CN1039231C - 因子vii的纯化 - Google Patents

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Abstract

在通过一些色谱的纯化步骤的纯化过程中FVII的活化和降解用于至少在一个纯化步骤中有Zn艹存在受到控制。

Description

因子VII的纯化
本发明涉及因子VII的可控活化和降解的方法。
凝血因子VII(FVII)是一种依赖于维生素K的丝氨酸蛋白酶，在血液凝固的外在途径中起重要作用。它在肝脏中合成并与分泌到血液中，以一种分子量大约50,000的单链糖蛋白(酶原)形式在血液中循环。该蛋白酶以其活化的形式，FVIIa催化活化另两个依赖于维生素K的丝氨酸蛋白酶家族的凝血因子，因子IX(FIX)和因子X(FX)。
活化的FX(FXa)接着将凝血酶原转化成凝血酶，凝血酶接着将纤维蛋白原转化成血块中的主要组分，纤维蛋白。
因子VII能够从血浆中纯化和用Broze和Majerus，J.Biol.Chem.255(4)(1980)1242-1247和Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.71(1983)1836-1841所述的方法活化成因子VIIa。
因子VIIa也可用DNA重组技术如下制得：在适当的培养基中培养用编码因子VII的DNA序列转染的哺乳动物细胞，分离产生的蛋白和将所说的蛋白活化成因子VIIa(参见欧洲专利申请书第/86302855，1号)。
因子VIIa可以被用于治疗已经产生因子VII抑制剂的病人(Hedner，U.and Kisiel，W，J.Clin.Invest.71(1983)1836-1841)和用于治疗患出血疾病如血小板紊乱包括血小板减少症、Von Willebrand’s症和其它与严重的组织损伤相关的其它典型病症(欧洲专利申请第86309.97.1号)
在血浆衍生的牛蛋白(Redcliffe & Nermerson，J.Biol.Chem.250(1975)338-395)和人重组蛋白(Thim等人Birochemistry 27(1988)7785-7793)的纯化过程中通过Arg
152-Ile153键的水解，FVII被活化成双链形式。通过吸附于阴离子交换剂(二乙基氨基乙基或三甲基氨基乙基改性的聚合性凝胶基质)上(A.H.Pedersen等人Biochemistry 28(1989)，9331-9336)FVII的活化被大大地增强了。FVII活化被增强的机理是未知的。除了活化外，一部分FVIIa分子主要在290和/或315位置上通过自身降解而被裂解(E.M.Nicolaisen等人FEBS＜ett.317(1993)245-249)。这样的降解产物是无活化的分子，它们在FVIIa制剂中的存在会导致最终制剂产物较低的比活性。此外，从一批到另一批降解产物的数量和性质是可变的，因而得到的制剂中生物学活性因子VIIa的含量也是可变的。最终制剂中的降解产物的含量可以触发病人的免疫系统。再次给药可能导致过敏反应，在严重情况下可以变为致死病程。病人也可能产生高滴度的抗因子VIIa的抗体，使随后的治疗变得困难或无效。
为了制备具有较低含量的降解产物的纯化的FVIIa产物，在纯化过程和随后的加工过程中有必要控制活化和阻止降解。与FVIIa相反，单链形式FVII，在重链中可抵抗或更小倾向于裂解，因此这可能是以单链形式纯化FVII的一个有利条件。
因此本发明的目的是提供一种FVII的纯化方法，用这种方法活化和降解可被避免或保持在可接受的较低程度，以提供一种高纯度的均相产物，然后该产物可在另外的步骤中比较高的产率被活化成FVIIa以产生具有较高比活性的单一的和均相的产物。
已知锌离子可抑制重组FVIIa的酰胺分解和蛋白分解的活性(Pedersen.A.H.等人Thrombosis and Haemostasis，65(1991)528-534)。现以惊人地发现在通过色谱柱材料的纯化过程中锌离子的加入可被用来控制FVII的自活化和阻止FVII/FVIIa的降解。
本发明最宽的方面是涉及一种在纯化过程中FVII的可控活化和降解的方法，借此对因子VII的溶液进行一些色谱纯化步骤，在这些纯化步骤中至少一步存在有Zn++。
本发明较窄的方面是涉及一种FVII的可控活化和降解的方法，其中FVH的溶液被施加到一些阴离子交换和免疫亲合柱上。
