CN102146134A

CN102146134A - 一种高效提取纯化凝血因子ix和凝血因子x的方法

Info

Publication number: CN102146134A
Application number: CN2011100014833A
Authority: CN
Inventors: 徐小龙; 沈登科
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2011-01-06
Filing date: 2011-01-06
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2031-01-06
Also published as: CN102146134B

Abstract

一种高效提取纯化凝血因子IX和凝血因子X的方法，包括血液的收集、处理、取血浆以及自血浆中提取IX粗提物和X粗提物及其纯化，其特征在于：所述的纯化是凝血因子IX粗提物和X粗提物分别用FIX/FX-bp-Sepharose 4B进行亲和层析纯化，所述的亲和配基FIX/FX-bp选自ACF I、ACF II或AHP。纯化后凝血因子IX可直接作为药物应用，纯化后凝血因子X可直接作为试剂使用。

Description

一种高效提取纯化凝血因子IX和凝血因子X的方法

一、技术领域

本发明涉及生物技术领域中血液制品的纯化方法，确切地说是一种高效提取纯化凝血因子IX和凝血因子X的方法。

二、背景技术

凝血因子IX(Coagulation factor IX，简写为FIX)和凝血因子X(Coagulation factor X，简写为FX)都是维生素K依赖因子，它们都是由肝细胞合成并分泌到血液中，并在凝血反应中发挥各自的活性[1]。FIX和FX都是糖蛋白，人源FIX的分子量为57,000，含多糖17％左右[2]；人源FX的分子量为72,000，含多糖10％左右[3]。

FIX和FX在凝血的瀑布反应中，位于内外源通路的交汇点，所以对凝血过程有着非常重要的作用。FIX在血浆中的的含量一股认为有5毫克/升左右，而FX在血浆中的的含量为10毫克/升左右。

FIX是一个非常重要的药物，在临床上被用作治疗B型血友病。B型血友病(也称作Christmas病)是一种非常严重的疾病。B型血友病患者的血液在体内和体外凝血活性降低，而他们的一生都必须在严格的医疗监控下度过。这些患者必须补充外源的正常血浆中提取的FIX，才可以让凝血时间恢复正常，且目前没有其他任何替代品。

FX虽然没有作为药物在临床使用，但是FX是个使用范围广泛的科研试剂。FX作为凝血通道上的重要环节，是一个很好的抗凝血药物的设计靶标。同时，FX也是一个选择性很高的精氨酸肽键水解酶，可以被设计成融合基因表达的融合蛋白的限制性内切酶。

因此，从血浆中高效率纯化制备FIX和FX具有重要的现实意义。

自上个世纪七十年代，FIX、FX第一次被纯化[4，5]发展到今天，国内外现在已经有多种从血液中纯化天然FIX、FX的方法。单纯的多步离子交换层析，或是离子交换层析和亲和层析相结合的方法，是当前普遍认可的从血液中提取高纯度FIX和FX的有效方法。多步离子交换层析，步骤繁琐，需要耗费较长的时间[6，7]。FIX、FX都是酶原，在长时间的纯化处理过程中，它们会被活化成活化状态的FIX(FIXa)、活化状态的FX(FXa)，所以，使用多步离子交换层析很难得到纯度较高的未被活化的FIX、FX。FIXa和FXa是具有生物学活性的水解酶，如果是临床用FIX中含有部分FIXa，则有可能在体内触发凝血反应形成血栓；FX虽然大部分情况是作为实验试剂被使用，但对纯度的要求也是很高的。离子交换层析和亲和层析相结合的方法较单纯的多步离子交换层析步骤简化，可以很大程度上解决多步离子交换层析费时的问题，且亲和配基对FIX或FX的特异性结合更有利于获得高纯度的FIX或FX[8]。目前已有的技术中，亲和效果最好的配基为Ca²⁺依赖型的单克隆抗体，其结合-解离条件简单温和，在含有Ca²⁺的缓冲溶液中抗体可以和抗原特异性结合，将淋洗液换成含有EDTA的缓冲溶液即可以洗脱下抗原。但是，单克隆抗体造价昂贵，且稳定性较差，难以大量应用到工业大批量生产。肝素是另一种亲和配基，它是一种带负电荷的多聚物，是AT-III的辅因子，又是许多凝血因子的抑制剂，可以通过静电和亲和相互作用可分离血浆中的很多凝血因子。肝素价格较便宜，但是亲和的特异性很差。

