が開 裂され、５２アミノ酸活性化ペプチドを遊離する。外因性経路では、膜上の組織 因子に結合しているＶＩ　Ｉａ因子によって開裂が触媒される。ラッセルクサリ ヘビ蛇毒中に含まれているようなプロテアーゼを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏの開裂 によって、Ｘ因子をＸａ因子に変換してもよい。このプロテアーゼはＤｉｓｃｉ ｐｉｏ。

Ｒ，Ｇ、ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７７）６：５２５３）によって記 載されている。

外因性経路と内因性経路において異なって活性化される、Ｘ因子の変異体も存在 する（Ｆａ　ｉ　ｒ、　Ｄ、Ｓ、ら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ（１９７９） 　６旦　８８４−８９４）、例えば、Ｘ因子”　Ｖｏｒａｒ　ｌｂｅｒｇ”は、 外因性経路に関しては正常なＸ因子の１５％の活性を有し、内因性経路に関して は正常なＸ因子の７５％の活性を有する（Ｗａ　ｔ　ｚ　ｋ　ｅ、　Ｈ，Ｈ，ら 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ１ぢｎ、（１９９０）　旦旦互　１１９８２−１１９８９） 。

トロンビンをその前駆体から形成するのにＸａ因子が必須の機能を果たすことか ら、Ｘ因子／Ｘａ因子を適当に操作することによって血小板凝固および血塊形成 におけるトロンビンの活性を抑制できるであろうことは明らかである。

プロトロンビンのトロンビンへの変換に影響を与えるＸａ因子の活性は、プロト ロンビナーゼ複合体へのその取り込みに依存する。従って、この操作の１つのア プローチは、Ｘａ因子がトロンビナーゼ複合体へ参与するのを防ぐことであった 。プロトロンビナーゼ複合体（プロトロンビンからトロンビンへの変換に対する 作用が、可溶性のＸａ因子の２７８．０００倍も早い）の形成について研究が行 われてきた（Ｎｅ　ｓ　ｈ　ｅ　ｉｍ、Ｈ，Ｅ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 （１９７９）　λ５４　：１０９５２）。これらの研究は、活性部位特異的阻害 因子、ダンシル　グルタミル　グリシル　アルギニル（ＤＥＧＲ）クロロメチル ケトンを用いてきた。これは、Ｘａ因子に蛍光受容体基を共有結合する。この阻 害因子で処理したＸａ因子はプロテアーゼ活性を失っているが、Ｘａ因子と同一 の化学量論でブロトロンビナーゼ複合体に取り込まれ、２．７Ｘ１０−’Ｍの解 離定数を有する（Ｎｅｓｈｅｉｍ、Ｍ、Ｅ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１ ９８１）λ旦旦：６５３７−６５４０：　Ｓｋｏｇｅｎ、Ｗ、Ｆら、、Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃ匹　１２９５３−１２９６１）。

Ｘａ因子の阻害の別の試みには、現在では組織因子経路阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ　 ｆａｃｔｏｒ　ｐａｔｈｗａｙ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　（ＴＦＰＩ）と呼ばれて いるリポプロティン−関連凝固阻害剤（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉ ａｔｅｄ　ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　（ＬＡＣＩ）Ｘジラ ルド（Ｇｉｒａｒｄ）、　s、Ｊ。

ら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８９）　３３８：５１８；　ジラルド（Ｇｉｒａｒｄ ）、Ｔ、Ｊ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）　２４８１４２１））、ヒル由 来のアンチスタチン（ダンライディ−（Ｄｕｎｖｉｄｄｉｅ）、　Ｃ，Ｔ、ら、 ＪＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９８９）：　２６４１６６９４）、およびダニ 由来のＴＡＰ（ワクスマン（Ｔａｘｍａｎ。

しら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９０）　２＝＋８：　５９３）の使用が含まれ る。代わりに、ビタミンに一依存性Ｇｌａ変換酵素を阻害する薬剤、例えばクマ リンも用いられている。これらの試みは、特異性の欠如、必要量の多さ、有害な 副作用、および効果の大幅な遅延などの理由から、いずれも成功していない。

ＰＣＴ国際公開ｔｌｓ　９１１０６３３７号が開示する別法では、Ｘａ因子の活 性部位を修飾して、プロトロンビナーゼ複合体の形成能を維持しつつ、酵素活性 を阻害している。

本発明の方法は、Ｘ因子からその活性型であるＸａ因子への変換を阻害すること を目指している。具体的には、この阻害様式は、Ｘ因子に付随するグリコジル化 残基の操作による。

