CN103122346B - 重组klk14蛋白的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组KLK14蛋白的亲和层析纯化方法，包括步骤：(1)将重组SPINK6蛋白与亲和层析介质混合，偶联反应，制得重组SPINK6蛋白亲和层析介质；(2)将重组KLK14蛋白通过预先用缓冲液A平衡好的装有步骤(1)的SPINK6蛋白亲和层析介质的层析柱；然后用缓冲液A清洗上样后的重组SPINK6蛋白亲和层析柱；再用缓冲液B将重组KLK14蛋白从层析柱上洗脱，并收集洗脱峰。本发明方法获得的重组KLK14蛋白的活性回收率为50-65％，纯度可达85％-90％，蛋白纯化倍数为10-20倍以上。本发明方法处理速度快、重复性好、柱效长且结合效率基本不变。

Description

重组KLK14蛋白的纯化方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白的纯化方法，具体涉及一种重组KLK14蛋白的亲和层析纯化方法。

背景技术

人组织KLK14是激肽释放酶家族成员之一，其成熟蛋白分子量为25KD，含227个氨基酸，是一种新型的胞外丝氨酸蛋白酶。KLK14由pre-KLK14被剪切形成有活性的成熟蛋白，成熟蛋白具有与胰蛋白酶及糜蛋白酶相似的蛋白降解活性，偏好型剪切底物精氨酸后一位氨基酸残基。有研究经体外实验证明，KLK14可作用于多种底物包括胶原I-IV，酪蛋白，明胶，层粘连蛋白，高分子量激肽原，纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，玻连蛋白以及类胰岛素样生长因子结合蛋白2和3等。KLK14对细胞间基质的降解活性被证明与多种肿瘤的发展过程相关，包括肿瘤生长，侵袭和血管生成。

FelberLM等于2005年在毕赤酵母表达系统中克隆表达了KLK14蛋白，并在2006年由Diamandis等建立了该酶的纯化方法，该方法包括离子交换与亲和层析两步法对培养上清中KLK14蛋白进行纯化。该方法中，浓缩20倍的1L培养上清分批次进入5ml阳离子交换柱，经盐缓冲液梯度洗脱后的KLK14蛋白进行进一步浓缩后与偶联了胰蛋白酶抑制剂的琼脂糖微粒共同孵育，最终由0.1N甘氨酸缓冲液洗脱。该方法中，由于阳离子层析介质的刚性弱，蛋白载量低，导致层析过程中流速不能太快，使样品处理量受到了很大限制，并且过于长时间的纯化过程易使重组蛋白的活性受到损害。

亲和层析法是近年来各类蛋白纯化的主要研究方向。该方法根据生物大分子能够与配体特异、可逆的结合在一起的特性，可以将目的蛋白从复杂的生物样品中分离纯化，具有较强的选择性，纯化步骤简单，效率高。目前，采用亲和层析法对KLK14进行纯化时，多采用胰蛋白酶抑制剂作为亲和介质与重组KLK14蛋白相互作用，然而由于广谱的胰蛋白酶抑制剂与KLK14的相互作用并不具有特异性，致使纯化过程中其它具有类似胰蛋白酶活性的杂蛋白无法与目标蛋白分离，降低了目的蛋白的纯度。此外，非特异性使胰蛋白酶抑制剂与KLK14之间的亲和力不高，导致洗脱过程中重组蛋白的损耗较大，大大降低了纯化效率。因此，寻找一种高特异性，高亲和力与KLK14结合的蛋白是KLK14纯化过程中急需解决的问题。

SPINK6蛋白是复旦大学实验室在研究细小病毒过程中发现的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，并首次在国际上证明其生物学功能(专利申请号：PCT/CN2009/074410)。最新的研究结果表明，SPINK6蛋白作为KLK家族的特异性抑制剂在皮肤角质层组织中发挥重要作用，其对KLK14的抑制作用尤为明显。目前，上述实验室已成功表达纯化高纯度高活性的SPINK6蛋白，在对KLK14的抑制试验中发现，当SPINK6与KLK14蛋白1∶1孵育时，即可基本完全抑制KLK14的活性。结果证明，SPINK6可以高特异性，高亲和力与KLK14蛋白相互作用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种重组KLK14蛋白的亲和层析纯化方法。尤其是一种以偶联SPINK6蛋白的琼脂颗粒作为亲和载体，高效特异纯化KLK14蛋白的方法，

具体而言，本发明的一种重组KLK14蛋白的亲和层析纯化方法，其特征在于，其包括步骤：

(1)制备亲和层析介质

参考GE公司出版的CNBr活化的Sepharose4B的使用说明书，进行亲和层析介质的制备。具体步骤如下：将亲和介质用pH2.0-3.0的HCl溶液进行溶胀、清洗，HCl溶液的用量为亲和介质的50-100倍体积量，然后用亲和介质的10-20倍的体积量的偶联液进行清洗，使亲和层析介质的pH达到8.0-10.0。

