HUT72712A - Purification of factor vii - Google Patents
Purification of factor vii Download PDFInfo
- Publication number
- HUT72712A HUT72712A HU9502846A HU9502846A HUT72712A HU T72712 A HUT72712 A HU T72712A HU 9502846 A HU9502846 A HU 9502846A HU 9502846 A HU9502846 A HU 9502846A HU T72712 A HUT72712 A HU T72712A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- buffer
- fvii
- purification
- nacl
- activation
- Prior art date
Links
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims description 27
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 title claims description 5
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 45
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 35
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 11
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 11
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 claims description 6
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 4
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 74
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 47
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 37
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 26
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 26
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 108010008488 Glycylglycine Proteins 0.000 description 10
- 229940043257 glycylglycine Drugs 0.000 description 10
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 8
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 8
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 7
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 2
- 235000013904 zinc acetate Nutrition 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZXIYZDSEASMXPI-UHFFFAOYSA-N 2-(methylamino)ethane-1,1,1-triol Chemical compound CNCC(O)(O)O ZXIYZDSEASMXPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100027612 Kallikrein-11 Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 208000013544 Platelet disease Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710152431 Trypsin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- -1 diethylaminoethyl groups Chemical group 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- FYFFGSSZFBZTAH-UHFFFAOYSA-N methylaminomethanetriol Chemical compound CNC(O)(O)O FYFFGSSZFBZTAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 229940068953 recombinant fviia Drugs 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000007281 self degradation Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- WGIWBXUNRXCYRA-UHFFFAOYSA-H trizinc;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Zn+2].[Zn+2].[Zn+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O WGIWBXUNRXCYRA-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000004108 vegetable carbon Substances 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000314 zinc acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960001939 zinc chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000011746 zinc citrate Substances 0.000 description 1
- 235000006076 zinc citrate Nutrition 0.000 description 1
- 229940068475 zinc citrate Drugs 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Catalysts (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás tisztítás során VII faktor szabályozott aktiválódására és leí bontására, ahol a VII faktor oldatát egy sor kromatográfiás tisztítási lépésnek vetjük alá.
A találmány szerinti eljárást, az jellemzi, hogy a tisztítási lépések legalább egyikét ++ Y
Zn+_l ionok jelenlétében vég/zHlk.
f
61.289/SZE
S.B.G. & K.
Nemzetközi Szabadalmi Iroda
H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
Λ ί(
VII. Faktor tisztítása
Novo Nordisk A/S, BAGSVAERD, DÁNIA
Feltalálók; JORGENSEN Tony, BALLERUP,
PEDERSEN Andcrs, Hjelholt, LYNGBY.
DÁNIA
A bejelentés napja: 1994. 03. 24.
Elsőbbsége: 1993.03.31.(382/93)
DÁNIA
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/DK94/00122
A nemzetközi közzététel száma: WO 94/22905
A találmány tárgya eljárás VII. faktor szabályozott aktiválására és lebontására.
A VII. véralvadási faktor (FVII) K-\ i tűm in-függő szerin-proteáz, amely kulcsszerepet játszik a véralvadás külső útjában. Ez a májban szintetizálódik és a vérbe választódik ki, ahol • · egyláncú, mintegy 50000 molekulatömegü glikoproteinként (zimogén) kering. Aktivált, FVIIa formájában ez a proteáz katalizálja két további, szerin-proteáz családba tartozó. K-vitamminfiiggö véralvadási faktor, a IX. faktor (FIX) és a X. faktor (FX) aktiválódását.
Az aktivált FX (FXa) azután a protrombint trombinná alakítja. A trombin pedig a fibrinogént átalakítja fibrinné. a vérrög fő alkatrészévé.
A VII. faktor plazmából tisztítható és Vlla faktorrá alakítható át a Broze és Majerus által leírt [J. Bioi. Chem. 255 (4), 1242-1247 (1980)] és a Hedner és Kisiel által leírt [J. Clin. Invest. 71. 1836/1841 (1983)] eljárásokkal.
A Vlla faktor előállítható rekombináns DNS technikával is olyan módon, hogy a VII. faktort kódoló DNS szekvenciával átfertözött emlős sejteket megfelelő tápközegben tenyésztjük, a termelt fehérjét izoláljuk és az említett fehérjét Vlla faktorrá aktiváljuk (lásd a
86302855.1 számú európai szabadalmi bejelentést.
A Vlla faktor olyan betegek kezelésére alkalmazható, akik a Vili, faktorra inhibitorokat fejlesztettek ki [Hedner U. és Kisiel W.: .1. Clin. Invest. 71, 1836/1841 (1983)]. olyan betegek kezelésére, akik vérzési rendellenességben szenvednek, pl. vérlemezkerendellenességekben, ide értve a trombocitogéniát és a von Willebrand betegséget, valamint más olyan betegségek kezelésére, amelyek tipikusan társulhatnak súlyos szöveti károsodásokkal (86309197.1 számú európai szabadalmi bejelentés).
