CN107796793B

CN107796793B - FXa的检测试剂及检测方法

Info

Publication number: CN107796793B
Application number: CN201710894942.2A
Authority: CN
Inventors: 徐小龙; 桂宗祥
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2017-09-28
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2037-09-28
Also published as: CN107796793A

Abstract

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及FXa的检测试剂及检测方法。本发明提供了一种FXa的检测试剂及检测方法，采用本发明提供的试剂能够在30min内完成对FXa的检测，由于Tb³⁺与AHP及AHP与FXa特异性结合反应迅速、结合力强，可以做到操作简便、重复性好、快速检测的目的。实验表明，本发明提供的试剂重复检测5次，不同浓度下，CV值均不超过3％，说明重复性好，准确性高。并且，本发明提供的方法，所需的样品量较低，可同时检测多个样品。

Description

FXa的检测试剂及检测方法

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及FXa的检测试剂及检测方法。

背景技术

凝血因子X为维生素K依赖的丝氨酸蛋白酶原，在血液含量为100nM/L。凝血因子X被FIX激活后产生活化凝血因子X(FXa)。FXa在血管出血时被激活，其为体内凝血酶原唯一的生理性激活物，在血液凝固的连锁反应中起关键性作用。研究表明，FXa可以作为体内出血的标志物，与血管内膜增生和动脉粥样硬化有关，同时FXa与肿瘤细胞的转移有关。因此，快速准确的检测出FXa在血液水平十分重要。

随着酶联免疫吸附测定技术的发展，目前市面上已经有一些FXa ELISA KIT产品，通用的FXa检测试剂盒检测原理为双抗体夹心法。用纯化的FXa抗体包被微孔板，制备成固相抗体，检测时往包被单抗的微孔中依次加入待测物质，再与HRP标记的FXa抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的待测FX呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中待测FXa浓度。但其ELISA检测法步骤较多，包括孵育、显色、洗板等过程，检测时间较长，通常在3～6h，这样的时间对于临床检测而言过长。另外，还有其他一些检测FXa的方法，例如，电化学法、凝固法或发色底物法。但这些方法都难免受到血浆中杂蛋白或血红色素的影响，容易产生误差。

因此寻找一种能够快速、准确测量样品FX含量的技术十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供FXa的检测试剂及检测方法。本发明提供的检测试剂能够实现对FXa快速、准确的检测。

本发明提供了一种FXa检测试剂，由金属结合蛋白AHP、Tb³⁺、Tris-HCl、Mg²⁺和水制得；所述金属结合蛋白与Tb³⁺的摩尔为1:(1～3)。

铽离子(Tb³⁺)能够与金属离子结合蛋白AHP结合，由于280nm激发蛋白质产生发射光谱与铽离子的激发光谱有重叠，二者之间存在荧光共振能量转移(FRET)，AHP作为供体，Tb³⁺作为受体。FRET程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，距离增大，FERT越弱，Tb³⁺的荧光强度越低。镁离子(Mg²⁺)可以诱导FXa与AHP结合，结合后会使AHP在280nm的发光基团(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)与Tb³⁺之间的空间距离增大，从而使Tb³⁺的荧光强度降低。因此，AHP与Tb³⁺之间比例和分子量固定的情况下，FXa含量越高，Tb³⁺荧光强度越低，通过建立FXa与Tb³⁺荧光强度之间的关系，可以通过检测Tb³⁺的荧光强度判断样品中FXa的含量。

本发明中，所述金属结合蛋白AHP的浓度为4～6nmol/L。所述金属结合蛋白AHP的浓度为5nmol/L。

AHP与FXa结合体系中存在Tb³⁺和Mg²⁺的情况下，Mg²⁺结合FXa，与AHP不结合。而Tb³⁺与AHP的结合常数很高，在体系中AHP:Tb³⁺的摩尔比为1:(1～3)结合良好，在AHP:Tb³⁺的摩尔比为1:2的情况下，二者能够完全结合。本发明实施例中，所述金属结合蛋白与Tb³⁺的摩尔为1:2。