申请人长期从事蛇毒中FIX/FX结合蛋白家族的研究，徐小龙教授在2000年从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中纯化了两种FIX/FX结合蛋白(FIX/FX-bp)，分别命名为ACF I和ACF II[9]。此后不仅对ACF I、ACF II进行了深入的研究[10，11]，同时也对不同蛇毒来源的FIX/FX-bp都进行了深入的研究，如江浙蝮蛇的中的FIX/FX-bp AHP[12]，竹叶青中的FIX/FX-bp等等。蛇毒中FIX/FX-bp属于C型凝集素类似蛋白家族，所研究的几个FIX/FX-bp，分子量均为30kD左右，都有α和β两条多肽链，都是α链和β链通过二硫键连接。FIX/FX-bp大多具有两个金属离子的结合位点，其在天然状态下就结合两个金属离子，例如，AHP在天然状态下结合一个Ca²⁺，一个Zn²⁺[12]。FIX/FX-bp在Mg²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺等离子存在的条件下既可以结合FIX，也可以结合FX，在这些金属离子不存在的条件下，会迅速和已经结合的FIX或FX发生解离[13]。FIX/FX-bp与IX、X都有很高的结合活性，且其特异性仅限于FIX和FX。FIX/FX-bp作为爬行动物的外分泌蛋白，具有很好的稳定性，且廉价易得。

1.Furie，B.and B.C.Furie，Mechanisms of thrombus formation.N Engl J Med，2008.359(9)：p.938-49.

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3.Mertens，K.and R.M.Bertina，Pathways in the activation of human coagulation factor X.Biochem J，1980.185(3)：p.647-58.

4.Fujikawa，K.，M.E.Legaz，and E.W.Davie，Bovine factors X 1 and X 2(Stuart factor).Isolation andcharacterization.Biochemistry，1972.11(26)：p.4882-91.

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7.Esnouf，M.P.，P.H.Lloyd，and J.Jesty，A method for the simultaneous isolation of factor X and prothrombinfrom bovine plasma.Biochem J，1973.131(4)：p.781-9.

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三、发明内容

本发明针对上述现有离子交换层析和亲和层析相结合的纯化方法的缺陷，旨在提供一种改进的两者结合纯化FIX/FX的方法，所要解决的技术问题是改进亲和层析填料基质的配基，使之不仅对人源的、而且对其他来源的IX、X均有特异性的高亲和力。

本发明遴选的配基就是存在于皖南尖吻蝮蛇、江浙蝮蛇、竹叶青等蛇毒中存在的结合蛋白ACF I、ACF II、AHP。这些原料均由市场上购买的粗蛇毒冻干粉纯化制得，具体纯化方法见文献(2000年Toxicon，第11期，第1517到1528页)；色谱柱填料基质原料为琼脂糖，我们使用的型号为CNBr-actived Sepharose 4B。本发明将配基ACF I、ACF II、AHP分别与基质Sepharose 4B树脂通过肽键偶联，制备得到几种FIX/FX-bp-Sepharose 4B。

本发明的技术方案也是离子交换层析和亲和层析相结合的方法，包括收集血液，并加入常规的抗凝剂和酶抑制剂，取血浆，自血浆中提取IX和X并纯化，所述的提取就是利用离子交换层析分离出IX粗提物和X粗提物，与现有技术的区别是IX粗提物和X粗提物分别用FIX/FX-bp-Sepharose 4B进行亲和层析纯化，首先IX粗提物和X粗提物分别在亲和缓冲液中搅拌混合，然后用洗脱液分别洗脱得到纯化的FIX或纯化的FX；所述的亲和缓冲液为0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/L CaCl₂，所述的洗脱缓冲液为0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/L EDTA。纯化后IX可直接作为药物应用，纯化后X可直接作为试剂使用。

比较几种FIX/FX-bp-Sepharose 4B的回收率。使用电泳测定FIX、FX的纯度，使用酶解肽段-质谱鉴定电泳条带，用酶底物法检测FIX、FX的活力。

本发明的创新之处在于，在亲和色谱纯化FIX、FX的方法中，改进使用了新型的高效配基FIX/FX-bp，这种配基蛋白在特定金属离子存在的条件下对FIX、FX有着特异性的高亲和力，而在没有特定金属离子存在的条件下与FIX、FX则不发生结合，且它的稳定性较目前亲和技术中使用的配基-单克隆抗体更好。使用单克隆抗体作为配基，只能和一个抗原发生特异性亲和反应，如anti-humanFIX只能和人源的FIX特异性结合。而本发明使用的新型的高效配基FIX/FX-bp，与任何来源的FIX和FX都有很高的特异性亲和力，并且这种亲和力受到特定金属离子的调控，故新型的高效配基FIX/FX-bp可以具有非常广泛的用途。在使用FIX/FX-bp作为亲和配基时，只需要改变金属离子浓度就可以完成亲和-解离洗脱的过程，洗脱条件温和，目标蛋白和配基蛋白发生变性而导致损失的量极少。