A plazma-eredetű szarvasmarha fehérje [Radcliffe és Nermersen: J. Bioi. Chem. 250, 338-395 (1975)] és a humán rekombináns fehérje [Thim és munkatársai: Biochemistrv 27, 7785-7793 (1988)] tisztítása során az FV1I az Arg]52-He153 kötés hidrolízisével aktiválódik kétláncú formába. Az FVII aktiválása nagy mértékben fokozódik anioncserélő gyantákon (dietil-amino-etil-csoportokkal vagy trimetil-amino-etil-csoportokkal módosított polimer gél mátrixok) való adszorpcióval. Az a mechanizmus, amely által az FVII aktiválódása fokozódik, nem ismeretes. Az aktiválódáson kívül az FVIIa molekulák egyik frakciója primer módon • · « · hasítódik a 290 és/vagy 315 helyeknél ön-lebomlással [Nicolaisen E.M. és munkatársai: FEBS letters 317. 245-249 (1993)]. Az ilyen lebomlási termékek inaktív molekulák, így jelenlétük a Vlla faktor készítményben a végtermék kisebb fajlagos aktiválását idézi elő. Ezen kívül a lebomlási termékek mennyisége és természete változhat egyik gyártási tételtől a másikig, ez pedig olyan készítményekhez vezet, amelyekben a biológiailag aktív Vlla faktor tartalom változó. A végső készítmény lebomlási termék tartalma beindíthatja a beteg immunrendszerét. Az újabb adagolás azután allergia-reakciókat eredményezhet, amelyek súlyosabb esetben akár halálos kimenetelűek is lehetnek. A betegek ezenkívül magas antitest titert is fejleszthetnek ki a Vlla faktor ellen, nehézzé vagy hatástalanná téve az ezután következő kezeléseket.
Abból a célból, hogy kis lebomlási termék tartalmú tisztított FVlIa terméket állítsunk elő, lényeges, hogy az aktiválást szabályozzuk és meggátoljuk a lebomlást a tsztítási munkamenet és az ezt követő feldolgozás során. Az FVIIa-val ellentétben az egyláncú forma, az FVII. ellenálló, vagy legalábbis kevésbé hajlamos a hasadásra a nehéz láncban. Ennek megfelelően előnyös lehet az FVII-et egyláncú formájában tisztítani.
A jelen találmánynak tehát az a célja, hogy FVU-re olyan tisztítási eljárást nyújtson, amely segítségével az aktiválódás és lebomlás elkerülhető vagy elfogadhatóan alacsony szinten tartható. Ezáltal olyan nagy tisztaságú, homogén terméket kívánunk előállítani, amelyet azután egy további lépésben FVIIa-vá lehet aktiválni magas kitermeléssel. így kapva egységes, homogén és nagy fajlagos aktivitású végterméket.
Ismeretes, hogy a cinkionok gátolják a rekombináns FVlIa amidolitikus és proteoltikus aktiválását [Pedersen A. H. és munkatársai: Thrombosis and Haemostasis 65 (528-534) 1991]. Meglepő módon arra jöttünk rá, hogy cinkionokat lehet alkalmazni az FVII önaktiválódásának szabályozására és az FVII/FVIIa lebomlás gátlására is a kromatográfiás oszlopanyagok segítségével végzett tisztítás során.
A legszélesebb értelmezésében a jelen találmány az FV1I tisztítás közbeni szabályozott aktiválódására és lebomlására szolgáló eljárásra vonatkozik, ahol a VII. faktort egy sor kromatográfiás lépésnek vetjük alá olyan módon, hogy legaalább az egyik tisztítási lépésben Zn++ ionok vannak jelen.
Egy valamivel szükebb értelmezésben a jelen találmány az FVII szabályozott aktiválódására és lebomlására szolgáló eljárásra vonatkozik, ahol az FVII oldatát egy sor aninoncserélö és immunaffinitásos oszlopra visszük fel.
A jelen találmány egyik előnyös kiviteli módjában az FVII oldatot a következő sorrendben visszük fel a kromatográfiás oszlopokra: 1.) anioncserélö: 2.) immunaffinitásos: 3.) anioncserélő; 4.) anioncserélő oszlopok, ahol legalább az első két lépésben Zn++ is van jelen.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a bejelentés ábráit:
Az 1.) ábra az FVII aktiválódását mutatja be anioncserélö oszlopok jelenlétében, változtatva a Zn++ ionok koncentrációját.
A 2.) ábra az rFVII aktiválódását mutatja be rFVIIa-vá a tisztítási munkamenetek során, ahol Zn++ ionok is vannak a pufferekben egy vagy több tisztítási lépésben.
Az A>E munkamenetek körülményeit az 1. táblázatban adjuk meg, míg az eredményeket a 2. táblázat mutatja be.
A 3.) ábra az FVIIa lebomlását szemlélteti a tisztítási munkamenetek során, ahol a pufferekben Zn++ ionok is találhatók - a tisztítási munkamenetek közül egyben vagy többen.
Az A>E munkamenetek körülményeit az 1.) táblázatban adjuk meg. míg az eredményeket a 2. táblázat mutatja be.
Mielőtt a találmányt részletesebben ismertetnénk, a jobb érthetőség kedvéért megadjuk bizonyos, később használandó kifejezések meghatározását.
FVII: Az FVII magában foglalja mind a plazmából izolált, mind a rekombináns DNS technológiával készített termékeket. Ide tartoznak az alléi variánsok is. amelyek létezhetnek önmagukban. de átmehetnek egyik formájukból másik formájukba is. továbbá ide tartoznak az olyan FVII fehérjék is, amelyek aminosav-gvök kihagyásokkal és/vagy helyettesítésekkel vannak módosítva, amennyiben aktiválás után ezek a variánsok a véralvadás szempontjából azonos vagy lényegében azonos biológiai aktivitással bírnak, mint az endogén humán FVIIa.
Az FVII kifejezés a fenti definíción belül magában foglalja azokat az FVII fehérjéket is, amelyekben a glikozilezés és/vagy más. transzláció utáni módosításának mértéke és elhelyezkedése változó a kiválsztott gazdasejtektől és a tenyésztési körülményektől függően, amikor a termék rekombináns DNS technikával fejeződik ki.