所用的偶联液为含有0.2-0.6MNaCl的NaHCO₃溶液(pH8.0-10.0)。

将重组SPINK6蛋白以重量比1∶200-400溶解在偶联液中，然后与上步用偶联液清洗过的亲和介质混合，在室温条件振荡0.5-2小时，或于4℃条件下放置12-36小时，使重组SPINK6蛋白与亲和介质偶联充分；然后用偶联液清洗制得的亲和层析介质，偶联液用量为制得的亲和层析介质体积的5-20倍；再用亲和介质体积1-5倍的0.1-0.5M的Gly缓冲液(pH8.0)或1-2M乙醇胺溶液浸泡放置2-4小时，用于封闭亲和层析介质中未被结合的活性位点。

重组SPINK6蛋白与亲和层析介质的重量比为1∶20-150；

所说的重组SPINK6蛋白依据专利PCT/CN2009/074410中的实施例8制备，利用制备型高效液相色谱方法提纯为纯度大于90％，并制成规格为0.7mg蛋白/mg冻干粉。

所说的亲和层析介质选自交联琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、丙烯酰胺聚合物、聚醚砜或脱乙酰壳多糖中的一种或一种以上；

(2)重组KLK14蛋白用亲和层析介质进行纯化

用0.01-0.1mol/LpH7.0-9.0含0.05-0.15mol/LNaCl缓冲液A平衡装有亲和层析介质的层析柱；

将重组KLK14蛋白样品以10-75cm/h上样至预平衡好的层析柱；

所说的单位cm/h为流速单位，即缓冲液每小时通过介质材料的高度。然后用0.01-0.1mol/LpH7.0-9.0含0.05-0.15mol/LNaCl的缓冲液A清洗上样后的亲和层析柱；

再用0.1-0.5mol/LpH2.5-4.5的缓冲液B以10-55cm/h的流速将重组KLK14蛋白从层析柱上洗脱并收集洗脱峰；缓冲液B的用量为层析柱体积的3-10倍；洗脱液收集在装有0.5-2mol/LpH7.0-9.0的缓冲液A中。

所说的重组KLK14蛋白样品为含重组KLK14蛋白基因的毕氏酵母发酵上清液(参照文献FelberL.M.Enzymaticprofilingofhumankallikrein14usingphage-displaysubstratetechnology.Biol.Chem.，2005；386：291-298制得)经离子交换步骤纯化后的洗脱峰(重组KLK14蛋白含量为0.001-0.005mg/ml，纯度为35-50％)与缓冲液A以体积比1∶1混合而成的。

所说的缓冲液A平衡亲和层析柱包括如下步骤：

将0.01-0.1mol/LpH7.0-9.0含0.05-0.15mol/LNaCl的缓冲液A以介质流速通过装有亲和层析介质的层析柱，用量为层析柱体积的3-10倍，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线。

所说的缓冲液A清洗上样后的亲和层析柱包括如下步骤：

用0.01-0.1mol/LpH7.0-9.0含0.05-0.15mol/LNaCl的缓冲液A以介质流速清洗上样后的亲和层析柱，用量为层析柱体积的3-10倍，通过紫外检测保证层析柱已清洗至基线。

所说的pH7.0-9.0的缓冲液A选自PBS、Tris-HCl、硼酸缓冲液中的一种或一种以上；

所说的pH2.5-4.5的缓冲液B选自醋酸-醋酸钠、NaHPO₄-柠檬酸、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的一种或一种以上。

所说的各种缓冲液的配制方法参考《分子克隆》第二版，附录B：分子克隆中使用的试剂与缓冲液的配制；上海科学出版社，1993。

本发明方法获得的重组KLK14蛋白的回收率为50-65％，纯度可达85-90％，蛋白纯化倍数为10-20倍以上，处理速度快、重复性好、柱效长(4℃下，20％乙醇保存柱效大于一年)。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的重组KLK14蛋白的纯化方法进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为重组KLK14蛋白亲和层析图谱。

图2为重组KLK14蛋白SDS-PAGE分析。

具体实施方式

实施例1制备重组SPINK6蛋白亲和层析介质

将1克CNBr活化的Sepharose4B干粉(1克干粉可溶胀至3.5ml胶)置于1mMHCl中并迅速用200ml1mMHCl于烧结玻璃漏斗中进行抽滤清洗15分钟并抽至半干。将50mg重组SPINK6蛋白冻干粉(重组SPINK6蛋白含量约为31.5mg)溶于20ml偶联缓冲液并缓慢加入胶(CNBr活化Sepharose-4B)中，室温下轻柔搅拌1小时，封闭液用量为10ml。偶联后，用35ml偶联缓冲液于烧结玻璃漏斗中对胶进行清洗除去未结合的蛋白随后将胶置于0.2MGly-HClpH8.0中封闭活性位点2小时，封闭液的用量为10ml。用0.1MTris-HClpH8.0含0.5MNaCl和0.1M醋酸缓冲液pH4.0含0.5MNaCl交替洗涤3个循环。最后在Tris-HCl体系下将胶装入1cm×10cm柱中，柱体积为3.5ml。收集偶联后清洗缓冲液44ml，通过lowry法测定蛋白浓度为0.17mg/ml，总量为7.48mg，继而计算偶联率。