四、附图说明

图1是FIX(左)、FX(右)的SDS-PAGE图。

图2是FIX的质谱鉴定结果。

图3是FX的质谱鉴定结果。

五、具体实施方式

(1)FIX/FX-bp-Sepharose 4B的制备

称取所需量的CNBr活化Sepharose-4B粉末，然后将其缓慢倒入10倍体积的1mmol/LHCl溶液中，轻微搅拌、分散凝胶颗粒。待凝胶溶胀后，用偶联缓冲液(0.2M硼酸-硼砂缓冲液pH＝8.0)清洗凝胶。将1体积FIX/FX-bp溶液加到1体积平衡好的活化琼脂糖中，低速搅拌偶联16～20h。随后加入过量乙醇胺反应，然后依次用高和低pH的缓冲液(含0.5mol/LNaCl的pH＝4.0，0.1mol/L醋酸钠缓冲液；含0.5mol/L NaCl的pH＝8.3，0.1mol/L硼酸-硼砂缓冲液)交替清洗凝胶三次，再用亲和缓冲液(0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/L CaCl₂)和洗脱缓冲液(0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/L EDTA)交替清洗，最后将其浸泡在含0.1％叠氮钠的平衡缓冲液中，4℃保存。

(2)凝血因子IX粗提物、凝血因子X粗提物的获得

将含有抗凝剂的血浆(含0.2mol/L柠檬酸三钠，17000unit/L肝素，0.2mol/L苯甲脒，l0000units/L大豆胰蛋白酶抑制剂)冷冻，然后在0℃条件下缓慢解冻，离心去除沉淀获得上清血浆。在4℃条件下，向上清血浆中加入DEAE-Sephadex A-50阴离子交换树脂，并温和搅拌。随后用平衡缓冲液(0.2mol/L氯化钠，0.01mol/L柠檬酸三钠，0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，和40unit/L肝素)清洗已吸附了蛋白的A-50树脂。清洗完成后，采用0-2.0mol/L氯化钠直线梯度洗脱A-50树脂，分别得到FIX和FX的粗提物。

(3)FIX/FX-bp-Sepharose 4B亲和色谱纯化凝血因子IX

取FIX粗提物，在亲和缓冲液(0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/L CaCl₂)环境下，加入FIX/FX-bp-Sepharose 4B并温和搅拌。随后用亲和缓冲液彻底清洗亲和着FIX的FIX/FX-bp-Sepharose 4B，大约需要10倍床体积的亲和缓冲液。接着使用洗脱缓冲液(0.02mol/LTris-HCl，pH 7.4，5mmol/LEDTA)洗脱FIX/FX-bp-Sepharose 4B的结合蛋白，大约需要2倍床体积即可完成洗脱。该洗脱下的蛋白，即为纯化的FIX，收集并脱盐浓缩，最后冷冻干燥。用美国American Diagnostica Inc.的酶底物

检测FIX的特异性酶活力为143，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测FIX的纯度为一个条带。

(4)FIX/FX-bp-Sepharose 4B亲和色谱纯化凝血因子X

取FX粗提物，在亲和缓冲液(0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/L CaCl2)环境下，加入FIX/FX-bp-Sepharose 4B并温和搅拌。随后用亲和缓冲液彻底清洗亲和着FX的FIX/FX-bp-Sepharose 4B，大约需要10倍床体积的亲和缓冲液。接着使用洗脱缓冲液(0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/LEDTA)洗脱FIX/FX-bp-Sepharose 4B的结合蛋白，大约需要2倍床体积即可完成洗脱。该洗脱下的蛋白，即为纯化的FX，收集并脱盐浓缩，最后冷冻干燥。用美国American Diagnostica Inc.的酶底物

检测FX的特异性酶活力为239，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测FX的纯度为一个条带。

Claims

1.一种高效提取纯化凝血因子IX和凝血因子X的方法，包括血液的收集、处理、取血浆以及自血浆中提取IX粗提物和X粗提物及其纯化，其特征在于：所述的纯化是凝血因子IX粗提物和凝血因子X粗提物分别用FIX/FX-bp-Sepharose 4B进行亲和层析纯化，首先IX粗提物和X粗提物分别在亲和缓冲液中搅拌混合，然后用洗脱缓冲液分别洗脱得到纯化的凝血因子IX或纯化的凝血因子X，所述的亲和缓冲液为0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/LCaCl2，所述的洗脱缓冲液为0.02mol/L Tris-HCl，pH 7.4，5mmol/L EDTA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：亲和配基FIX/FX-bp选自ACF I、ACF II或AHP。