FVIIa biológiai aktivitás: Az FVIIa biológiai aktivitást a véralvadásban való közreműködéssel lehet jellemezni a külső út során.
Az FVIIa az FX-et FXa-vci aktiválja, amely viszont a protrombint alakítja át trombinná. ezáltal beindítva a fibrin rög képződését.
Szabályozott aktiválódás és lebomlás: Ez a kifejezés olyan eljárást takar, amelyben az FVII aktiválódása és elbomlása a tisztítás során egy adott paraméter (ez esetben Zn++ ionok jelenléte) megtervezett, ellenőrzött változatai szerint megy végbe.
Zn++ ionok távollétében a tisztítási folyamat paramétereit az együtt lezajló aktiválódás! és lebomlási reakcióhoz kell igazítani. Zn+ ionok jelenlétében viszont úgy kell lehetővé tenni ezeknek a reakcióknak a szabályozását, hogy a tisztítás és az aktiválódás optimalizálása egymástól függetlenül legyen lehetséges.
····· ·· · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · « · ·· · ···· ··
A továbbiakban részletesebben ismertetjük a találmányt.
A humán FVII-et előnyösen átf'ertőzött emlős hörcsögivadék-vese sejtekben [Baby Hamster Kidney (BHK)] fejezzük ki olyan módon, ahogyan ez a 86302855.1 számú európai szabadalmi bejelentésben le van írva. Az FVII-et és a sejtnövekedést stimuláló fehérjéket tartalmazó tenyészközeget a sejtektől centrifugálással és szűréssel különítjük el. mielőtt a kromatográfiás tisztítást elkezdenénk.
Tisztítás céljából az FVII-et különböző típusú kromatográfiás mátrixokra adszorbeáljuk; ilyenek lehetnek a kationcserélők. anioncserélők immunaffínitásos mátrixok, fémionkelátképzök. festékaffínitásos mátrixok, hidrolöb kölcsönhatásos mátrixok, valamint affinitásos mátrixok immobilizált biospecifikus ligandumokkal. Azok a mechanizmusok, amelyekkel az FVII adszorbeálódik a különböző mátrixokhoz, változóak, ennél fogva a Zn++ ionok hatása az FVII aktiválódására eltérő lehet, de mindenképpen jelentős a különböző típusú kromatográfiás mátrixokon történő adszorbeálódás során.
A cinksók egy vagy több olyan elváló oldathoz vagy pufferhez adhatók, amelyeket a kiegyensúlyozáshoz és elváláshoz alkalmazunk. A cinksó lehet bármely oldható cinksó, mint pl. cink-acetát, cink-citrát, cink-klorid vagy cink-szulfát.
A Zn++ ion koncentrációja változhat 10 pmól/l és 1 mmól/1 között, előnyösen mintegy 20 ptmól/l és mintegy 1 mmól/1 között, még előnyösebben mintegy 40 pimól/l és mintegy 1 mmól/1 között.
A tisztított FVII ezt követő aktiválódását FVIIa-vá FXIIa alkalmazásával érhetjük el, amint ezt Hedner és Kiesel leírták [.I. Clin. hívest. 71 1836-1841 (1983)], de elérhetjük más tripszin-szerü fajlagossággal bíró proteázokkal is [Kiesel és Fujikawa: Behring Inst. Mitt. 73 29-42 (1983)]. Egy másik eljárás szerint az FVII aktiválható polimer makromolekulák jelenlétében is, ilyenk lehetnek pl. a polilizin mátrix szerkezetek, helyettesített agaróz gél vagy membránok.
• · · ·
Az alábbiakban a kísérleti eljárásokat ismertetjük.
A tisztítási munkamenetet a tisztításhoz és az rFVIT aktiválódásához rFVIIa-vá az alábbi, egymmást követő kromatográfiás lépésekkel hajtottuk végre: 1.) lépés: anion csere; 2.) lépés: immunaffinitásos kromatográfiai 3.) lépés: anioncsere; 4.) lépés: anioncsere.
A tisztítási munkamenetek kísérletsorozatát végeztük el. amelyekben a munkamenetek egy részében cinksók hozzáadására is megtörtént a kromatográfiás lépések egyikének vagy többjének összes pufferjához. ahogyan ez az 1. táblázatban körvonalazva van.
A kísérleti körülményeket a 2-4. példákban adjuk meg.
A referencia-kísérletet (E.) a 2. példa szerint hajtottuk végre azzal a különbséggel, hogy nem adtunk hozzá Zn(CH3-COO)2*t.
1. táblázat
| TISZTÍTÁSI MUNKAMENET | KROMATOGRÁFIÁS LÉPÉS | |||
| 1 | -> | 4 | ||
| A | - | r | + | + |
| B | - | -r | + | - |
| C | - | + | - | - |
| E (referencia) | - | - | - | - |
| +/- jelzi a cinksók jelenlétét vagy távollétét a pufferok | xtn. |
Az egyes eluciós lépéseket megvizsgáltuk az FVII aktiválódásának mértéke (% FVII) és az FVIIa lebomlási termék tartalomra. Az ÉVII átalakulását a kétláncú FVIIa formává standard poliakrilamid elektroforézissel (PAGE) mértük nátrium-clodecil-szulfátban (SDS) redukáló körülmények között; a festés Coomassie Blue festékkel, a mennyiségi mérés pedig lézer denzitometriával történt.
.· ·· · ··· • ····· « · · β .........
Az FVIIa lebomlási termék tartalom mennyiségi mérése fordított fázisú, nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (RP-HPLC) történt butil-kötésű szilikagél oszlopon, lineáris acetonitril gradienssel.