本发明中，所述Tb³⁺的来源为Tb(NO₃)₃·5H₂O。

本发明中，所述Tb³⁺的浓度为8～12nmol/L。

一些具体实施例中，所述Tb³⁺的浓度为10nmol/L。

本发明中，所述Mg²⁺的来源为MgSO₄。

本发明中，所述Mg²⁺的浓度为8～12μmol/L。一些具体实施例中，所述Mg²⁺的浓度为10μmol/L。

本发明中，所述Tris-HCl的浓度为150～250nmol/L。所述Tris-HCl的浓度为200nmol/L，pH值为7.4。

本发明所述检测试剂的制备方法为：分别将金属结合蛋白AHP、Tb³⁺和Tris-HCl溶解后混合5min，然后加入Mg²⁺制得检测试剂。

所述混合的温度为室温，优选为18～30℃。

本发明还提供了一种FXa的检测方法，将本发明所述的检测试剂与待测样品混合，4℃反应20min后，以280nm为激发波长，检测546nm处荧光强度，标准曲线法获得待测样品中FXa的浓度。

本发明所述的待测样品为血液。由于杂蛋白浓度高会影响280nm下AHP与Tb³⁺之间的荧光共振能量转移，因此需要合适的稀释比例以满足实验要求。本发明中，所述检测试剂与待测样品的体积比为(50～200):1。实验表明，检测试剂与待测样品体积比为200:1(v:v＝200:1)时，理论荧光强度与实际荧光强度之间的误差仅为2.37％。杂质影响基本消除，因此采用V_血浆：V_检测试剂＝1:200的稀释倍数效果更好。

所述检测荧光强度为：设置时间分辨荧光终点法模式，自动增益，每次增益倍数均为200，延迟:50μsec，采集时间:1950μsec，激发波长280nm，检测波长546nm处荧光强度。

本发明提供了一种FXa的检测试剂及检测方法，采用本发明提供的试剂能够在30min内完成对FXa的检测，由于Tb³⁺与AHP及AHP与FXa特异性结合反应迅速、结合力强，可以做到操作简便、重复性好、快速检测的目的。实验表明，本发明提供的试剂重复检测5次，不同浓度下，CV值均不超过3％，说明重复性好，准确性高。并且，本发明提供的方法，所需的样品量较低，可同时检测多个样品。

附图说明

图1示荧光分光光度计检测不同样品中Tb³⁺荧光曲线；

图2示Mg²⁺存在条件下，Fxa与AHP非还原结合电泳；

图3示Mg²⁺不存在条件下，Fxa与AHP非还原结合电泳；

图4示荧光分光光度计测量不同比例FXa加入检测试剂后Tb³⁺荧光强度变化；

图5示浓度与荧光强度之间的关系。

具体实施方式

本发明提供了FXa的检测试剂及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

所述金属结合蛋白AHP来自于江浙蝮蛇蛇毒干粉，采用阴离子交换层析和分子筛两个步骤进行分离提纯。取自屠宰场的新鲜猪血在实验室离心得到的含FXa的猪血浆，通过Sepharose 4B-ACF I处理之后得到去除FXa的血浆，根据实验设计加入定量的FXa。其余化学试剂均为分析纯。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1检测试剂制备

将金属结合蛋白AHP、Tb(NO₃)₃·5H₂O和溶解于pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液。用去离子水调整至金属结合蛋白AHP浓度为5nmol/L、稀土离子Tb³⁺浓度为10nmol/L、Tris-HCl浓度为200nmol/L，充分混合5分钟，加入硫酸镁溶液，调整Mg²⁺浓度为10μM充分反应混合5分钟

实施例2检测试剂的检测

对不同状态的试剂进行荧光检测(图1)和电泳检测(图2～3)。

Tb³⁺本身的荧光很弱，Tb³⁺加入AHP后荧光大幅增强，加入Mg²⁺对其没有影响。FXa不能使Tb³⁺荧光增强，FXa加入AHP-Tb³⁺-Mg²⁺中会使Tb³⁺荧光降低，但仍旧远高于Tb³⁺-Mg²⁺中荧光强度。低浓度BSA加入AHP-Tb³⁺-Mg²⁺中Tb³⁺荧光基本保持不变，说明低浓度的杂蛋白对体系没有影响。

图2电泳环境为1mMMg²⁺，1道为AHP，2道为AHP+FXa，3道为AHP+Tb³⁺FXa，4道为FXa。其中，2道和3道中AHP与FXa均完全结合形成一条条带。图3电泳环境中没有Mg²⁺，1道为AHP，2道为AHP+Tb³⁺FXa，,3道为FXa。2道中AHP与FXa没有结合为两条条带。

