CN1810258A - 一种原于蛇毒的复方止血药 - Google Patents

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Abstract

一种原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：所述药物的主活性成份为纯度大于97％的类凝血酶和凝血因子X激活剂，类凝血酶和凝血因子X激活剂的活性比例范围为1∶1～1000∶1。本发明止血药可以在保证疗效的同时，尽量降低蛋白酶的用量，从而减少了发生不良免疫应答反应几率。

Description

一种原于蛇毒的复方止血药
技术领域：
本发明涉及一种酶制剂，具体提供了一种原于蛇毒的复方止血药，所含的有效成份为蛇毒类凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活剂(FXA)，特别是对该药物中FXA的分离纯化工艺以及复合制剂处方进行了优选。
背景技术：
1934年Macfarlane等发现蝰蛇蛇毒具有十分显著的使血液凝固作用，当它稀释1000倍时还能在17秒钟使血友病病人的血液凝固(参见The Lancet，Drs.Macfarlane&Barnett：Haemostatic Possibilities ofSnake-venom，Nov，3，1934，985-987)。国外早期一些地区将其用作外用止血药(参见The Lancet，Clinical and Labboratory Notes，Feb.22，1936，428)，当时使用的是未经分离纯化的全毒，如Stypven(Wellcome UK)，该产品多用作诊断试剂(参见BloodReviews7，176-189，1993)。
1963年奥地利学者Von Klobusitzky首次从巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)毒液中分离出多种凝血成份，发现它们在凝血的不同水平起作用。第一个分离纯化的凝血成份是Batroxobin，它是一种丝氨酸蛋白水解酶(Thrombin-LikeEnzyme——类凝血酶)，也就是所说的巴曲酶(Stocker，K.，&Egberg，n.，1973，Thromb.Diath.Haemorrh.1，361；Stocker，K.，&Barlow，G.H.，1976，MethodEnzymol.45，214；Holleman，W.H.，&Weiss，L.J.，1976，J.Biol.Chem.251.1663)。Batroxobin酶切哺乳动物的血浆纤维蛋白原中纤维蛋白肽A，使之转变为纤维蛋白，因此在体外能引起血浆纤维蛋白的凝聚，起凝血作用(Funk，C.，等，1975，J.Br.J.Haematol.21，43)。但在体内它不激活凝血因子V和凝血因子VIII(Niewiarowski等，1977，Trombin Res.10.863；Niewiarowski等，1979，iochemistry，21，3437；Kirby等，1979，Biochemistry，18，3564)，所以由其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交联，易被纤维蛋白溶酶降解，导致体内纤维蛋白原浓度降低而表现出抗凝效应，从而影响动物的出血—凝血过程。Bothrops atrox蛇毒中还含有一种止血成份，即凝血因子X激活剂(FXA)(Nahas等，1964，Thromb.Diath.Haemorrh.12，355；Nahas等，1979，Thromb.Haemorrh，41，314；Hofmann等，1983，Biochemistry，65，201)。它是经DEAE阴离子交换柱层析，凝胶过滤柱层析等纯化方法得到的活性成份，其分子量为75000，还原SDS-PAGE电泳证实，它是由分子量为59000的重链和分子量为15000的轻链聚合体通过二硫键所组成(Hofmann等，1987Biochemistry，26，780)。FXA能将凝血因子X转化为具有酰胺活性和凝血活性Xa或中间物。FXA激活凝血因子X时被Ca2+离子激活，FXA对合成底物TAME、S-2238、S2337没有水解活性。当将FXA和来源于Vipera russelli(或Daboia russelli)的RVV-X相比较时，发现两者均能特异地激活凝血因子X，在凝血因子X的重链的Arg52-Ile53键切断，释放出52个残基的活性肽Xa。与RVV-X不同的是，FXA还有另外两个酶切位点：一个是在重链的N末端，产生因子Xμ，另一个在因子Xaα的末端，产生的因子Xaγ。