A lényegében a kiviteli példákban leírt módon végrehajtott kísérletek eredményeit a 2. táblázatban foglaljuk össze, és a 2. és 3. ábrákban ábrázoljuk. A 2. ábránál nyilvánvaló, hogy cinkionok jelenlétében (A,B, és C vonalak) rFVII aktiválódás egyáltalán nem vagy nagyon korlátozott mértékben megy végbe az immunaffinitásos lépés során (2. lépés) és az anioncserélő lépések során (3. és 4. lépés) (A és B vonalak).
Ezzel ellentétben erőteljes aktiválódás megy végbe a 2. lépésben (E vonal) és a 3. és 4. lépésekben (B. C és E vonalak) cinkionok távollétében.
Az is nyilvánvaló, hogy a cinkionok, amelyek az FVII/FVIla átalakulásra, tehát az FVII aktiválódásra gátló hatással bírnak, kölcsönhatása reverzibilis természetű; a ciinkionokat fölös mennyiségű EDTA-val komplex kötésbe vive az FVII aktiválódik az ezután következő tisztítási lépésekben (B és C vonalak).
Az 1. lépésben láthatóan nem történik aktiválódás cinkionok távollétében sem. Ez az FVII sokkal kisebb koncentrációjának tulajdoniiható az oszlopon.
Az 1. lépésbeli eluátum, amelyet minden kísérletben alkalmazunk, kevesebb, mint 1%
FVlIa-t tartalmazott.
2. táblázat
| Kísérlet | Tisztítási lépések | Zn++ | % FVII (SDS- PAGE) | %FVIIa le- bomlott (RP- HPLC) |
| A+B | 2 | + | 94 | 0 |
| + | 92 | 0 | ||
| A | 4 | 89 | <2 | |
| B | 4 | - | 18 | 3.6 |
| C | 2 | 4- | 99 | |
| - | 69 | <2 | ||
| 4 | - | 2 | 5.0 | |
| E | 2 | - | 46 | 3.9 |
| - | 19 | 4.6 | ||
| 4 | - | 4 | <8.0 |
1. példa
Az FVII aktiválódásának gátlása an ioncserélő gyantán való kötődéskor
A Zn++ ionok hatását vizsgáljuk meg az ÉVII aktiválódására egy olyan kísérletben, amelyben tisztított FVII-et adszorbeálunk Q-Sepharose FF mátrixon ZrE^ ionok különböző koncentrációi mellett. 500 pg FVII-et inkubaiunk 1.5 ml-es kémcsövekben 50 μ! Q-Sepharose FF-el 800 pl pufferben (10 mmól/1 trisz, 50 mmól/1 NaCl. 2 mmól/1 CaC'b). és különböző koncentrációban cink-acetáttal. 1 illetve 2 múlva a mátrixot leülepítjük centrifugálással és a felülúszót eltávolítjuk. 800 pl puffért (10 mmól/1 trisz. 50 mmól/1 NaCl. 25 mmól/1 CaCb: pH 8,0) adunk hozzá, majd összekeverés és centrilügálás után a felülúszóból mintákat veszünk és elemezzük FVII/FVIIa-ra SDS-PAGE eljárással.
Az eredmények (1. ábra) azt mutatják, hogy Zn~+ ionok távollétében az FVII 55%-a FVIIa-vá aktiválódik 1 órán belül és több mint 90%-a aktiválódik 2 órán belül.
- 10 ···· · ·· ·· • · · · · • · · · · · · • · ···· . . .
·· · ···· ··
μ.πτόΙ/1 Ζη++ ion jelenlétében csak 25% aktiválódik 1 órán belül és csak 73% aktiválódik 2 órán belül.
pmól/l fölötti Zn++ ion koncentrációk jelenlétében nem történik aktiválódás 2 órán belül.
A kísérletekből nyilvánvaló, hogy a /.r%+ ionoknak mintegy 10 pimól/l koncentrációtartományban gátló hatásuk van az FVI1 aktiválódásra anioncserélök jelenlétében és elképzelhető, hogy a Zn++ ionok az FVI1 aktiválódásra a Zn++ ion összes olyan koncentrációinál hatnak, amelyek a 10 Limól/1 alatti értékektől egészen az 1 mmól/1 értékig terjednek.
Úgy tűnik, hogy a Zn++ koncentrációjának változtatásával lehetséges szabályozni az FV1I aktiválódást sebességi állandóját és nagy Zn++ koncentrációknál lényegében meg lehet védeni az FVII-et az aktiválódástól és ennek következtében a lebomlástól is.
2. példa
Az rFVII tisztítását és aktiválódását rFVIIa-vá az alábbi négy kromatográfiás lépés segítségével hajtjuk végre.
1. lépés:
Az rFVII-et tartalmazó sejttenyésztő tápközeget hígítással beállítjuk 10 mS/cm ionerősség alá és A pufferral [10 mmól/1 trihidro.xi-metil-aniino-metán (trisz); 150 mmól/1 NaCl; pH 8] elő-egvensúlyozott Q-Sepharose oszlopra visszük fel.
Egy mosási lépés után, amelyet csaknem azonos, de 175 mmól/1 NaCl-t tartalmazó pufferral végzünk, rFVII-et B pufferral (10 mmól/1 trisz; 150 mmól/1 NaCl: 25 mmól/1 CaCb; pH 8) eluáljuk.
2. lépés:
Az eluált oldatot, amely 104 mg/1 rFVII-ct tartalmaz, beállítjuk egy végső összetételre: 10 mmól/1 trisz: 1 mól/1 NaCl; 25 mmól/l CaCb: 70 pmól/l Zn(CH'’,C’OO)2- pH 7,5. majd immobilizált anti-FVII monoklonális antitestet tartalmazó Sepharose oszlopra visszük fel.