在本发明的优选实施方案中FVII溶液以下列次序被施加到色谱柱上：1)阴离子交换；2)免疫亲合；3)阴离子交换；4)阴离子交换柱，其中Zn++至少存在于前两步中。
图1说明了当改变Zn++浓度时在有阴离子交换柱存在下FVII的活化。
图2说明了在纯化步骤的一步或多步的缓冲溶液中包括有Zn++的纯化方案中rFVII活化成rFVIIa。
方案A到E的条件在表1中给出，结果列于表2。
图3说明了在纯化步骤中的一步或多步的缓冲溶液中包括有Zn++的纯化方案中FVIIa的降解。
方案A到E的条件在表1中给出，结果列于表2。
在阐述本发明之前，提出在下文中所用的某些术语的定义对理解本发明可能是有帮助的：
FVII：FVII包括从血浆中分离的或用DNA重组技术制备的FVII，也包括在不同的个体中可能存在和出现的等位基因的变体和因氨基酸残基的缺失和/或取代而修饰的FVII蛋白，它们通过活化对于血液凝固具有与内源性人FVIIa相同或基本上相同的生物学活性。
“FVII”在上述定义范围内也包括当用DNA重组技术表达时具有糖基化程度和部位变化和/或其它根据选定的宿主细胞和培养条件转译后修饰的FVII蛋白。
FVIIa生物学活性：FVIIa生物学活性的特征在于经外在途径调解血液凝固。
FVIIa活化FX或为FXa，FXa又将凝血酶原转化成凝血酶，由此引发形成纤维蛋白血块。
可控活化和降解：这一表达包括这样一个过程，即在纯化过程中FVII的活化和降解是根据给定参数的有意识被控制的变化进行的(此时有Zn++存在)。
在Zn++不存在时，纯化的工艺参数不得不被调整到同时发生活化和降解反应，在Zn++存在时，已证明有可能控制这些反应，使得独立地使纯化和活化尽可能完善成为可能。
人FVII优选地按欧洲专利申请第86302855.1号中所叙述的在转染的哺乳动物的幼苍鼠肾(BHK)细胞中表达。在色谱纯化前用离心法和过滤法从细胞中分离出含有FVII和细胞增长刺激蛋白的培养基。
为了纯化的目的FVII被吸附于不同类型的色谱基质上如：阳离子交换剂，阴离子交换剂，免疫亲合基质、金属离子螯合剂，染料亲合基质，疏水作用基质和具有固定化了的生物特异性配体的亲合基质。FVII吸附于不同基质上的机理是不同的，因此Zn++对FVII活化的影响可能不同，但是在吸附于不同类型的色谱基质过程中仍是显著的。
锌盐可以被加入到一种或几种洗脱溶液和用于平衡和洗脱的缓冲溶液中，锌盐可以是任何可溶性锌盐如乙酸锌、柠檬酸锌、氯化锌或硫酸锌。
Zn++浓度可以在10μM至1mM间变化和优选地是在大约20μM至大约1mM，更好地是在大约40μM至大约1mM间。
随后按照Hedner和Kiesel(J.Clin.INvest.71(1983)1836-1841)所述使用FXIIa或用其他具有胰蛋白酶样特异性的蛋白酶可实现纯化FVII活化成FVIIa。可选择地，FVII可以在有聚合的大分子如聚赖氨酸、基质结构、取代的琼脂糖凝胶或膜存在下被活化。
通过下列四个连续的色谱步骤来施行将rFVII纯化和活化成rFVIIa的纯化方案：第1步阴离子交换；第2步免疫亲合色谱；第3步阴离子交换；第4步阴离子交换。
实施纯化方案的一个实验系列，其中一些方案包括向在表1中所概括的一步或多步的色谱步骤的所有缓冲溶液中加入锌盐。
实验条件在实施例2～4中给出。
参此实验(E)按照实施例2施行，但未加入Zn(CH3COO)2。
                表    1
纯化方案          色谱步骤
  1   2   3   4
    A   -   +   +   +
    B   -   +   +   -
    C   -   +   -   -
    E(参比)   -   -   -   -
+/-表示在缓冲溶液中存在或不存在锌盐
测定每步洗脱物中FVII活化的程度(90FVII)和FVIIa降解产物的含量。FVII向双链FVIIa形式的转化用标准的聚丙烯酰胺电泳(PAGE)在十二烷基硫酸钠(SDS)中在减压条件下与考马斯蓝染色相结合并用激光密度计量法定量化来测量。
FVIIa降解产物的含量用反相高效液相色谱(RP-HPLC)在丁基键合的硅胶柱上以线性乙腈梯度来定量。
基本上按照实施例所述实施的实验的结果列于表2并用图2和图3表示。从图2中明显地看出在有锌离子存在时(线A、B和C)在免疫亲合步骤(第2步)和阴离子交换步骤(第3步和第4步)(线A和B)中没有或非常有限的rFVII活化发生。