国外进口的Reptilase(中文商品名：立止血)或Hemocoagulase(参见Handb Exp.Pharm.52Snake Venom and Blood Coagulation 1991，Reprinted by SigmaChemical Company)是由从巴西矛头蝮蛇(Bothrops atrox)中提取的类凝血酶(巴曲酶)制成的止血药物制剂。
国内有立止血仿制品—巴曲亭，也是从巴西矛头蝮蛇中提取的类凝血酶(巴曲酶)成份制成的酶类止血药。
国内也有将凝血因子X活化酶用作诊断的蝰蛇蛇毒试剂盒，用来诊断血浆中凝血因子X是否缺乏。2000年4月5日公开的中国专利，申请专利号是CN1249338A，题目：一种高效提取凝血因子X活化酶的方法。纯化后的RVV-X主要用于肿瘤迁移机理等科研领域的研究。
另一相关专利是2004年8月18日公开的中国专利，其申请专利号是CN1520880A，题目：一种止血药。首次将来源于Vipera russelli(或Daboiarusselli)RVV-X作为止血药的主要成份，并将蛇毒类凝血酶作为协同剂。众所周知，RVV-X是金属蛋白酶，其分子量为92880D，由分子量57600D的重链和分子量分别为16400D、19400D两条轻链通过二硫键组成。它是凝血研究外源激活剂最好的例子。
事实上，作为大分子量蛋白药物，对人体很容易引起不良的免疫应答反应，如：发热反应，产生抗体，形成份子量较大免疫复合物，对肾小球造成一定损伤，从而限制了其使用剂量。
发明内容：
本发明的目的是提供一种原于蛇毒的复方止血药，该止血药可以在保证疗效的同时，尽量降低蛋白酶的用量，从而减少了发生不良免疫应答反应几率。
本发明提供了一种原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：所述药物的主活性成份为纯度大于97％的类凝血酶和凝血因子X激活剂，类凝血酶和凝血因子X激活剂的活性比例范围为1∶1～1000∶1。较佳的活性比例范围是20∶1～500∶1。
本发明原于蛇毒的复方止血药中，所述的类凝血酶是巴西矛头蝮蛇、白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇蛇毒中含有的类凝血酶，或者是通过基因工程获得的重组巴西矛头蝮蛇、白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇的类凝血酶。
本发明原于蛇毒的复方止血药中，所述的凝血因子X激活剂是巴西矛头蝮蛇蛇毒中含有的凝血因子X激活剂FXA、或基因工程重组FXA；或者是来源于蝮蛇Vipera russelli或Daboia russelli的凝血因子X成份，或其基因工程重组产物。
本发明原于蛇毒的复方止血药中，最佳的选择为，类凝血酶是巴西矛头蝮蛇的类凝血酶——巴曲酶，凝血因子X激活剂是巴西矛头蝮蛇蛇毒中含有的凝血因子X激活剂FXA，其中还可以含有氨基酸成份作为蛋白酶保护剂，氨基酸首选为甘氨酸，可以以甘露醇为赋形剂，其中类凝血酶+凝血因子X激活剂∶甘氨酸∶甘露醇的量为20～0.1∶1～0.01∶0.02～0.06单位∶克∶克。
本发明原于蛇毒的复方止血药中，其凝血因子X激活剂的分离纯化方法是采用DEAE-Fast Flow系列阴离子交换树脂和Sephacryl系列分子筛柱分离实现的。它的活力鉴定及检测是通过所谓的生色底物法实现的。
本发明与现有技术相比主要有以下不同。首先是主要药效成份来源不同。考虑到凝血因子X激活剂的分子量较大，不适合作为药物的主要药效成份，所以本发明所阐述的止血药是从巴西矛头蝮蛇蛇毒中提取的类凝血酶或基因工程重组巴曲酶作为止血药的主要成份，其药效显著，已经临床应用，而凝血因子X激活剂作为协同剂是从巴西矛头蝮蛇蛇毒中提取的或通过基因工程获得。其次是两者的配比完全不同，而且止血活性比前者更强。再次，两者的应用剂量不同，由于止血活性比前者更强，因此，所用剂量较前者低，但止血效果却优于前者。最后是制剂配方不同，本止血药的制剂配方含有蛋白酶保护剂甘氨酸和赋形剂甘露醇。
具体实施方式：
1、凝血因子X激活剂的分离纯化方法
称取巴西矛头蝮蛇蛇毒溶于10mM Tris-HCl，pH7.5(含50mM NaCl)，并透析，离心，取上清上阴离子交换柱DEAE-cellulose层析，用上述缓冲液0.05-0.3M NaCl进行梯度洗脱，收集活性峰。活性峰直接上到用相同缓冲液(含75mMNaCl)平衡的Sephadex G-150层析柱层析，并收集活性峰，然后再上DEAE-cellulose柱层析。收集活性峰，冻干，于-20℃条件下保存。产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，其分子量为75000D，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证实，它是由分子量为59000D的重链和分子量为14000-15000D的轻链通过二硫键结合组成的。与文献报道一致(Hofmann等，1987 Biochemistry，26，780)。