Az antitest-oszlopot elő-egyen.súlyozzuk C pufferral (10 mmól/1 trisz; 100 mmól/1 NaCl; 20 mmól/1 CaCb: 70 pmól/l Zn(CI-b,COO)2· pH 7,5). Az oszlopot először 10 mmól/1 triszt, 2 mól/1 NaCl-t, 20 mmól/1 CaCb-t és 70 pmól/l Zn/CF^COOb-t (pH 7,5) tartalmazó oldattal, majd C pufferral mossuk. Ezután az rFVII/rFVIIa-t eluáljuk egy puffer (75 mmól/1 trisz; 30 mmól/1 trinátrium-citrát; 70 pmól/l Zn(CI bCOO)2; pH 7.5) felvitelével.
3. lépés:
Az eluátumot azonnal felvisszük Q-Sepharosc oszlopra, amelyet elö-egyensúlyoztunk az alábbi pufferral: 10 mmól/1 trisz; 150 mmól/1 NaCl; 70 pmól/l Zn(CI-b,COO)2: pH 8,6.
Az oszlopot azonos pufferral mossuk és az rFVlI/rFVlla-t A puflertól D pufferig [10 mmól/l trisz: 500 mmól/1 NaCl; 70 pmól/l Zn(CFb,COO)2; pH 8,6] terjedő lineáris gradienssel eluáljuk.
4.lépés:
Az rFVII/rFVIIa-t tartalmazó frakció ionerősségét hígítással 10 mS/cm alá állítjuk be és azonnal olyan Q-Sepharose oszlopra visszük fel, amelyet elö-egyensúlyoztunk az alábbi pufferral: 10 mmól/1 glici 1-glicin; 150 mmói/i NaCl: 70 pmól/l Zn(CFb,COO)2; pH 8,6.
Az oszlopot először az alábbi pufferrel: 10 mmól/1 glicil-glicin: 175 mmól/1 NaCl; 70 pmól/l Zn(CH3COO)2; pH 8,6, majd E pufferral [10 mmól/1 glicil-glicin; 100 mmól/1 NaCl; 70 pmól/l Zn(CH3COO)2; pH 8,6] mossuk, az rFVII/rFVIIa-t lineáris gradienssel eluáljuk, ·*··· ·· ·» • · · · · • · · · · · · • ····· · · · |ο ·♦ · ···· ·· amely gradiens az E puffertöl az alábbi pufferig terjed: 10 mmól/1 glicil-glicin; 15 mmól/1
CaCb; 70 pmóí/l Zn(CHiCOO)2; pH 8.6. Az átáramlási sebesség 1 térfogat/óra.
A tisztított rFVIIa az alábbi jellemzőkkel bír:
rFVIIa tartalom: 345 mg/l. UV spektroszkópiával [optikai sűrűség (OD280) mérve];
Idegen fehérje tartalom: < 1% RP-HPLC-vel mérve:
rFVII tartalom: 89% SDS-PAGE alapján;
rFVIIa lebomlási termék tartalom: < 2% RP-HPLC-vel mérve.
3. példa
Az rFVII rFVIIa-vá való tisztítását és aktiválódását az alábbi négy kromatográfiás lépésben hajtjuk végre:
1. lépés:
Az rFVII-et tartalmazó tápközeg ismerősségét hígítással 10 mS/cm alá állítjuk be és felvisszük A pufferral [10 mmól/1 trihidroxi-metil-amino-metán (trisz); 150 mmól/1 NaCl. (pH
8)| elöegyensúlyozott Q-Sepharose oszlopra.
Közel azonos pufferral (de 175 mmól/1 NaCI-lel) végzett mosási lépés után az rFVII-et
B pufferral [10 mmól/1 trisz; 150 mmól/1 NaCl; 25 mmól/1 CaCb: pH 8| cluáljuk.
2. lépés:
104 mg/l rFVII-et tartalmazó eluált oldatot végső összetételére állítjuk be (10 mmól/1 trisz; 1 mól/1 NaCl; 25 mmól/1 CaCh: 70 umól/l Zn/CH^COOh- pH 7.5). majd immobilizált anti-FVII monoklonális antitestet tartalmazó Sepharose oszlopra visszük fel.
«·· · • * · · « • ·· · ··· • ····· · · · _ 13 _ ·· · .... «·
Az antitest-oszlopot elő-egyensúlyozzuk C pufferral (10 mmól/1 trisz; 100 mmól/1 NaCl; 20 mmól/1 CaCb; 70 pmól/l Zn/CH^COOb. pH 7,5). Az oszlopot először 10 mmól/1 triszt. 2 mól/1 NaCl-t. 20 mmól/1 CaCb-t és 70 umól/1 ZnlCH^COOb-t (pH 7,5) tartalmazó oldattal, majd C pufferral mossuk. Ezután az rf VII/rFVHa-t eluáljuk egy puffer (75 mmól/1 trisz; 30 mmól/1 trinátrium-citrát; 70 umól/1 Zn(CIb,COO)2; pH 7.5) felvitelével.
3. lépés:
Az eluátumot azonnal felvisszük Q-Sepharose oszlopra, amelyet elö-egyensúlyóztunk az alábbi pufferral: 10 mmól/1 trisz: 150 mmól/1 NaCl; 70 pmól/l Zn(Cfb,COO)2; pH 8,6.