与此相反，在不存在锌离子时在第2步(线E)和在第3和第4步(线B、C和E)中发生了大范围的活化。
也很明显，锌离子与FVII/FVIIa相互作用引起的对FVII活化的抑制效应具有可逆的性质；由于通过与过量的EDFA配合除去锌离子后，在随后的纯化步骤(线B和C)中FVII被活化。
在第一步中很显然在不存在锌离子时没有活化发生，这可能是由于柱上FVH的浓度太低。
第一步的洗脱物，它被用于全部实验中，含有少于1％的FVIIa。
                 表    2
 实验  纯化步骤    Zn++   ％FVII(SDS-PAGE)  降解的％F VIIa(RP-HPLC)
A+B 2 + 94 0
3 + 92 0
  A     4     +     89     ＜2
  B     4     -     18     3.6
C     2     +     99     ＜2
    3     -     69     ＜2
    4     -     2     5.0
E     2     -     46     3.9
    3     -     19     4.6
    4     -     4     8.0
实施例1
结合于阴离子交换剂上时FVII活化的抑制作用
Zn++对FVII活化的影响用一个实验来测试，在该实验中在不同浓度的Zn++存在下纯化过的FVII被吸附于Q-SepharoseFF基质上。在1.5ml的试管中将500μgFVII与50μlQ-SepharoseFF在800μl缓冲溶液：10mM Tris，50mMNaCl，2mMCaCl2和不同浓度的乙酸锌中一起保温。1小时和2小时后用离心法使基质沉降并除去上清液，加入800μl 10mM Tris，50mMNaCl，25mMCaCl2PH8的缓冲溶液，混合和离心后取上清液的样品用SDS-PAGE分析FVII/FVIIa。
结果(图1)表明在Zn++不存在时，在1小时内55％的FVII被活化成FVIIa，在2小时后超过90％的FVII被活化成FVIIa。
在有10μM Zn++存在时，1小时后只有25％被活化，2小时后只有73％被活化。
在有超过40μM浓度的Zn++存在时在2小时内没有活化发生。
从该实验清楚地看到在阴离子交换剂存在下大约10μM至大约100μM浓度范围的Zn++对于FVII的活化具有抑制作用，可以设想在低于10μM至1mM的整个Zn++的全部浓度范围中Zn++对于FVII的活化都有影响。
看起来通过改变Zn++浓度有可能控制FVII的活化速率常数并且在高Zn++浓度下基本上可“保护”FVII不被活化和因此不被降解。
                  实施例2
rFVII的纯化和活化成rFVIIa通过下列四个色谱步骤进行：
第1步：
通过稀释将含有rFVII的细胞培养基调整至离子强度低于10MS/cm并施加到用缓冲溶液A：10mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)；150mMNaCl PH8预平衡的Q-Sepharose柱上。
用在同样缓冲溶液中的175mMNaCl洗涤后用缓冲溶液B：10mMTris；150mMNaCl；25mMCaCl2 PH8洗脱rFVII。
第2步：
将含有104mg/L rFVII的洗脱溶液调整到最终组成：10mMTris；1M NaCl；25mM CaCl2；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5并施用到具有固定化的抗FVII单克隆抗体的Sepharose柱上。
抗体柱用缓冲溶液C：10mMTris；10mM NaCl；20mMCaCl2；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5预平衡，然后用10mMTris；2M NaCl；20mM CaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5冲洗柱子，接着用缓冲溶液C冲洗。此后用一种缓冲溶液：75mMTris30mM柠檬酸三钠；70μMZn(CH3COO)27.5洗脱rFVII/rFVIIa。
第3步：