2、凝血因子X激活剂的鉴别方法(生色底物法)
凝血因子X激活剂能作用于凝血因子X，后者释放的Xa可作于S-2222或S-2337等生色底物产生p-nitroaniline，通过在405nm波长下检测吸光度值的变化，来实现对凝血因子X激活剂的鉴别及活力测定。
3、凝血因子X激活剂的单位定义
在如下体系中，于405nm波长处检测光吸收值并记录10分钟内光吸收值的变化。
体系：
①缓冲液1(50mmol/L Tris-HCL pH＝7.5，150mmol/L NaCl，2.5mmol/L CaCl2，(含1mmol/L Benzamidine hydrochioride)——100μl；
②0.5unit/ml的FX——50μl；
③待测样品——50μl；
充分混合后于37℃保温10分钟；
④缓冲液2(200mmol/L Tris-HCL pH＝8.3，150mmol/L NaCl，10mmol/LEGTA)——250μl；
充分混匀；
⑤2.5mmol/ml S-2337——50μl；
迅速混均后测定10分钟内光吸收值的变化。
定义在上述体系下光吸收值变化为0.02±0.005的凝血因子X激活剂的活力为1单位。
同时，凝血因子X激活剂也可采用体外凝血试验方法进行活力检测。
4、体外凝血试验
采用同类产品活性的测定方法进行体外凝血试验，具体实验方法为：取人—枸橼酸抗凝血浆0.2ml，加入直径1cm的试管中，置37℃水浴中保温3分钟，加入37℃预热的样品溶液0.2ml，立即混匀计时，于40秒开始，检查血浆凝固情况，记录初凝时间，同时测定3管，3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒，则适当稀释供试品溶液，记录60±20秒内凝固的供试品溶液浓度，在上述条件下，能使0.2ml人—枸橼酸抗凝血浆在60秒凝固的酶量，定义为一个单位。
5、体内促凝活性检验
体内凝血试验采用小鼠断尾法。将凝血因子X激活剂和类凝血酶分别配制成适当浓度的溶液作为供试品溶液。
取健康小鼠，随机分为7组，每组5只，按表中剂量小鼠尾静脉注射0.5ml，并于注射后15分钟时，用剪刀在距小鼠尾尖0.3cm处剪断，血液自行流出后立即计时，到血液凝固停止计时。以出血时间缩短作为判断止血效果的指标。同时用生理盐水作为阴性对照。
6、制剂处方筛选
本发明还提供了具有稳定作用的止血药物的制剂处方，该药物含有类凝血酶、FXA、赋形剂—甘露醇、和蛋白酶保护剂—甘氨酸。
实施例1凝血因子X激活剂(FXA)体外凝血试验
采用同类产品活性的测定方法进行体外凝血试验，具体实验方法为：取人—枸橼酸抗凝血浆0.2ml，加入直径1cm的试管中，置37℃水浴中保温3分钟，加入37℃预热的样品溶液0.2ml，立即混匀计时，于40秒开始，检查血浆凝固情况，记录初凝时间，同时测定3管，3管初凝时间误差应小于20秒。若初凝时间小于40秒，则适当稀释供试品溶液，记录60±20秒内凝固的供试品溶液浓度，在上述条件下，能使0.2ml人—枸橼酸抗凝血浆在60秒凝固的酶量，定义为一个单位。计算效价，记录试验结果。
表1凝血因子X激活剂(FXA)体外凝血试验结果
实验次数 样品稀释倍数                 凝固时间
  1   2   3   平均时间
  1   100   12   12   12   12
  2   300   25   26   25   25.3
  3   400   50   51   49   50
4 450 56 58 57 57
  5   500   60   60   60   60
  6   550   63   64   64   63.6
  7   800   86   85   85   85.3
本试验确定本品的活力为：500u/ml。
表2类凝血酶(巴曲酶)体外凝血试验结果
实验次数 样品稀释倍数              凝固时间(秒)
  1   2   3   平均时间
  1   100   7   7   7   7
  2   500   25   25   25   25
  3   1000   60   60   60   60
  4   950   58   57   57   57.3
  5   1050   64   64   64   64
  6   1200   84   85   83   84
本试验确定本品的活力为：1000u/ml