由图2的结果可以得出Mg²⁺是AHP与FXa结合的必须条件，Tb³⁺的存在不影响二者的结合。

实施例3样品检测

1、确定合适样品稀释比例。由于杂蛋白浓度高会影响280nm下AHP与Tb³⁺之间的荧光共振能量转移，因此需要合适的稀释比例以满足实验要求。

按照检测试剂与去除FXa的血浆体积比50:1、150:1、200:1混合(分别编号1、2、3)。同时取检测试剂(编号4)荧光作为对照计算误差。20分钟后，分别取200微升样品注入黑色96孔板中，设置时间分辨荧光终点法模式，增益倍数酶标仪自动调整，延迟:50μsec,采集时间:1950μsec，激发波长280nm,检测波长546nm处荧光强度(图4)。

结果如表1所示：

表1荧光强度

样品编号	1	2	3	4
					546nm荧光强度	521	588	681	701
误差(％)	24.2	15.56	2.37	-

计算示例：1号样品误差，理论荧光强度(即不受杂蛋白影响)为701×50/51＝687.25误差为(687.25-521)/687.25＝0.242。

由结果可以得出，稀释检测试剂与血浆体积比为200:1(v:v＝200:1)时，其相差仅为2.37％。杂质影响基本消除，因此采用V_血浆：V_检测试剂＝1:200的稀释倍数。

2、在V_血浆：V_检测试剂＝1:200的比例混合检测试剂和去除FXa的血浆，在混合样品中定量的加入1.25nM、2.5nM、3.75nM、5nM和6.25nM、7.5nM的FXa。按照上述参数检测546nM处荧光强度。结果如表2：

表2荧光强度

FXa浓度/nM	1.25	2.5	3.75	5	6.25
						546nm荧光强度	499	332	224	167	143

故可以画出浓度与荧光强度之间的关系(图5)，由图可以得出荧光强度y与浓度x的增大逐渐减低，并趋于稳定。其在0-3.75nM范围内，二者关系趋近于线性关系y＝678.5-139.6x，其线性相关系数为0.99877，其线性关联度很高。故可通过混合样品测量546nm处荧光判断其浓度。由此，可以计算得出，线性范围为0～2.5nM。

3、将去除FXa的猪血浆与的检测试剂按照上述方法混合后，定量的加入1nM、1.5nM、2nM、2.5nM、3nM FXa，用以模拟不同情况的血浆。混合20分钟后。检测546nm处荧光，其结果如带入方程得到其检测结果。每个浓度做配制5个样品做检测。荧光强度如表3：

表3荧光强度

代入方程计算FXa浓度，并计算标准差SD和离散系数CV，结果如表4：

表4 FXa浓度、标准差和离散系数

各个浓度的CV％均小于3，灵敏度较高。同一浓度不同样品间相差较小且与标定浓度误差很小，说明重复性较好，准确性较高。实验结果说明，本实验方案可以准确测量稀释血浆中FXa浓度。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种FXa检测试剂，其特征在于，由金属结合蛋白AHP、Tb³⁺、Tris-HCl、Mg²⁺和水制得；所述金属结合蛋白AHP与Tb³⁺的摩尔比为1:2;

所述金属结合蛋白AHP为江浙蝮蛇蛇毒凝血因子X结合蛋白。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述Tb³⁺的来源为 Tb(NO₃)₃·5H₂O。

3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述Mg²⁺的来源为 MgSO₄。

4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述金属结合蛋白AHP的浓度为4~6nmol/L。

5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述Tb³⁺的浓度为8~12nmol/L。

6.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述Mg²⁺的浓度为8~12 μmol/L。

7.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述Tris-HCl的浓度为150~250nmol/L，pH值为7.4。

8.权利要求1~7任一项所述检测试剂的制备方法，其特征在于，分别将金属结合蛋白AHP、Tb³⁺和Tris-HCl溶解后混合5min，然后加入Mg²⁺制得检测试剂。

9.一种FXa的检测方法，其特征在于，包括：将权利要求1~7任一项所述的检测试剂与待测样品混合，4℃反应20min后，以280nm为激发波长，检测546nm处荧光强度，标准曲线法获得待测样品中FXa的浓度。