ヒトではなくウシのＸ因子は、そのグリコジル化パターンが詳細に研究されてい る。ウシＸ因子の重鎮は、３６番目の残基にＮ−結合グリコシル化を有し、３０ ０００番目基に〇−結合グリコシル化を有する（ミズオチ（Ｍｉｚｕｏｃｈｉ） 、　Ｔ、ら、Ｊ、阻ｏ１．　ＣｈｅＩｌｌ、　（１９８０）　２５５：　３５２ ６−３５３１）。ヒトのＸ因子のグリコジル化パターンは知られていないが、こ の活性化ペプチドは３９番目および４９番目の位置にＮ−結合グリコノル化の可 能な部位を二つ有している（ディビー（Ｄａｖｉｅ）、　Ｅ、Ｗ、、　ｒヘメオ スタシスと血栓症（Ｈｅｍｅｏｓｔａｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ） Ｊ　、第二版、Ｒ，ｗ、コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）編集、（１９８７）　２ ５０頁）。加えて、関連するウシＩＸ因子の第−上皮成長因子様ドメインには、 セリン−結合糖鎖の存在が報告されているので（ハセ（Ｂａｓｅ）、　Ｓ。

ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　（１９９０）　２６５：　１８５８−１ ８６１）；ヒトＸ因子軽鎖のＥＧＦ一様ドメインも〇−結合糖鎖を含んでいるか もしれない。

従って、本発明はＸ因子からＸａ因子への変換を阻害して、活性なプロトロンビ ナーゼ複合体の形成を阻止する別の方法を提供する。

発明の開示 本発明は、血栓形成並びにトロンビンにより誘発される再狭窄および炎症のよう な血管系の他の病理学的症状の進行の予防および治療に有用な、効果的治療剤を 提供する。このことは、西洋社会において、血栓の発生が死亡の主な原因であり 、また血管形成術およびその他の血管手術の適用の増加につれて再狭搾の問題が 高まっているために、重要である。本発明の治療物質はヒトＸａ因子の生成を阻 害しまたは減少させることができる。

これらの治療剤は、血栓症の急激な発症を阻止するために特に有用である。この 用途は、安静時狭心症の帝者の冠動脈内の血栓形成の防止、血栓溶解治療後の再 血栓症の防止、複雑な血管形成術中の血栓症の防止を含む。これらの治療剤は、 血管形成術またはその他の血管手術に引き続いて平滑筋細胞の増殖を防止するた めにも有用であろう。本発明の治療剤は、ヘパリンを利用する現在の標準的治療 （ハンソン（Ｈａｎｓｏｎ）、　ＲｌＳ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　（１９８８）　８５：　３１８４）に比べて、多大な利点を提 供する。一つの態様において、本発明の化合物はレクチンであり、これはヒトＸ 因子に存在する炭水化物部分に特異的に結合して、Ｘａ因子への変換を阻害する 。別の態様において、本発明の化合物はそれ自身グリコジル化構造を変化させる 能力ををする。

本発明は一つの観点において、ヒトＸ因子と、ガラクトースもしくはＮ−アセチ ルガラクトサミンにα（２−６）結合した末端シアル酸に結合する能力を有する 特異的な炭水化物結合試薬とを接触させることよりなる、ヒトＸ因子の活性化の 阻止方法に関する。以下、これらの標的グリコジル基をそれぞれＳＡ（２−６） ａＧａｌおよびＳＡ（２−６）　ａＧａｌＮＡｃと略記する。用いる試薬はｒＳ Ａ／Ｇａｌ／Ｇａ１ＮＡｃＪ結合試薬である。この炭水化物結合試薬は、時間、 温度およびｐＨが適切な条件下でヒトＸ因子に接触すると、ヒトＸ因子が外因性 もしくは内因性経路でヒトＸａ因子へ変換されるのを阻止するために有効である 。したがって、別の観点において、本発明は該炭水化物結合試薬とＸ因子とから なる複合体に関する。

本発明は別の観点において、Ｘ因子と一緒に誘導体を形成している炭水化物部分 の開裂またはＸ因子のノアリル化の阻止により、Ｘ因子を活性化に対して不感受 性にする因子に関する。