实施例2类凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活剂协同体外凝血试验
用浓度为500u/ml的类凝血酶(巴曲酶)和浓度为500u/ml凝血因子X激活剂按下表所需配比进行配制供试品溶液，保证终溶液的活力理论值为：500u/ml。阳性对照1为1单位的类凝血酶(巴曲酶)，阳性对照2为1单位的凝血因子X激活剂，阴性对照为生理盐水。
表3类凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活剂协同体外凝血试验结果
实验次数 稀释倍数 样品配比系数               凝固时间(秒)
  1   2   3   平均时间
  阳性对照1   ——   ——   61   60   59   60
  阳性对照2   ——   ——   60   60   60   60
  1   500   1∶1   60   59   58   59
  2   500   10∶1   57   56   56   57.3
  3   500   100∶1   50   52   52   51.3
  4   500   500∶1   53   54   52   53
  5   500   1000∶1   56   58   55   56.3
  6   500   1100∶1   61   62   66   63
  7   500   1200∶1   63   63   64   63.3
  8   500   1300∶1   63   64   61   63.2
  阴性对照   64   64   63   63.7
实施例3类凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活剂单独以及协同体内止血试验
按照临床研究指导原则，体内凝血试验采用小鼠断尾法。结合类凝血酶(巴曲酶)临床用量情况我们选择：20～0.1单位/60kg这一范围分别对类凝血酶(巴曲酶)和凝血因子X激活剂选择四个点作小鼠的体内凝血试验，小鼠按人的用药剂量作相应的调整，依照相关的比例调整后的用药剂量为8～0.04u/kg。
具体方法如下：取凝血因子X激活剂和类凝血酶(巴曲酶)分别配置适当浓度的溶液作为供试品溶液。
取健康小鼠，随机分为7组，每组5只，按表中剂量小鼠尾静脉注射0.5ml，并于注射后15分钟时，用剪刀在距小鼠尾尖0.3cm处剪断，血液自行流出后立即计时，到血液凝固停止计时。以出血时间缩短作为判断止血效果的指标。同时用生理盐水作为阴性对照，用立止血阳性作为阳性对照。结果见下表
注：“-”为缩短出血时间，“+”为延长出血时间。
表3类凝血酶(巴曲酶)体内凝血试验结果
  剂量   小鼠编号   平均值
  小鼠   1   2   3   4   5
  出血时间(秒) 8u/kg 183 181 179 182 175 180
  4u/kg   165   175   176   169   164   169.8
  0.4u/kg   177   169   165   172   175   171.2
  0.04u/kg   190   180   185   195   192   188.4
表4凝血因子X激活剂体内凝血试验结果
  剂量                小鼠编号   平均值
  小鼠   1   2   3   4   5
  出血时间(秒)   8u/kg   180   175   183   185   180   180.6
  4u/kg   176   169   165   178   175   172.6
  0.4u/kg   174   178   165   170   178   173
  0.04u/kg   190   195   193   186   193   191.4
以临床常规用量1u为基础，取凝血因子X激活剂和类凝血酶(巴曲酶)分别配置适当浓度的溶液作为供试品溶液。进行协同体内止血的试验。阳性对照品为立止血，阴性对照为生理盐水。其结果见下表：
表7类凝血酶(巴曲酶)(A)和凝血因子X激活剂(B)协同体内止血试验结果(剂量为0.4u/kg)
  实验次数   样品配置比例A∶B                             凝固时间(秒)
1 2 3 4 5 平均值
  阳性对照   1   185.4   189.7   190.1   185   190.8   190.4
  1   1∶1   172   175   183   184   186   180
  2   10∶1   169.9   170.8   178   179.8   180.5   175.8