Az oszlopot azonos pufferral mossuk és az rFVII/rFVIIa-t A puffertól D pufferig [10 mmól/1 trisz; 500 mmól/1 NaCl; 70 μιηόΐ/l ZnfClbCOOb: pH 8.6] terjedő lineáris gradienssel eluáljuk.
4. lépés:
Az rFVII/rFVIIa-t tartalmazó frakciót 2 mmól/literesre állítjuk be etilén-diamintetraecetsavra (EDTA). majd az ionerösséget hígítással 10 mS/cm aki visszük le, ezután azonnal felvisszük az alábbi pufferral elő egyensúlyozott Q-Sepharose oszlopra: 10 mmól/1 glicilglicin; 150 mmól/1 NaCl; pH 8,6.
Először 10 mmól/1 glicil-glicint; 175 mmól/1 NaCl-t tartalmazó pufferral (pH 8,6), majd E pufferral (10 mmól/1 glicil-glicin; 100 mmól/1 NaCl; pH 8.6) mosunk, az rFVII/rFVIIa-t olyan lineáris gradienssel eluáljuk. amely az E puffertól az alábbi pufferig terjed: 10 mmól/1 NaCl; 15 mmól/1 CaCb: pH 8.6. Az áramlási sebesség 1 térfogat/óra.
A tisztított rFVIIa készítmény az alábbi jellemzőkkel bír;
rFVIIa tartalom; 492 mg/1. UV spektroszkópiával [optikai sűrűség (OD280) mérve];
Idegen fehérje tartalom: < 1% RP-HPLC-vel mérve;
···♦ » >· · • · · · « • · » · ··· *·····» 4 .
-14- .........
rFVII tartalom: 18% SDS-PAGE alapján;
rFVIIa lebomlási termék tartalom: 3.6% RP-HPLC-vel mérve.
4. példa
Az rFVII tisztítása és aktiválódása rFVIIa-vá a következő négy lépésben megy végbe:
1. lépés:
Az rFVII-et tartalmazó tápközeg ismcrösségét hígítással 10 mS/cm alá állítjuk be és felvisszük A pufferral [10 mmól/1 trihidroxi-nietil-amino-metán (trisz): 150 mmól/1 NaCl, (pH 8)| elöegyensúlyozott Q-Sepharose oszlopra.
Közel azonos pufferral (de 175 mmól/1 NaCI-lel) végzett mosási lépés után az rFVII-et B pufferral [10 mmól/1 trisz; 150 mmól/1 NaCl: 25 mmól/1 CaCb: pH 8| eluáljuk.
2. lépés:
104 mg/1 rFVII-et tartalmazó eluált oldatot végső összetételére állítjuk be (10 mmól/1 trisz: 1 mól/1 NaCl; 25 mmól/1 CaCb: 70 umól/l Zn(CFb,COO)2. pH 7.5). majd immobilizált anti-FVII monoklonális antitestet tartalmazó Sepharose oszlopra visszük fel.
Az antitest-oszlopot elö-egyensúlvozzuk C pufferral (10 mmól/1 trisz; 100 mmól/1 NaCl; 20 mmól/1 CaCb: 70 μηιόΐ/ΐ ZntCHyCOOh. pH 7.5). Az oszlopot először 10 mmól/1 triszt. 2 mól/1 NaCl-t. 20 mmól/1 CaCb-t és 70 pmól/l Zn/CH^COOh-t (pH 7,5) tartalmazó oldattal, majd C pufferral mossuk.
Ezután az rFVII/rFVIIa-t eluáljuk egy puffer (75 mmól/1 trisz: 30 mmól/1 trinátrium citrát; 70 pmól/l Zn(CFl3COO)2: pH 7.5) felvitelével.
··«·· -» 4 • · · · 9
-9 »· « · fl * • ····« 4 , ♦· · »··· ·· -1 ? -
3. lépés:
Az eluátumot 2 nimól/liter EDTA koncentrációra állítjuk be. majd azonnal felvisszük olyan Q-Sepharose oszlopra, amelyet az alábbi pufferral elö-egyensúlyoztunk ki: 10 mmól/1 trisz; 150 mmól/1 NaCl; pH 8,6.
Az oszlopot azután azonos pufferral mossuk, majd az íTVII/rFVlla-t A puufertöl D pufferig [10 mmól/1 trisz: 500 mmól/1 NaCl: 70 μηιόΐ/ΐ Zn(CH^COOb: pH 8.6] terjedő lineáris gradienssel eluáljuk.
4. lépés:
Az rFVII/rFVIIa-t tartalmazó frakciót hígítással 10 mS/cm ionerősség alá állítjuk be. ezután azonnal felvisszük az alábbi pufferral elő egyensúlyozott Q-Sepharose oszlopra: 10 mmól/1 glicil-glicin; 150 mmól/1 NaCl: pH 8.6.
Mosást végzünk először az alábbi összetételű oldattal: 10 mmól/1 glicil-glicin; 175 mmól/1 NaCl. pH 8.6, majd E pufferral (10 mmól/1 glicil-glicin: 100 mmól/1 NaCl: pFI 8,6). Az rFVII/rFVIIa-t olyan lineáris gradienssel eluáljuk. amely az E puffertöl az alábbi pufferig terjed: 10 mmól/1 glicil-glicin; 100 mmól/1 NaCl; 15 mmól/'l CaCb: pH 8.6. Az átfolyási sebesség 1 térfogat/óra.
A tisztított rFVIIa készítmény az alábbi jellemzőkkel bír:
rFVIIa tartalom: 1.2 mg/ml. UV spektroszkópiával [optikai sűrűség (OD280) mérve];
Idegen fehérje tartalom: < 1% RP-HPLC-vcl mérve;
rFVII tartalom: 1% SDS-PAGE alapján:
rFVIIa lebomlási termék tartalom: 6,7% RP-HPLC-vel mérve.