实施例2重组SPINK6蛋白亲和层析纯化重组KLK14蛋白

亲和介质：偶联有SPINK6蛋白的Sepharose4B凝胶3ml(购自Pharmacia生物技术有限公司，经CNBr活化)，预先装入10ml容积层析柱。

样品：人重组KLK14蛋白样品为参考文献(FelberL.M.Enzymaticprofilingofhumankallikrein14usingphage-displaysubstratetechnology.Biol.Chem.，2005；386：291-298)制备的含人重组KLK14蛋白基因的毕氏酵母发酵上清液经离子交换步骤纯化后的洗脱峰(KLK14蛋白含量为0.003mg/ml，纯度为25％)40ml与平衡缓冲液以体积比1∶1混合而成的样品缓冲液80ml。

层析设备：AKTAexplorer100蛋白纯化系统，购自GE生物技术公司。

平衡、清洗缓冲液：0.01mol/LTris-HCl(pH7.5)含0.05mol/LNaCl缓冲液。

洗脱缓冲液：0.1mol/LGly-HCl(pH3.0)缓冲液。

中和缓冲液：1mol/LTris-HCl(pH7.5)缓冲液。

平衡：用平衡缓冲液平衡装有3ml偶联有胰蛋白酶的Sepharose4B凝胶层析柱，柱高为3.5cm，以70cm/h流速平衡5个柱体积，通过紫外检测(A280)保证层析柱已平衡至基线。

上样：将80ml样品缓冲液以70cm/h通过经平衡缓冲液平衡好的胰蛋白酶的Sepharose4B凝胶层析柱，待紫外检测变化时开始收集流穿峰。

清洗：上样完，用清洗缓冲液以50cm/h的流速清洗层析柱，用量为层析柱体积的5倍，待紫外检测(A280)至基线时停止收集流穿峰，共收得107ml流穿液。

洗脱：清洗至基线后，用洗脱缓冲液以30cm/h的流速将重组KLK14蛋白从层析柱上洗脱下来，待紫外检测变化时开始收集洗脱峰，缓冲液用量为层析柱柱体积的4倍。在洗脱液收集管中预先加入中和缓冲液，收集洗脱峰3毫升，实验结果如图1所示，其中峰1为重组KLK14蛋白洗脱峰，峰2为重组KLK14蛋白流穿峰。通过SDS-PAGE对重组SPINK6蛋白进行纯度鉴定，结果如图2所示。图中泳道M为低分子量标准蛋白(Mark)，泳道1为KLK14蛋白毕氏酵母发酵上清液，泳道2为SPINK6亲和柱纯化的KLK14蛋白。将该结果用电泳分析软件bandscan进行分析，结果显示，经MMC离子交换纯化的KLK14蛋白纯度为22.2％，经SPINK6蛋白亲和纯化后的样品中KLK14蛋白的纯度提高到85.7％(如表1所示)。

表1SDS-PAGE电泳纯度检验

Claims (1)

1.重组KLK14蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

亲和介质：偶联有SPINK6蛋白的Sepharose4B凝胶3ml，购自Pharmacia生物技术有限公司，经CNBr活化，预先装入10ml容积层析柱；

样品：人重组KLK14蛋白样品为含有编码人重组KLK14蛋白的基因的毕氏酵母发酵上清液经离子交换步骤纯化后的40ml洗脱峰与平衡缓冲液以体积比1:1混合而成的80ml样品缓冲液，所述洗脱峰中KLK14蛋白含量为0.003mg/ml，纯度为25%；

层析设备：AKTAexplorer100蛋白纯化系统，购自GE生物技术公司；

平衡、清洗缓冲液：含0.05mol/LNaCl的0.01mol/LTris-HClpH7.5缓冲液；

洗脱缓冲液：0.1mol/LGly-HClpH3.0缓冲液；

中和缓冲液：1mol/LTris-HClpH7.5缓冲液；

平衡：用平衡缓冲液平衡装有3ml偶联有胰蛋白酶的Sepharose4B凝胶层析柱，柱高为3.5cm，以70cm/h流速平衡5个柱体积，通过紫外检测A280保证层析柱已平衡至基线；

上样：将80ml样品缓冲液以70cm/h通过经平衡缓冲液平衡好的胰蛋白酶的Sepharose4B凝胶层析柱,待紫外检测变化时开始收集流穿峰；

清洗：上样完，用清洗缓冲液以50cm/h的流速清洗层析柱，用量为层析柱体积的5倍，待紫外检测A280至基线时停止收集流穿峰，共收得107ml流穿液；

洗脱：清洗至基线后，用洗脱缓冲液以30cm/h的流速将重组KLK14蛋白从层析柱上洗脱下来，待紫外检测变化时开始收集洗脱峰，缓冲液用量为层析柱柱体积的4倍，在洗脱液收集管中预先加入中和缓冲液，收集洗脱峰3毫升，其中峰1为重组KLK14蛋白洗脱峰，峰2为重组KLK14蛋白流穿峰。