  3   20∶1   149   155   156   158   162   156
  4   100∶1   129.5   131   135.5   139   141   135.2
  5   500∶1   145   148.5   159   161   162.5   155.2
  6   600∶1   170   171.5   175   183   187.5   177.4
  7   1000∶1   169   178   180   185   186   179.6
  阴性对照   277   281   285   287   288   283.6
试验结果表明：当类凝血酶和凝血因子X激活剂被制成组合给药制剂时，类凝血酶的止血作用得到了协同，止血作用得到明显提高。可以明显地看出：类凝血酶与凝血因子X激活剂的止血作用应用剂量范围比为1∶1～1000∶1，其中最优应用剂量范围活性比为20∶1～500∶1。同立止血相比，其止血作用更明显。
实施例4白眉蝮蛇类凝血酶和凝血因子X激活剂协同体内止血试验
按实施例3的实验方法进行。结果见表8
表8白眉蝮蛇类凝血酶(A)和凝血因子X激活剂(B)体内协同止血试验结果(剂量为0.4u/kg)
  实验次数   样品配置比例A∶B                           凝固时间(秒)
1 2 3 4 5 平均值
  阳性对照   1   188   185   194   192   189   189.6
  1   10∶1   180   179   176   183   179   179.4
  2   20∶1   165   162   166   168   160   164.2
  3   100∶1   138   135   140   144   138   139.0
  4   500∶1   158   160   155   159   162   158.8
  阴性对照   281   283   279   292   280   283.0
试验结果表明，白眉蝮蛇类凝血酶和凝血因子X激活剂同样在20∶1～500∶1范围内具有协同止血作用。
实施例5白眉蝮蛇类凝血酶和凝血因子RVV-X协同体内止血试验
按实施例3的实验方法进行。结果见表9。
表9白眉蝮蛇类凝血酶(A)和凝血因子RVV-X(B)协同体内止血试验结果(剂量为0.4u/kg)
  实验次数   样品配置比例A∶B                         凝固时间(秒)
1 2 3 4 5 平均值
  阳性对照   1   194   189   188   190   193   190.8
  1   10∶1   180   182   178   181   180   180.2
  2   20∶1   160   162   160   165   163   162.0
  3   100∶1   133   135   135   139   134   135.2
  4   500∶1   162   160   163   158   155   159.6
  阴性对照   288   285   282   282   286   284.6
试验结果表明，白眉蝮蛇类凝血酶和凝血因子RVV-X也同样在20∶1～500∶1范围内具有协同止血作用。
实施例6尖吻蝮蛇类凝血酶和凝血因子X激活剂体内止血试验
按实施例3的实验方法进行。结果见表10。
表10尖吻蝮蛇类凝血酶(A)和凝血因子X激活剂(B)体内止血试验(剂量为0.4u/kg)
  实验次数   样品配置比例A∶B                         凝固时间(秒)
1 2 3 4 5 平均值
  阳性对照   1   185   188   186   184   190   186.6
  1   10∶1   177   179   182   179   180   179.4
  2   20∶1   165   163   169   166   163   165.2
  3   100∶1   140   144   141   138   140   140.6
  4   500∶1   163   160   154   159   160   159.2
  阴性对照   277   270   274   280   273   274.8
试验结果表明，尖吻蝮蛇类凝血酶和凝血因子X激活剂同样在20∶1～500∶1范围内具有协同止血作用。
实施例7尖吻蝮蛇类凝血酶和凝血因子RVV-X协同体内止血试验
按实施例3的实验方法进行。结果见表9
见表9  尖吻蝮蛇类凝血酶(A)和凝血因子RVV-X(B)体内止血试验(剂量为0.4u/kg)
  实验次数   样品配置比例A∶B                        凝固时间(秒)
1 2 3 4 5 平均值
阳性对照 1 188 184 182 187 185 185.2
  1   10∶1   180   185   187   184   181   179.4
  2   20∶1   165   163   169   166   163   165.2
  3   100∶1   132   130   134   133   140   134.4
  4   500∶1   160   168   166   158   165   163.4
  阴性对照   280   279   282   284   282   281.4
试验结果表明，白眉蝮蛇类凝血酶和凝血因子RVV-X同样在20∶1～500∶1范围内具有协同止血作用。
实施例8稳定止血药制剂处方试验
按照下表进行配比试验。
表11处方试验筛选结果
  处方组成   每毫升含量   处方1   处方2   处方3
  血凝酶   1.0U   +   +   +
  凝血因子X激活剂   0.002U   +   +   +
  甘氨酸混合物   6mg   +   -   -
  甘氨酸混合物   8mg   -   +   -
  甘氨酸混合物   10mg   -   -   -
  甘露醇   50mg   +   +   +
  冻干前凝固时间(秒)   50   50   50
  冻干后30天凝固时间(秒)   63   52   80
  增加的凝固时间(秒)   13   2   30
从表中数据可以看出，当加入甘氨酸后制剂的酶活性比没加入的要稳定，其中处方2的活性变化最小，即处方2最稳定，从而确定以甘氨酸为稳定剂，并且其含量优选为8mg/ml。

Claims (10)

1、一种原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：所述药物的主活性成份为纯度大于97％的类凝血酶和凝血因子X激活剂，类凝血酶和凝血因子X激活剂的活性比例范围为1∶1～1000∶1。
2、按照权利要求1所述原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：类凝血酶和凝血因子X激活剂的优选活性比例范围为20∶1～500∶1。
3、按照权利要求1所述原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：所述的类凝血酶是巴西矛头蝮蛇、白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇蛇毒中含有的类凝血酶，或者是通过基因工程获得的重组巴西矛头蝮蛇、白眉蝮蛇或尖吻蝮蛇的类凝血酶。
4、按照权利要求1所述原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：所述的凝血因子X激活剂是巴西矛头蝮蛇蛇毒中含有的凝血因子X激活剂FXA、或基因工程重组FXA；或者是来源于蝮蛇Vipera russelli或Daboia russelli的凝血因子X激活剂成份，或其基因工程重组产物。
5、按照权利要求1所述原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：所述的类凝血酶是巴西矛头蝮蛇的类凝血酶——巴曲酶，凝血因子X激活剂是巴西矛头蝮蛇蛇毒中含有的凝血因子X激活剂FXA，其中还含有氨基酸成份。
6、按照权利要求5所述原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：所述氨基酸为甘氨酸。
7、按照权利要求6所述原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：以甘露醇为赋形剂。
8、按照权利要求7所述原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：类凝血酶+凝血因子X激活剂∶甘氨酸∶甘露醇的量为20～0.1∶1～0.01∶0.02～0.06单位：克∶克。
9、按照权利要求1所述原于蛇毒的复方止血药，其特征在于：其凝血因子X激活剂的分离纯化方法是采用DEAE-Fast Flow系列阴离子交换树脂和Sephacryl系列分子筛柱分离实现的。它的活力鉴定及检测是通过所谓的生色底物法实现的。
10、权利要求1所述药物在制备止血性药物中的应用。
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