···· *
Claims (7)
1. Eljárás tisztítás során VII faktor szabályozott aktiválódására és lebontására, ahol a VII faktor oldatát egy sor kromatográfiás tisztítási lépésnek vetjük alá. azzal jellemezv e. hogy a tisztítási lépések legalább egyikét /:·,' ionok jelenlétében végezzük.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítási lépések során a VII. faktort egy sor anioncserélö és imnumalTinitásos kromatográfiás oszlopra visszük fel.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárásban a Zn++ iont valamely oldható cinksó formájában alkalmazzuk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárásban a Zn++ iont mintegy 10 μηιόΙ/Ι és mintegy 1 mmól/l közti koncentrációban alkalmazzuk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárásban a Zn++ iont mintegy 20 pmól/l és mintegy 1 mmól/l közti koncentrációban alkalmazzuk.
6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárásban a Zn++ iont mintegy 40 pmól/l és mintegy 1 mmól/l közti koncentrációban alkalmazzuk.
7. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az FVI 1-t az alábbi sorrendben visszük fel a kromatográfiás oszlopokra: I. anioncserélő oszlop: 2. immunaffmitásos oszlop; 3. anioncserélö oszlop, 4. anioncserélö oszlop és a Zn++ iont legalább két lépésben alkalmazzuk.
A meghatalmazott ifj. Szentpéteri Adam . szabadalmi ugyviváx
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY □ 0!
> > LL. LJL xO xO θ'*
1QQ
o o o
Cd T1=1 I Ad %
1. obrQ ifj. Szentpéteri Ádám szabadalmi ügyvivő
1113.
4-323
H
Tde<ü<T 34-24550, Fax: 34KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY 3á *w
Ói ói
W
ΙΙΛΗ1 % ói + ói Ó
I J + ói + ói ra f
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK93382A DK38293D0 (da) | 1993-03-31 | 1993-03-31 | Fremstilling af proteiner |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9502846D0 HU9502846D0 (en) | 1995-12-28 |
| HUT72712A true HUT72712A (en) | 1996-05-28 |
Family
ID=8092871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9502846A HUT72712A (en) | 1993-03-31 | 1994-03-24 | Purification of factor vii |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5700914A (hu) |
| EP (1) | EP0691984A1 (hu) |
| JP (1) | JPH08508264A (hu) |
| CN (1) | CN1039231C (hu) |
| AU (1) | AU677309B2 (hu) |
| CA (1) | CA2159313A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ253395A3 (hu) |
| DK (1) | DK38293D0 (hu) |
| FI (1) | FI954649A0 (hu) |
| HU (1) | HUT72712A (hu) |
| IL (1) | IL109164A0 (hu) |
| NO (1) | NO953883L (hu) |
| PL (1) | PL310887A1 (hu) |
| TW (1) | TW278079B (hu) |
| WO (1) | WO1994022905A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA941956B (hu) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19538716A1 (de) * | 1995-10-18 | 1997-04-24 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Quantifizierung von aktiviertem Gerinnungsfaktor VII (FVIIa) |
| DE19538715A1 (de) * | 1995-10-18 | 1997-04-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Reinigung von Faktor VII und aktiviertem Faktor VII |
| DK1308456T3 (da) | 1998-05-06 | 2007-12-27 | Genentech Inc | Antistofoprensning ved ionbytterkromatografi |
| AT408613B (de) * | 1998-06-17 | 2002-01-25 | Immuno Ag | Pharmazeutisches faktor vii-präparat |
| WO2001058935A2 (en) | 2000-02-11 | 2001-08-16 | Maxygen Aps | FACTOR VII OR VIIa-LIKE MOLECULES |
| IL162239A0 (en) | 2001-12-21 | 2005-11-20 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Liquid composition of factor vii polypeptides |
| US20040009918A1 (en) * | 2002-05-03 | 2004-01-15 | Hanne Nedergaard | Stabilised solid compositions of modified factor VII |
| EP2283856B1 (en) | 2002-06-21 | 2017-09-20 | Novo Nordisk Health Care AG | Stabilised solid compositions of factor VIIa polypeptides |
| AU2004221758B2 (en) * | 2003-03-18 | 2010-07-22 | Novo Nordisk Health Care Ag | Method for the production of GLA-residue containing serine proteases |
| US7897734B2 (en) | 2003-03-26 | 2011-03-01 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Method for the production of proteins |
| CA2525224A1 (en) | 2003-05-23 | 2004-12-02 | Michael Bech Jensen | Protein stabilization in solution |
| ATE547114T1 (de) * | 2003-06-25 | 2012-03-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Flüssige zusammensetzungen von factor vii polypeptiden |
| ES2335994T3 (es) * | 2003-07-01 | 2010-04-07 | Novo Nordisk Health Care Ag | Composicion farmaceutica liquida, acuosa de polipeptidos factor vii. |
| ES2574581T3 (es) | 2003-08-14 | 2016-06-20 | Novo Nordisk Health Care Ag | Composición farmacéutica líquida acuosa de polipéptidos de tipo Factor VII |
| CN1890257A (zh) | 2003-12-01 | 2007-01-03 | 诺和诺德医疗保健公司 | 液体因子ⅶ组合物的病毒过滤 |
| EP2298287B1 (en) * | 2003-12-19 | 2018-04-11 | Novo Nordisk Health Care AG | Stabilised compositions of factor VII polypeptides |