将洗脱液立即施加到用缓冲溶液：10mMTris；150mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6预平衡的Q-Sepharose柱上。
用相同的缓冲溶液洗涤此柱并以线性梯度从缓冲溶液A至缓冲溶液D：10mMTris；500mM NaCl；70μM Zn(CH3COO)2PH8.6洗脱rFVH/rFVIIa。
第4步：
通过稀释将含有rFVII/rFVIIa的部分调整至离子强度低于10mS/cm并立即施加到用缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸；150mM NaCl；70μM Zn(CH3COO)2，PH8.6预平衡的Q-Sepharose柱上。
用缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸；175mM NaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6；和缓冲溶液E：10mM甘氨酰甘氨酸；100mM NaCl；70μM Zn(CH3COO)2PH8.6洗涤后，以线性梯度从缓冲溶液E至缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸；100mM NaCl；15mMCaCl2；70μM Zn(CH3COO)2PH8.6将rFVII/rFVIIa洗脱。流速是1体积/小时。
纯化的rFVIIa制剂具有下列特征：rFVIIa含量：345mg/l用UV光谱测得(OD280)；外来蛋白质含量：＜1％(用RP-HPLC测得)rFVII含量：89％(用SDS-PAGE测得)rFVIIa降解产物含量：＜2％(用RP-HPLC测得)
实施例3
FVII的纯化和活化成FVIIa通过下列四个色谱步骤进行：
第1步：
通过稀释将含有rFVH的细胞培养基调整到离子强度低于10mS/cm并施加到用缓冲溶液A：10mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)；150mM NaClPH8预平衡的Q-Sepharose柱上。
用在同样缓冲溶液中的175mM NaCl洗涤后用缓冲溶液B：10mMTris；150mM NaCl；25mM CaCl2PH8洗脱rFVII。
第2步：
将含有104mg/l rFVII的洗脱溶液调整到最终组成：10mMTris；1MNaCl；25mMCaCl2；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5并施加到具有固定化了的抗FVII单克隆抗体的Sepharose柱上。
抗体柱用缓冲溶液C：10mMTris；100mM NaCl；20mMCaCl2；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5预平衡，然后用10mMTris；2M NaCl；20mMCaCl2；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5洗涤此柱，接着用缓冲溶液C洗涤。此后用一种缓冲溶液：75mM Tris；30mM柠檬酸三钠；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5洗脱rFVII/rFVIIa。
第3步：
将洗脱液立即施加到用缓冲溶液：10mMTris；150mMNaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6预平衡的Q-Sepharose柱上。
用相同的缓冲溶液洗涤此柱并以线性梯度从缓冲溶液A至缓冲溶液D：10mM Tris；500mM NaCl；70μMZn(CH3COO)2PH8.6洗脱rFVII/rFVIIa。
第4步：
将含有rFVII/rFVIIA的部分调整至2mM乙二胺四乙酸(EDFA)并通过稀释将离子强度调整至低于10mS/cm，将其立即施加到用缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸；150mM NaCl PH8.6预平衡的Q-Sepharose柱上。
用缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸；175mM NaClPH8.6和缓冲溶液E：10mM甘氨酰甘氨酸；100mM NaCl PH8.6洗涤后，以线性梯度从缓冲溶液E至缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸；100mM NaCl；15mM CaCl2PH8.6洗脱rFVII/rFVIIa。流速是1体积/小时。
纯化过的rFVIIa制剂具有下列特征：rFVHa含量：492mg/l，用UV光谱测得(VD280)；外来蛋白质含量：＜1％，用RP-HPLC测得；rFVII含量：18％，用SDS-PAGE测得；rFVIIa降解产物含量：3.6％，用RP-HPLC测得。
实施例4
rFVII的纯化和活化成rFVHa通过下列四个色谱步骤进行：
第1步：
通过稀释将含有rFVII的细胞培养基调整至离子强度低于10mS/cm并施加到用缓冲溶液A：10mM三羟基甲基氨基甲烷(Tris)；150mM NaCl.PH8预平衡的Q-Sepharose柱上。
用在同样缓冲溶液中的175mM NaCl洗涤后用缓冲溶液B：10mM Tris；150mM NaCl；25mM CaCl2 PH8洗脱rFVII。
第2步：
将含有104gm/l rFVII的洗脱物溶液调整至最终组成：10mM Tris；1M NaCl；25mM CaCl2；70μMZn(CH3COO)2PH7.5并施加到具有固定化了的抗FVII单克隆抗体的Sepharose柱上。
抗体柱用缓冲溶液C 10mM Tris；100mM NaCl；20mMCaCl2；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5预平衡。然后用10mMTris；2M NaCl；20mMCaCl2；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5洗涤此柱，接着用缓冲溶液C洗涤。此后用缓冲溶液：75mM Tris；30mM柠檬酸三钠；70μM Zn(CH3COO)2PH7.5洗脱rFVII/rFVIIa。
第3步：
将洗脱液调整至2mM EDTA并立即施加到用缓冲溶液：10mM Tris；150mM NaClPH8.6预平衡的Q-Sepharose柱上。
将该柱用相同的缓冲溶液洗涤并以线性梯度从缓冲溶液A至缓冲溶液D：10mM Tris；500mM NaCl PH8.6洗脱rFVII/rFVIIa。
第4步：
通过稀释将含有rFVII/rFVIIa的部分调整至离子强度低于10mS/cm并立即施加到用缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸；150mM NaCl PH8.6预平衡的Q-Sepharose柱上。
用缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸：175mM NaCl PH8.6和缓冲溶液E：10mM甘氨酰甘氨酸：100mM NaCl PH8.6洗涤后，以线性梯度从缓冲溶液E至缓冲溶液：10mM甘氨酰甘氨酸；100mM NaCl；15mM CaCl2 PH8.6洗脱rFVII/rFVIIa。流速是1体积/小时。
纯化过的rFVIIa制剂具有下列特征；rFVIIa含量：1.2mg/ml，用UV光谱测得；外来蛋白质含量：＜1％，用RP-HPLC测得；rFVII含量：1％，用SDS-PAGE测得；rFVIIa降解产物含量：6.7％，用RP-HPLC测得。

Claims (6)

1.一种在因子VII的纯化过程中控制因子VII的活化和降解的方法，借此对因子VII的溶液进行至少两个色谱纯化步骤，其中Zn++以大约10μm至大约1mM的浓度存在于至少一个纯化步骤中。
2.根据权利要求1的方法，其中将因子VII的溶液施加到阴离子交换和/或免疫亲合色谱柱上。
3.根据权利要求1或2的方法，其中Z++以可溶性锌盐的形式存在。
4.根据权利要求1或2的方法，其中Zn++以大约20μm至大约1mM的浓度存在。
5.根据权利要求4的方法，其中Zn++以大约40μm至大约1mm的浓度存在。
6.根据权利要求2的方法，其中FVII的溶液以下列次序施加到色谱柱上：1)阴离子交换；2)免疫亲合；3)阴离子交换；4)阴离子交换柱和其中至少在两步中存在有Zn++。
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