本発明の別の観点には、治療剤として有用な炭水化物結合試薬または炭水化物開 裂試薬の医薬組成物や、それらの組成物を用いて、トロンビンによって開始され る血栓症またはその他の病理学症状を防止または治療する方法も含まれる。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよびＩＢは、それぞれ、ウシＸ因子およびヒトＸ因子をグリコンダーゼ で処理したとき、これらの因子の凝固活性が受ける影響を調べた結果を示すも本 発明は、ヒトＸ因子の特定の炭水化物残基のブロックまたは炭水化物部分の開裂 が、プロトロンビナーゼ複合体の形成に必須であるヒトＸ因子の活性型への変換 を阻害するという発見に基づくものである。より詳しくは、グリコジル化部分の 、シアル酸残基がガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミン残基にα（２ −６）結合している非還元末端において、シアル酸残基に結合しつる試薬（ＳＡ ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　１ＮＡｃ結合試薬）がこの阻害をすることができる。これら の試薬には、種々のレクチン類（例えば、セイヨウニワトコ（Ｓ　ａｍｂ　ｕ　 ｃ　ｕｓ　ｎｉｇｒａ）アグルチニン（ＳＮＡ、ニワトコ果木皮レクチン）およ びある種の哺乳類レクチン、ならびに他の小分子（例えば、この標的に結合する ことが知られているかまたは示すことのできるペプチド類）が含まれる。この点 においては、ＩＸａ／■ａ因子または組織■ａ因子由来のペプチドが特に有用で ある。

他の重要なＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ１ＮＡｃ結合試薬は、この標的と特異的に免疫 反応性である抗体である。このような抗体は、これらの三糖類部分のいずれかを 、キーホール・アオガイ・ヘモシアニン、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブ ミン、ジフテリアトキソイド、ロタウィルスＶＰ６キヤリア蛋白質等の免疫原性 付与キャリアと結合させて免疫原性とすることによって、都合よく製造すること ができる。炭水化物をこのタイプの免疫原性キャリアに結合させるための適当な 手法、例えば、炭水化物のカルボニル部分をキャリア上の利用可能なアミノ基に 結合した後に還元する手法は、当該技術分野でよく知られている。

次に、それ自体でまたはより大きな炭水化物として免疫原性付与キャリアと結合 した三糖類部分を、標準的な免疫処置プロトコールによって適当な被検体に投与 して抗体産生を誘導する。このプロトコールの有効性は、投与された動物の血清 について、免疫原、または好ましくはその適切な三糖類部分を、抗原、すなわち 特異的結合の相手として用いる標準的なイムノアッセイを行うことにより監視す ることができる。このようなイムノアッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ、 酵素結合イムノアッセイ、蛍光タイプのイムノアッセイ等は、当該技術分野にお いてよく知られている。十分なタイターが得られたとき、イムノグロブリン精製 後の抗血清を直接用いてもよ（、あるいは、免疫した動物の膵臓細胞または末梢 血白血球を用いて、三糖類部分に免疫的に特異的なこれらの抗体のモノクローナ ル形態の製造をすることができる。一般には、抗体産生細胞をハイブリドーマ等 の形態で不死化する手法もまた、現在では標準的な方法である。

これらのＳＡ／Ｇａ　１／Ｇａ　ｌＮＡｃ結合試薬に加えて、一般にＸ因子の活 性ペプチドの炭水化物部分に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）もＸａ 因子の形成を阻害するであろう。

他のアプローチにおいては、グリコジル化されたＸ因子のシアル酸末端残基の形 成を妨害することもまた、活性化に抵抗するＸ因子を得る有効な方法である。

１つのアプローチにおいては、α（２−６）シアリルトランスフェラーゼの阻害 剤を生物に投与することにより、この目的を達成することができる。すなわち、 その生物は、その活性化に必要な必須の置換基を欠失したＸ因子を産生ずるだろ う。シアル酸残基のための受容体として内部糖鎖が提供されなければならないた め、このアプローチの変形として、一般にＸ因子のグリコジル化を触媒するトラ ンスフェラーゼの阻害剤もまた有効であろう。阻害剤は、グリコジル化Ｘ因子の 全手段（ｒｅｐｅ　ｒ　ｔｏ　ｉ　ｒｅ）を変更するのに有効であるように生物 に供給される。すなわち、過剰のＸａ因子により特徴付けられるかまたはＸａ因 子のレベルの減少により恩恵をうける状態に関しては、これらの阻害剤は妨害剤 として振る舞うと同時に予防薬としても振る舞う。このような阻害剤としては、 アンフオマイシン、カスタノスペルミン、２．３−デヒドロ−２−デオキシ−Ｎ −アセチル−ノイラミン酸、１−デオキシマンノジリマイシン塩酸塩、１−デオ キシノジルマイシン、Ｎ−メチル−１−デオキシノジルマイシン、スウェインソ ニンおよびツニカマイシン等が挙げられる。

また別のアプローチにおいては、Ｘ因子からＸａ因子への変換に明らかに必要な ＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　Ｉ　ＮＡｃ配列の可溶性類似体を、必須二糖類残基の競 合剤として用いることができる。このような競合剤は、それがなければＸ因子か らＸａ因子への変換が達成されるような条件の下で存在するように導入される。

すなわち、ｉｎ　ｖｉｊｒｏにおいて、可溶性類似体は変換の内因性または外因 性経路の成分とともに導入される。生きた生物全体については、可溶性類似体が 投与され、ｉｎ　５ｉｔｕでこの変換が妨害される。可溶性類似体は、Ｘ因子の グリコジル化側鎖上で生ずる場合にＳＡ　（２−６）ａＧａｌまたはＳＡ　（２ −６）αＧａ１ＮＡｃ残基と類似の空間的電荷的外形を有する低分子量の分子で ある。このような可溶性類似体としては、ＳＡ　（２−６）ａＧａｌおよびＳＡ 　（２−６）αＧａ１ＮＡｃそれ自体、ならびに、三糖類および三糖類の類似体 またはこれらの特徴を示す他の複合体構造がある。

さらに別のアプローチにおいては、Ｘ因子からＸａ因子への変換は、Ｘ因子から グリコジル化部分を除去し、このことにより活性化を受けないようにする試薬に よって阻害することができる。適当なこのような試薬としては、ノイラミニダー ゼおよびシアリル酸残基を除去するある種の特定のグリコシダーゼがある。

Ｘ因子からＸａ因子への変換を阻害する好ましい方法は、Ｘ因子のグリコジル化 側鎖においてＳＡ　（２−６）ａＧａｌおよびＳＡ　（２−６）　αＧａｌＮＡ ｃ残基とともに複合体を形成しつる結合剤を利用する。一般に、本発明の方法に おいて使用するための、ＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　ｌＮＡｃ結合試薬として有用な 試薬は、試験されるべき候補化合物の特異的結合相手として三糖類部分（または これを含む分子）を用いる単純な特異的結合アッセイを用いて同定することがで きる。このようなアッセイは、イムノアッセイと同様の方法により実施される。

例えば、典型的なプロトコールにおいては、標的とされるべき三糖類部分を固体 支持体に結合させ、結合した支持体を候補試薬で処理する。次に、処理された支 持体を洗浄して、未結合候補化合物を除去する。支持体に結合したまま残った候 補化合物は、化合物に特異的に結合し、かつそれ自体が検出可能である標識（例 えば、放射性標識または酵素標識）を用いて標識された追加部分等の適当な手段 により検出する。すなわち、ＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　１ＮＡｃ結合試薬の候補化 合物は、このような単純かつ簡単なプロトコールによって有効性を迅速にスクリ ーニングすることができる。

本発明の方法においては、上述の方法により同定されたＳＡα（２−６）Ｇａｌ および／またはＳＡα（２−６）Ｇａ　ｌ　ＮＡｃ結合試薬を、その変換が阻害 されるべきＸ因子と接触させる。このような接触により、外因性または内因性経 路のいずれかにより、活性型への変換に抵抗性を有する複合体が生ずる。該接触 は、過剰の、好ましくは２倍から１０倍モル過剰の該試薬を用い、複合体の形成 に適当な温度、ｐＨ１および塩条件において実施する。一般に、このような接触 は、４℃から室温において、４時間から一夜、生理食塩水および生理的ｐＨの存 在下において行う。

レクチンである本発明のＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　１ＮＡｃ結合化合物は、天然源 の単離によって調製され、またある状況下においては、組み換え技術によって調 製される。あるいはまた、ＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　ｌＮＡｃ結合ドメインを含む 合成ペプチドを全長レクチンの替わりに使用してもよい。これらのペプチドは、 既知である標準固相又は溶液相ペプチド合成技術を使用して合成され、当業界に おいては実際上商業的に入手可能である。

本発明のＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　１ＮＡｃ結合試薬、並びにＸ因子の活性化を阻 害することができる上記した選択的方法は、血栓症の併発を伴う処置並びに病因 としてトロンビン生成が含まれる状況において有用である。これらの状況には、 動脈血栓症、例えば、冠状及び抹消血管形成及びアセレフｌ−ミー　（ａｔｈｅ ｒｅｃｔｏｍｙ）の間の、並びに、血管バイパス処置（抹消及び冠状の）の間及 びその後の不安定な（即ち、安静の）アンギナ性かつ急性の血管閉塞、心筋梗塞 の血栓崩壊治療後の再閉塞、血栓性発作（進化における発作）、及び脈管炎によ る血栓症（カワサキ病）を含むものが含まれる。静脈血栓症、例えば、下肢の深 静脈血栓症、肺動脈塞栓症、腎静脈、肝静脈、工大静脈血栓症、及び海綿静脈側 血栓症を含む状況もまた含まれる。他の標的となる状況は、凝固系の広汎な活性 化を含むもの、例えば、散在した脈管内凝固を伴うセブノス、他の硬化における 散在した脈管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、及び未知の病因の稀な状況（ 抗凝固性狼狽）を含むものである。

本発明のＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　ｌ　ＮＡｃ結合試薬及びＸ因子の活性化の阻害 のための選択的方法はまた、血液製品又は試料の調製において、並びに臓器の輸 送と移植そして１皮移植者の関連治療において、採取臓器における心肺バイパス のための抗凝固剤及び抗炎症剤としても有用である。これらの試薬及び方法は、 特に、内在する脈管自装置（例えば、カテーテル、移植片、パッチ）において低 速放出形において有用である。

血栓症はまた、平滑筋の細胞増殖を直接的又は間接的に引き起こすことによって 、血管形成、アセレクトミー又は動脈血管内膜切除のような血管介入後における 再狭窄においても役割を果たし、そして本発明の試薬はまたこの状況を治療する ことにおいても有用である。

成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）は、プロトロンビン性の内皮が炎症性及び増殖 性成分とともに存在する可能性が高い「内毒素」疾患であると考えられる；本発 明の試薬及び方法はまた、ＡＲＤＳの治療にも有用である。

レクチン又はそれらのペプチド結合ドメインであるか、あるいは抗体又はそれら の断片、又はペプチドを基礎とする他の物質である、本発明の治療試薬は、タン パク質又はペプチドの投与のための慣用的な賦形剤を使用して、典型的には注入 によって、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　ＰｈａｒＩｌｌａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉ獅■ Ｃｏｍｐａｎｙ、最新編、Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡに記載されているようにして、 投与のために製剤化される。抗血栓症効果のために、レクチンあるいは他のペプ チド又はタンパク質を、好ましくは注入によって、そして好ましくは静脈内注入 によって、全身的に投与する。投与量の水準は、被験者の状態及び選択した特定 の態様を含む多数の要因に依存する。しかしながら、適切な投与量の範囲は連続 注入投与１当たり、患者当たり１から５０ｍｇの水準である。注入のために、タ ンパク質を液体培地、例えば、バンク（Ｈａｎｋ）の溶液、リンガ−（Ｒｉｎｇ ｅｒ）の溶液、デキストロース溶液、及び各種の緩衝液中に溶解又は懸濁する。

安定剤のような付加的な賦形剤もまた使用できる。

注入に加えて、本発明のレクチン又は池の治療用試薬は、坐剤、経口投与、鼻腔 内スプレーを含む粘膜通過投与を介して、そして低速放出製剤によって、全身的 に投与することができる。付加的な製剤技術としては、リポソームのような封入 製剤が含まれる。

治療薬としての有用性に加えて、本発明の試薬は、ポリクローナル抗血清を作製 したり、あるいは免疫パートナ−と融合させることができる細胞を製造してこれ らの試薬に特異的なモノクローナル抗体の産生源を得るために使用することがで きる。これらの抗体は、本発明の試薬を使用する治療を監視するための診断手段 として有用である。

Ｘ因子のＸａ因子への変換を阻害することに関する本発明のＳＡ／Ｇａｌ／Ｇａ １ＮＡｃ結合試薬あるいは他の候補物質の能力は、Ｘａ因子の酵素活性特性を生 成することに関する外因性又は内因性経路の推定上の活性化条件にかけられたＸ 因子の能力に対する候補阻害剤の効果を測定することによって研究することがで きる。従って、生成したＸａ因子の存在は、クロモザイムＸ（Ｎ−メトキシカル ボニル−Ｄ−ノルロインルーグリンルーアルギニンー４−ニトルアニリドアセテ ート、ベーリンガーマンハイム）加水分解の加水分解速度論によって測定する内 因性経路によって推定上のＸａ因子酵素を生成するために、Ｘ因子を０．２ｎＭ のＩＸａ因子、５．　８ｎＭのＶＩＩＩ　ａ因子（Ｃｕｔｔｅｒ　ｈｅｍｏｐｈ ｉｌｉａ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅから）　、ｍＭの範囲の過剰のリン脂質、及 び５から１０ｍＭのカルシウムイオンとともに活性化する。活性化は、Ｘ因子を ３７°Ｃで約１０分間生理的食塩水中においてインキュベートし、上記したクロ モザイムＸの加水分解によって形成したＸａ因子を検出することによって行う。

ＶＩＩＩ因子のＶＩＩＩａへの活性化は、ヒルーユバンクス（ｌｉｉｌｌ−Ｅｕ ｂａｎｋｓ）、Ｄ、　Ｃ，、Ｊ　Ｒｉａｌ　Ｃｈｅｖａ（１９９０）　１７８５ ４−１７８５８に記載されているように行う。

ＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　１ＮＡｃ結合試藁の効果を測定するために、Ｘ因子及び 候補結合試薬を最初に、カルシウム、マグネシウム及びマンガンのイオンを各々 約１ｍＭずつ含￥１する緩衝食塩水中において、４から２４時間、低温でブレイ ンキュベートする。同様に、Ｘ因子のグリコノル化を除去する候補阻害酵素を、 内在経路の成分の添加前に、この因子とともにブレインキュベートする。ＳＡ／ Ｇａｌ／Ｇａ１ＮＡｃ残基の競合的可溶性アナログの阻害能力を試験するために 、可溶性アナログを経路の成分とともに添加する。しかしながら、これらの阻害 剤の効用は生きている１−物体においてはＸ因子の形成に依存しているために、 このアッセイ法はグリコジル化の阻害剤であるこれらの試薬のためには適切では ない。

外因性経路に対する効果のために、Ｘ因子からＸａ因子への変換を、０．５から １ｎＭのＶＩＩ因子、組織因子（トロンボプラスチンＣ）、過剰のリン脂質及び ５から１０ｍＭのカルシウムイオンを使用して行う（内因性経路活性化に関して 記載した通り）。

上記の方法は、ＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　ｌＮＡｃ結合試薬であるか、さもなけれ ばＸａ因子の形成を阻害する候補化合物が、Ｘ因子の活性化の阻害を示すことを 確認する方法の実例である。これらのアッセイ法は、グリコシダーゼ、又はＳＡ ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　ｌＮＡｃ結合試薬と同様にグリコジル化単位を除去すること ができる他の試薬について、Ｘ因子の活性化を阻害する効率を測定するために使 用される。上記したアッセイセットは、上記したように使用され、それには候補 グリコンダーゼ又は他のグリコリル化除去酵素、又はＳＡ／Ｇａ　１／Ｇａ　ｌ ＮＡｃ結合試薬を含み、そしてＳＡ／Ｇａ　ｌ／Ｇａ　ｌＮＡｃ配列の可溶性類 似体を含むブレインキュベーションが含まれる。

以下の実施例は本発明を実例によって説明することを意図するものであり、本発 明を限定することを意図するものではない。

実施例１ 種々の結合特異性を有するレクチンの、ヒト及びウシＸ因子と複合する能力予備 的な試験において、種々の結合特異性を有するレクチンの、ヒト及びウシＸ因子 及びＸａ因子と複合する能力を、グリカン鑑別キット（ファーストチョイス、ベ ーリンガーマンハイム）を使用して試験した。製造者の指示に従って実施した手 順において、Ｘ因子またはＸａ因子を最初にニトロセルロースまたはナイロン膜 上に固定し、そしてキットからのジゴキンゲニンでラベルしたレクチンの特異的 結合をアルカリンフオスフェートに結合した抗ンゴキシゲニン抗体を使用して検 出した。表１はキットの種々のレクチンを使用して得た結果を要約する。

ウシ　ヒト Ｇａ１ａｎｔｈｕｓ　ｎ１ｖａｌｉｓ　高マンノース鎖　−−一−凝集素（ＧＮ ＾） 落花生凝集素（ＰＮ＾）　Ｇａ１（β１−３）ＧａｌＮＡｃ、−−一−（Ｉｌｏ 　ＳＡ） Ｄａｔｕｒａ　ｓｔｒａＩｌｉｏｎｉｕｍ　Ｇａ１（β１−４）ＧａｌＮＡｃ； 　−−＋　−凝集素（ＤＳＡ）　、　ＧｌｃＮＡｃ Ｓａｍｂｕｃｕｓ　ｎｉｇｒａ　ＳＡ（α２−６）Ｇａｌ　−−＋　−凝集素（ ＳＮＡ）　ＳＡ（ａ　２−６）Ｇａｌ２−６）ＧａｌＮＡｃ　ａｍｕｒｅｎｓｉ ｓ　ＳＡ（α２−３）Ｇａｌ　＋　−十　−凝集素（ＭＡＡ） 従って、ＤＳＡ、ＳＮＡ及びＭＡＡはヒトＸ因子に結合し、そしてウシＸ因子は ＭＡＡによってのみ結合される。活性化された形態はいずれもこれらのレクチン に結合しなかった。

ヒトまたはウシＸ因子（１μＭ）及び候補化合物レクチン（５μＭ）をそれぞれ １ｍＭのＣａ”２、Ｍｇ＋２及びＭｎ”イオンを含む緩衝生理食塩液中で４℃に おいて一晩インキユベートした。インキュベートしたｉｌ物をＩＸａ、ＶＩ　Ｉ 　Ｉａ因子、リン脂質及びカルシウムイオンで上述したように活性化した。遊離 したＸａ因子をクロモザイムＸ基貫を使用して上述のように測定した。いずれの レクチンもウシＸ因子の活性化を阻害せず、ＳＮＡのみがヒトＸ因子の活性化を 阻害した。阻害の程度は４１％であった。

ウシまたはヒト因子Ｘを実施例１の５つのレクチンと実施例２において説明した 同じ方法でインキュベートし、そして次にＶＩＩａ因子、組織因子、リン脂質及 びカルシウムイオンで上述したように活性化した。Ｘａ因子の生成は上記のよう に決定した。いずれのレクチンもウシＸ因子の活性化を阻害せず、ＳＮＡのみが 再びヒトＸ因子の活性化を阻害した（６７％阻害）。

ヒトＸ因子（１μＭ）を０〜２０μＭの範囲の濃度のＳＮＡとともに４℃におい て一晩インキユベートした。アリコートを内因性及び外因性経路の活性化剤を使 用して上の実施例２及び３に記述したように測定した。ウシＸ因子を対照として 使用し、モしてＳＮＡの最も高い濃度においてのみ軽度の禁止を示した。

ＩＸａ／Ｖｌｌｌａを使用した内因性経路の活性化において、１μＭ　ＳＮＡ以 下では阻害は事実上観察されず、１．５μＭの濃度において阻害は４０％であり 、２０μＭにおいて約４７％に増加した。

外因性の活性化経路において、０．５μＭ　ＳＮＡでは阻害は事実上得られなか ったが、１μＭのＳＮＡは約２７％の阻害を示し、２０μＭＳＮＡでは８０％の 阻害へ増加した。

種々の特異性をもつグリコノダーゼを、製造者の使用説明書に従ってこれらのグ リコンダーゼでＸ因子を処理することにより、ヒトおよびウシのＸ因子を処理す るのに使用した。はとんどは、消化が３７°Ｃ−夜で行われたが、ノイラミニダ ーゼについてはそれより短い期間で完全消化した。反応混合物をＳＤＳ／ＰＡＧ Ｅｌ：ｌ＝ｊし、次いで、クーマン−ブルーで染色し、そして、処理したＸ因子 タンパク質の移動度のシフトを未処理のＸ因子と比較して決定した。ウシＸ因子 またはヒトＸ因子のいずれも、グリコシダーゼのいずれについても軽鎖について 移動度のシフトを示さなかった。しかし、試験したグリコシダーゼのあるものは 、下記の表２に記載するように重鎮の移動度の変化をもたらした。

活性における脱グリコジル化の影響を数種の方法で試験した。第一の方法は、脱 グリコジル化物質を標準的な凝析分析法−一活性化した部分トロンボプラスチン 時間分析（ＡＰＴＴ）およびプロトロンビン時間分析（ＰＴ）−−で試験した。

分析は、標準的な手順で行ったが、Ｘ因子−欠失ヒト血漿を用い、自動凝析分析 器を使用した。これらの分析の結果も表２に示す。

さらに、グリコシダーゼ処理タンパク質をＩＸａ因子／ＶＩＩＩａ因子複合体ま たはＶＴ　Ｉａ因子／組織因子複合体を使用して活性化し、活性化したＸａ因子 をクロモザイムＸを使用して検出した。これらの結果を、ウシＸ因子およびヒト Ｘ因子について各々図ＩＡおよび図ＩＢに示す。

表２ ヒトＸ因子　ウシＸ因子 Ａｎ、　Ｃ，ＡＰＴＴ　ＰＴ　ＡＨ，Ｃ，ＡＰＴＴ　ＰＴ（ｋｄ）　（ｋｄ） 対照　−１００１００−−−１００１０００−グリコノダーゼ　６．２　６１　 １０８　３．３　１１６　１０６エンドグリコンダーゼ　ＨＯ４９６００８８１ ０６ノイラミニダーゼ　４．５　１２　８　４．５　４　２Ｎ−グルコノダーゼ 　Ｆ　７　１４８　３７　７　９７　１０２表２は、Ｈ鎖の移動度のソフトに加 え、対照の活性を基準とした百分率としてＡＰＴＴおよびＰＴ凝析試験の結果を 示す。ノイラミニダーゼのみが凝析活性の減少に劇的な効果があった。しかし、 エンドグリコシダーゼ　ＨはヒトＸ因子に関して部分的に効果があった。

図ＩＡおよびＩＢは、ウシＸ因子およびヒトＸ因子について、クロモザイムＸに より分析した外因性または内因性経路による各々の活性における結果を示す。

ノイラミニダーゼのみがいずれかの経路による活性を実質的に減少する効果力（ あり、表２の凝析活性の結果と一致する。

ランＸ ヒ　ト　Ｘ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、〜ＩＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，Ｓ Ｎ、ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ。

ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、Ｆｌ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　Ｎ ｉＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、ＲＯ，ＲＵ、Ｓ Ｄ、ＳＥ、ＵＳ、ＶＮ

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトＸ因子と、ガラクトースまたはガラクトサミン残基とα２−６結合した シアル酸残基と特異的に結合できる試薬（ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬 ）とを、Ｘ因子と複合体形成するのに十分な量と時間で接触させることからなる 、ヒトＸ因子のヒトＸａ因子への変換を阻害する方法。
2. ２．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬がレクチンである請求の範囲１項に記 載の方法。
3. ３．レクチンがセイヨウニワトコアグルチニン（ＳＮＡ）である請求の範囲２項 に記載の方法。
4. ４．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬が抗体である請求の範囲１項に記載の 方法。
5. ５．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬が哺乳動物レクチンである請求の範囲 １項に記載の方法。
6. ６．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬がＩＸａ／ＶＩＩＩａ因子または組織 因子／ＶＩＩａ因子から由来するペプチドである請求の範囲１項に記載の方法。
7. ７．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬とヒトＸ因子とからなる複合体。
8. ８．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬がレクチンである請求の範囲７項に記 載の複合体。
9. ９．レクチンがセイヨウニワトコアグルチニン（ＳＮＡ）である請求の範囲８項 に記載の複合体。
10. １０．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬が抗体である請求の範囲７項に記載 の複合体。
11. １１．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬が哺乳動物レクチンである請求の範 囲７項に記載の複合体。
12. １２．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬がＩＸａ／ＶＩＩＩａ因子または組 織因子／ＶｌＩａ因子から由来するペプチドである請求の範囲７項に記載の複合 体。
13. １３．活性成分であるＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬を薬剤的に受容し得 る賦形剤と混合してなる、Ｘ因子のＸａ因子への変換の阻害に有用な薬剤組成物 。
14. １４．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬がレクチンである請求の範囲１３項 に記載の組成物。
15. １５．レクチンがセイヨウニワトコアグルチニン（ＳＮＡ）である請求の範囲１ ４項に記載の組成物。
16. １６．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬が抗体である請求の範囲１３項に記 載の組成物。
17. １７．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬が哺乳動物レクチンである請求の範 囲１３項に記載の組成物。
18. １８．ＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合試薬がＩＸａ／ＶＩＩＩａ因子または組 織因子／ＶＩＩａ因子から由来するペプチドである請求の範囲１３項に記載の組 成物。
19. １９．治療を必要とするヒト被験体に有効量のＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合 試薬またはその薬剤組成物を投与することからなる、ヒト被験体の血栓症を予防 または治療する方法。
20. ２０．治療を必要とするヒト被験体に有効量のＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合 試薬またはその薬剤組成物を投与することからなる、ヒト被験体の炎症を予防ま たは治療する方法。
21. ２１．治療を必要とするヒト被験体に有効量のＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合 試薬またはその薬剤組成物を投与することからなる、ヒト被験体の再狭窄を予防 または治療する方法。
22. ２２．治療を必要とするヒト被験体に有効量のＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃ結合 試薬またはその薬剤組成物を投与することからなる、ヒト被験体の移植合併症を 予防または治療する方法。
23. ２３．ヒトＸ因子と、該Ｘ因子からのグリコシル化部分を開製することのできる 試薬とを、グリコシル化部分を開製するのに十分な量と時間で接触させることか らなる、ヒトＸ因子のヒトＸａ因子への変換を阻害する方法。
24. ２４．グリコシダーゼがノイラミニダーゼである請求の範囲２３項に記載の方法 。
25. ２５．ヒトＸ因子と、Ｘ因子の活性化ペプチドのグリコシル化部分と結合できる 試薬とを、該ペプチドと結合するのに十分な量と時間で接触させることからなる 、ヒトＸ因子のヒトＸａ因子への変換を阻害する方法。
26. ２６．ヒトＸ因子と、少なくとも１つのＳＡ／Ｇａｌ／ＧａｌＮＡｃの可溶性類 似体とを接触させることからなり、該接触は、該可溶性類似体の不存在下では通 常Ｘ因子のＸａ因子への変換に影響する条件下で行う、ヒトＸ因子のヒトＸａ因 子への変換を阻害する方法。
27. ２７．該条件が外因性または内因性経路の条件である請求の範囲２６項に記載の 方法。
28. ２８．可溶性類似体を生きている生物体に投与することによって接触を行う請求 の範囲２６項に記載の方法。
29. ２９．生物体に有効量のグリコシル化阻害剤を投与することからなる、生きてい る生物体中におけるヒトＸ因子のヒトＸａ因子への変換を阻害する方法。
30. ３０．阻害剤がシアリルトランスフェラーゼを阻害する請求の範囲２９項に記載 の方法。