| EP1831242B1 (en) * | 2004-12-23 | 2012-09-26 | Novo Nordisk Health Care AG | Reduction of the content of protein contaminants in compositions comprising a vitamin k-dependent protein of interest |
| PT1841863E (pt) * | 2005-01-14 | 2010-10-25 | Bayer Healthcare Llc | Método para a purificação de factor vii |
| PL1907540T3 (pl) * | 2005-07-22 | 2013-05-31 | Bayer Healthcare Llc | Aktywacja czynnika VII w roztworze |
| US8841255B2 (en) | 2005-12-20 | 2014-09-23 | Duke University | Therapeutic agents comprising fusions of vasoactive intestinal peptide and elastic peptides |
| US20130172274A1 (en) | 2005-12-20 | 2013-07-04 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
| EP1971355B1 (en) * | 2005-12-20 | 2020-03-11 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
| WO2009158704A2 (en) | 2008-06-27 | 2009-12-30 | Duke University | Therapeutic agents comprising elastin-like peptides |
| CN103539852B (zh) * | 2012-07-12 | 2015-08-12 | 上海泰龙生物医药科技有限公司 | 一种从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法 |
| EP2687595B1 (en) | 2012-07-19 | 2018-05-30 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Method for purifying transgenic factor VII |
| AU2013331240B8 (en) | 2012-10-17 | 2016-11-24 | The Procter & Gamble Company | Strip for the delivery of an oral care active and methods for applying oral care actives |
| EP3560946B1 (en) | 2016-12-22 | 2022-02-02 | KM Biologics Co., Ltd. | Chromatographic method for collecting blood coagulation factor vii with high yield |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4981952A (en) * | 1988-10-04 | 1991-01-01 | Eli Lilly And Company | Method for the purification of vitamin K-dependent proteins |
-
1993
- 1993-03-31 DK DK93382A patent/DK38293D0/da unknown
-
1994
- 1994-03-14 TW TW083102182A patent/TW278079B/zh not_active IP Right Cessation
- 1994-03-21 ZA ZA941956A patent/ZA941956B/xx unknown
- 1994-03-24 WO PCT/DK1994/000122 patent/WO1994022905A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-03-24 CA CA002159313A patent/CA2159313A1/en not_active Abandoned
- 1994-03-24 US US08/446,671 patent/US5700914A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-24 CZ CZ952533A patent/CZ253395A3/cs unknown
- 1994-03-24 AU AU64239/94A patent/AU677309B2/en not_active Ceased
- 1994-03-24 EP EP94911854A patent/EP0691984A1/en not_active Withdrawn
- 1994-03-24 CN CN94191833A patent/CN1039231C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-24 HU HU9502846A patent/HUT72712A/hu unknown
- 1994-03-24 PL PL94310887A patent/PL310887A1/xx unknown
- 1994-03-24 JP JP6521552A patent/JPH08508264A/ja active Pending
- 1994-03-30 IL IL10916494A patent/IL109164A0/xx unknown
-
1995
- 1995-09-29 NO NO953883A patent/NO953883L/no unknown
- 1995-09-29 FI FI954649A patent/FI954649A0/fi unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2159313A1 (en) | 1994-10-13 |
| WO1994022905A1 (en) | 1994-10-13 |
| JPH08508264A (ja) | 1996-09-03 |
| ZA941956B (en) | 1994-09-30 |
| CN1121723A (zh) | 1996-05-01 |
| FI954649A (fi) | 1995-09-29 |
| IL109164A0 (en) | 1994-06-24 |
| US5700914A (en) | 1997-12-23 |
| DK38293D0 (da) | 1993-03-31 |
| AU677309B2 (en) | 1997-04-17 |
| NO953883L (no) | 1995-11-28 |
| PL310887A1 (en) | 1996-01-08 |
| NO953883D0 (no) | 1995-09-29 |
| FI954649A0 (fi) | 1995-09-29 |
| HU9502846D0 (en) | 1995-12-28 |
| AU6423994A (en) | 1994-10-24 |
| EP0691984A1 (en) | 1996-01-17 |
| CZ253395A3 (en) | 1996-01-17 |
| CN1039231C (zh) | 1998-07-22 |
| TW278079B (hu) | 1996-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT72712A (en) | Purification of factor vii | |
| JP3459416B2 (ja) | 修飾されたファクター▲ｖｉｉ▼ | |
| US5580560A (en) | Modified factor VII/VIIa | |
| AT405516B (de) | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle | |
| EP2504349B1 (en) | Method of purifying pegylated proteins | |
| AU732953B2 (en) | Factor X deletion mutants and analogues thereof | |
| KR20110036071A (ko) | 그의 보조인자의 부존재하에서 응고활성을 갖는 인자 ｉｘ 변이체 및 출혈 질환을 치료하기 위한 그의 용도 | |
| US8513386B2 (en) | FVIII-independent FIX-mutant proteins for hemophilia a treatment | |
| US20010007901A1 (en) | Process for purifying factor VII and activated factor VII | |
| Chavin | Factor VIII: structure and function in blood clotting | |
| CA2105282C (en) | Preparation of factor ix | |
| JP4680329B2 (ja) | 血管障害の治療方法 | |
| RU2167936C2 (ru) | Способ минимизации деградации активированного протеина с (варианты), стабилизированная композиция активированного протеина с | |
| Rezaie et al. | Proline at the P2 position in protein C is important for calcium-mediated regulation of protein C activation and secretion | |
| AU703760B2 (en) | Modified Factor VII pharmaceutical | |
| CZ2000982A3 (cs) | Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé faktory, závislé na vitaminu K a jeho použití |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |